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用于CRM197的高水平表达的密码子优化多核苷酸
申请号	CN201580062524.6	申请日	2015-11-17	公开(公告)号	CN107109416A	公开(公告)日	2017-08-29
申请人	生物E有限公司;			发明人	阿克沙·格尔; 拉维·普拉塔普·纳拉扬·米什拉; 纳伦德尔·德夫·曼特纳; 马希马·达特拉;
摘要	本发明涉及通过优化的新型多核苷酸序列和用所述多核苷酸转化的宿主高水平表达具有药理学意义的细菌类毒素或毒素蛋白。具体地，本发明提供用于多肽CRM197的大量生产的方法，其中，本发明的多核苷酸用于转化合适的宿主，导致相应蛋白质的过表达，以及用于分离表达的多肽的方法。更具体地，本发明涉及CRM197在大肠杆菌中的高水平表达及用于其的分离和纯化的方法。
权利要求	1.一种包含SEQ ID NO.2的优化多核苷酸序列及其变体，所述变体与所述优化多核苷酸序列SEQ ID NO.2至少70％同源。 2.一种包含SEQ ID NO.2的优化多核苷酸序列及其变体，所述变体与所述优化多核苷酸序列SEQ ID NO.2至少70％至88％同源 3.根据权利要求1和2所述的SEQ ID NO.2的变体，选自SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9、10。 4.一种用于生产多肽的方法，包括以下步骤： a)选择基本上由SEQ ID NO.2或其变体组成的优化多核苷酸序列，所述变体与SEQ ID NO.2至少70％同源， b)可选地将步骤(a)的所述多核苷酸序列连接到合适的载体中， c)将所述多核苷酸序列插入或转化到大肠杆菌宿主细胞中， d)在培养基中培养转化的所述宿主细胞用于所述多肽的高水平表达， e)保持10至40℃的诱导温度以产生多肽， f)从所述宿主细胞中提取细菌多肽，然后纯化来以高产率获得纯多肽。 5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述合适的载体是选自pET9a、pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、pET12a、pTWINl、pTWIN2、pET12b、pET12c、pET17b的质粒载体。 6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述大肠杆菌菌株选自BL21(DE3)、BL21Al、HMS174(DE3)、DH5α、W3110、B834、origami、Rosetta、NovaBlue(DE3)、Lemo21(DE3)、T7、ER2566和C43(DE3)。 7.根据权利要求4所述的方法，其中，CRM197的产率为约0.1g/L、0.25g/L、0.5g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g L、约4g/L、约4.5g/L、约4.5g/L、约5g/L。 8.根据权利要求4所述的方法，其中，通过提供用于多核苷酸的表达的合适的诱导温度来引起周质表达，而没有用于定向转运至周质空间中的任何异源序列。 9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述诱导温度范围为10至40℃。 10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多肽是载体蛋白。 11.根据权利要求10所述的载体蛋白，其中，所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。 12.根据前述权利要求中任一项所述的CRM197，其中，所述CRM197与从伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌和其它致病细菌分离的多糖分子结合。 13.根据前述权利要求中任一项所述的CRM197，其中，所述CRM197用作用于疫苗，如对抗伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌和其它致病细菌的疫苗的结合载体。
说明书全文	用于CRM197的高水平表达的密码子优化多核苷酸技术领域 [0001] 本发明涉及通过优化的新型多核苷酸序列和用所述多核苷酸转化的宿主来高水平表达细菌类毒素。 [0002] 本发明还提供了用于多肽CRM197的大量生产的方法，其中将本发明的多核苷酸用于转化合适的宿主，得到相应蛋白质的过表达，以及用于分离表达的多肽的方法。背景技术 [0003] 白喉毒素(DT)是由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)合成和分泌的蛋白质外毒素。白喉棒状杆菌的产毒菌株包含携带毒素基因的噬菌体溶源菌。DT的成熟形式合成为含535个氨基酸的单一多肽，其源自初始的536个前肽，其在190、192和193位经受蛋白水解以形成成熟的毒素。这种剪接或蛋白水解导致两个亚单位A和B，其通过二硫化物桥连接在一起(Moskang et al，Biol.Chem.264:15709-15713，1989)。亚单位A是催化活性的NAD依赖性ADP-核糖基转移酶部分。