| 说明书全文 |
（関連出願）
本出願は、参照によって完全に本明細書に組み込まれている米国特許出願６０／４７０３９７の優先権を主張する。 （発明の分野）
本出願は、間葉細胞機能、例えば平滑筋および線維芽細胞増殖またはサイトカイン発現を調整するための化合物および方法、ならびに間葉細胞機能と関連する状態、例えば喘息と関連する気道過敏症を治療するための化合物および方法に関する。 本出願の化合物は、エストラトリエン誘導体の１クラス（class）である。
（発明の背景）
喘息は、様々な程度の気道閉塞、慢性炎症、気道壁リモデリング（ＡＷＲ）と呼ばれる気道壁構造の変化、および気道過敏症（ＡＨＲ）を特徴とする疾患である。 ＡＨＲは、通常メタコリンまたはヒスタミンまたは寒気もしくはブラジキニンなどの他の誘発性刺激による気道閉塞の人工誘導により測定される。 ＡＨＲは、気道の刺激誘発閉塞の濃度−反応曲線における左への移動、およびこれらの非特異的刺激に応じたプラトーの消失を特徴とする。
気道閉塞、例えば喘息または慢性閉塞性肺疾患で起こる気道閉塞は自然に消失するか、または剤による治療で消失する。 喘息を治療するために現在使用されている薬剤の３つの主なクラスは、予防薬（抗炎症薬）、緩和剤および症状制御剤である。 これらの薬剤はすべて、気道閉塞および／または炎症を低減させることを目的とする。 予防薬は、消炎作用によって気道閉塞の可能性および／または程度を小さくする。 緩和薬剤は平滑筋短縮の迅速な反転を起こし、したがって気管支痙攣気道閉塞を軽減する。 症状制御剤は、気道閉塞が緩和薬剤の使用を必要とするレベルに達する可能性を小さくする、持続的な気管支拡張反応を起こす。
各公知の治療法はかなりの副作用を有する。 上記治療法の組合せにより、すべてではないが多くの患者で喘息症状を制御することができる。 重度の喘息患者は喘息患者全体の１０％未満であるが、喘息の医療予算の７０％を超える割合を占めると考えられ、また喘息による入院および死亡の最も危険性の高い群である。 したがって、この疾患の症状を制御し予防する新しい治療法に対する明らかな必要がある。 現在利用できる薬剤の３つのクラスは、気道壁リモデリング（ＡＷＲ）の原因を特に標的にしているわけではない。 しかし、ＡＷＲは喘息治療のための可能な新しい標的として確認されている。 気道壁リモデリングがＡＨＲの発生の主要因子であるとの仮説を裏付ける、広範な証拠がある。 平滑筋、線維芽細胞および細胞外マトリックスが占められる気道容積の増加は、ＡＷＲにおける気道壁の肥厚に寄与すると考えられている。 この容積増加の少なくとも１つの原因は、気道平滑筋細胞による過増殖である。 そのような肥厚の結果、所与の量の平滑筋収縮に対する気道狭窄が増加する。 さらに、ＡＷＲは気道内の平滑筋細胞に対する負荷を減らし、収縮器官の所与の程度の活性化に対してより大きな平滑筋細胞の収縮を可能にする。 したがって、ＡＷＲの構造変化によりＡＨＲの非特異的性質を説明することができる。 リモデリングを予防または反転することができる抗喘息剤は、ＡＨＲを減らすことによって平滑筋収縮の結果として起こる気道閉塞の程度を減らす潜在能力を有すると言える。
本出願の目的は、平滑筋細胞または線維芽細胞の機能を調整することができる薬剤および方法を提供することであり、それによって平滑筋細胞または線維芽細胞機能と関連する状態、例えば喘息を治療するための可能性のある薬剤を提供することである。
（発明の概要）
本出願は、新規エストラトリエン誘導体およびそれらの合成方法および使用方法を対象とする。 新規エストラトリエン誘導体は平滑筋細胞および／または線維芽細胞機能、例えば細胞増殖、細胞外マトリックス沈着、サイトカイン発現および収縮を調整するのに用いることができ、平滑筋細胞および／または線維芽細胞に関連する状態で使用することができる。 これらの化合物は、平滑筋および／または線維芽細胞の増殖およびサイトカイン発現を調整する際に驚くべき選択性を示した。 一実施形態は式Ｉの化合物を提供し、
（式中、
Ｒ
１およびＲ ４は、それぞれＨ、Ｒ ａ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄ 、−ＣＮ、−ＮＯ ２ 、−ハロ、ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ ａからなる群から選択され；
Ｒ
２は、−ＯＲ ｂ 、−（Ｒ ｃ ） ｎ −ＡＲ ｂ 、−Ｈ、−Ｒ ｅ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｅ 、−ＣＨ＝ＮＯＨ、−ＣＨ＝ＮＯＲ ｂ 、−ＣＨ＝ＮＮＲ ｂ ２ 、−ＯＨ、−ＳＲ ｂ 、−Ｒ ｂ 、−ＣＮ、−Ｒ ｃ Ｒ ｄおよび−ハロからなる群から選択され、式中、ｎは、０または１であり；
Ｒ
３は、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ ＯＲ ｂ 、−Ｈ、−エステル−Ｒ ｂからなる群から選択され；
Ｒ
５は、メチルであり；
Ｒ
６は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ ｂまたは−ハロであり；
Ｚ'は、Ａまたは＞ＣＨ
２ 、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＲ ｂ 、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−ＯＨ、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−ＣＮ、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−ＮＲ ｂ ２ 、＞ＣＲ ｂ ２ 、＞Ｃ＝Ｎ−ＮＨ ２ 、＞Ｃ＝Ｎ−ＮＲ ｂ ２ 、−Ｏ−、＞Ｎ−Ｒ ｂ 、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−Ｒ ｃ −ＯＲ ｂ 、＞ＣＲ ｂ Ｒ ｅ 、＞ＣＲ ｂ −ＮＲ ｂ Ｒ ｅ 、＞Ｃ＝Ｎ−エステル−Ｒ ａであり；
Ｚ”は、Ａまたは＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ（Ｈ）ＯＨ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＲ
ｂ 、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−ＯＲ ｂ 、＞Ｃ（Ｒ ｂ ）−Ｒ ｃ −ＯＲ ｂ 、＞Ｃ（Ｈ）−ＮＲ ｂ ２ 、＞Ｃ（Ｈ）−ハロ、＞ＣＲ ｂ ２ 、＞Ｃ＝Ｎ−エステル−Ｒ ａであり；
Ａは、＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｘ、＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｒ
ｃ −Ｘ、＞Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−Ｒ ｃ −Ｘ、＞Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−Ｘ、＞Ｃ＝Ｎ−エステル−Ｘであり；
Ｘは、１つまたは複数の置換基Ｙによって置換された芳香族基であり、式中、Ｙは、−Ｈ、−ＮＯ
２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄから選択され；
Ｒ
ａは、直鎖、分岐鎖または環状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アラルケニルまたはアラルキニルであり；
Ｒ
ｂは、Ｈまたは直鎖、分岐鎖もしくは環状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アラルケニルもしくはアラルキニルであり；
Ｒ
ｃは、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１〜Ｃ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；
Ｒ
ｄは、−ＯＨ、−ＮＨ ２ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ ａ 、−ＳＲ ｂから選択される１つまたは複数の置換基を表し；
Ｒ
ｅは、アシルであり；
Ｎは０または１であり；
ただし、前記化合物は少なくとも１つの基Ａを含み、またＲ
１およびＲ ４がＨであり、Ｒ ２がＯＲ ａであり、Ｒ ３がＯＨであり、Ｒ ６が−Ｈであり、かつＺ”がＯＨまたはＮＨ ２であるときはＺ'におけるＡは、＞Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−ＳＯ ２ −Ｘではない）；
あるいは、その塩、水和物、プロドラッグ、異性体、互変異性体および／またはその誘導体を提供する。
一実施形態によると、Ｚ'およびＺ”の少なくとも１つはＡである。言い換えると、この実施形態によるとＡは位置６および１７の一方または両方に存在する。
他の実施形態によると、「置換基」Ｙの群はＨを含むが、芳香族基がフェニルであるとき、可能な置換基Ｙのクラスは適切にはＨを排除する。
一実施形態では、開示されている化合物は、線維芽細胞および／または平滑筋細胞の機能を調整する活性を有する。 前記化合物は、増殖を抑えることによって細胞機能を調整することができる。 他の実施形態において、前記化合物は細胞、細胞移動、細胞サイトカイン発現または細胞収縮による細胞外マトリックス沈着の１つまたは複数に影響を及ぼすことによって、細胞機能を調整することができる。
一実施形態では、前記化合物は気道過敏症、例えば喘息で発現する気道過敏症を抑えることができる。
他の実施形態では、前記化合物は線維症、例えば肺線維症または肺の炎症を抑える。
一実施形態によると、前記化合物は間葉細胞機能を調整する特異活性を有する。
本開示は、上で定義された式Ｉの化合物を合成する方法も提供し、前記方法は式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、
（式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ｂ 、Ｒ ｃ 、ｎ、Ｚ'およびＺ”は式Ｉで定義されたとおりである）
のケトンまたはアルデヒド前駆体を、式Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−ＸまたはＨ ２ Ｎ−エステル−Ｘ（式中、Ｘは式Ｉで定義されたとおりである）のアミンと反応させて、
式Ｉの化合物を形成するステップを含む。
本出願により、上で定義された式Ｉの化合物および薬剤として許容される担体を含む医薬組成物も提供される。
本出願により、上で定義された式Ｉの化合物の、平滑筋細胞および／または線維芽細胞の機能を調整するための薬剤としての使用も提供される。 一実施形態では、前記使用は抗増殖性剤または抗炎症剤としての使用である。 本出願は、気道過敏症抑制剤としての、または抗喘息剤としての式Ｉの化合物の使用も提供する。
他の実施形態では、本化合物は線維症、例えば肺線維症を抑制する薬剤として使用される。 さらなる実施形態において、式Ｉの化合物は肺の炎症を抑えるための薬剤として使用される。 一実施形態では、本化合物は間葉細胞機能を調整する特異活性を有する薬剤として使用される。 本出願により、平滑筋細胞および／または線維芽細胞機能と関連する状態の治療のための方法であって、それを必要とする対象に式Ｉの化合物の治療的有効量を投与することを含む方法が提供される。 ある具体的な実施形態において、前記状態は気道平滑筋細胞または肺線維芽細胞の機能と関係している。 この細胞機能は、細胞増殖、細胞サイトカイン発現、細胞による細胞外マトリックス沈着、細胞移動または細胞収縮から選択される。
本出願により、気道過敏症の治療における式Ｉの化合物の使用も提供される。 好ましい一実施形態において、本化合物は喘息の治療で使用される。
本出願により、肺線維症などの線維症の抑制における式Ｉの化合物の使用も提供される。
本出願により、肺炎症の抑制における式Ｉの化合物の使用も提供される。
本出願により、平滑筋細胞および／または線維芽細胞の機能と関連した状態の治療薬の製造における式Ｉの化合物の使用が提供される。
本出願で確立されている薬剤の活性としては、それには限定されないが、平滑筋の増殖、移動およびサイトカイン合成の抑制ならびに線維芽細胞増殖の抑制および炎症の抑制が含まれることは、当業者ならば理解しよう。 これらの活性を鑑みると、薬剤はアレルギー性および炎症性疾患、例えばリウマチ様関節炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性感染症および敗血症などの治療で活性を示すことが予想される。 線維芽細胞増殖が減少することは、薬剤が多様な型の肺線維症、瘢痕化および臓器の癒着／フィブロイドを含む線維症状態の治療において活性を有することも示唆される。 式Ｉの好ましい化合物は、以下の１つ以上が適用される化合物である。
ｉ． Ｙは、好ましくは−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、ＣＦ ３ −ＣＣｌ ３ 、テトラゾールおよびイミダゾールからなる群から選択される不活性化基であり、より好ましくは−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ −ＣＣｌ ３ 、テトラゾールまたはイミダゾールである；
ｉｉ． Ｘは、好ましくはフェニル、ナフチルまたはピリジル、最も好ましくはフェニルである；
ｉｉｉ． Ｘは好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換基Ｙを含み、最も好ましくはＸがフェニルであるとき、単一の置換基Ｙは４の位置にある；
ｉｖ． 存在する場合、Ａの基Ｒ ｃは好ましくはアルキレン、より好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキレン、最も好ましくは−ＣＨ ２ −または−ＣＨ ２ ＣＨ ２ −である；
ｖ． Ａは好ましくは＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｘ、＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−Ｒ ｃ −Ｘ、より好ましくは＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｘまたは＞Ｃ＝Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘである；
ｖｉ． Ｚ”がＡであるとき、Ｚ'は好ましくは＞ＣＨ ２ 、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＯＲ ｂである；
ｖｉｉ． Ｚ'がＡであるとき、Ｚ”は好ましくは＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ（Ｈ）ＯＨ、＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＯＲ ｂ 、より好ましくは＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ（Ｈ）ＯＨまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨである；
ｖｉｉｉ． Ｒ ２は、好ましくは−ＯＲ ｂ 、−ＡＲ ｂ 、−Ｒ、−Ｒ ｃ Ｒ、−ＣＨ＝ＮＯＨ、−ＣＨ＝ＮＯＲ ｂ 、−ＣＨ＝ＮＮＲ ｂ ２ 、−ＯＨ、−ＳＲ ｂ 、−Ｒ ｂまたは−ＣＮ、より好ましくは−ＯＲ ｂ 、最も好ましくは−ＯＭｅである；
ｉｘ． Ｒ ３は好ましくは−ＯＨ、−ＯＲ ａまたは−Ｒ ｃ ＯＲ ｂ 、最も好ましくは−ＯＨである；
ｘ． Ｒ １およびＲ ４はそれぞれ好ましくはＨである；
ｘｉ． Ｒ ６は好ましくはＨである。 好ましい特徴を有する上記の基のそれぞれは、互いに組み合わせることができる。 ある組合せ、例えば基ｉｖと基ｉおよび／または基ｉｉｉなどは特に好ましい。
本出願は、さらに以下の化合物を含む。
式（Ｖ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｚ”およびＸは式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基である）；
式（ＶＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｚ'およびＸは式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｅは直接結合またはアルキレン基である）；
式（ＶＩＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６およびＺ”は式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基であり；
Ｘ １は１つまたは複数の置換基Ｙ １によって置換アリール基から選択され、式中、Ｙ １は−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄおよび１つまたは複数の置換基Ｙで置換された複素環式芳香族基から選択され、式中、Ｙは、−Ｈ、−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄから選択される）；
式（ＶＩＩＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６およびＺ'は式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基であり；
Ｘ １は１つまたは複数の置換基Ｙ １によって置換アリール基から選択され、式中、Ｙ １は−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄおよび１つまたは複数の置換基Ｙで置換された複素環式芳香族基から選択され、式中、Ｙは、−Ｈ、−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄから選択される）；
式（ＩＸ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５およびＲ ６は式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基であり；
Ｘ １は１つまたは複数の置換基Ｙ １によって置換アリール基から選択され、式中、Ｙ １は−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄ 、および１つまたは複数の置換基Ｙで置換された複素環式芳香族基から選択され、式中、Ｙは、−Ｈ、−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄから選択され；
Ｚ”'は＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ（Ｈ）ＯＨまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨである）；
式（Ｘ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５およびＲ ６は式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基であり；
Ｘ １は１つまたは複数の置換基Ｙ １によって置換アリール基から選択され、式中、Ｙ １は−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄ 、および１つまたは複数の置換基Ｙで置換された複素環式芳香族基から選択され、式中、Ｙは、−Ｈ、−ＮＯ ２ 、−ＣＮ、−ＳＯ ３ Ｈ、−ＳＯ ３ Ｒ ａ 、−ＣＯ−Ｒ ｂ 、− ＋ ＮＲ ｂ ３ 、−ＣＯ ２ Ｒ ｂ 、−ハロ、−ＣＦ ３ 、−ＣＣｌ ３ 、テトラゾール、イミダゾール、−アリール、−置換アリール、−Ｒ ａ 、−ＮＨ ２ 、−ＮＲ ａ ２ 、−ＯＨ、−ＯＲ ａ 、−Ｒ ｃ −ＣＮ、−Ｒ ｃ −ハロ、−ＮＲ ｂ ＣＯＲ ｂ 、−Ｒ ｃ −ＮＲ ｂ ２ 、−Ｒ ｃ Ｒ ｄから選択され；
Ｚ ＩＶは＞ＣＨ ２ 、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｃ＝Ｎ−ＯＨである）；
式（ＸＩ）の化合物：
（式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｚ'、Ｚ”、Ｒ ｂおよびＸは式Ｉで定義されたとおりであり、
Ｒ ｆは直接結合またはアルキレン基である）。
本出願人は、上で定義された置換基Ａを含むエストラトリエン誘導体は、平滑筋および／または線維芽細胞の細胞機能、特に細胞増殖、細胞による細胞外マトリックス沈着、細胞移動およびサイトカイン発現を調整する活性を有することを発見した。 したがって、本出願は広義には上で定義された置換基Ａを含むすべてのエストラジオール誘導体を含むが、ただし、この化合物は２−エトキシ−６−トシルヒドラゾン−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオールではない。
（発明の詳細な説明）
本明細書において、単語「含む（comprising）」は「含む（including）がそれには限定されない」ことを意味し、また単語「含む（comprises）」は対応する意味を有することは明白に理解される。 開示化合物は、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥＯ）の誘導体の１クラスである。 ２ＭＥＯおよびこの化合物の他の誘導体ならびにそれらの癌治療活性は、これまで探求されてきた。
単独または「アラルキル」のような複合語で使用される用語「アルキル」は、炭素原子数が１から１０、好ましくは１から６、より好ましくは１から４の直鎖、分岐鎖または環状炭化水素基を指す。 メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルは、そのようなアルキル基の例となる。
単独または複合語で使用される用語「アルケニル」は、炭素原子数が２から２０、好ましくは２から１４、より好ましくは２から６の少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する線状、分岐、または単環式もしくは多環式の基を意味する。 アルケニル基の例としては、アリル、エテニル、プロペニル、ブテニル、イソブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、１−ノネニル、１，３−ブタジエニルなどがある。 用語「アルキニル」は、対応する意味を有する。 単独または複合語で使用される用語「アシル」は、カルバモイル、脂肪族アシル基、炭素原子数が１から２０、好ましくは１から１４の複素環アシルと称される複素環を含んでいる芳香族アシルまたはアシル基と称される芳香環を含んでいるアシル基を意味する。 アシルの例としては、カルバモイル；直鎖または分岐鎖のアルカノイル、例えばホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、２−メチルプロパノイル、オクタノイル；アルコキシカルボニル、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル；シクロアルキルカルボニル、例えばシクロヘキシルカルボニル；アルキルスルホニル、例えばメチルスルホニルまたはエチルスルホニル；アルコキシスルホニル、例えばメトキシスルホニルまたはエトキシスルホニル；アロイル、例えばベンゾイル、トルオイルまたはナフトイル；アラルカノイル、例えば、フェニルアルカノイル、例えばフェニルアセチルもしくはフェニルプロパノイル、またはナフチルアルカノイル、例えばナフチルブタノイル；アラルケノイル、例えばフェニルアルケノイル、例えばフェニルプロペノイルもしくはフェニルメタクリリルまたはナフチルアルケノイル、例えばナフチルプロペノイル；アラルコキシカルボニル、例えばフェニラコキシカルボニル、例えばベンジルオキシカルボニル；アリールオキシカルボニル、例えばフェノキシカルボニル；アリールオキシアルカノイル、例えばフェノキシプロピオニル、アリールカルバモイル、例えばフェニルカルバモイル；アリールチオカルバモイル、例えばフェニルチオカルバモイル、アリールグリオキシロイル、例えばフェニルグリオキシロイル；アリールスルホニル、例えばフェニルスルホニル；複素環カルボニル；複素環アルカノイル、例えばチエニルアセチル、チアジアゾリルアセチルまたはテトラゾリルアセチル；複素環アルケノイル、例えば複素環プロペノイル；あるいは複素環グリオキシロイル、例えばチアゾリルグリオキシロイルなどがある。 単独または複合語で使用される用語「複素環基」は、窒素、硫黄および酸素から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含んでいる単環式または多環式の複素環基を指す。 この用語の範囲内での広範なヘテロ環の少数例は、次のとおりである：ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ピラニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリルオキサジアゾリル、モルホリニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリジニル、ベンゾチアゾリルおよびベンゾチアジアゾリル。
好ましくは、複素環基は芳香族の５員環または６員環の複素単環基である。
「アラルキル」または「アリールアシル」などの単独または複合語で使用される用語「アリール」は、１つ、２つまたは３つの環を含む炭素環芳香系を意味し、そのような環は仮結合してもよく、または縮合してもよい。 用語「アリール」は、芳香族の基、例えばフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンおよびビフェニルを包含する。 好ましくはアリールはフェニルである。
用語「芳香族基」は、アリール基および芳香族の複素環（すなわち複素環式芳香族）基を指し、上で例示された特定のヘテロ環を含む。
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。
用語「アルコキシ」は、それぞれ好ましくは炭素原子数が１から約６のアルキル部を有する直鎖または分岐鎖のオキシ含有基を指す。 アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシがある。 用語「任意選択で置換された」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルデヒド、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリールオキシ、ベンジルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアリールオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロ複素環、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ベンジルアミノ、ジベンジルアミノ、アシル、アルケニルアシル、アルキニルアシル、アリールアシル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシロキシ、アルキルスルホニロキシ、アリールスルフェニロキシ、複素環、複素環オキシ、複素環アミノ、ハロ複素環、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、カルボアルコキシ、カルボアリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、ベンジルチオ、アシルチオ、リン含有基などの基から選択される１つまたは複数の基でさらに置換されても置換されていなくてもよい基を指す。
用語「エステル」は本明細書ではその最も広い意味で用いられ、炭素、硫黄またはリンと酸素との少なくとも１つの二重結合、および炭素、硫黄またはリン原子から他の酸素または硫黄原子への単結合を含んでいる二価の基を指す。 有機エステル基の例としては、スルホニラート、スルホン酸エステル、ホスホン酸エステル、ホスホンチオ酸エステル、カルボン酸エステルおよびチオール酸エステル（ＲＣＯＳ）がある。 さらに、他の官能基もエステル基に含むことができる。 これらの官能基としては、チオ、スルファニル、スルフィニル、スルホニル、スルホナチル、ホスフィニル、ホスホニル、ホスホリル、アミノまたはその混合物がある。 これらの官能基を含んでいるエステルの例としては、ホスホノチオ酸、チオリン酸、スルフィニルリン酸、スルファチルアミノ酸、スルホナチルホスフィン酸およびホスホロアミド酸に由来するエステルがある。 気道平滑筋細胞増殖と関連する状態としては、喘息および関連する状態、例えば気道壁リモデリングおよび気道過敏症、さらには喘息とは無関係で平滑筋細胞増殖を特徴とする状態、例えば慢性閉塞性肺疾患または新生物、腫瘍または癌に至る平滑筋細胞の異常増殖がある。
気道平滑筋細胞増殖の抑制は、平滑筋細胞分割周期の減速または停止を含む。 一実施形態では、増殖の抑制は、好ましくは平滑筋細胞死の増加および収縮のような他の正常平滑筋細胞機能の喪失を伴わない。
用語「選択性」は、本明細書では組織からの１つまたは複数の細胞型の行動に対して、その組織と関連する他の細胞型よりも大きく影響する化合物の能力を記載するのに用いられる。
例えば、気道平滑筋細胞または線維芽細胞の増殖の抑制の選択性とは、こうした細胞の細胞分割速度が、気道および他の組織と関連する他の細胞、例えば内皮細胞、肺胞細胞、上皮細胞、肥満細胞および乳房腫瘍上皮細胞などにおけるよりも大きな割合で減少することを意味する。 （合成方法）
選択された位置に基Ａを含んでいる開示化合物は、Ａの代わりにカルボキシ基を有する適当なエストラトリエンをベースにした前駆体を、適当なアミンと縮合反応で反応させることにより調製することができる。 以下において、発明者らは置換アリールアミン（Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−ＸまたはＨ ２ Ｎ−エステル−Ｘ）の標準合成方法を示し、その後エストラトリエン前駆体を多様化する様々な方法を記載する。
置換アリールアミン（Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−Ｒ ｃ −Ｘ、Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−ＸまたはＨ ２ Ｎ−エステル−Ｘ）
置換アリールヒドロキシルアミン（例えば、Ｈ ２ Ｎ−Ｏ−ＸおよびＨ ２ Ｎ−Ｏ−Ｒ ｃ −Ｘ）は、いくつかの方法によって容易に合成することができる。 好ましい合成方法は、アリール置換ヒドロキシルアミンの主要フタルイミド中間体を通したものである。 この場合、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドは置換アリールおよびアリールアルキルハロゲン化物に対する求核攻撃を通して作用する。 ［１］他の脱離基はいくつでもハロゲン化物の代わりに使うことができる。 以降のヒドラジン処理によるフタルイミド基の除去により、しばしばそのＨＣｌ塩として単離される置換アリールヒドロキシルアミンが得られる。
これらの中間体へ至る他の経路は、置換されたフェニルホウ酸とＮ−ヒドロキシフタルイミドとの銅媒介による結合を通したものである。 ［２］同じく、以降のヒドラジンによるフタルイミド基の除去により、所望のアリールオキシアミンが得られる。
置換アリールヒドロキシルアミンの他の合成方法は、脱プロトン化エチルアセトキシヒドロキサメートによる置換されたフルオロベンゼンに対する求核攻撃とその後の過塩素酸による加水分解である。 ［３］
これらの例はフェニル環の場合のためであるが、ナフチルおよびピリジルで置換されたヒドロキシルアミンのいくつかの製造方法も存在する。 ［４−６］
一旦これらの置換されたヒドロキシルアミンが合成されると、それらはベースのエストラ−１，３，５（１０）−トリエンステロイド構造に含まれるケトンおよびアルデヒドの両方との縮合反応で容易に使用して、置換アリールオキシムを形成することができる。
広範囲の置換アリールヒドラジンが市販されている（例えば、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン）。 広範囲の置換アリールスルホニルヒドラジン（Ｈ ２ Ｎ−ＮＨ−ＳＯ ２ −Ｘ）および置換アリールスルホニルヒドロキシルアミンも市販されている。 あるいは、置換アリールヒドラジンを生成する簡単な方法は、Malachowskiら［２８］が例示しているように確立された還元アミノ化化学の使用を含む。 置換アリールアルデヒドはヒドラジンで求核攻撃をすることができ、生成物を還元すると所望の置換アリールヒドラジンが得られる。 これらのヒドラジンと適当な前駆体化合物ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶとの反応からは、対応するヒドラジド、スルホン酸ヒドラジドまたはスルホニルオキシムが得られる。 これら３群の後者２つは、本出願のエステル含有化合物の例である。
エストラ−１，３，５−（１０）−トリエンの多様化による前駆体化合物ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの形成 発明者らは、ここでＡの代わりにカルボキシ基を含み、またＲ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ６ 、Ｚ'およびＺ”の位置で可能なことが示された置換基のいずれかを含む前駆体エストラトリエンを得るのに用いることができる様々な方法に目を向ける。
（Ａ）Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３およびＲ ４の位置での多様化 多くの市販のエストラ−１，３，５（１０）−トリエン化合物は、分子の芳香Ａ環上の置換が大きく変化したものを容易に得ることができる。 これらの市販の化合物の多くは、Ｚ”の位置に、置換アリールアミンと縮合させて式Ｉの化合物を形成することができるケトン官能性も有す。代わりにこれらの化合物は、置換アリールアミンとの縮合前に下で示す手法を使ってさらに多様化することができた。 例として、以下の化合物はSteraloids Inc.から市販されている。
（17-OH 化合物）
1-メチルエストラジオール
2,4-ジブロモエストラジオール
2,4-ジニトロエストラジオール
2-ブロモエストラジオール
2-エトキシエストラジオール
2-フルオロエストラジオール
2-ヒドロキシエストラジオール
2-ヒドロキシエストラジオール-3-メチルエーテル
2-ヨードエストラジオール
2-メトキシエストラジオール-3-メチルエーテル
2-ニトロエストラジオール
4-ブロモエストラジオール
4-フルオロエストラジオール
4-メトキシエストラジオール
4-メチルエストラジオールエストラジオール-3-アセテートエストラジオール-3-ベンゾエートエストラジオール-3-ベンジルエーテルエストラジオール-3-カルボキシメチルエーテルエストラジオール-3-プロピオネートエストラジオール-3-スルフェート （17-オン 化合物）
1-メチルエストロン
2-フルオロエストロン
2-ヒドロキシエストロン
2-ヒドロキシエストロン-3-メチルエーテル
2-メトキシエストロン-3-メチルエーテル
3-デスオキシエストロン
4-ヒドロキシエストロン
4-ニトロエストロンエストロン-3-アセテートエストロン-3-ベンゾエートエストロン-3-ベンジルエーテルエストロン-3-エチルエーテルエストロン-3-メチルエーテルエストロン-3-スルフェート （16-変化体）
16-ヒドロキシエストラジオール-3-メチルエーテル
16-ブロモエストロン
16-ブロモエストラジオール-3-メチルエーテル
16-ヒドロキシエストラジオール-3-アセテート
16-ブロモエストラジオール
16-ヒドロキシエストラジオール
2,16-ジヒドロキシエストラジオール
16-ヒドロキシ-2-メトキシエストラジオール
16-ヒドロキシ-4-メトキシエストラジオール
16-ヒドロキシエストラジオール-3-スルフェートである。 以下の化合物は、Research Plusから商業的に入手できる：
（17-OH 化合物）
16-ブロモエストラジオールエストラジオール-3-メチルエーテルエストラジオール-3-ホスフェート
2,4-ジメトキシエストラジオール
3,4-ジブロモ-2-メトキシエストラジオール（17-オン 化合物）
2,4-ジニトロエストロンエストロン-3-ホスフェートである。 適当なＲ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３およびＲ ４基を含んでいる市販の化合物を除いて、他は既存の方法によりベースのエストラ−１，３，５（１０）−トリエン構造を多様化して容易に合成することができる。 １位（Ｒ １ ）におけるこれらの異なる置換基の例としては、参考文献７〜１０で示されている方法で作ることができるアミン、ヒドロキシル、エーテルおよびアルキル鎖がある。 ２位（Ｒ ２ ）におけるこれらの異なる置換基のいくつかの例としては、参考文献１１〜１７で示されている方法で作ることができるニトロ基、ハロゲン原子、アミン、ヒドロキシル、チオール、エーテル、アルキル鎖およびアルキレンがある。
３位（Ｒ ３ ）における置換のいくつかの例としては、ヒドロキシル、エーテルおよびエステル、例えばアルキルリン酸エステルおよびスルファミン酸エステルがあり、これらは参考文献１４および１８〜２２で示されている方法で作ることができる。
４位（Ｒ ４ ）における置換のさらなる例としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル、エーテル、アルキル基、アルケン、シアノおよびニトロの基があり、これらは参考文献１７および２３〜２６で示されている方法で作ることができる。 （（Ｂ）Ｚ'の多様化）
６位のベンジル酸化は、クロムベースの様々なオキシダント、最も好ましくは酸性媒体の三酸化クロムの使用によって実施することができる。 ２位における電子求引性置換基の場合（例えば：Ｒ ２ ＝シアン基）、この種の酸化反応は２位の置換基の取り込みの前に実施する必要がある。 Ｒ ２位の置換を可能にするには、この場合好ましくはアセタールまたはアセタール誘導体としてＺ'、および恐らくＺ”のケトンの保護が必要かもしれない。一旦ケトン官能性がＺ'の適当な位置にあるならば、いかなる置換アミンもこの部分と縮合させることができるが、代わりに、適当な水素化物試薬による還元で６−ヒドロキシ誘導体が得られる。オキシムが取り込まれたならばこの還元によりアミンがもたらされ、アミン自体は還元アミノ化によってさらにアルキル化される。これらの反応のすべては、当技術分野で広く探求されている［３４］。上述の各種反応は、下記のスキーム４で図示されている。
（（Ｃ）Ｚ”の多様化）
６位および／または１７位に既にケトン官能性が存在し、芳香Ａ環（Ｒ １ 〜Ｒ ４ ）上に様々な置換を有する多くのエストラ−１、３、５（１０）−トリエンステロイド化合物が市販されている。 これらは、適当な置換アリールヒドロキシルアミンとの縮合によるアリールオキシムの形成のために、直ちに用いるのに適当である。 多くの市販のエストラ−１，３，５（１０）−トリエンステロイド化合物も１７−ヒドロキシル官能性が存在し、Ｚ”位置のさらなる多様化のために必要に応じて容易にケトンに変換することができる。この種の酸化反応のために多くの方法が存在する。［１４、２７］。重要な因子は、分子上の芳香環または他の場所に置換基として存在しているかもしれない他の潜在的に酸化可能な基の酸化を阻止するための適当な保護基（例えば、アセチル、メトキシル、ベンジル）の使用である。
ヒドロキシル基がＺ”で必要な場合でも、同じく水素化物試薬によるケトンからの単純な還元によりこの官能性が与えられる。同様に、オキシムの還元アミノ化または還元は、この位置でのアミン官能性の取り込みを可能にする。さらに、このアミンのアルキル化も還元アミノ化を通して可能である。
Ｚ'がケトン、オキシムまたはアリールオキシムでありＺ”もケトン、オキシムまたはアリールオキシムである場合は、Ｚ”はベンジル位のＺ'の酸化より前に、適当なオキシムまたはアリールオキシムに先ず変換しなければならない。 この状況は、２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムの合成で例示される。
（Ｄ）２位（Ｒ ２ ）の多様化によりＡを導入する。
２−ホルミルエストラジオールは、PertおよびRidley［２３］の方法と、その後のベンジルヒドロキシルアミンおよび４−ニトロベンジルヒドロキシルアミンとの縮合によるそれぞれ２−ベンジルオキシイミノメチルエストラジオールおよび２−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノメチルエストラジオールの生成によって調製することができる。 他の化合物を生じる変異については、アルデヒドはケトンに変換することができ、または、アルデヒドは炭化水素鎖（−Ｒ ｃ −）に沿ってさらに移動したＲ ２に位置することができる。 （置換アリールアミンと式ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物との縮合）
必要な置換アリールアミン（それは、ヒドラジンでよい）および式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの前駆体が一旦合成されたかまたは得られたならば、これらは実施例で示した当技術分野で公知の手法で縮合させて式Ｉの標的化合物を生成する。
式ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物と置換アミンとの縮合反応は置換アリールアミン誘導体との反応に限定されるものではなく、上で定義された他の多くの「エステル」を形成することができる。 その多くの変種が市販されている置換アリールスルホニルヒドラジンによる反応は置換アリールスルホン酸ヒドラジドを提供し、同様に、置換アリールスルホニルヒドロキシルアミンは対応する置換アリールスルホニルオキシムを提供する。 これらの反応は、アリール基がフェニルである場合について、下で図式的に示されている。 下で示す１つ（または複数）の置換基を有するフェニル基は、基Ｘ、すなわち置換された異なるアリールで置換することができた。
同じく、１７位にケトン基を有する前駆体化合物との縮合反応は置換アリールヒドロキシルアミン誘導体との反応に限定されるものではなく、上で定義された他の多くの「エステル」を形成することができる。 その多くの変種が市販されている置換アリールスルホニルヒドラジンによる反応は置換アリールスルホン酸ヒドラジドを提供し、同様に、置換アリールスルホニルヒドロキシルアミンは対応する置換アリールスルホニルオキシムを提供する。
式Ｉの化合物の塩は好ましくは薬剤として許容されるものであるが、薬剤として許容されない塩も、それらが薬剤として許容される塩の調製の中間体として有用なことから、本出願の範囲内にあることは理解されよう。 薬剤として許容される塩の例としては、薬剤として許容されるカチオン、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムの塩；薬剤として許容される無機酸、例えば塩酸、オルトリン酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸および臭化水素酸の酸付加塩；または、薬剤として許容される有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トリハロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸の塩がある。 さらに、本出願の化合物の一部は、水または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成することができる。 そのような溶媒和物は、本出願の範囲に含まれる。
「薬剤として許容される誘導体」は、対象へ投与すると式Ｉの化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を（直接または間接的に）提供することのできるいかなる薬剤として許容される塩、水和物または他のいかなる化合物も意味する。
用語「プロドラッグ」は本明細書では最も広い意味で用いられ、in vivoで式Ｉの化合物、例えば有機酸エステルまたはエーテルに変換される化合物を含む。
用語「互変異性体」は本明細書では最も広い意味で用いられ、２つの異性体形態の間で平衡状態で存在することができる式Ｉの化合物を含む。 そのような化合物は、２つの原子または基を接続している結合において、およびこれらの原子または基の化合物内の位置において異なる。
用語「異性体」は本明細書では最も広い意味で用いられ、構造異性体、幾何異性体およびステレオ異性体を含む。 式Ｉの化合物は１つまたは複数のキラル中心を有することができるので、鏡像異性的形態で存在することができる。 式Ｉで示されている波線は、その置換基がαまたはβの位置にあるか、またはこれらの異性体混合物であることを示す。
本出願の組成物は、式Ｉの少なくとも１つの化合物を、１つまたは複数の薬剤として許容される担体および任意選択に他の治療薬と共に含む。 各担体、希釈液、アジュバントおよび／または賦形剤は、組成物の他の成分と適合しかつ対象に有害ではないという意味において、薬剤として「許容される」ものでなければならない。 組成物としては、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所（口内、気道および舌下を含む）投与、膣投与または非経口（皮下、筋肉内、経静脈および皮内を含む）投与に適当なものがある。 便宜上、組成物は単位用量剤形で提供されてもよく、薬学の分野で公知の方法によって調製することができる。 そのような方法は、有効成分を１つまたは複数の副次的な成分を構成する担体と組み合わせるステップを含む。 一般に、組成物は、有効成分を液状の担体、希釈液、アジュバントおよび／または賦形剤、あるいは微粉固体担体または両方と一様にかつ密接に混ぜ合わせ、必要に応じて生成物を成型することによって調製される。 本明細書で用いる用語「対象」は、薬学的に活性な剤による治療を必要とする疾患または状態を有すいかなる動物を指す。 対象は哺乳類、好ましくはヒト、または家畜もしくは伴侶動物でもよい。 本出願化合物はヒトの治療のために用いるのに適当であることが特に企図されているが、獣医科治療にも適用することができ、例えばイヌおよびネコなどの伴侶動物、ならびにウマ、ポニー、ロバ、ラバ、ラマ、アルパカ、ブタ、ウシおよびヒツジなどの家畜、または動物園の動物、例えば霊長目動物、ネコ科の動物、カニド、ウシ科動物および有蹄類の治療にも適用される。 気道平滑筋細胞増殖を支配しているメカニズムは主に哺乳類全般で保存されていることは理解されることから、本出願化合物は様々な生物種において気道平滑筋細胞増殖の増加と関連する状態の治療に対する広い適用を企図するものである。
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、本出願の化合物の、所望の治療反応を生じるための、例えば喘息などの気道平滑筋細胞過増殖と関連する状態を予防または治療するために有効な量を意味する。
特定の「治療的有効量」は、治療されている特定の状態、対象の身体的条件、治療されている対象の種類、治療期間、併用療法（もしあれば）の性格、ならびに使用される特定の製剤および化合物またはその誘導体の構造などの因子によって明らかに異なる。
本出願の化合物は、作用のある組合せを提供するためにさらに他の医薬品と組み合わせることができる。 その組合せが式ＩまたはＩＩの化合物の活性を奪わない限り、薬学的に活性のある薬剤のいかなる化学的適合性のある組合せを含むものとする。 本出願の化合物および他の医薬品は別々に、逐次的に、または同時に投与することができることは理解されよう。 他の医薬品としては、例えばその状態が喘息である場合は抗炎症薬、予防薬、緩和剤および症状制御剤の現行の処方計画の１つまたは複数がある。
医薬組成物の調製のための方法および医薬用担体は、Remingtonの論文、Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, Williams & Wilkins, Pennsylvania, USAなどの教科書で述べられているように当技術分野で公知である。
本明細書で使用される「医薬用担体」とは、式Ｉの化合物を対象に送達するための薬剤として許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルである。 担体は液体でも固体でもよく、意図する投与方法で選択される。 各担体は、組成物の他の成分と適合しかつ対象に有害ではないという意味において、薬剤として「許容される」ものでなければならない。
式Ｉの化合物は、経口的に、局所的にまたは非経口に、従来の非毒性の薬剤として許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含んでいる投薬単位製剤で投与することができる。 本明細書で使用される用語、非経口には、皮下注射、肺または鼻腔への投与のためのエアゾール、静脈内、筋肉内、クモ膜下、頭蓋内の注射または注入手法がある。
本出願は、本出願の新規治療方法で使用するための、適当な局所、経口および非経口投与用の医薬製剤も提供する。 本出願の化合物は、錠剤、水性もしくは油性の懸濁液、ロゼンジ、トローチ剤、散剤、顆粒剤、乳剤、カプセル、シロップまたはエリキシルとして経口投与することができる。 経口用の組成物は、薬剤として洗練されかつ口に合う製剤を生産するために、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤の群から選択される１つまたは複数の剤を含むことができる。 適当な甘味料としては、ショ糖、乳糖、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンがある。 適当な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天がある。 適当な着香剤としては、ハッカ油、ウィンターグリーン油、チェリー、オレンジまたはラスベリーの香料がある。 適当な保存料としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムがある。 適当な潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクがある。 適当な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンがある。 錠剤は、錠剤の製造に適当な非毒性の薬剤として許容される賦形剤と混合された有効成分を含む。 これらの賦形剤は、例えば（１）不活性希釈液、例えば炭酸カルシウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；（２）顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸；（３）結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア；および（４）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでよい。 これらの錠剤はコーティングしなくてもよいし、または胃腸管における崩壊および吸収を遅らせるために公知の手法でコーティングして、より長時間持続する作用を提供することができる。 例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような時間遅延物質を使用することができる。 コーティングを米国特許第４２５６１０８号、４１６０４５２号および４２６５８７４号で記載されている手法を用いて行い、放出制御のための浸透圧性治療錠剤を形成することもできる。
式Ｉの化合物ならびにこの方法で有用な薬学的活性剤は、in vivo適用のために注射または段階的な灌流により、独立にまたは一緒に非経口投与することができた。 投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、腔内、経皮または例えば浸透圧ポンプによる注入により行うことができる。 in vitro試験のために、薬剤は生物学上許容できる適当な緩衝液に加えるかまたは溶かすことができ、また細胞または組織に加えることができる。 非経口投与のための製剤としては、無菌水溶液または非水性溶液、懸濁液および乳剤がある。
通常、用語「治療する」および「治療」などは、本明細書では所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るために対象、組織または細胞に影響を及ぼすことを意味する。 効果は、疾患または徴候またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点から予防的であり、かつ／または疾患の部分的または完全な治癒の観点から治療的である。 本明細書で用いる「治療する」は、脊椎動物、哺乳類、特にヒトの疾患のいかなる治療または予防を包含し、（ａ）その疾患の素因を有するかもしれないがまだ罹患の診断をされていない対象でその疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻止すること、すなわちその発生を止めること、または（ｃ）疾患の影響を軽減または改善すること、すなわち疾患の影響の退行を引き起こすことを含む。 組成物には、疾患を改善するために有用な様々な医薬組成物が含まれる。 本出願の一実施形態に従う医薬組成物は、式Ｉの化合物、その類似体、誘導体または塩、あるいは式Ｉの化合物と１つまたは複数の薬学的活性剤との組合せを、担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用いて対象への投与に適当な剤形へ製剤化することにより調製される。 頻繁に使用される担体または補助剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動植物油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば滅菌水、アルコール類、グリセリンおよび多価アルコールなどがある。 保存剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスがある。 他の薬剤として許容される担体としては、例えば本明細書で参照により組み込まれているRemingtonの論文、Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams and Wilkins (2000)、およびThe British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)で記載されているように、水溶液、非毒性の賦形剤、例えば塩、保存料、緩衝液、その他がある。 医薬組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野の通常の技術に従って調節される。 GoodmanおよびGilmanの論文、The Pharmacological Basis for Therapeutics (7 th ed., 1985)およびRemingtonの論文、Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Williams and Wilkins (2000)を参照。
医薬組成物は、好ましくは用量単位で調製され、かつ投与される。 固体の用量単位は、錠剤、カプセルおよび坐薬とすることができる。 １日用量の投与は、個々の用量単位またはより小さないくつかの用量単位の形で単回投与することにより、また小分けされた用量を特定の間隔で複数回投与することにより実施することができる。
これらの医薬組成物は、治療有効量で局所にまたは全身に投与することができる。 この使用のために有効な量は、疾患の重症度ならびに対象の体重および一般状態によって決まる。 一般的に、in vitroで使用される投薬量は、医薬組成物のin situ投与のための有効量の有用な指針を提供し、細胞傷害性副作用の治療のための有効量を決定するためには動物モデルを用いることができる。 様々な検討が、例えばLangerの論文、Science, 249: 1527, (1990)で記載されている。 式Ｉの化合物の好ましい投薬量レベルは、体重１キログラム当たり約０．１ｍｇから約１５０ｍｇ位、より好ましくは体重１キログラム当たり５０から１００ｍｇ位であり、特に好ましい１日投薬量は体重１キログラム当たり約５０ｍｇである。 担体物質と組み合わせて単一の投薬量を調製するための有効成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式によって異なる。 例えば、ヒトへの経口投与を目的とする製剤は、約５ｍｇから１ｇの活性化合物を、全組成物の約５パーセントから９５パーセントの間の適当で都合のよい量の担体物質と共に含むことができる。 用量単位剤形は、通常約５ｍｇから５００ｍｇの有効成分を含む。
経口用の製剤は、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合された硬質ゼラチンカプセルの剤形でもよい。 それらは、有効成分が水性または油性のビヒクル、例えば落花生油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセルの剤形でもよい。
水性懸濁液は、通常、水性懸濁液の製造のために適当な賦形剤と混合された形で活性物質を含む。 そのような賦形剤としては以下のものがある。 （１）懸濁化剤、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム；（２）分散剤または湿潤剤、例えば（ａ）レシチンのような天然のホスファチド；（ｂ）アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン；（ｃ）エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール；（ｄ）エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、（ｅ）エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートである。
式Ｉの化合物は、リポソーム送達系、例えば小単膜リポソーム、大単膜リポソームおよび多重膜リポソームの形でも投与することができる。 リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。
本発明を、以下の限定しない実施例のみを参照してこれから詳細に説明する。
（式Ｉの候補化合物の調製）
（実施例１）
（２−メトキシ−６−（４'−ニトロベンジル）オキシイミノエストラジオール（「４ＮＯ」）の合成） （実施例１ａ）
２−メトキシエストラジオール（１）を、無水酢酸のピリジン溶液で処理することにより９５％の収率でジアセチル化した。 二保護された種のベンジル位酸化を、三酸化クロムの酢酸／水混合液を用いて４５％の収率で行った。 新たに形成されたケト化合物（３）を炭酸カリウムのメタノール水溶液で処理することにより両方のアセテートを９８％の収率で除去した。 次いで、このケトンの縮合をＯ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミンのメタノール溶液を用いて行い、２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール（５）を９９％の収率で得た。
（実施例１ｂ）
（３，１７−ビス−アセチルオキシ−２−メトキシエストラ−１，３，５（１０）トリエン（２））
２−メトキシエストラジオール（１２７．５ｍｇ、０．４２６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、無水ピリジン（６．０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。 無水酢酸（３．０ｍＬ）を滴下して加え、反応物を室温に温めた。 一晩攪拌後、反応混合物を０℃に冷却し、その時点で１Ｍ塩酸水溶液５０．０ｍＬを加え、反応物を室温に温めた。 抽出を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で行い、続いて合わせた有機抽出物を３Ｍ塩酸水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでろ過し、溶媒を真空で蒸発させて白色固体（１５４ｍｇ）を得た。 生成物は、ＴＬＣで分析した際、均一であり、したがって、精製は必要ないとみなされたが、分析用サンプルは、１：５の酢酸エチル／石油スピリットを溶離液として用いて、シリカゲルカラムで精製した。