其负责使延伸因子-2(EF-2)无活性，因此下调靶细胞中的蛋白质合成。 [0004] 白喉毒素是高度细胞毒性的；单个分子可以对细胞致死，且10ng/kg的剂量可杀死动物和人类。在通过注射该毒素提供人工免疫的过程中，应包括解毒过程，以使其对于接受者的摄入是安全的。通常，通过天然形式的DT的化学修饰来将其解毒，以这种方式其仍保留疫苗制剂中所需的需要的抗原性。 [0005] 随后，引入称为交叉反应物质197或CRM197的白喉毒素的遗传解毒形式；其基本上保留了DT的免疫交叉反应性质。 [0006] CRM197已用于制备包括白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、乙型肝炎(Hepatitis B)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的结合疫苗。其通过产毒棒状杆菌噬菌体β的亚硝基胍诱变产生，然后将棒状杆菌噬菌体β用于感染白喉棒状杆菌。(Uchida et al，Nature New Biology(1971)233；8-11，Nucleic Acids Res.1984May 25；12(10).4063-9)。 [0007] 已研究了CRM197作为DT增效剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197蛋白质具有与DT相同的分子量；但在A亚单位中的单碱基变化，即野生型DT的多核苷酸序列的碱基变化上不同，其中鸟嘌呤替换为腺嘌呤导致在52位的氨基酸替换，产生CRM197中的谷氨酸替代甘氨酸(Giannini G.et al，1984)。该点突变导致毒性的显著损失，并使CRM197对于人类使用是安全的。 [0008] 由于在野生型细菌中表达水平低，因此用于疫苗的大量的白喉毒素(如用于疫苗的CRM197)的生产受到阻碍。先前由Bishai等人(J.Beeteriol.189：5140-5151)通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达CRM197解决了该问题，其描述了含有白喉毒素(包含毒性信号序列)的重组融合蛋白的表达；但这导致产生降解的蛋白质。取决于毒素的具体特征，例如大小和二级结构，活性形式的低产率也与降解、不当的折叠或两者有关。因此，与大多数生物制药一样，存在在CRM197的纯化步骤期间发生的表达的蛋白质的额外损失，由此维持CRM197的生物活性形式形成挑战。因此，存在以活性形式实现细菌类毒素CRM197的高水平表达的需要。 [0009] WO 2011/042516公开了通过周质表达制备细菌毒素的改进方法，包括以下步骤：a)培育包含其中特定的信号序列与细菌毒素的序列连接的表达载体的细菌宿主细胞的培养物，和b)诱导包含与细菌毒素连接的特定信号序列的多肽的表达，使得周质表达细菌毒素。 [0010] WO 2013/178974A1公开了在大肠杆菌宿主中细胞内表达CRM197的方法，其包括表达包含可操作地连接至启动子和至少一个完全回文操纵子序列的编码CRM197的基因的载体。 [0011] WO 2015/134402A1公开了用于在大肠杆菌宿主的简化基因组中产生重组CRM197的方法，其包括在适合于表达重组CRM197蛋白质的条件下，温育简化基因组大肠杆菌，其包含含有编码融合到引导CRM197蛋白质的转移到可操作地连接到表达控制序列的周质的信号序列的CRM197蛋白质的核苷酸序列的表达载体，由此获得至少1克/升的可溶性CRM197的产量，并且其中天然亲本大肠杆菌菌株是12菌株，优选为K12 MG1655。 [0012] US 2012/0128727 A1公开了编码多肽CRM197的分离的核酸分子、包含该分离的核酸分子的表达载体，和用于重组生产CRM197标签融合蛋白的方法，包括在有利于生产所述CRM197标签融合蛋白的条件下培养重组细胞以及分离所述融合蛋白。 [0013] US 2012/0289688 A1公开了用于通过以下来周质表达重组多肽的方法(A)培育革兰氏阴性宿主细胞的培养物；和(B)诱导多肽的表达使得周质表达蛋白质；其中在表达过程中执行以下步骤中的一个或多个：(i)步骤a)的pH低于步骤b)的pH；(ii)步骤a)的温度高于步骤b)的温度；或(iii)步骤a)的底物进料速率高于步骤b)的底物进料速率。 [0014] US 2014/0050758 A1公开了用于细菌类毒素的周质表达的方法，包括以下步骤：a)在发酵培养基中培育革兰氏阴性宿主细胞的培养物，其中用多核苷酸转化宿主细胞，并且其中该多核苷酸编码细菌类毒素和周质信号序列；诱导细菌类毒素的表达； [0015] b)使所述宿主细胞成熟，其中成熟步骤包括：I)使宿主细胞经受pH冲击：II)不加入饲料温育宿主细胞；或III)使宿主细胞经受低于-20℃的温度；以及 [0016] c)从宿主细胞中提取细菌类毒素，其中提取过程包括渗透压休克(osmotic shock)，其中革兰氏阴性宿主细胞选自由大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)和莫拉氏菌(Moraxella)组成的组，其中宿主细胞在步骤b)期间是活的，并且其中在含有10-5000升的培养物的发酵器中进行该过程。 [0017] US 8,530,171公开了在假单胞菌宿主细胞中产生重组毒素蛋白的方法，所述方法包括：将编码毒素蛋白的核苷酸序列连接到表达载体中；用表达载体转化假单胞菌宿主细胞；并在适于表达重组毒素蛋白质的培养基中培养转化的假单胞菌宿主细胞；其中重组载体蛋白是CRM197，并且其中以约0.2克/升至约12克/升的可溶性或活性CRM197蛋白质的产率产生重组蛋白质。 [0018] 使用CRM197作为载体蛋白的复合多糖疫苗已被批准用于人类使用。这些包括：(Novartis Vaccines and Diagnostics)，指定用于预防由脑膜炎奈瑟氏菌亚组A、C、Y和W-135引起的侵入性脑膜炎球菌病的疫苗； (Novartis Vaccines)，C群脑膜炎球菌结合疫苗；和 (Wyeth Pharmaceuticals,Inc.)，靶向13种血清型的肺炎链球菌的儿童肺炎疫苗，以及 (Wyeth)，流感嗜血杆菌b型疫苗。此外，CRM197具有作为白喉棒状杆菌疫苗接种的增强抗原的潜在用途，并且正在研究作为用于其它疫苗的载体蛋白质。 [0019] 近来，因为与其结合HB-EGF的可溶形式的能力相关的其潜在的抗肿瘤作用(Mekada et al，美国专利公开号2006/0270600A1)，对CRM197的兴趣正在增加。这种抗肿瘤功能不仅可归因于CRM197，而且可归因于DT毒素的其它无毒性衍生物(例如，双突变体DT52E148K或融合蛋白GST-DT)。已从编码CRM197的基因开始通过PCR构建这些突变体。然而，在所述研究中，使用白喉棒状杆菌的培养物在35℃下生长16-17小时生产完整的CRM197。通过用硫酸铵初步沉淀，然后在离子交换和疏水层析中的三个连续步骤，从上清液中纯化CRM197(Mekada et al.,)。 [0020] 因此，显然需要用于以高产率和成本有效的方式生产CRM197的可替代方法。因此，用于经济地生产CRM197的方法将极大地促进疫苗研究、开发和制造。 [0021] 发明目的 [0022] 本发明的主要目的是提供用于CRM197的高水平表达的优化的多核苷酸。 [0023] 又一个目的是提供用于控制多肽表达以获得CRM197的可调节方法。 [0024] 又一个目的是提供用于以高产率以纯净形式商业生产CRM197的高水平表达方法。发明内容 [0025] 本发明提供了包含SEQ ID NO.2的优化多核苷酸序列及其变体，该变体与优化多核苷酸序列SEQ ID NO.2至少70％同源。 [0026] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于高水平表达多肽CRM197的优化多核苷酸序列(SEQ ID NO:2)及其结构变体，其选自但不限于SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9和10。 [0027] 在又一个实施方式中，本发明提供了优化多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)及其结构变体，如SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9和10，其与所述优化多核苷酸序列SEQ ID NO.2至少70至88％同源。 [0028] 本发明还提供了用于生产多肽的方法，包括以下步骤： [0029] a)选择基本上由SEQ ID NO.2或其与SEQ ID NO.2至少70％同源的变体组成的优化多核苷酸序列 [0030] b)可选地将步骤(a)的多核苷酸序列连接到合适的载体中， [0031] c)将多核苷酸序列插入或转化到大肠杆菌宿主细胞中， [0032] d)在培养基中培养转化的宿主细胞用于多肽的高水平表达， [0033] e)保持10至40℃的诱导温度以产生多肽， [0034] f)从宿主细胞中提取细菌多肽，然后纯化以获得具有高产率的纯多肽。 [0035] 以上获得的多肽适合用作用于制备复合免疫原性制剂的载体蛋白质。附图说明 [0036] 图1：示出了对应于由多核苷酸SEQ ID NO.2编码的表达的CRM197运行的SDS-PAGE电泳凝胶法；其中泳道1：标准分子质量标记；泳道2和3：由大肠杆菌培养物提取物的总细胞蛋白分离和纯化的CRM197，并且分别在非还原性和还原性SDS-PAGE上进行。 [0037] 图2：示出了使用兔多克隆抗体的纯化的CRM197的蛋白质印迹分析；泳道1：分子量阶梯。泳道2和3分别包括在还原性和非还原性条件下电泳的CRM197样品。 [0038] 图3：SDS PAGE显示纯化的可溶性部分泳道1：参照蛋白质；泳道2：蛋白质分子量标记；泳道3-10：合并的多肽CRM197。 [0039] 图4：显示在CRM197的溶解时进行的测试的电泳凝胶运行(SDS PAGE 12％)，泳道1：CRM197的尿素溶解的部分；泳道2：上清液；泳道3：来自第一团块洗涤的样品；泳道4：合并自第二团块洗涤的样品。 [0040] 图5：尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)，其中主洗脱峰显示样品中CRM197的存在。 [0041] 图6：多肽CRM197的肽质量指纹(质谱)以定义一级氨基酸序列的一致性。本发明的重组CRM(BioE rCRM)具有与参照CRM197序列100％的序列相似性。 [0042] 图7：通过埃德曼降解(Edman degradation)的rCRM197的N末端序列确认。10个氨基酸序列GADDWDSSK(N-末端乙酰基)显示纯化的多肽的起始部分。第一个氨基酸确定为G。 [0043] 图8：本发明的重组CRM(BioE rCRM)的CD光谱与参照CRM197重叠。还分析了二级结构参数，并显示与参照相似。结果表明本发明的重组CRM(BioE rCRM)在结构上与参照相似。 [0044] 图9：使用荧光试验用参照确认本发明的重组CRM(BioE rCRM)的结构等同性。用参照CRM197(C7CRM)覆盖本发明的重组CRM(BioE rCRM)的DSF曲线。该数据确认本发明的重组CRM(BioE rCRM)与参照C7-CRM197的相似性。 [0045] 图10：二硫键的确认。分析本发明的重组CRM(Bio rCRM)在蛋白质中存在正确的二硫键。可以确认存在于蛋白质中的二硫键，第一个连接氨基酸186至201，并且第二键连接氨基酸461至471。质谱法用于分析CRM197中的二硫键连。 [0046] 图11：通过CRM197特异性ELISA用参照CRM197确认的本发明的重组CRM(BioE rCRM)的抗原相似性。来自不同的来源的所有CRM都显示出与单克隆抗体相似的识别特征。具体实施方式 [0047] 用作药物产品或疫苗的多肽表达需要实现宿主细胞系的高生物量和/或生产力。在不存在多因素的情况下，可以显著降低多肽产生的效率，其包括使用编码该多肽的最佳多核苷酸序列。已知遗传密码表现出简并性，其总计为编码相同的氨基酸序列的多核苷酸序列的变异。氨基酸链的合成速率是影响表达构建体设计的来自单个基因的整体表达水平的决定因素，具有重要意义。因此，最佳多核苷酸序列的构建对于确定多肽的整体表达水平是重要的，并且必须被良好地调控。其包括但不限于密码子在生物体中偏好的频率或在人工载体或媒介的情况下是期望的最接近频率。这转而反映了tRNA丰度或同源细胞tRNA频率，必须由其小心选择同义密码子选择模式。其它因素还包括形成二级结构的潜力、mRNA水平和RNA稳定性，待进行的随后预期的操作、合成路径等。必须小心调控这些结构的发生，因为这些模式的选择与感兴趣的个体蛋白质和表达宿主的优化不同。 [0048] 因此，本发明的主要实施方式提供了优化多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)及其结构变体。 [0049] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于CRM197的多肽的高水平表达的优化多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)及其结构变体，该结构变体选自但不限于SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9和10，具有等于或大于70％的相似性。 [0050] 周质表达是指来自宿主细胞内的周质空间中的感兴趣的预期基因(如细菌类毒素或白喉类毒素)的表达产物的分泌。 [0051] 细胞质表达是指包封在细胞膜内的细胞的胞质隔室中的蛋白质的表达。 [0052] 表达的诱导是指从多核苷酸诱导表达而进行的步骤，使得以加速的速率获得产物，这可能包括添加合适的诱导剂如IPTG、阿拉伯糖、麦芽糖等。 [0053] 本发明的优化序列可应用于选自但不限于SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9、10的SEQ ID NO.2的其他变体并且还包括在SEQ ID NO.1(保留相同的炎性和免疫刺激性能并且能够结合细胞受体HB-EGF的野生型白喉毒素)的衍生物的产生中的序列，但与CRM197在单个氨基酸替换上不同，并且缺乏对靶宿主的细胞毒性。 [0054] CRM197的多核苷酸序列可以源自白喉毒素的序列(Greenfield,L.et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6853-6857)，或通过使用由Giannini G.et al.,(1984)给出的CRM197的氨基酸序列作为参照得出。优化由此获得的野生型多核苷酸序列用于宿主细胞，更优选地革兰氏阴性细胞，更优选地作为宿主细胞的大肠杆菌中的高表达。可以通过化学合成或通过组装程序制备本发明的这种多核苷酸序列。 [0055] 在又一个实施方式中，提供了用于宿主细胞中的CRM197的细胞内表达的方法，其中具有调控序列的表达构建体提供本发明的多核苷酸的表达。可以将该多核苷酸序列与用于编码的多肽的导向转运的信号序列关联。其可以可操作地连接到提供靶向在宿主的周质空间中分泌的表达的周质信号序列。 [0056] 本发明还提供了CRM197的高水平生产，其中通过为多核苷酸的表达提供合适的诱导温度来引起周质表达，而没有用于导向转运到周质空间中的任何异源序列。 [0057] 可选地，还可以将本发明的多核苷酸与标签多肽的多核苷酸关联。还已知标签的存在增强蛋白质在细胞质中的稳定性和溶解度，并用于其随后的纯化。 [0058] 可以单独地或结合多标记相关，在5’端或3’端将这些标签与编码标签多肽的寡核苷酸序列关联，以促进其细胞质稳定性和/或使用具有对各种标签肽的高亲和性的基体和树脂的随后的纯化。