Rf 0.88[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット (1:1), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ6.86(s, 1H), 6.71(s, 1H), 4.67(t, J=8.3Hz, 1H), 3.78(s, 3H), 2.77-2.74(m, 2H), 2.28(s, 3H), 2.04(s, 3H), 2.26-1.23(m, 13H), 0.81(s, 3H) （実施例１ｃ）
（３，１７−ビス−アセチルオキシ−２−メトキシ−６−オキソエストラ−１，３，５（１０）トリエン（３））
三酸化クロム（７９．８ｍｇ、０．７９８ｍｍｏｌ）を、９０分間かけて、攪拌しながら９０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液２．０ｍＬに溶解した。 この酸化混合物を、１０℃で、攪拌している３，１７−ビス−アセチルオキシ−２−メトキシエストラ−１，３，５（１０）トリエン（２）（７２．５ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。 混合物を１０℃で３０分間攪拌し、その時点で反応物を氷／水混合物（３０ｍＬ）に注ぎ、それを酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。 合わせた抽出物を水（２０ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。 有機溶媒を蒸発させて、黄色固体残渣を得た。 この残渣を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィにより、１：３の酢酸エチル／石油スピリット混合物を溶離液として用いて精製し、白色固体を得た（３４ｍｇ、４５％）。
Rf 0.36[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット (1:3), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.73(s, 1H), 6.92(s, 1H), 4.71(t, J=8.5Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 2.69(dd, J=16.9, 3.4Hz, 1H), 2.53 (dt, J=16.9, 3.4Hz, 1H), 2.31(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.40-1.34(m, 13H), 0.83(s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ): δ195.81, 171.10, 168.92, 155.40, 146.95, 138.42, 126.06, 121.79, 108.36, 82.09, 55.97, 49.74, 43.49, 43.26, 42.63, 39.57, 36.38, 27.36, 25.35, 22.92, 21.12, 20.52, 11.84 （実施例１ｄ）
（２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオール（４））
無水炭酸カリウム（２０ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、攪拌している３，１７−ビス−アセチルオキシ−２−メトキシ−６−オキソエストラ−１，３，５（１０）トリエン（３）（７）（３４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を含む８．０ｍＬのメタノール溶液に加えた。 水（３．０ｍＬ）を加え、反応物を室温で１６時間攪拌した。 次いで、反応物のｐＨを、１Ｍ塩酸水溶液を滴下して加えて、ｐＨ４に調整した。 抽出を酢酸エチル（３×１０ｍｌ）で行い、次いで、合わせた有機層を水（１０ｍＬ）およびブライン溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。 溶媒を真空で蒸発させて乳白色固体を得て、これをシリカゲル（３：２の酢酸エチル：石油スピリット）フラッシュクロマトグラフィにより精製して、標的化合物２６．４ｍｇ（９８％）を白色結晶性固体として得た。
mp 189-190℃ (dec); Rf 0.34[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット (3:2), シリカゲル]; 1 H NMR (CD 3 OD): δ7.36(s, 1H), 6.91(s, 1H), 3.92(s, 3H), 3.66(t, J=8.5Hz, 1H), 2.52(dd, J=16.8, 3.5Hz, 1H), 2.43-1.26(m, 12H), 0.76(s, 3H). （実施例１ｅ）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール（「４ＮＯ」）（５））
攪拌している２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオール（４）（１７６．０ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）のメタノール（２５．０ｍｌ）溶液に、窒素雰囲気下で４−ニトロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（２６６ｍｇ、１．５７４ｍｍｏｌ）を加えた。 この溶液に、４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、１．０３３ｇ）を加え、反応混合物を加熱還流した。 １７時間後、反応物を室温に冷却し、溶媒を真空で除去した。 粗生成物を無水テトラヒドロフランに溶解し、ＰＳ−イソシアネート（１．２５ｍｍｏｌ／ｇ装填、２．５２２ｇ）樹脂で、１５．５時間処理した。 セライトパッドを通して混合物をろ過し、さらにテトラヒドロフラン（４×５０ｍＬ）で溶離させることにより、淡黄色溶液を得て、これを真空で蒸発させ、無定形固体を得た（２５７ｍｇ、９９％）。
Rf 0.60[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット(2:1), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.21(d, 8.8Hz,2H), 7.53(d, 8.8Hz,2H), 7.46(s, 1H), 6.78(s, 1H), 5.49(s, 1H), 5.27(s, 2H), 3.90(s, 3H), 3.75(t, J=8.6Hz, 1H) 3.14(dd, J=18.1, 4.4Hz, 1H), 2.19-1.22(m, 12H), 0.77(s, 3H); ESIMS [M+H] + m/z = 467; HRESI-MS: [M+H] + 467.2185 (467.2182 計算値) （実施例２）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（「４ＮＯＭ」）（１０）の合成）
（実施例２ａ）
２−メトキシエストロンを、メタノール中で還流させながら過剰のヒドロキシルアミンと縮合させ、２−メトキシエストロン−１７−オキシム（６）を単独の幾何異性体として得た。 精製することなく、この化合物を無水酢酸のピリジン溶液で処理し、３，１７−ジアセチル化オキシム誘導体（７）を２段階工程で９０％の収率で得た。 三酸化クロムの酢酸／水混合液を用いたアセチル保護種のベンジル位縮合により、６−オキソ誘導体を得て、これを直ちに脱保護して２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム（９）をこの２段階工程で７１％の収率で得た。 ４−ニトロベンジルヒドロキシルアミンのメタノール溶液を用いたケトンの処理により、２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（１０）を３３％の収率で得た。
（実施例２ｂ）
（２−メトキシエストロン−１７−オキシム（６））
２−メトキシエストロン（１．６９８ｇ、５．６５１ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１６０．０ｍｌ）懸濁液に、窒素雰囲気下で、ヒドロキシルアミン塩酸塩（１．１１０ｇ、１５．９７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３５℃に微温で温めることにより完全に溶解させた。 ４−ポリビニルピリジン（８．００ｇ、２５％架橋）を加え、反応物を還流させた。 １４．５時間後、反応物を室温に冷却し、溶媒を真空で除去した。 残渣を無水テトラヒドロフラン（６０．０ｍｌ）に懸濁させ、焼結ガラス漏斗でろ過した。 樹脂をさらにテトラヒドロフラン（４０．０ｍｌ、５０．０ｍｌ）で洗浄し、ろ液を真空で蒸発させて、粗生成物を白色泡状物質として得た（１．９４２ｇ）。
Rf 0.28[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット (1:2), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ6.79(s, 1H), 6.65(s, 1H), 5.50(s, 1H), 3.86(s, 3H), 2.90-2.70(m, 2H), 2.60-1.32(m, 13H), 0.96(s, 3H); ESIMS [M+H] + m/z = 316 （実施例２ｃ）
（３−アセチルオキシ−２−メトキシエストラ−１，３，５（１０）トリエン−１７−オンアセチルオキシム（７））
粗２−メトキシエストロン−１７−オキシム（６）（１．９３７ｇ）を、窒素雰囲気下で、ピリジン（１２．０ｍＬ、１４８．８ｍｍｏｌ）に溶解した。 無水酢酸（６．０ｍＬ、６３．６ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら滴下して加えた。 室温で１６時間、攪拌を続け、この時点で反応物を１Ｍ塩化アンモニウム水溶液（５０．０ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を注意深く加えることにより失活させた。 次いで、反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ、次いで２×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を１Ｍ塩化アンモニウム溶液（３×５０ｍＬ）、１Ｍ塩酸水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空で蒸発させ、次いで高真空で乾燥させて灰白色固体（２．０９９ｇ）を得た。 ２段階で９０％の収率を示した。
Rf 0.38[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット(1:2), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ6.89(s, 1H), 6.75(s, 1H), 3.81(s, 3H), 2.84-2.72(m, 2H), 2.60-1.32(m, 13H), 2.31(s, 3H), 2.16(s, 3H) 1.02(s, 3H) （実施例２ｄ）
（３−アセチルオキシ−２−メトキシ−６−オキソエストラ−１，３，５（１０）トリエン−１７−オンアセチルオキシム（８））
三酸化クロム（２．２６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を、６０分間かけて振とうしながら、９０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液５０．０ｍＬに溶解した。 この酸化混合物を、攪拌している３−アセチルオキシ−２−メトキシエストラ−１，３，５（１０）トリエン−１７−オンアセチルオキシム（７）（２．０９９ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、５〜８℃で滴下して加えた。 この混合物を５〜８℃で４２分間攪拌し、この時点で反応物を水（１５０ｍＬ）を加えることにより失活させた。 次いで、反応混合物を酢酸エチル（２×１５０ｍＬ、次いで１００ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出物を飽和炭酸ナトリウム水溶液（３×１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。 次いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、セライトパッドを通してろ過し、これをさらに酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄した。 溶媒を蒸発させて、淡黄色固体を得た。 生成物は、ＴＬＣで解析した際、均一であり、したがって、精製は必要ないとみなされたが、分析用サンプルは、１：１の酢酸エチル／石油スピリットを溶離液として用いて、シリカゲルカラムで精製した。
Rf 0.28[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット(1:1), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.77(s, 1H), 6.95(s, 1H), 3.93(s, 3H), 2.69(dd, J=16.9, 3.4Hz, 1H), 2.53 (dt, J=16.9, 3.4Hz, 1H), 2.31(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.40-1.34(m, 13H), 1.05(s, 3H); ESIMS [M+H] + m/z = 414 （実施例２ｅ）
（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム（９））
無水炭酸カリウム（１２．５６ｇ、９０．８７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、攪拌している粗３−アセチルオキシ−２−メトキシ−６−オキソエストラ−１，３，５（１０）トリエン−１７−オンアセチルオキシム（８）のメタノール（１５０ｍＬ）溶液に加えた。 １３．５時間後、水（５．０ｍＬ）を加え、反応物を４０℃で１２時間攪拌した。 次いで、反応混合物を水（１５０ｍＬ）で希釈し、溶液のｐＨを１Ｍ塩酸水溶液を滴下して加えることによりｐＨ７に調整した。 抽出を酢酸エチル（３×ｌ５０ｍＬ）で行い、次いで、合わせた層を水（１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。 真空で溶媒を蒸発させて乳白色固体を得て、これをシリカゲル（２：１の酢酸エチル：石油スピリット）のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、灰白色固体１．２３３ｇ（２段階で７１％）を得た。
Rf 0.46[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット(2:1), シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.61(s, 1H), 6.85(s, 1H), 5.57(s, 1H), 3.97(s, 3H), 2.77(dd, J=16.6, 3.4Hz, 1H), 2.61-1.41(m, 12H), 0.97(s, 3H); ESIMS [M+H] + m/z = 330 （実施例２ｆ）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（「４ＮＯＭ」）（１０））
攪拌している２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム（９）（２２．８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１０．０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で、４−ニトロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（４２．５ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（１８５．０ｍｇ、２５％架橋）を加えた。 反応物を室温で２４時間攪拌し、この時点で溶媒を真空で蒸発させた。 淡黄色残渣を無水テトラヒドロフラン（１５．０ｍＬ）に懸濁させ、過剰の求核試薬をＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（１７７．０ｍｇ）を用い、室温で２４時間かけて捕捉した。 固相抽出カートリッジ（Supelco LC-CN）で固体をろ過し、さらにテトラヒドロフラン（４×５．０ｍＬ）で洗浄し、次いで窒素気流下で溶媒を除去することにより、淡黄色油状物を得て、これをさらにシリカゲル（２：１の酢酸エチル：石油スピリット）のフラッシュクロマトグラフィで精製して、必須生成物１１．２ｍｇ（３３％）を淡黄色固体として得た。
Rf 0.33[酢酸エチル-ペテロリウムスピリット(3:2), シリカゲル]; ESIMS [M+H] + m/z = 480
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.21(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.48 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.55 (br s, 1H), 5.27 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 18.1, 4.4 Hz, 1H), 2.65-1.21 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.63, 154.16, 148.08, 147.41, 146.09, 143.97, 135.09, 128.34, 123.58, 123.27, 109.89, 106.83, 74.67, 55.87, 53.20, 43.97, 41.84, 36.50, 33.56, 29.43, 25.55, 25.07, 22.91, 17.01; ESI-MS (20v) m/z 480(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 480.2125 (480.2135 計算値); （実施例３）
（２−ベンジルオキシイミノメチルエストラジオールおよび２−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノメチルエストラジオールの合成）
２−ホルミルエストラジオールを、PertおよびRidleyの論文［２３］による方法により調製し、次いで、ベンジルヒドロキシルアミンおよび４−ニトロベンジルヒドロキシルアミンと縮合して、それぞれ２−ベンジルオキシイミノメチルエストラジオール（Ｙ＝Ｈ、１２ａ）および２−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノメチルエストラジオール（Ｙ＝ＮＯ ２ 、１２ｂ）を得た。
２つの２−ホルミルエストラジオール（７．２ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）を含む５ｍＬの無水ＴＨＦ溶液を、窒素雰囲気下で攪拌し、Ｏ−アリールヒドロキシルアミン（それらの塩酸塩として）を以下に示すようにそれぞれに加えた。
各ヒドロキシルアミンを加えて、多量の２５％架橋のポリ（４−ビニルピリジン）（２００〜２２０ｍｇ）を各反応管に加え、各管を加熱還流し、１６時間攪拌した。 反応物を室温に冷却し、ＰＳ−ベンズアルデヒド捕捉樹脂（３２〜４２ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ／ｇ装填）を各管に加えた。 反応物を２時間攪拌し、その時点ですべての残渣をポリエチレンフリットを通してろ過することにより除去した。 残渣をＴＨＦ（３×５ｍＬ）で洗浄し、残留溶媒を窒素気流下で除去した。
得られた生成物を、薄層クロマトグラフィ（ＳｉＯ２、１：１ 酢酸エチル：石油スピリット）、２２分間かけてグラジエント溶離７０％ＣＨ ３ ＣＮ／Ｈ ２ Ｏ〜９８％ＣＨ ３ ＣＮ／Ｈ ２ Ｏする高性能液体クロマトグラフィ（Phenomenex C18 column spherex 5、（２５０×４．６ｍｍ））、およびエレクトロスプレー質量分析により解析した。 結果を下記表に示す。
（実施例４）
（６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３６）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例４ａ）
（Ｎ−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（試薬Ａ）（５９２．３ｍｇ、３．６３１ｍｍｏｌ）の２５ｍＬ無水テトラヒドロフラン溶液に、窒素雰囲気下で、臭化３，５−ジフルオロベンジル（試薬Ｂ）（５１６．７μＬ、３．９９４ｍｍｏｌ）を加えた。 次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（試薬Ｃ）（１．３６７ｍＬ、７．９８８ｍｍｏｌ）を攪拌しながら滴下して加えたところ、即時に色の変化が生じた。 次いで、反応物を加熱還流し、２０時間この温度を保持し、外界温度に冷却し、濃白色沈殿を形成させた。 次いで、反応混合物を水２５ｍＬで希釈し、その後酢酸エチル５×２５ｍＬで抽出した。 合わせた有機画分を水（２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。 真空で蒸発させ、生成物（Ｄ）９３６．１ｍｇ（８９％）を白色固体として得た。
Rf 0.375[ジクロロメタン, シリカゲル]; 1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.86 - 7.75 (m, 4H), 7.11 - 7.09 (m, 2H), 6.85 - 6.79 (m, 1H), 5.17 (s, 2H). ESI-MS (40V) m/z 312(100) [M+Na] + , 601(34) [2M+Na] + （実施例４ｂ）
（Ｏ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
Ｎ−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）フタルイミド（Ｄ）（１４３．０ｍｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）を氷酢酸５ｍＬに溶解し、塩酸３７％（１．００ｍＬ、３１．８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら滴下して加えた。 反応物を加熱還流して、その温度を３時間保持し、外界温度に冷却した。 反応混合物を窒素気流下で蒸発させ、その後０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に懸濁させた。 混合物のｐＨを、さらに６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を滴下して加えてｐＨ８＜１０に調整した。 抽出を酢酸エチル３×１５ｍＬで行った。 合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて淡黄色油状物を得て、これをエタノール（１ｍＬ）に溶解し、その後１Ｍ塩化水素のジエチルエーテル（３ｍＬ）溶液を滴下して加えることにより、直ぐ白色沈殿が生じた。 さらにジエチルエーテル（２５ｍＬ）を加え、遠心分離し、デカンテーションし、さらにジエチルエーテル（２５ｍＬ）により洗浄し、さらに遠心分離し、デカンテーションし、その後空気乾燥して白色固体（Ｅ）を得た（７８．６ｍｇ、８２％）。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.92 (br s, 3H), 7.24 (tt, J = 9.6, 2.4Hz, 1H), 7.17 - 7.09 (m, 2H), 4.96 (s, 2H); ESI-MS (20V) m/z 160(100) [M+H] + , 143(43) [M+H-NH 2 ] + （実施例４ｃ）
（６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３６）の調製）
２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム（Ｆ）（１５．０ｍｇ、０．０４５５ｍｏｌ）、Ｏ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）（１１．６ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（Ｇ）（２５％架橋、２００ｍｇ）を窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、外界温度で攪拌しながら、メタノール（１０ｍＬ）で溶媒和させた。 反応を外界温度で６４時間進行させ、その時点で反応混合物を真空で蒸発させた。 得られた残渣を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に再懸濁させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（Ｈ）（４６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）で処理した。 懸濁液をＬＣ−Ｃ１８固相抽出カートリッジでろ過し、さらにＴＨＦ３×５ｍＬで洗浄した。 蒸発、次いで、シリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（１：１）］のフラッシュクロマトグラフィにより白色無定形固体（２０．２ｍｇ、９４％）を得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.50 (s, 1H), 6.89 - 6.82 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.76 - 6.64 (m, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H, 2.62 - 1.20 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 471(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 471.2086 (471.2095 計算値) （実施例５）
（６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−３５）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１５．１ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）の量で用い、試薬ＥとしてＯ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を１２．１ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを２１０ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４３．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 生成物である、２−メトキシ−６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノエストラジオールを８８％の収率で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.49 (s, 1H), 6.89 - 6.87 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.74 - 6.68 (m, 1H), 5.50 (br s, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.62 - 1.22 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ164.04 (dd, J = 248.0, 13.0 Hz), 155.41, 149.02, 144.93 (t, J = 9.9 Hz), 136.51, 124.55, 111.32 (dd, J = 18.7, 6.5 Hz), 110.95, 107.92, 107.90, 103.86 (t, J = 25.2 Hz), 82.69, 75.71, 56.90, 51.53, 44.09, 42.88, 38.30, 37.26, 31.63, 30.61, 26.76, 24.14, 12.00; ESI-MS (20v) m/z 458(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 458.2131 (458.2143 計算値) （実施例６）
（６−（３−メトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６６）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例６ａ）
Ｎ−（３−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドの調製 以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化３−メトキシベンジルを４８６．１μＬ（３．４７ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを５１４．８ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）の量で用い、試薬Ｃ １．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）を用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出は、酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（３−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドを、９５％の収率で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.84 - 7.70 (m, 4H), 7.26 (m, 1H), 7.10 - 7.06 (m, 2H), 6.89 (dd, J = 8.3, 2.8 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.80 (s, 3H) （実施例６ｂ）
（Ｏ−（３−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（３−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドを２１１．５ｍｇ（０．７９１ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物Ｅである、Ｏ−（３−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を９２％の収率で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.15 (br s, 3H), 7.32 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.97 - 6.92 (m, 3H), 4.88 (s, 2H), 3.76 (s, 3H) （実施例６ｃ）
（６−（３−メトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６６）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして、２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１３．０ｍｇ（０．０４０ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例６ｂからの試薬Ｅを９．７ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１０３．９ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−メトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを収率４５％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.55 (s, 1H), 7.26 (m, 1H), 7.15 (br s, 1H), 7.01 - 6.97 (m, 2H), 6.84 (dd, J = 8.1, 2.6 Hz, 1H) 6.77 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.20 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.63 - 1.24 (m, 12H), 0.76 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 465(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 465.2385 (465.2389 計算値) （実施例７）
（６−（３−メトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−６２）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１１．２ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例６ｂからの試薬Ｅを８．７ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１２０．２ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−メトキシベンジルオキシ）イミノエストラジオールを収率７０％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.54 (s, 1H), 7.26 (m, 1H), 6.97 (m, 2H), 6.84 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz, 1H) 6.77 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.73 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H), 2.33 - 1.15 (m, 12H), 0.76 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ159.59, 153.86, 147.88, 143.88, 139.94, 135.37, 129.32, 123.76, 120.41, 113.60, 113.22, 109.99, 106.84, 81.64, 76.06, 55.82, 55.21, 50.50, 43.02, 41.83, 37.27, 36.22, 30.57, 29.58, 25.71, 23.08, 10.94; ESI-MS (20v) m/z 452(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 452.2432 (452.2437 計算値) （実施例８）
（６−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６７）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例８ａ）
（Ｎ−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化３−トリフルオロメトキシベンジルを５４６．０μＬ（３．３７ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを４９９．１ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）の量で用い、１．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出には酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドを収率９４％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.82 - 7.71 (m, 4H), 7.47 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.42 - 7.38 (m, 2H), 7.22 - 7.20 (m, 1H), 5.19 (s, 2H). （実施例８ｂ）
（Ｏ−（３−トリフルオロメトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドを２０２．８ｍｇ（０．６３１ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物（Ｅ）Ｏ−（３−トリフルオロメトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を収率９０％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ9.79 (br s, 3H), 7.54 (dd, J=8.6, 7.9 Hz 1H), 7.43 - 7.36 (m, 3H), 4.90 (s, 2H) （実施例８ｃ）
（６−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６７）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム）を１４．１ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例８ｂからの試薬Ｅを１３．６ｍｇ（０．０５６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１２４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを収率３４％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.52 (s, 1H), 7.40 - 7.26 (m, 3H), 7.14 (d, 7.9 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.50 (br s, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.20 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.67 - 1.24 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.93, 153.79, 149.25, 147.91, 143.91, 140.79, 135.01, 129.65, 123.51, 120.46 (q, J = 257.1 Hz), 120.34, 119.97, 109.88, 106.74, 75.14, 55.83, 53.17, 43.94, 41.83, 36.48, 33.57, 29.42, 25.58, 25.02, 22.85, 17.00; ESI-MS (20v) m/z 519(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 519.2102 (519.2107 計算値) （実施例９）
（６−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−６３）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１１．０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例８ｂからの試薬Ｅを１１．０ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１４１．３ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノエストラジオールを収率２５％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.49 (s, 1H), 7.37-7.23 (m, 3H), 7.12 - 7.11 (m, 1H), 6.76 (s, 1H), 5.43 (br s, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.72 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.12 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H, 2.32 - 1.17 (m, 12H), 0.75 (s, 3H); ESI-MS (60v) m/z 506(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 506.2155 (506.2154 計算値) （実施例１０）
（６−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６８）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例１０ａ）
（Ｎ−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化４−トリフルオロメトキシベンジルを４９０．９μＬ（３．０７ｍｍｏｌ）の量で用い、試薬Ａを４５５．０ｍｇ（２．７９ｍｍｏｌ）の量で用い、１．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出は、酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドを収率９１％で得た。
[δ 1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.82 7.70 (m, 4H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H) （実施例１０ｂ）
（Ｏ−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）フタルイミドを２２３．３ｍｇ（０．６９５ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物ＥのＯ−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を９３％の収率で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.78 (br s, 3H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.01 (s, 2H) （実施例１０ｃ）
（６−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６８）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１４．２ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１０ｂからの試薬Ｅを１３．７ｍｇ（０．０５６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１３３．４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを収率８５％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.94 (br s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 5.57 (br s, 1H), 5.18 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.18 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.63 - 1.23 (m, 12H), 0.93 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.71, 153.57, 148.67, 147.89, 143.91, 137.05, 134.95, 129.58 123.55, 120.80, 120.44 (q, J = 257.2 Hz), 109.87, 106.75, 75.17, 55.83, 53.17, 43.95, 41.79, 36.45, 33.53, 29.40, 25.52, 25.05, 22.89, 16.98; ESI-MS (20v) m/z 519(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 519.2101 (519.2107 計算値) （実施例１１）
（６−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−６４）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１１．４ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１０ｂからの試薬Ｅを１１．４ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１３３．１ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−トリフルオロメトキシベンジルオキシ）イミノエストラジオールを収率２９％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.52 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.47 (br s, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.74 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.12 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.34 - 1.17 (m, 12H), 0.76 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 506(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 506.2149 (506.2154 計算値) （実施例１２）
（６−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６９）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例１２ａ）
（Ｎ−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化４−トリフルオロメチルチオベンジルを７４７．８ｍｇ（２．７７ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを４７５．５ｍｇ（２．９１ｍｍｏｌ）の量で用い、１．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出は、酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）フタルイミドを９５％の収率で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.86 - 7.73 (m, 4H), 7.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.25 (s, 2H). （実施例１２ｂ）
（Ｏ−（４−トリフルオロメチルチオベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）フタルイミドを２０３．１ｍｇ（０．６０２ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物ＥのＯ−（４−トリフルオロメチルチオベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩を、収率８４％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.36 (br s, 3H), 7.76 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.99 (s, 2H) （実施例１２ｃ）
（６−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６９）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１５．５ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１２ｂからの試薬Ｅを１５．９ｍｇ（０．０６１ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１１６．９ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率６８％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.90 (br s, 1H) 7.64 (d, J = 8.1 Hz, 2H) 7.52 (s, 1H), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.55 (br s, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.21 (dd, J = 17.9, 4.6 Hz, 1H), 2.64 - 1.39 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.70, 153.76, 147.94, 143.93, 141.63, 136.30, 135.00, 129.57 (q, J = 308 Hz), 128.84, 123.46, 109.90, 106.77, 75.15, 53.17, 43.97, 41.80, 36.45, 33.54, 29.42, 25.52, 25.08, 22.90, 16.99; ESI-MS (20v) m/z 535(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 535.1873 (535.1878 計算値) （実施例１３）
（６−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−６５）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１１．２ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１２ｂからの試薬Ｅを１１．９ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１３３．８ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−トリフルオロメチルチオベンジルオキシ）イミノエストラジオールを、収率８７％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.63 (d, J = 8.2 Hz, 2H) 7.51 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.16 (dd, J = 18.1, 4.6 Hz, 1H), 2.34 - 1.18 (m, 12H), 0.77 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 522(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 522.1922 (522.1926 計算値) （実施例１４）
（６−（４−ピリジルメチルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−１５）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例１４ａ）
（Ｎ−（４−ピリジルメチルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして（４−ブロモメチル）ピリジン臭化水素酸塩を２．０４８ｇ（８．０９８ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを１．２０１ｇ（７．３６２ｍｍｏｌ）の量で用い、３．６６５ｍＬ（２２．０８ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を、外界温度で１３６時間、テトラヒドロフラン５０．０ｍＬ中で行った。 抽出には酢酸エチル３×５０ｍＬを用いた。 合わせた抽出物を、水（５０ｍＬ）、５０％飽和食塩水（１００ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。 生成物ＤのＮ−（４−ピリジルメチルオキシ）フタルイミドをトルエンから再結晶化し、収率３４％を得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.66 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 7.85 - 7.74 (m, 4H), 7.48 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 5.24 (s, 2H) （実施例１４ｂ）
（Ｏ−（４−ピリジルメチル）ヒドロキシルアミン二塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−ピリジルメチルオキシ）フタルイミドを１０３．３ｍｇ（０．６０２ｍｍｏｌ）で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら２．５時間行った。 生成物Ｏ−（４−ピリジルメチル）ヒドロキシルアミン二塩酸塩（Ｅ）を、収率５０％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD): δ8.90 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 5.26 (s, 2H) （実施例１４ｃ）
（６−（４−ピリジルメチルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−１５）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１６．５ｍｇ（０．０５０ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１４ｂからの試薬Ｅを１２．８ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１７２．４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３７．１ｍｇの量で用いた。 反応を９０時間行った。 精製をシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（３：１）］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 生成物２−メトキシ−６−（４−ピリジルメチルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率４６％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.13 (br s, 1H), 8.54 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.14 (dd, J = 17.6, 4.5 Hz, 1H), 2.56 - 1.20 (m, 12H), 0.83 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 + DMSO-d 6 ) δ154.85, 149.67, 149.29, 149.12, 144.98, 134.98, 122.38, 110.53, 110.49, 108.64, 80.29, 73.56, 55.78, 50.17, 43.02, 41.75, 37.51, 36.45, 30.26, 29.52, 25.68, 23.08, 11.48; ESI-MS (20v) m/z 436(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 436.2225 (436.2236 計算値) （実施例１５）
（６−（４−ピリジルメチルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−１６）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１３．７ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１４ｂからの試薬Ｅを１１．１ｍｇ（０．０５６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１４０．２ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３２．５ｍｇの量で用いた。 反応を９０時間行った。 精製を、シリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（３：１）］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 生成物２−メトキシ−６−（４−ピリジルメチルオキシ）イミノエストラジオールを、収率５２％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.58 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.47 (s, 2H), 7.33 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (t, J = 8.4 Hz), 3.16 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.37 - 1.20 (m, 12H), 0.78 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 423(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 423.2271 (423.2283 計算値) （実施例１６）