可以根据本发明使用的各种标签包括HA标签(血细胞凝集素)、MYC标签、Strep II、FLAG、HPC(蛋白质C的重链)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合蛋白(CBD)和几丁质结合蛋白(CBP)。 [0059] 还可用本领域公知的分子技术将本发明的多核苷酸并入包含调控序列的载体构建体中(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd ed.，(1989))。这包括但不限于合适的启动子、复制起点、核糖体结合位点、转录终止序列、可选择性标记和多克隆位点。特别地，具有有效和特异性的构建体的质粒是优选的；如包含对噬菌体T7的RNA聚合酶特异的T7启动子的一种。可以参考这些方法，但不限于在美国专利申请号2012/0128727；美国专利号5,055,294；美国专利号5,128,130；美国专利号5,281,532；美国专利号4,695,455；美国专利号4,861,595；美国专利号4,755,465和美国专利号5,169,760中公开的一种。用于在白喉棒状杆菌中生产CRM197蛋白质的质粒系统也描述于美国专利号5,614,382中。 [0060] 在一个实施方式中，宿主细胞是革兰氏阴性宿主细胞。宿主细胞表达系统如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)已经在蛋白质的生产中广泛讨论。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸优选用于大肠杆菌中的CRM197的细胞内表达，其中宿主菌株选自BL21(DE3)、BL21A1、HMS174(DE3)、DH5α、W3110、B834、origami、Rosetta、NovaBlue(DE3)、Lemo21(DE3)、T7、ER2566和C43(DE3)。 [0061] 在优选的实施方式中，本发明提供了编码细菌类毒素的多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，可选地将其连接到载体中，随后将载体插入到宿主细胞中。可以通过本领域已知的任何方法进行到宿主细胞中的插入。可以通过物理或化学的转化方法进行这种插入或转化。随后，在具有添加的抗生素的培养皿上选择转化的菌落。 [0062] 用于本发明的合适的载体包括但不限于pET9a、pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、pET12a、pTWTN1、pTWTN2、pET12b、pET12c、pET17b，以及通常具有强噬菌体T7启动子(例如，pRSETA、B和C[Invitrogen])和pTYB1、pTYB2、pTYB3和pTYB4的所有载体。 [0063] 在另一个实施方式中，大肠杆菌细胞用于表达编码CRM197的多核苷酸。通过测序验证插入的多核苷酸的适当取向和位置。得到的构建体用于通过任何已知的化学或物理方法转化宿主细胞。例如使用6.5kV.cm-1至25kV.cm-1范围内的电场电穿孔宿主细胞，此处用于转化宿主的优选的化学方法。使得这些细胞在25至40℃下，在合适的培养基如LB或SOC培养基中生长30分钟至120分钟，然后在25至40℃下转移至选择培养基陪替氏平皿(petriplate)10至36小时，其中选择包含本发明的多核苷酸的阳性菌落。 [0064] 可以使用或不使用标记完成阳性克隆的选择。可使用的合适的标记选自但不限于抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素等。 [0065] 将编码全长CRM197蛋白质的多核苷酸克隆在T7 lacI启动子附近，其驱动大肠杆菌的T7聚合酶阳性菌株中的蛋白质的表达。多核苷酸的表达由T7启动子严格控制，其在IPTG或自动诱导培养基的存在下诱导。 [0066] 优化用于培养宿主的参数用于CRM197蛋白质的高水平表达。在一个实施方式中，优化培养基组分、包括生长温度、诱导物浓度和诱导时间的培养条件。使用的培养基可选自但不限于化学限定培养基、LB(Luria-Bertani)、TB(极品肉汤(Terrific Broth))、SOB(超级优化肉汤(Super Optimal Broth))、SOC(具有分解代谢阻遏物的超级优化肉汤)、YT肉汤(酵母提取物和胰蛋白胨)、超级肉汤、丰富培养基、基本培养基、矿物质培养基等。培养基的成分包括但不限于，碳源，如例如葡萄糖、蔗糖或甘油，有机氮源如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物，使用无机氮源并且其可选自例如铵盐、氨水和气态氨，补充有例如低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其它成分的补充剂。可使用本领域已知的方法制备培养基。 [0067] 可以在小体积上如在LB、极品肉汤或化学限定培养基中5-50ml上测试转化的宿主细胞的表达。该表达可以经受约0.01mM、约0.05mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM和约1mM范围内的不同浓度的诱导物。在电泳装置中，优选在SDS PAGE电泳中测定多肽表达，并观察为用考马斯亮蓝(-)染色的过表达的条带。 [0068] 随后，将宿主细胞接种在500mL的烧瓶培养物中；并使其在最佳条件下生长，在此期间CRM197表达从16小时持续到32小时。在恒定搅拌且优选在需氧条件下培养之后，收获细胞并裂解。可以应用任何已知的方法裂解细胞，优选的方法包括以适当浓度含有洗涤剂的裂解缓冲液。在裂解后，在一个或多个离心步骤中将蛋白质组分合并。在含有20-50mM pH 7.5-8.5的Tris-HCl、100-150mM的NaCl、0.5-1.5％的洗涤剂和0.5-1.5％的蛋白酶抑制剂的缓冲液中伴随搅拌进行裂解。 [0069] 在一个实施方式中，在10至40℃下进行用于表达的诱导温度。在一个实施方式中，以可调节的方式在诱导温度下得到CRM197，其中当诱导温度保持在10至20℃时，可溶部分中存在大于80％的表达的CRM197。在另一个实施方式中，当诱导温度保持在25至40℃时，获得的大于80％的表达的CRM197在不溶性部分中作为胞质包涵体，在从合并的胞质部分的溶解步骤后将其从其中纯化。 [0070] 在一个实施方式中，使用各种浓度的尿素本身，1M尿素、或2M尿素、或3M尿素、或4M尿素、或5M尿素、或6M尿素、或7M尿素、或8M尿素、或9M尿素来溶解胞质包涵体。 [0071] 在具体的实施方式中，可溶性CRM197的产率为约0.1g/L、0.25g/L、0.5g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g/L、约4g/L、约4.5g/L、约4.5g/L、约5g/L。 [0072] 在具体的实施方式中，不溶性CRM197的产率为约0.25g/L、0.5g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g/L、约4g/L、约4.5g/L、约4.5g/L、约5g/L。 [0073] 使用离子交换色谱柱纯化表达的蛋白质，随后亲和层析。 [0074] 因此，本发明涉及多于一个随后的纯化步骤，并且还在离子交换色谱步骤中利用CRM197的pI值，由此将其与其它污染蛋白质分离。最后，通过BCA/Bradford/Lowry试验量化CRM197的量，并在10-12％的丙烯酰胺凝胶中可视化(SDS-PAGE)。通过蛋白印迹法和类似的免疫测定进行多肽的确定。通过SDS-PAGE和HPLC方法测量纯化的多肽的纯度和完整性。由此表达的蛋白质的产量为500-1000mg/L的培养基，并且随后可以通过调控培养添加剂和条件以及纯化步骤来改变。本发明的方法还提供了工业上适用的调节诱导时间，并且随后调控层析步骤的pH和温度的方法，提供简单、便宜并且不费力。其排除了包括制备缓冲液或试剂盒或其工作溶液的大量步骤的需要。在去除标签期间，不需要提供额外的缓冲液或盐或酶或设备。在具体的实施方式中，纯化的CRM197多肽容易缺乏第一蛋氨酸氨基酸，其存在在最终的CRM197蛋白质中是不期望的，并且其去除引起额外的纯化步骤的需要。由此获得的多肽为活性和天然形式；其容易缺乏不期望的蛋氨酸作为第一氨基酸，而不需要额外的步骤。通过Insilico/生物信息学工具分析CRM197氨基酸序列；显示在蛋白质中约38.4％的疏水性。发现CRM197的等电点为约5.81。CRM197蛋白质含有4个半胱氨酸氨基酸残基和21个脯氨酸残基。通过测量DNA上的核酸内切酶活性的功能试验来证实多肽的再折叠。通过多肽的圆二色性(CD)分析(图8)和差示扫描荧光分析法(DSF)(图9)进行生物物理学/二级结构确认，并与可商购的多肽(Sigma Aldrich)比较。 [0075] 在另一个实施方式中，证实了正确的二硫键连的存在，并与可商购的CRM197多肽(Sigma Aldrich)比较(图10)。通过用多种蛋白酶酶切CRM197多肽和氨基酸序列的绘图也证实产生的多肽的氨基酸序列的正确性(图6)。通过Edman降解测序证实产生的多肽的N-端氨基酸序列(图7)。 [0076] 在优选的实施方式中，本发明提供了用于CRM197多肽的高水平表达的优化多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，及其具有等于或大于70％的相似性，优选85-99％的相似性的结构变体。 [0077] 在又一个优选的实施方式中，本发明提供了用于大肠杆菌细胞中的CRM197的多肽的高水平表达的优化多核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。 [0078] 在另一优选的实施方式中，本发明使用核酸SEQ ID NO.2及其变体在革兰氏阴性细菌细胞，优选大肠杆菌中提供白喉毒素或CRM197或其变体的高水平表达，包括以下步骤： [0079] a)选择编码多肽CRM197的基因SEQ ID NO.2或其变体， [0080] b)将基因SEQ ID NO.2亚克隆至表达载体中， [0081] c)用步骤b的表达载体转化宿主大肠杆菌细胞； [0082] d)在适于表达毒素蛋白质的培养基中培养转化的宿主细胞； [0083] e)通过在30至40℃范围内的温度下加入IPTG作为诱导剂来诱导融合蛋白的表达，[0084] f)从宿主细胞中提取不溶形式的细菌类毒素，以及 [0085] g)以大于0.5mg/l的产率纯化纯净形式的CRM197。 [0086] 使用层析法进行纯化。