（６−（４−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３８）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例１６ａ）
（Ｎ−（４−シアノベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化４−シアノベンジルを７７３．４ｍｇ（３．９５ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを５８５．０ｍｇ（３．５９ｍｍｏｌ）の量で用い、１．３５ｍＬ（７．８９ｍｍｏｌ）の試薬Ｃで用いた。 反応を還流しながら２０時間行った。 抽出にはジクロロメタン３×５０ｍＬを用いた。 合わせた抽出物を、水（５０ｍＬ）、ブライン５０ｍＬで洗浄した。 生成物ＤのＮ−（４−シアノベンジルオキシ）フタルイミドを、収率７３％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ7.89 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.85(m, 4H), 7.73 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.27 (s, 2H) （実施例１６ｂ）
（Ｏ−（４−シアノベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−シアノベンジルオキシ）フタルイミドを１４３．１ｍｇ（０．５１４ｍｍｏｌ）で用いた。 反応を還流しながら３時間行った。 生成物Ｏ−（４−シアノベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を収率７０％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ7.89 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.02 (s, 2H). （実施例１６ｃ）
（６−（４−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３８）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１４．０ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１６ｂからの試薬Ｅを１０．２ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを２００ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４８．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 生成物２−メトキシ−６−（４−シアノベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを収率７４％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.64 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.48 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.55 (br s, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.20 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H), 2.60-1.25 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 460(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 460.2235 (460.2236 計算値) （実施例１７）
（６−（４−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−３７）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１１．７ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１６ｂからの試薬Ｅを８．９ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを２００ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４９ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 生成物２−メトキシ−６−（４−シアノベンジルオキシ）イミノエストラジオールを収率７７％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.73 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H), 2.18-1.22 (m, 12H), 0.77 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ154.41, 147.95, 144.14, 143.82, 135.46, 132.15, 128.24, 123.36, 118.92, 111.26, 109.78, 106.80, 81.58, 74.87, 55.82, 50.43, 43.00, 41.77, 37.20, 36.16, 30.52, 29.52, 25.67, 23.07, 10.94; ESI-MS (60v) m/z 447(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 447.2275 (447.2284計算値) （実施例１８）
（６−（３−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−５１）の調製）
これは、実施例４で詳述したものに対応する段階の２つの中間体を介して調製した。 （実施例１８ａ）
（Ｎ−（３−シアノベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化３−シアノベンジルを７７３．４ｍｇ（３．９５ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを５８５．０ｍｇ（３．５９ｍｍｏｌ）の量で用い、１．３５ｍＬ（７．８９ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら２０時間行った。 抽出には、ジクロロメタン３×５０ｍＬを用いた。 合わせた抽出物を水（５０ｍＬ）、ブライン５０ｍＬで洗浄した。 生成物ＤのＮ−（３−シアノベンジルオキシ）フタルイミドを、収率７３％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.85 - 7.75 (m, 6H), 7.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.1, 7.8 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H). （実施例１８ｂ）
（Ｏ−（３−シアノベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（３−シアノベンジルオキシ）フタルイミドを１４３．１ｍｇ（０．５１４ｍｍｏｌ）で用いた。 反応を還流しながら３時間行った。 生成物Ｏ−（３−シアノベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を、収率７０％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ10.75 (br s, 3H), 7.88 - 7.85 (m, 2H), 7.75 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 7.9, 7.8 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H). （実施例１８ｃ）（ＣＰ−ＤＭ−４−５１）
（６−（３−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシムの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１４．０ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１８ｂからの試薬Ｅを１０．２ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを２００ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４８．０ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 精製をシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（２：３）］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 生成物２−メトキシ−６−（３−シアノベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率７４％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.78 (br, s1H), 7.68 (s, 1H), 7.62 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 - 7.44 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.55 (br s, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 17.9, 4.4 Hz, 1H), 2.65-1.25 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ171.19, 154.00, 148.02, 143.94, 140.11, 135.02, 132.26, 131.38, 131.27, 129.10, 123.32, 118.89, 112.44, 109.85, 106.77, 74.73, 55.85, 53.19, 44.07, 41.77, 36.45, 33.51, 29.40, 25.54, 25.27, 22.88, 16.97; ESI-MS (20v) m/z 460(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 460.2231 (460.2236 計算値) （実施例１９）
（６−（３−シアノベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−５２）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを、１１．７ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例１８ｂからの試薬Ｅを８．９ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを２００ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４９ｍｇの量で用いた。 反応を６４時間行った。 生成物２−メトキシ−６−（３−シアノベンジルオキシ）イミノエストラジオールを、収率７７％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.67 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.53 - 7.43 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 5.54 (br s, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.74 (t, J = 8.5 Hz, 1H) 3.12 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.34-1.22 (m, 12H), 0.77 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ154.43, 147.95, 143.82, 140.23, 135.48, 132.20, 131.31, 131.22, 129.07, 123.39, 118.89, 112.41, 109.80, 106.83, 81.59, 74.64, 55.82, 50.43, 43.00, 41.76, 37.20, 36.17, 30.53, 29.53, 25.67, 23.07, 10.93; ESI-MS (20v) m/z 447(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 447.2283 (447.2284 計算値) （実施例２０）
（６−（４−メチルベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７６）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２０ａ）
（Ｎ−（４−メチルベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４に概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化４−メチルベンジルを５９０．３μＬ（２．９０ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを５９０．３ｍｇ（３．１９ｍｍｏｌ）の量で用い、１．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出には、酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（４−メチルベンジルオキシ）フタルイミドを、収率９０％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.82 - 7.72 (m, 4H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.17 (s, 2H), 2.35 (s, 3H) （実施例２０ｂ）
（Ｏ−（４−メチルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−メチルベンジルオキシ）フタルイミドを２１４．８ｍｇ（０．８５５ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物Ｏ−（４−メチルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を、収率２１％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ9.77 (br s, 3H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.81 (s, 2H), 2.30 (s, 3H) （実施例２０ｃ）
（６−（４−メチルベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７６）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを８．８ｍｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２０ｂからの試薬Ｅを６．０ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１０７．１ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを４０．３ｍｇの量で用いた。 反応を９０時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−メチルベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率４３％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.56 (s, 1H), 7.32 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 5.50 (br s, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 18.1, 4.4 Hz, 1H), 2.63-1.24 (m, 12H), 2.35 (s, 3H), 0.92 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 449(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 449.2435 (449.2440 計算値) （実施例２１）
（６−（４−メチルベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−７８）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを６．２ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２０ｂからの試薬Ｅを４．４ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１２０．４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを２２．３ｍｇの量で用いた。 反応を９０時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジに通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−メチルベンジルオキシ）イミノエストラジオールを、収率２５％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.54 (s, 1H), 7.31 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 5.45 (br s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.10 (dd, J = 18.1, 4.6 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.33-1.17 (m, 12H), 0.75 (s, 3H);
ESI-MS (20v) m/z 436(100) [M+H] + （実施例２２）
（６−（４−イソプロピルベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７７）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２２ａ）
（Ｎ−（４−イソプロピルベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４に概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化４−イソプロピルベンジルを５６３．０μＬ（２．９９ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを４８８．５ｍｇ（３．２９ｍｍｏｌ）の量で用い、１．２０ｍＬ（７．０１ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を還流しながら１５時間行った。 抽出には、酢酸エチル１×１５ｍＬおよびジクロロメタン２×２５ｍＬを用いた。 生成物ＤのＮ−（４−イソプロピルベンジルオキシ）フタルイミドを、収率９８％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.86 - 7.71 (m, 4H), 7.47 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 5.18 (s, 2H), 2.91 (septet, J = 6.9 Hz, 1H), 1.24 (s, 3H), 1.23 (s, 3H) （実施例２２ｂ）
（Ｏ−（４−イソプロピルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（４−イソプロピルベンジルオキシ）フタルイミドを２０８．６ｍｇ（０．７４７ｍｍｏｌ）で用い、氷酢酸を１０ｍＬの量で用い、塩酸３７％を２．００ｍＬ（６３．６ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を還流しながら４．５時間行った。 生成物Ｏ−（４−イソプロピルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を、収率２４％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ7.33 - 7.20 (m, 4H), 4.80 (s, 2H), 2.89 (septet, J = 7.0 Hz, 1H), 1.20 (s, 3H), 1.18 (s, 3H). （実施例２２ｃ）
（６−（４−イソプロピルベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７７）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを６．３ｍｇ（０．０１９ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２２ｂからの試薬Ｅを４．１ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１０６．４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５．１ｍｇの量で用いた。 反応を９０時間行った。 ろ過はＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（４−イソプロピルベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率２１％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.57 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 5.47 (br s, 1H), 5.16 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.19 (dd, J = 17.9, 4.6 Hz, 1H), 2.91 (septet, J = 7.0 Hz, 1H) 2.63-1.20 (m, 12H), 1.44 (s, 3H), 1.43 (s, 3H), 0.92 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 477(100) [M+H] + （実施例２３）
（６−（３−ニトロベンジルオキシ）イミノ−２−メトキシエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０５）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２３ａ）
（Ｎ−（３−ニトロベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（試薬Ａ）（１．０５９ｇ、６．４１８ｍｍｏｌ）の２５ｍＬ無水テトラヒドロフラン溶液に、窒素雰囲気下で、臭化３−ニトロベンジル（試薬Ｂ）（１．５４３ｍＬ、７．１４１ｍｍｏｌ）を加えた。 次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（試薬Ｃ）（２．１５５ｍＬ、１２．９８ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら滴下して加えたところ、即時に色の変化が生じた。 次いで、反応物を、外界温度に１９時間保持した。 次いで、反応混合物をテトラヒドロフラン２５ｍＬおよび水１００ｍＬで希釈し、その後、酢酸エチル３×１００ｍＬで抽出した。 合わせた有機画分を、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 精製は、シリカゲル［ジクロロメタン］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 真空で蒸発させて、生成物（Ｄ）８７７．６ｍｇ（４５％）を白色固体として得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.39 (dd, J = 1.9, 1.9 Hz, 1H), 8.25 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.0, 7.9 Hz, 1H), 7.84 - 7.75 (m, 4H), 5.30 (s, 2H) （実施例２３ｂ）
（Ｏ−（３−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
Ｎ−（３−ニトロベンジルオキシ）フタルイミド（実施例２３ｂからのＤ）（１６６．２ｍｇ、０．５５７ｍｍｏｌ）を、エタノール１５ｍＬに加え、ある量のジクロロメタン（７．５ｍＬ）を加えた。 ヒドラジン水和物（試薬１）（２９．８μＬ、０．６１３ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら窒素雰囲気下で、反応物に加えた。 反応物を加熱還流し、１８時間この温度を保持し、その後外界温度に冷却した。 反応物を真空で蒸発させ、エタノール５ｍＬに懸濁させ、懸濁液を外界温度で２時間攪拌し、その後固体をろ過により除いた。 残渣を、さらにエタノール３ｍＬで洗浄した。 ろ液および洗液を合わせて、蒸発させ、シリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（２：３）］のフラッシュクロマトグラフィにより精製を行った。 得られた油状物をエタノール（２ｍＬ）に溶解し、次いで塩化水素（ジエチルエーテル中１Ｍ）およびジエチルエーテル２０ｍＬを加えることにより、白色沈殿を得た。 さらにジエチルエーテルで洗浄した固体をろ過することにより、生成物（Ｅ）を収率９４％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD): δ8.39 - 8.20 (m, 2H), 7.84 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.1, 7.9 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H) （実施例２３ｃ）
（２−メトキシ−６−（３−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０５）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１４．７ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２３ｂからの試薬Ｅを１１．９ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを７２．１ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３３．５ｍｇの量で用いた。 反応を還流しながら２８時間行った。 ろ過は、ポリエチレンフリットを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率６８％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.26 (s, 1H), 8.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.0, 7.9 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.41 (br s, 1 H), 6.78 (s, 1H), 5.52 (br s, 1H), 5.27 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.23 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H), 2.63 - 1.22 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.81, 154.22, 148.31, 148.02, 143.91, 140.78, 135.12, 133.96, 129.25, 123.29, 122.80, 122.63, 109.85, 106.77, 74.64, 55.84, 53.15, 43.95, 41.83, 36.48, 33.55, 29.44, 25.55, 25.05, 22.88, 17.01; ESI-MS (20v) m/z 480(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 480.2135 (480.2135 計算値) （実施例２４）
（２−メトキシ−６−（３−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−３−１０６）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１６．３ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２３ｂからの試薬Ｅを２６．３ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを６０ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを１９３ｍｇの量で用いた。 反応を６０時間行った。 ろ過は、ポリエチレンフリットを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオールは、収率９２％を得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.25 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.15 (dd, J = 8.1 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.1, 7.9 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.26 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 18.0, 4.6 Hz, 1H), 2.36 - 1.20 (m, 12H), 0.77 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ154.60, 148.30, 147.96, 143.80, 140.80, 135.52, 133.90, 129.23, 123.36, 122.74, 122.57, 109.80, 106.82, 81.60, 74.55, 55.81, 50.41, 43.00, 41.77, 37.21, 36.15, 30.53, 29.56, 25.67, 23.05, 10.93; ESI-MS (20v) m/z 467(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 467.2179 (467.2182 計算値) （実施例２５）
（２−メトキシ−６−（２−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１１７）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２５ａ）
（Ｎ−（２−ニトロベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化２−ニトロベンジルを１．６３０６ｇ（７．５４８ｍｍｏｌ）で用い、実施例２３ａからの試薬Ａを１．１１９３ｇ（６．８６１ｍｍｏｌ）の量で用い、２．２７７ｍＬ（１３．７２ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を外界温度で４１時間行った。 さらなる量の試薬Ｂ［臭化２−ニトロベンジル］（３１３．５ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、反応を外界温度でさらに４８時間続けた。 反応物を水（５０ｍＬ）で希釈した。 生成物ＤのＮ−（２−ニトロベンジルオキシ）フタルイミドを、クロロホルムから再結晶することにより収率５１％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ) δ8.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 7.8 Hz), 7.90 - 7.68 (m, 5H), 7.54 (dd, J = 8.3, 7.8 Hz, 1H), 5.65 (s, 2H) （実施例２５ｂ）
（Ｏ−（２−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（２−ニトロベンジルオキシ）フタルイミドを１８８．４ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ｉを３３．８μＬ（０．６９５ｍｍｏｌ）で用いた。 反応を、エタノール１５ｍＬ中で還流しながら２０時間行った。 さらなる量の試薬Ｉを加え（５μＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）、反応を還流しながらさらに２４時間続けた。 生成物Ｏ−（２−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を収率２３％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD) δ8.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.51 - 7.83 (m 3H), 5.44 (s, 2H). （実施例２５ｃ）
（２−メトキシ−６−（２−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１１７）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１３．５ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２５ｂからの試薬Ｅを１０．５ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを８０ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 反応を６６時間行った。 生成物２−メトキシ−６−（２−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率８８％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61 (m, 2H), 7.46 - 7.40 m, 2H), 6.77 (s, 1H), 5.59 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.25 (dd, J = 18.1, 4.6 Hz, 1H), 2.71 - 1.24 (m, 12H), 1.00 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 480(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 480.2136 (480.2135 計算値) （実施例２６）
（２−メトキシ−６−（２−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−３−１２４）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１６．３ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２５ｂからの試薬Ｅを１５．８ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを９８．３ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを５２ｍｇの量で用いた。 反応を４８時間行った。 生成物を、メタノール（８ｍＬ）に溶解し、Ｃ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）を通してろ過することにより精製した。 生成物２−メトキシ−６−（２−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオールを、収率９９％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 - 7.57 (m, 2H), 7.46 - 7.38, m, 2H), 7.49 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.59 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.76 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 3.19 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.34 - 1.20 (m, 12H), 0.77 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 467(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 467.2179 (467.2182 計算値) （実施例２７）
（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２７ａ）
（Ｎ−（４−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして塩化４−メトキシベンジルを０．９７７７ｇ（７．２０４ｍｍｏｌ）で用い、実施例２３ａからの試薬Ａを１．０６８４ｇ（６．５４９ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２３ａからの試薬Ｃ ２．１７３ｍＬ（１３．１０ｍｍｏｌ）を用いた。 反応を外界温度で４１時間行った。 さらなる量の試薬Ｂ［塩化４−メトキシベンジル］（２５０．０μＬ、１．８３５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、反応を外界温度でさらに４０時間続けた。 反応物を水（５０ｍＬ）で希釈した。 生成物ＤのＮ−（４−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドを粗収率７２％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ) とりわけδ7.83 - 7.77 (m, 2H), 7.76 - 7.70 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.15 (s, 2H), 3.81 (s, 3H). （実施例２７ｂ）
（Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
粗試薬ＤとしてＮ−（４−メトキシベンジルオキシ）フタルイミドを２９１．９ｍｇ（１．０３０ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ｉを１０１．３μＬ（２．０８４ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応をエタノール６ｍＬおよびジクロロメタン３ｍＬ中で還流しながら２１時間行った。 生成物Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を収率２３％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD) δ7.36 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.92 (s, 2H), 3.81 (s, 3H). （実施例２７ｃ）
（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−６）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム）を１９．７ｍｇ（０．０６０ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２７ｂからの試薬Ｅを１１．５ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを１００．４ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを１１７．６ｍｇの量で用いた。 反応を２４時間行った。 さらなる量の実施例２７ｂからの試薬Ｅを、反応混合物（４．９ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）に加え、反応をさらに４４時間続けた。 生成物２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを、収率７０％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.57 (s, 1H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 5.54 (br s, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.16 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H), 2.62 - 1.39 (m, 12H), 0.92 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ170.82, 159.26, 153.05, 147.74, 143.89, 134.82, 130.31, 130.05, 123.88, 113.69, 109.91, 106.72, 75.94, 55.84, 55.24, 53.19, 43.96, 41.80, 36.46, 33.55, 29.41, 25.55, 25.05, 22.90, 16.98; ESI-MS (20v) m/z 465(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 465.2382 (465.2390 計算値) （実施例２８）
（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）イミノエストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−５）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストラジオールを１７．３ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２７ｂからの試薬Ｅを１０．５ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを８６．６ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを９１．３ｍｇの量で用いた。 反応を２４時間行った。 さらなる量の試薬Ｅを、反応混合物（３．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）に加え、反応をさらに４０時間続けた。 生成物を、メタノール（８ｍＬ）に溶解し、Ｃ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）を通してろ過することにより精製した。 生成物２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）イミノエストラジオールを、収率８０％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.56 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 5.51 (br s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.72 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.35 - 1.14 (m, 12H), 0.75 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 452(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 452.2435 (452.2437 計算値) （実施例２９）
（２−メトキシ−６−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１１８）の調製）
これは、以下のように、２つの中間体を介して調製する。 （実施例２９ａ）
（Ｎ−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）フタルイミドの調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ａに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｂとして臭化３−トリフルオロメチルベンジルを１．１０１９ｇ（７．２１４ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ａを１．０７０ｇ（６．５５９ｍｍｏｌ）の量で用い、２．２４６ｍＬ（１３．１８ｍｍｏｌ）の試薬Ｃを用いた。 反応を外界温度で４１時間行った。 さらなる量の試薬Ｂ［臭化３−トリフルオロメチルベンジル］（２５０．０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、反応を外界温度でさらに４８時間続けた。 反応物を水（５０ｍＬ）で希釈した。 精製は、シリカゲル［トルエン、次いでジクロロメタン］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 生成物ＤのＮ−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）フタルイミドを、収率３９％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.89 - 7.72 (m, 6H),7.64 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.0, 7.6 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H) （実施例２９ｂ）
（Ｏ−（３−トリフルオロメチルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例２３ｂに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬ＤとしてＮ−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）フタルイミドを５８８．０ｍｇ（１．７３７ｍｍｏｌ）で用い、試薬Ｉを１０１．３μＬ（２．０８４ｍｍｏｌ）の量で用いた。 反応を、エタノール（６ｍＬ）およびジクロロメタン（３ｍＬ）中で還流しながら１６時間行った。 さらなる量のエタノール（５ｍＬ）およびジクロロメタン（２．５ｍＬ）を加え、反応を還流しながらさらに５時間続けた。 生成物Ｏ−（３−トリフルオロメチルベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｅ）を収率１３％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD): δ7.78 - 7.60 (m, 4H), 5.10 (s, 2H). （実施例２９ｃ）
（２−メトキシ−６−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１１８）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシム）を７．５ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）の量で用い、実施例２９ｂからの試薬Ｅを６．５ｍｇ（０．０２９ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを８０ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３０ｍｇの量で用いた。 反応を６６時間行った。 ろ過は、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通した。 生成物２−メトキシ−６−（３−トリフルオロメチルベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシムを収率９５％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.66 (br s, 1H), 7.62 - 7.44 (m, 4H), 6.78 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.23 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.20 (dd, J = 18.0, 4.4 Hz, 1H), 2.62 - 1.16 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 503(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 503.2155 (503.2158 計算値) （実施例３０）
（６−（２，４−ジニトロフェニルヒドラゾノ）−２−メトキシ−エストロン−１７−オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１１９）の調製）
以下の変形形態では、上記の実施例４ｃに概説したものと同様の手順を用いた。
試薬Ｆとして２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−オキシムを１１．６ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）の量で用い、試薬Ｅ（２，４−ジニトロフェニルヒドラジン）を８．７ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）の量で用い、樹脂Ｇを８０ｍｇの量で用い、樹脂Ｈを３５ｍｇの量で用いた。 ある量の塩酸（３７％、１００．０μＬ）を反応物に加えた。 反応を外界温度で１６時間行った。 生成物をメタノール（８ｍＬ）に溶解し、Ｃ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）でろ過することにより精製した。 生成物６−（２，４−ジニトロフェニルヒドラゾノ）−２−メトキシ−エストロン−１７−オキシムを、収率２４％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ9.16 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.38 (dd, J = 9.7, 2.1 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 2.99 (dd, J = 16.7, 4.9 Hz), 2.66 - 1.11 (m, 12H), 0.98 (s, 1H); ESI-MS (20v) m/z 508(100) [MH] - ; HRESI-MS: [MH] - 508.1825 (508.1832 計算値) （実施例３１）
（エストロン−１７−（４−ニトロベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０１）の調製）
エストロン（１６．０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン（３０．３ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、８１．３ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を外界温度で２４時間、次いで、還流しながら２４時間行った。 反応物を、真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（２２２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で６０時間攪拌し、その後ポリエチレンフリットを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン２×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、淡黄色固体を得て、これをメタノール（５ｍＬ）に懸濁させた。 この懸濁液をＣ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）に通し、さらなる量のメタノール（２ｍＬ）で洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、生成物エストロン−１７−（４−ニトロベンジル）オキシムを収率８６％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.20 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.93 (br s, 1H), 2.92 - 1.22 (m, 15H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ171.89, 153.45, 147.26, 146.32, 138.01, 132.24, 127.99, 126.45, 123.48, 115.24, 112.74, 73.89, 52.92, 44.51, 43.91, 38.11, 34.09, 29.47, 27.17, 26.15, 22.97, 17.30; ESI-MS (20v) m/z 421(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 421.2122 (421.2127 計算値) （実施例３２）
（２−メトキシエストロン−１７−（４−ニトロベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０３）の調製）
２−メトキシエストロン（９．８ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン［市販品］（１６．７ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、７２．９ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を外界温度で２４時間、次いで、還流しながら１６時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（１２２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を、無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で６０時間攪拌し、その後、ポリエチレンフリットを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン２×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて淡黄色固体を得て、これをメタノール（５ｍＬ）に懸濁させた。 この懸濁液をＣ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）に通し、さらなる量のメタノール（２ｍＬ）で洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて生成物２−メトキシエストロン−１７−（４−ニトロベンジル）オキシムを、収率７３％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.18 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 5.47 (br s, 1H), 5.16 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 2.88 - 1.22 (m, 15H), 0.93 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ171.79, 147.23, 146.35, 144.60, 131.31, 129.26, 127.96, 123.47, 114.58, 107.94, 73.88, 56.03, 52.91, 44.46, 44.20, 38.09, 34.12, 28.84, 27.29, 26.44, 26.14, 22.94, 17.31; ESI-MS (20v) m/z 451(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 451.2222 (451.2233 計算値) （実施例３３）
（エストロン−１７−（３−ニトロベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０２）の調製）
試薬Ｏ−（３−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミンを、上記実施例２３ａおよび２３ｂの方法により調製した。