层析技术可以是亲和层析、凝胶过滤、高压液相色谱(HPLC)或离子交换色谱法或两种或更多种的组合。优选地，当将CRM197与标签融合蛋白关联时，亲和层析可用于将CRM197与其它蛋白质分离。 [0087] 在另一个优选的实施方式中，涉及柱条件的温度和pH的变化的简单步骤也有助于从关联的标签中洗脱CRM197。更具体地，在6.5-8.5范围内的pH和在4℃-30℃范围内的温度可用于从标签中分离CRM197。 [0088] 在另一个实施方式中，根据本发明制备的CRM197用于结合从伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌(Meningococcus)、肺炎链球菌和其它致病细菌分离的多糖分子。 [0089] 在另一个实施方式中，根据本发明制备的CRM197用作用于疫苗的复合载体，如对抗伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎球菌(Pneumococcus)、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌(Meningococcus)、肺炎链球菌和其它致病细菌的那些疫苗。 [0090] 参照以下实施例更具体地说明本发明。然而，应当理解，本发明不以任何方式受这些实施例限制，而是包括其在本文描述的的参数内的变化，如本领域技术人员所熟知的。 [0091] 实施例1 [0092] 步骤(i)：新型CRM197基因的合成： [0093] 根据大肠杆菌密码子使用优化全长CRM197基因。以下参数用于CRM197基因优化：密码子使用偏好性、GC含量、mRNA二级结构、自定义期望模式(Custom Desired Pattern)、自定义不期望模式、重复序列(直接重复、反向重复和二分体重复)、限制酶识别位点(缺失或插入)。 [0094] 使用BamH1和Sap1限制性位点在pUC57质粒载体的多克隆位点处克隆优化的CRM197基因(SEQ ID NO.2)，生成pUC57_CRM197。在大肠杆菌DH5α宿主中转化含有CRM197基因的载体，并在LB+卡那霉素r板上选择克隆体。通过由Age I(位于CRM197基因中)和Nde I(位于pUC57质粒中)的pUC57_CRM197质粒的限制性酶切，证实pUC57中的CRM197基因的存在和正确性。此外，通过PCR和DNA测序证实CRM197的序列。 [0095] 步骤(ii)：将CRM197插入表达载体pTWIN1中 [0096] 在LB+卡那霉素中在50ml体积中将携带pUC57_CRM197的大肠杆菌DH5α生长过夜。将细菌离心，并将团块用于质粒分离。使用制造商的说明，通过使用Qiagen质粒小量制备试剂盒进行质粒的分离。通过nono-drop量化分离的质粒。 [0097] 将CRM197(SEQ ID NO.2)从pUC57中切除，用限制性内切核酸酶BamHI和SapI酶切5μg质粒。在1％琼脂糖凝胶上运行酶切的质粒，并且通过使用制造商的说明，使用Qiagen凝胶萃取试剂盒纯化对应于CRM197基因(SEQ ID NO.2，～1.6kb)的条带。随后，还使用BamHI和SapI酶切5μg的表达质粒pTWIN1，以产生与CRM197基因相容的限制性位点。还用具有制造商的说明，使用Qiagen凝胶萃取试剂盒从凝胶中纯化酶切的pTWIN1。 [0098] 使用制造商的说明，使用基于T4连接酶的DNA连接试剂盒(Promega)，将酶切的CRM197基因连接在pTWIN1中。在T4 DNA连接酶和缓冲液的存在下在20μl的反应体积中，将载体(pTWIN1)和插入片段(CRM197)以1:3、1:4、1:5的比例混合。在16℃下将连接混合物温育过夜。第二天早晨，在BL21-DE3大肠杆菌表达宿主中加入/转化5μl的连接混合物。通过使用化学转化方案来转化BL21。在冰中将连接+BL21细胞温育30分钟。在温育后，在42℃下提供45秒的热休克。将样品在室温下冷却，并向其中加入500μl的SOC培养基。在37℃下以200rpm将具有转化体的管温育2小时。将来自其的100μl的混合物涂板在LB+氨苄青霉素板上用于转化体的筛选。 [0099] 第二天早晨，从Luria肉汤+氨苄青霉素板选择CRM197表达BL21-DE3转化体。在这些之中，选择生长在Luria肉汤+氨苄青霉素上的5个克隆体，在37度，200rpm下，在10ml的Luria肉汤+氨苄青霉素培养基中生长过夜。将培养物离心并使用Qiagen质粒萃取试剂盒从细胞团块中提取质粒。 [0100] 为了验证克隆的正确性，分别用AgeI和ApaI限制性内切核酸酶来酶切2μg的质粒。AgeI位点存在于CRM197中，且ApaI位于pTWIN1中。因此，使用两种酶的双重酶切用于确认正确的克隆。将克隆体命名为pTWIN1_CRM197(BL21-DE3)。此外，通过使用CRM197基因特异性引物的PCR和DNA测序确认克隆。通过在10ml的Luria肉汤+氨苄青霉素中生长细菌过夜，制备表达CRM197的BL21的甘油储液。第二天早晨，将40％灭菌的甘油加入到培养物中，并将1ml的等份分配到冷冻小瓶中。在-80度下保存小瓶以进一步用于表达分析。 [0101] 步骤(iii)：CRM197的表达的确认 [0102] 将保存在-80度下的BL21克隆体在Luria肉汤+氨苄青霉素板上划线。