エストロン（１４．９ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、Ｏ−（３−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン［実施例２３ｂから］（２８．２ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、９１．５ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を外界温度で２４時間、次いで還流しながら２４時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（２０７ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で６０時間攪拌し、その後ポリエチレンフリットを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン２×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、淡黄色固体を得て、これをメタノール（５ｍＬ）に懸濁させた。 この懸濁液をＣ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）に通し、さらなる量のメタノール（２ｍＬ）で洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、生成物エストロン−１７−（３−ニトロベンジル）オキシムを収率７７％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.23 (br s, 1H), 8.14 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 7.9, 7.8 Hz, 1H), 7.14 (d, 8.5 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.78 (br s, 1H), 2.92 - 1.22 (m, 15H), 0.94 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ172.18, 153.61, 148.46, 141.10, 138.27, 133.86, 132.53, 129.34, 126.71, 122.84, 122.66, 115.44, 112.94, 74.07, 53.11, 44.74, 44.13, 38.32, 34.32, 29.71, 27.39, 26.40, 23.20, 17.51; ESI-MS (20v) m/z 421(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 421.2122 (421.2127 計算値) （実施例３４）
（２−メトキシエストロン−１７−（３−ニトロベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−３−１０４）の調製）
試薬Ｏ−（３−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミンを、上記実施例２３ａおよび２３ｂの方法により調製した。
２−メトキシエストロン（９．７ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）、Ｏ−（３−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン［実施例２３ｂから］（１６．５ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、６３．３ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を外界温度で２４時間、次いで還流しながら１６時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（１２１ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で６０時間攪拌し、その後ポリエチレンフリットを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン２×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、淡黄色固体を得て、これをメタノール（５ｍＬ）に懸濁させた。 この懸濁液をＣ１８カートリッジ（３００ｍｇ装填）に通し、さらなる量のメタノール（２ｍＬ）で洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、生成物２−メトキシエストロン−１７−（３−ニトロベンジル）オキシムを収率７６％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.24 (s, 1H), 8.15 (dd, J = 8.8, 2.1 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.0, 7.8 Hz, 1H), 7.14 (d, 8.5 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 5.45 (br s, 1H), 5.16 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.94 - 1.24 (m, 15H), 0.95 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 451(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 451.2214 (451.2233 計算値) （実施例３５）
（エストロン−１７−（４−メトキシベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３３）の調製）
試薬Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミンを、上記実施例２７ａおよび２７ｂの方法により調製した。
エストロン（４．２ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン［実施例２７ｂから］（４．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、１０１．９ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を還流しながら４８時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（４４ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で７０時間攪拌し、その後ＬＣ−Ｃ１８固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン４×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、生成物エストロン−１７−（４−メトキシベンジル）オキシムを、収率９４％で得た。
1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ9.00 (s, 1H), 7.26 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.90 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.77 - 1.16 (m, 15H), 0.86 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 406(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 406.2377 (406.2382 計算値) （実施例３６）
（２−メトキシエストロン−１７−（４−メトキシベンジル）オキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−３４）の調製）
試薬Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミンを、上記実施例２７ａおよび２７ｂの方法により調製した。
２−メトキシエストロン（４．６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、Ｏ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン［実施例２７ｂから］（４．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、９８．６ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を還流しながら４８時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（５０ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で７０時間攪拌し、その後ＬＣ−Ｃ１８固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン４×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させて、生成物２−メトキシエストロン−１７−（４−メトキシベンジル）オキシムを、収率８８％で得た。
1 H NMR (DMSO-d6): δ8.56 (br s, 1H), 7.26 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H) 2.72 - 1.13 (m, 15H), 0.87 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 436(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 436.2491 (436.2488 計算値) （実施例３７）
（６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノエストリオール（ＣＰ−ＤＭ−４−８８）の調製）
試薬Ｏ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミンを、上記実施例４ａおよび４ｂの方法により調製した。
６−オキソ−エストリオール（８．４ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、Ｏ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン［実施例４ｂから］（１０．９ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、１５０ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を還流しながら４８時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（６９．７ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で２．５時間攪拌し、その後ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン３×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させ、白色固体を得て、これをシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（２：１）］のフラッシュクロマトグラフィにより精製し、生成物６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノエストリオールを収率８６％で得た。
1 H NMR (CD 3 OD/CDCl 3 ): δ7.31 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.92 - 6.86 (m, 2H), 6.77 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 6.73 (tt, J = 6.8, 2.2 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.08 - 4.02 (m, 1H), 3.46 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 18.2, 4.3 Hz, 1H), 2.30 - 1.23 (m, 10H), 0.73 (s, 3H); ESIMS (20v) m/z 444(100) [M+H] + （実施例３８）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール−１７−アセテート（ＣＰ−ＤＭ−４−９１）の調製）
２−メトキシエストラジオール−１７−アセテート（１６．３ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン（１８．６ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、１５０ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を還流しながら４８時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（１１３．６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で２．５時間攪拌し、その後ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン３×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させ、生成物２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール−１７−アセテートを、収率９２％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.21(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.53(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.46 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 5.49 (br s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.69 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.15 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.28 - 1.31(m, 12H), 2.07 (s, 3H), 0.81 (s, 3H); ESIMS (20v) m/z 509(100) [M+H] + （実施例３９）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−メチルオキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７５）の調製）
これは、以下のように、４つの中間体を介して調製する。 （実施例３９ａ）
（２−メトキシエストロン−１７−メチルオキシムの調製）
２−メトキシエストロン（９８．３ｍｇ、０．３２７ｍｍｏｌ）をメタノール（１２ｍＬ）に溶解し、メトキシルアミン塩酸塩（８２．０ｍｇ、０．９８１ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、２０７．０ｍｇ）を、攪拌しながら窒素雰囲気下で加えた。 反応を還流しながら２１時間行い、その後、真空で蒸発させた。 混合した固体をジクロロメタン（１０ｍＬ）に懸濁させ、ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、さらにジクロロメタン５ｍＬで洗浄した。 真空で蒸発させることにより無定形白色固体を収率９９％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ6.90 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.81 - 1.37 (m, 15H), 0.94 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 330(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 330.2082 (330.2069 計算値) （実施例３９ｂ）
（２−メトキシエストロン−１７−メチルオキシム−３−アセテートの調製）
２−メトキシエストロン−１７−メチルオキシム（１０６．５ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ）をピリジン（２．０ｍＬ、２４．８０ｍｍｏｌ）に溶解し、無水酢酸（１．０ｍＬ、１０．５８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、外界温度で攪拌しながら滴下して加えた。 １５．５時間後、反応物を１Ｍ塩酸水溶液で希釈して、その後酢酸エチル３×１０ｍＬで抽出した。 合わせた抽出物を水（１０ｍＬ）、およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 ろ過し、真空で蒸発させることにより、乳白色固体を収率９０％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ6.89 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.81 - 1.33 (m, 15H), 2.29 (s, 3H), 0.93 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 372(100) [M+H] + （実施例３９ｃ）
（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシム−３−アセテートの調製）
三酸化クロム（１１９．５ｍｇ、１．１９５ｍｍｏｌ）を酢酸（１．８０ｍＬ）および水（０．２０ｍＬ）の混合液に溶解した。 ２−メトキシエストロン−１７−メチルオキシム−３−アセテート（１０４．５ｍｇ、０．２８１ｍｍｏｌ）の酢酸（２．００ｍＬ）溶液、次いで、さらなる量の酢酸（１．８０ｍＬ）および水（０．２０ｍＬ）を加え、反応物を５０分間５〜８℃に保持した。 反応物を水（２５ｍＬ）で希釈し、その後、酢酸エチル３×２０ｍＬで抽出した。 合わせた抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 ろ過し、真空で蒸発させることにより白色固体を収率８７％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.75 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.91 (br s, 3H), 3.85 (s, 3H), 2.77 (dd, J = 16.8, 3.4 Hz, 1H), 2.62 - 1.25 (m, 12H), 2.32 (s, 3H), 0.96 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 386(100) [M+H] + （実施例３９ｄ）
（２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシムの調製）
２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシム−３−アセテート（８４．４ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ）をエタノール（１０．０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（９３４ｍｇ、６．７５８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。 外界温度で１８時間攪拌を続け、その後、１Ｍ塩化アンモニウム溶液（２５．０ｍＬ）を加えた。 反応物のｐＨをさらに６Ｍ塩酸溶液を滴下して加えることによりｐＨ＝７に調整した。 抽出をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で行った。 合わせた抽出物を、水（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 ろ過し、真空で蒸発させることにより粗生成物を得た。 精製はシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（１：２）］のフラッシュクロマトグラフィにより行った。 生成物を白色固体として、収率７８％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.59 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 5.52 (br s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.73 (dd, J = 16.8, 3.5 Hz, 1H), 2.56 - 1.37 (m, 12H), 0.94 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 344(100) [M+H] + ,366(64) [M+Na] + ; HRESI-MS: [M+H] + 344.1851 (344.1826 計算値) （実施例３９ｅ）
（２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−メチルオキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７５）の調製）
２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシム（１６．４ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）およびＯ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（１２．７ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。 多量の４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、２１７．４ｍｇ）を加え、反応を外界温度で６６時間行った。 混合物を真空で蒸発させ、その後ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（３９ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を加え、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応混合物をさらに４８時間攪拌し、その後ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン３×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させ、黄色油状残渣を得て、これをシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（３：７）］のフラッシュクロマトグラフィにより精製し、生成物を収率６６％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.21(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.50 (br s, 1H), 5.27 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 18.1, 4.5 Hz, 1H), 2.58-1.25 (m, 12H), 0.93 (s, 3H); 13 C NMR (CDCl 3 ) δ169.65, 154.22, 148.03, 147.36, 146.11, 143.89, 135.20, 128.34, 127.83, 123.58, 123.22, 109.79, 106.77, 74.65, 55.85, 53.19, 43.85, 41.82, 36.49, 33.68, 29.46, 25.60, 22.97, 17.10; ESI-MS (20v) m/z 494(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 494.2288 (494.2291 計算値) （実施例４０）
（２−メトキシ−６−（３，５−ジフルオロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−メチルオキシム（ＣＰ−ＤＭ−４−７４）の調製）
この実施例で用いる２つの試薬、２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシムおよびＯ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩は、それぞれ実施例３９ａ〜３９ｄおよび４ａ〜４ｂの手順により調製した。
２−メトキシ−６−オキソ−エストロン−１７−メチルオキシム［実施例３９ｂから］（１４．５ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）およびＯ−（３，５−ジフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩［実施例４ｂから］（１０．７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。 多量の４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、２２７．８ｍｇ）を加え、反応を外界温度で６６時間行った。 混合物を真空で蒸発させ、その後、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（３９ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を加え、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応混合物をさらに４８時間攪拌し、その後ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン３×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させ、黄色油状残渣を得て、これをシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（２：７）］のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、生成物を収率５２％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ7.50 (s, 1H), 6.93 - 6.87 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.72 (tt, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 5.48 (br s, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.20 (dd, J = 18.0, 4.6 Hz, 1H), 2.60-1.25 (m, 12H), 0.93 (s, 3H); ESI-MS (20v) m/z 485(100) [M+H] + ; HRESI-MS: [M+H] + 485.2246 (485.2252 計算値) （実施例４０Ａ）
（６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノ−１７−エチニル−エストラジオール（ＣＰ−ＤＭ−４−８９）の調製）
１７−エチニル−６−オキソ−エストラジオール（８．９ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）およびＯ−（３，５−４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン（１１．７ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）および４−ポリビニルピリジン（２５％架橋、１５０ｍｇ）を、窒素雰囲気下で反応容器にすべて加え、攪拌しながらメタノール（１０ｍＬ）で溶媒和した。 反応を還流しながら４８時間行った。 反応物を真空で蒸発させ、ＰＳ−ベンズアルデヒド樹脂（７１．７ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌｇ −１ ）を容器に加えた。 反応混合物を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁させ、外界温度で２．５時間攪拌し、その後ＬＣ−ＣＮ固相抽出カートリッジを通してろ過し、これをさらにテトラヒドロフラン３×５ｍＬで洗浄した。 合わせたろ液および洗液を蒸発させ、白色固体を得て、これをシリカゲル［酢酸エチル−石油スピリット（４０〜６０℃）（１：２）］のフラッシュクロマトグラフィにより精製し、生成物６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノ−１７−エチニル−エストラジオールを収率４３％で得た。
1 H NMR (CDCl 3 ): δ8.22(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.53(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.35(d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.21(d J = 8.5 Hz, 1H), 6.84(dd J = 8.5, 2.9 Hz, 1H), 5.29(s, 2H), 4.84 (br s, 1H), 2.62 (s, 1H), 3.14(dd, J = 18.3, 4.6 Hz, 1H), 2.40-1.24(m, 12H), 0.86(s, 3H); ESIMS (20v) m/z 461(100) [M+H] + （実施例４〜４０Ａの化合物）