将板在37度下温育过夜。挑取单个菌落，并在150ml的烧瓶中接种于50ml的Luria肉汤+氨苄青霉素培养基中。在37度，200RPM下温育烧瓶直到OD600＝1。一旦OD达到期望点，抽取5ml培养物用作未诱导的培养物。将未诱导的培养物保存在冰上直到使用。为了诱导CRM197基因的表达，将0.5mM的IPTG加入至剩余的45ml培养物，并将烧瓶在30度和200rpm旋转下进一步温育另外的4小时。4小时后收获诱导的培养物，并通过SDS-PAGE(图1)和蛋白质印迹法(图2)检测CRM197的表达。 [0103] 对于SDS-PAGE分析，将1ml诱导的培养物和未诱导的培养物(二者都归一化为OD 600＝1)置于1.5ml的微量离心管(Eppendorf tube)中。将管离心并将团块重新悬浮于50μl的PBS中。在该悬浮液中，加入50μl的具有还原剂(2x)的SDS-PAGE加样缓冲液。将混合物在 100度下煮沸5分钟。 [0104] 将样品在室温下冷却，并将20μl的未诱导和诱导的培养物加载到4-12％的Tris甘氨酸凝胶中。在150伏下将凝胶运行1.5小时。取出凝胶并在考马斯亮蓝染料中温育1小时。染色后，将凝胶留在含40％的甲醇＝10％的乙酸的脱色溶液中3小时。将CRM197表达可视化为～58Kd的蛋白质，其仅在诱导的培养物中可见。对于蛋白质印迹法，以与SDS-PAGE相同的方式运行单独的凝胶组，并将凝胶印迹在PVDF(聚偏二氟乙烯膜)上。通过抗CRM197抗体将膜免疫印迹。在蛋白质印迹法中，CRM197显示为～58Kd处的单一的免疫反应性条带。在未诱导的培养物中没有观察到CRM197特异性条带。该实验证实，本研究中产生的克隆体可以表达rCRM197蛋白质。将这些克隆体进一步用于CRM197的大规模生产和纯化。 [0105] 步骤(iv)：来自BL21大肠杆菌的CRM197的发酵和纯化。 [0106] 将1ml小瓶的BL21大肠杆菌细胞接种到50ml的LB+Amp培养基中，并在37度，200rpm下生长过夜。在20L规模下进行发酵。将大肠杆菌细胞接种到发酵器中并在30摄氏度下培养。在OD600＝20下用0.5mM的IPTG诱导培养物。在诱导后12小时收获发酵培养物，并通过离心制备细胞团块。将细胞团块在匀浆器中机械裂解。通过离心细胞裂解物分离包涵体(其包含期望的蛋白质CRM197)。丢弃上清液，并保留含有包涵体(IB)的团块。通过将团块再悬浮于8M的尿素中将IB均质化，并通过离子交换色谱法纯化蛋白质。测量发酵水平下CRM197的定量。在SDS-PAGE上将全细胞裂解物与作为标准的已知量的BSA一起运行。通过密度测定分析定量在SDS-PAGE(图3)中显示为～58KD条带的CRM197的定量。BSA用作定量的参照。发现蛋白质的总量为1.4克CRM197/升BL21大肠杆菌细胞。 [0107] 在电泳凝胶运行(SDS PAGE 12％)中进行以上制备的CRM197的溶解测试，显示对CRM197的溶解进行的测试，泳道1：CRM197的尿素溶解的馏分；泳道2：上清液；泳道3：来自第一团块洗涤的样品；泳道4：合并自第二团块洗涤的样品(图4)。 [0108] 通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)测定样品中CRM197的存在，其中主洗脱峰显示样品中CRM197的存在(图5)。 [0109] 通过肽质量指纹(质谱法)测定以上制备的CRM197的一级氨基酸序列，并具有与参照CRM197序列100％的序列相似性(图6)。 [0110] A.通过LC-MS分析的BE rCRM的胃蛋白酶酶切。 [0111] B.胰蛋白酶、Glu-C和Asp-N酶切CRM197中的序列覆盖率(与SEQ ID NO.1相同，即显示100％的同源性) [0112] 通过埃德曼降解证实以上制备的rCRM197的N-末端序列。10个氨基酸序列GADDVVDSSK(N-末端乙酰基)显示纯化的多肽的起始部分。第一个氨基酸确定为G(图7)。 [0113] 以上制备的CRM197的CD光谱与参照CRM197重叠。结果表明以上制备的重组CRM197在结构上类似于参照CRM197(图9)。 [0114] 分析了通过上述方法制备的CRM197的二硫键的确认(图10)，并通过质谱法确认蛋白质中存在的两个二硫键，第一个连接氨基酸186至201，且第二个键连接氨基酸461至471。 [0115] 表I [0116]胱氨酸编号多肽序列 186 GQDAMYEYMAQACAGNR(SEQ ID NO.11) 201 SVGSSLSCINLDWDVIR(SEQ ID NO.12) 461 CR(SEQ ID NO.13) 471 AIDGDVTFCRPK(SEQ ID NO.14) [0117] 表II [0118]胰蛋白酶多肽链组合理论Mono m/z 观察的Mono m/z Cys 186-201 935.6706 935.6694 Cys 461-471 913.9558 913.9539 [0119] 通过CRM197特异性ELISA证实通过上述方法制备的CRM197与参照CRM197的抗原相似性。来自不同的来源的所有CRM都显示出与单克隆抗体相似的识别特征(图11)。

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