実施例４〜４０Ａの化合物を以下に示す。
（その他の化合物の合成）
下記の化合物は、先に詳述したものと同様の方法で合成したかまたはすることが可能である。
2-メトキシ-6-(3,5-ジフルオロベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(2-シアノベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3-シアノベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(4-シアノベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(2-ニトロベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3-ニトロベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3,5-ジフルオロベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-シアノベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(3-シアノベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(4-シアノベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-ニトロベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(3-ニトロベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-ニトロフェニルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(3-ニトロフェニルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-ニトロフェニルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3-ニトロフェニルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(2-ピリジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(3-ピリジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(4-ピリジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-ピリジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3-ピリジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(4-ピリジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシエストロン-17-(4-ニトロベンジル)オキシム
2-メトキシエストロン-17-(3-ニトロベンジル)オキシム
6-(4-シアノベンジルオキシ)イミノエストラジオール
6-(4-ニトロベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(4-カルボキシベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(4-メトキシベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(4-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(3-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(2-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストロン-17-オキシム
2-メトキシ-6-(4-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(3-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストラジオール
2-メトキシ-6-(2-トリフルオロメチルベンジルオキシ)イミノエストラジオール。 （実施例４１）
（本発明の化合物の有効性の試験）
（試験化合物がヒト気道平滑筋細胞増殖に与える影響）
（ａ）ヒト気道平滑筋の培養 ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞を、以前（Fernandesらの論文、1999）に詳細に公表されている方法により、Alfred Hospital（Melbourne）より提供された肺切除または心肺移植試料から得られる巨視的に正常な気管支（直径０．５〜２ｃｍ）から培養した。
約０．１ｇの平滑筋を、細胞培養ごとに気管支壁から剥ぎ取った。 切除した組織を、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ（ＣＳＬ、Australia）および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＣＳＬ、Australia）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Flow Laboratories、Scotland）に浸漬させた。 この組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Oxoid、England）ですすぎ、気道平滑筋を２ｍｍ ３の小片に切り刻み、エラスターゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Worthington Biochemical、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で２時間消化し、次いで、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）（Worthington Biochemical、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃で攪拌しながら、１２時間インキュベートした。
得られた細胞懸濁液を遠心分離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。 最後の遠心ステップ後に、細胞をＬ−グルタミン（２ｍＭ、Sigma、ＵＳＡ）、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アンホテリシンＢ（２μｇ／ｍＬ、Wellcome、ＵＫ）および熱失活したＦＣＳ（１０％ｖ／ｖ、ＣＳＬ、Australia）を追加したＤＭＥＭ２５ｍＬに再懸濁させ、２５ｃｍ ２の培養フラスコに蒔いた。 最初の単離物を７から１４日間インキュベートし、集密状態にした。
細胞をトリプシン（０．５％、ＣＳＬ、Australia）およびＥＤＴＡ（ＰＢＳ中１ｍＭ、ＢＤＨ、Australia）に１０分曝すことにより毎週回収して、７５ｃｍ ２のフラスコに１：３の割合で継代した。 マイトジェンで誘導される細胞数の増加における影響を調査することにより、細胞培養での化合物の活性を確定した。 我々は、２ＭＥＯおよびそのアナログである４ＮＯおよび４ＮＯＭのいずれかの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のトロンビンの増殖性刺激に応じたＨＡＳＭ細胞の増殖に対する影響を調べた。 細胞を、１．５×１０ ４細胞ｃｍ ２の密度で６−ウェルプレートに蒔き、血清添加培地を除去することにより２４時間静止状態にし、次いでトロンビン（０．３Ｕ／ｍｌ）またはｂＦＧＦ（３００ｐＭ）のいずれかで４８時間刺激した。 試験化合物をＨＡＳＭ細胞と共に３０分間プレインキュベートし、その後トロンビンを加えた。 ４８時間のインキュベーション終了後に、血球計算盤のチャンバーで計数するために、細胞をトリプシン（１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中０．５％ｗ／ｖ）により培養プレートからはがし、外界温度で、０．５％（ｗ／ｖ）トリパンブルーを含むＰＢＳ中で５分間インキュベートし、２回洗浄し（２％ ＦＣＳのＰＢＳ溶液）、遠心分離により単離し（１２，０００×ｇ、５分）、２％ＦＣＳのＰＢＳ溶液２００μｌに再懸濁させた。
これらの実験結果を、図１および表３に表す。 データは、ビヒクルで処理したウェル中の細胞数の割合として表され、平均および平均の標準偏差として表される。
２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストラジオール（４ＮＯ）アナログは、広い濃度範囲（１０ｎＭから１０μＭ）でＨＡＳＭ細胞の増殖に対する阻害活性を示す（図１）。 驚くべきことに、２ＭＥＯに関連するアナログである２−メトキシ−６−（４−ニトロベンジルオキシ）イミノエストロン−１７−オキシム（４ＮＯＭ）は、２ＭＥＯまたは４ＮＯのいずれよりもかなり強力であった（図１）。 ４ＮＯの阻害活性は、マイトジェンとしてのトロンビンまたは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のいずれとも同様であった（表３）。 これらの２つの異なるマイトジェン間の選択性の欠如は、これおよび関連するアナログは特定のマイトジェンに関し受容体レベルで働くように思われず、むしろこのような反応に役立つ細胞内シグナル伝達経路に影響を及ぼさないであろうことを示唆している。
その他の開示された化合物がトロンビン誘導ヒト気道平滑筋細胞増殖の阻害に与える影響についてもこのアッセイを用いて検証し、その結果を表４のＡからＣ欄に要約する。
トロンビンに誘導されるヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）の増殖を制御する化合物の効力を、上述した培養液中で維持している細胞で評価した。 効力は、増殖反応を５０％減少させる濃度の負の対数を意味するｐＩＣ ５０値（表４のＡ欄）として示した。 さらに、ある化合物の阻害効果が二相性である場合には、データも「２部位（two site）」モデルに適合し、ここで５０％までの阻害に対応する最初の相および１００％までの阻害に対応する第２の相に関する化合物の効力を測定し、ｐＩＣ ２５およびｐＩＣ ７５値として示した（各々ＢおよびＣ欄）。 単相モデルがより適当であると確定した場合には、ｐＩＣ ２５およびｐＩＣ ７５値を計測しないかまたは表に示した。 データは、Ｂ環のＣ６に結合したベンジロキシイミノ環における置換により、全般的に２−メトキシエストラジオールよりも著しく高い、増殖を制御する効力を示す化合物が得られることを示している。 １７位の同様のベンジロキシイミノ置換体を有する一群の化合物は、対応する６位のアナログよりも低い効力を示した。 平滑筋の増殖を制御するこの種の試薬の効力が、平滑筋の増殖により特徴付けられる疾患を治療する際のそれらの有用性を支持している。
ウシ大動脈血管平滑筋を用い、より限定した一連の化合物を用いた実験も行った。 ３μＭで、２−メトキシエストラジオール、ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７、およびＣＰ−ＤＭ−３−９１は、ｂＦＧＦ（３００ｐＭ）で誘導される増殖を、それぞれ８７±６％、７５±１４％および９３±４減少させた。 これらの知見は、開示した化合物が心臓血管系の血管平滑筋の機能障害を伴う疾患において治療作用を有するであろうことを示唆している。
開示した化合物がトロンビンまたはｂＦＧＦで誘導されるヒト気道平滑筋細胞の増殖を阻害する能力を測定するために、このようなアッセイを容易に利用し得ることは理解されるであろう。 これらのアッセイは、このような化合物が血管平滑筋細胞などの他の組織由来の平滑筋細胞のトロンビンまたはｂＦＧＦで誘導される増殖を阻害する能力を試験するためにも用いられるであろう。
（ｂ）細胞周期状態のフローサイトメトリー分析 細胞を、１．５×１０ ４細胞／ｃｍ ２の密度で６−ウェルプレートに蒔き、前述のように静止状態にし、次いでトロンビン（０．３Ｕ／ｍｌ）で４８時間刺激した。 マイトジェンを加えるときに、Monomed Aをすべての細胞（対照細胞を含む）に加えた。
細胞を、３７℃で３０分間（０．５％ｗ／ｖ）、トリプシンと共にインキュベートすることにより培養プレートからはがした。 得られた懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、その後、−２０℃で最長３週間保管するために、７０％エタノール１ｍｌに再懸濁させた。 染色前に、細胞を２回洗浄して（２％ ＦＣＳのＰＢＳ溶液）、エタノールを除去した。 固定した細胞を、Rnase II（１８０ｍＵ／ｍｌ）を含むヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）のトリトンＸ−１００（０．１％ｖ／ｖ）を用いて染色した。 細胞懸濁液を１８ゲージニードルに通して細胞凝集塊の分離を促進させた。 細胞を分析前に２４時間保管した。
細胞周期状態を、Becton-Dickinson FACScan instrument（Becton Dickinson、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて分析した。 各試料から１万個（event）を計数し、ＭｏｄＦｉｔＬＴ Ｖ２．０ analysis package（Verity Software House、ＭＥ、ＵＳＡ）を用いて分析した。 培養プレートからの細胞の剥離がなかったことおよびトリパンブルー（５％より少ない）による細胞の染色がなかったことにより明らかに示されるように、３μＭ未満の濃度で細胞毒性の証拠はなかった。 ＦＡＣｓプロファイルは、ｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１期ＤＮＡ量の集積はなかったので、アポトーシスがアナログの作用特性ではないことを示唆している。 したがって、これらのアナログは気道平滑筋細胞に対し特異的な抗増殖効果を与えると考えられる。 いずれの特定の提案された作用形態に結び付けられることを希望するものではなく、これらの結果は、適用化合物が細胞内シグナル伝達経路の調節を介して作用することを示唆している。
トロンビン（０．３Ｕ／ｍＬ）の存在下で２ＭＥＯおよび４ＮＯＭがＨＡＳＭの形状に与える影響を調査した。 アナログは、ＨＡＳＭと共に３０分間プレインキュベートし、その後、トロンビンを加えた。 インキュベーションを４８時間続け、その後ＨＡＳＭの画像を記録した。
重要なことに、増殖の阻害に同等の効果を及ぼす濃度では、４ＮＯ（１μＭ）は、調査したＨＡＳＭ細胞の形状に検出可能な影響を与えなかったが、２ＭＥＯ（１０μＭ）は広範な細胞の円形化を生じた。
その他の化合物が細胞周期および細胞死に与える影響を、同様のアッセイ系を用いて調査してもよい。 （実施例４２）
（試験化合物が非平滑筋細胞の増殖に与える影響）
４ＮＯの影響を、ＩＩ型気道上皮細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号：ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５、肺癌、ヒト）（図２）を含むいくつかの非平滑筋細胞型、エストロゲン受容体を示すヒト乳腺腫瘍細胞系ＭＣＦ７（ＡＴＴＣ受入番号：ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２、乳腺腺癌、ヒト）（図３）、およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）（図４）で評価した。
試験化合物の影響を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に応答したＡ５４９細胞の増殖について調べた。 アナログを、Ａ５４９細胞と共に３０分間プレインキュベートし、その後ＦＣＳを加えた。 インキュベーションを４８時間続け、その後細胞を計数した。 データは、ビヒクルで処理したウェル中の細胞数の割合として示し、平均および平均の標準偏差として示す。 ２ＭＥＯおよび４ＮＯが５％ＦＣＳに応答したＢＡＥＣの増殖に与える影響でしたのと同様に、２ＭＥＯおよび４ＮＯが５％ＦＣＳまたは上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、３００ｐＭ）に応答したＭＣＦ７の増殖に与える影響を調べた。 インキュベーションパラメータは、上述したものと同様とした。 結果は平均および平均の標準偏差として示す。 驚くべきことに、３μＭ未満の濃度では、４ＮＯはこれらの細胞型のいずれの増殖に対しても検出可能な影響を示さなかったが、このことは、平滑筋細胞および線維芽細胞に対するこの化合物の特異性を示唆しており、気道でもみられる他の様々な細胞に対してはみられなかった。 これに対して、２ＭＥＯは各細胞型の増殖の効果的な阻害剤であった。
このアッセイを、他の化合物が５％ＦＣＳに応じた非平滑筋細胞ＭＣＦ７およびＡ５４９（上述のもの）の増殖を阻害する能力を評価するのにも使用した。 このアッセイの結果を表４に示す（それぞれＧおよびＨ欄）。 化合物の効力は、これらの細胞系の増殖の阻害では、ＨＡＳＭであったものよりもかなり少なかった。 これらの知見は、これらの化合物の作用に関する細胞型特異的な標的があるという主張を支持している。 このようなアッセイは、他の開示化合物がこれらの細胞または他の関心のある非平滑筋細胞に与える影響を検討するために採用してもよい。 （実施例４３）
ＨＡＳＭ増殖の阻害についての試験化合物とデキサメタゾンとの比較 我々は、４ＮＯ（１μＭ）およびグルココルチコイドであるデキサメタゾン（Ｄｅｘ、１００ｎＭ）がｂＦＧＦ（３００ｐＭ）に応答したＨＡＳＭ細胞の増殖に与える影響を検討した。 デキサメタゾンは、通常抗炎症性のグルココルチコイドが用いられる。 細胞は、標準的なプラスチック製組織培養プレートで培養した。 試験化合物をＨＡＳＭと共に３０分間プレインキュベートし、その後ｂＦＧＦを加えた。 インキュベーションを７日間続け、その後細胞を計数した（図５）。 データは、ビヒクルで処理したウェル中の細胞数の割合として示し、平均および平均の標準偏差として示す。
プラスチック製培養プレート上のＨＡＳＭ細胞の増殖を、デキサメタゾンにより減弱したが、完全に遮断しなかった。 これに対し、有利に４ＮＯはＨＡＳＭ細胞数の増加をデキサメタゾンのものより低いレベルにまで明らかに減少させた。 細胞外マトリックスのコラーゲンで育成したＨＡＳＭ細胞のグルココルチコイドおよび試験化合物に対する応答についても検討した。 細胞は、コラーゲンで被覆したシラスティック基盤上で培養した。 ＨＡＳＭ細胞を試験化合物と共に３０分間プレインキュベートし、その後ｂＦＧＦ（３００ｐＭ）を加えた。 インキュベーションを７日間続け、その後細胞を計数した（図６）。 データは、ビヒクルで処理したウェル中の細胞数の割合として示し、平均および平均の標準偏差として示す。
驚くべきことに、コラーゲンＥＣＭ上でのＨＡＳＭ細胞の増殖は、デキサメタゾンによる調節に対し耐性があった。 このことは、コラーゲン含有マトリックスの存在下でこの化合物の効果が減弱化されることを示唆している。 しかし、４ＮＯは、コラーゲンＥＣＭ上の細胞に対して抗増殖剤としてのその有効性を保持していた。 これらの知見は、ＨＡＳＭ細胞増殖がグルココルチコイドよりも現在開示した化合物により良好に制御されることを示している。 （実施例４４）
（エストロゲン受容体およびチューブリンに対する試験化合物の親和性）
（エストロゲン受容体結合アッセイ）
エストラジオール（Ｅ２）、２ＭＥＯおよびアナログのエストロゲン受容体（ＥＲ）親和性を、ＥＲ源としてラット子宮細胞基質を用い（Markaverichらの論文、1979）、詳述されているように（Hughesらの論文、2002）決定した。 子宮（バッチ当たり６〜１０）をBrown Norwayラット（２５０〜３５０ｇ）から単離し、生理食塩水中で血液を洗浄して除き、Ultra Turraxホモジナイザーを用いて、氷上で１分間隔で３×１５秒間のバーストで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ｗ／ｖグリセロール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド）中でホモジナイズした。
核物質および細胞残屑を７５０×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離して除き（Sorvall RT7）、細胞基質成分を３００００×ｇ、４℃で１２０分間、Beckman JM1遠心機で遠心分離して調製した。 細胞基質を希釈して、Bradfordの方法（Bioradの論文）を用いて測定される、約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質（ラット子宮抽出物）とした。 結合アッセイを、細胞基質２００μＬ、置換剤（１０μＭエストラジオールまたは緩衝液）５０μＬおよび０．２ｎＭ［ ３ Ｈ］−Ｅ２（１５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）５０μＬを含む上述の緩衝液３００μＬ中で、４℃で一晩インキュベートして行った。 デキストランで被覆した活性炭［４００ｍｇのデキストラン（臨床グレードＣ）および２ｇの活性炭（Norit A）を含むＴｒｉｓ緩衝液１００ｍＬ］５００μＬを加え、Sorval RT7で、４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、遊離の放射性リガンドから区分を分離した。
０．０１〜５０ｎＭの範囲の［ ３ Ｈ］−エストラジオールでの飽和分析法より、Ｋ ｄは０．１８ｎＭ、ＢｍａＸは、１１２ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質（ｎ＝３、Graph Pad Prism（商標）を用いて分析）となり、このことは、置換研究において０．２ｎＭの濃度が最適であったことを示していた。 ０．５から１．０の対数刻みで０．１ｎＭ〜１０μＭの範囲で２ＭＥＯおよびアナログの分析を行い、適当な範囲の同定後、１０につき３〜４つの濃度を用いてエストラジオールの置換を測定した。
０．１８ｎＭのＫｄ（飽和分析法により決定したもの）を用いてCheng-Prussofの式にデータをあてはめた。 データはｐＩＣ ５０ （放射性標識の最大の置換の５０％を生じる濃度の負の対数）として示す。
結果を表５に示す。 （コルヒチン結合アッセイのためのチューブリンの精製）
２ＭＥＯおよびそのアナログがある程度精製したチューブリンのその結合部位で３ Ｈ−コルヒチンを置換する能力を調べた。 この結合アッセイでは、チューブリンのある程度の精製は、WilliamsおよびLeeの重合・脱重合方法（Williamsらの論文、1982）によった。 屠殺の約１５分後に３つの子ヒツジ脳（全量約１５０ｇ）を得た。 複数回分の１００ｇの脳を、冷ＰＭ４Ｍ緩衝液５０ｍＬ（１００ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス［２−エタンスルホン酸］（ＰＩＰＥＳ）、１ｍＭ ＭｇＳＯ ４ 、２ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍＭ ＤＴＴ、４Ｍグリセロール、ｐＨ６．９）中で、国内製ブレンダー（Power Blender、Ronson）を用い、最高設定で３０秒間、ホモジナイズした。 粗ホモジネートを１５分間（９０００ｒｐｍ（６５００×ｇ）、４℃）遠心分離し、沈殿（細胞片、細胞外マトリックスおよび粗核分画）を廃棄した。 次いで、６５００×ｇの上澄液を７５分間（２８０００ｒｐｍ（９６０００×ｇ）、４℃）遠心分離し、沈殿（主に細胞膜からなっている）を廃棄した。 ９６０００×ｇ上澄液のＧＴＰ（グアノシン三リン酸）濃度を、調製したばかりの５０ｍＭ ＧＴＰを含む蒸留水の適量の溶液を加えて１ｍＭに調整した。 チューブリンの重合は水浴中で３７℃に４５分間加熱することにより行った。 次いで、粗チューブリンを６０分間（２８０００ｒｐｍ（９６０００×ｇ）、２７℃）、遠心分離することにより沈殿させた。 次いで、チューブリンを多く含む沈殿を、手持ち式組織ホモジナイザーを用いて緩衝液１５ｍＬ（１Ｍグルタミン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、ｐＨ６．６）中に徐々に再懸濁させた。 次いで、ある程度精製したチューブリンを氷上で３０〜６０分間インキュベートし、−８０℃で凍結させた。
WilliamsおよびLee（1982）によれば、氷上の３０〜６０分のインキュベーションは、チューブリン（Williamsらの論文、1982）を脱重合させるはずである。 しかし、このインキュベーション後に６０分間清澄させた（２８０００ｒｐｍ、４℃、６０分）分画はコルヒチンの特異的結合を示さず、このことはチューブリンがまだ重合されており、浮遊状態であったことを示唆していた。 したがって、３０〜６０分の氷冷インキュベーション後に生じた分画をさらに精製することなく用いた。 （コルヒチン置換アッセイ）
チューブリンのコルヒチン結合部位に対する親和性の決定を、 ３ Ｈコルヒチンの置換により行った。 反応成分は、D'Amatoおよび同僚らの方法（D'Amatoらの論文、1994）によったが、１ｍｌサイズ排除カラムでの遊離の放射性リガンドからの区分の分離は、Penefskyの方法（Penefskyの論文、1977）から採用した。 Hamelおよび同僚ら（Hamelらの論文、1996）はチューブリンに結合している３ Ｈ ２−メトキシエストラジオールの特性を研究するのにこれらのマイクロカラムを用いることに成功した。 Sephadex G-50（ファイングレード）カラムから構成される各マイクロカラムを、１ｍＬの使い捨てのシリンジで約０．９５ｍｌまで満たした。 複製反応混合物（合計体積０．４８ｍｌ）は、約０．５ｍｇ／ｍＬのある程度精製したチューブリン、１μＭ ３ Ｈ コルヒチン、および置換化合物を含む緩衝液（１Ｍ グルタミン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、０．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ６．６）を含んでいた。 飽和研究は、このアッセイのコルヒチンのＫ Ｄが１．４μＭであることを示し、このことは１μＭが適当な放射性リガンド濃度であったことを意味していた。 ５刻み（１０ −７．５から１０ −４ Ｍの範囲）の置換剤を用いた。
反応混合物を、水浴中、３７℃で３０分間、インキュベートし、次いで氷上で１から１．５時間、冷却安定化させた。 次いで、各反応混合物ごとに、３つの０．１４ｍｌアリコートを予め冷却した分離マイクロカラムに加えた。 分離は、２分間遠心分離することにより行った（１１００ｒｐｍ（１００×ｇ）、４℃）。 「Emulsifier Safe」シンチレーション液（Packard）５ｍｌを各チューブに加え、試料をPackard 1600TR液体シンチレーション分析器で計数した。 データをCheng-Prusoffの式にデータをあてはめて、Ｋ ｉおよびｐＩＣ ５０値を計算した（GraphPad Prism）。
最大１０μＭまでの濃度では２ＭＥＯアナログである４ＮＯおよび４ＮＯＭはわずかしかまたはまったく検出可能な３ Ｈ−エストラジオールの置換を有しなかったが、２ＭＥＯはｐＩＣ ５０値６．８であった（表５）。 ４ＮＯまたは４ＮＯＭのいずれもこの濃度ではＥ２結合の５０％を置換せず、したがって、これらの親和定数は決定することができなかった（表５）。
コルヒチン置換実験の結果は、２ＭＥＯはチューブリンに対しｐＩＣ ５０ ４．８を有していたが、どの試験化合物も最大１００μＭまでの濃度では有意なコルヒチンの置換を示さなかったことを実証した。 チューブリンに対する試験化合物の親和性が比較的弱いとすれば、これらの化合物である試験化合物の抗増殖活性が微小管動態の一般的な分裂により媒介される可能性は低いように思われる。
続けて、いくつかの開示化合物について、上述したラット子宮の細胞基質調製物から３Ｈ−エストラジオールを置換する能力を調べた。 これらのアッセイの結果を表４のＦ欄にまとめる。 例外なく、表４に例示した化合物は、細胞基質のエストロゲン受容体に対する親和性が２−メトキシエストラジオールが有するものよりも低かった。
ＥＲに対する試験化合物の親和性が非常に低いとすれば、これらの化合物の動作態様はこの受容体を介していないと思われるであろう。 （実施例４５）
（試験化合物がヒト気道平滑筋細胞によるインターロイキン−１αに媒介されるＧＭ−ＣＳＦ産生に与える影響）
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、インターロイキン−１、リポ多糖類およびディーゼル排気（Ritzらの論文、2002）と同様に多様な炎症誘発性刺激による刺激下で、幅広い多様な異なる細胞型により産生されるサイトカインである。 ＧＭ−ＣＳＦは、関節リウマチ、喘息、敗血症およびアレルギー性鼻炎を含む様々な異なる炎症性疾患に関与する。 ＧＭ−ＣＳＦは程度の差はあれ、あらゆる組織の炎症に関係していると思われる（Hamiltonの論文、2002）。
間葉細胞、線維芽細胞および平滑筋細胞が、炎症性疾患におけるサイトカインの重要な役割に有意に寄与することが今や確立されている。 特に、気道平滑筋細胞が炎症性サイトカインを産生する能力の十分な証拠がある（Panettieriの論文、2002）。 これらの連関により、４ＮＯのＧＭ−ＣＳＦに対する阻害作用が潜在的に重要な抗炎症作用を構成するであろうというこの提案を可能にしている。 ４ＮＯの潜在的な抗炎症作用を調査するために、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）がインターロイキン−１α（１ｎｇ／ｍｌ）により媒介されるＨＡＳＭ産生に与えるその影響を調べた。 （ＧＭ−ＣＳＦレベルの測定）
ＧＭ−ＣＳＦレベルの測定は、ＥＬＩＳＡを用いて定量化した。 ＥＬＩＳＡプレートを、ラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル被覆抗体（１μｇ／ｍｌ、Endogen、ＭＡ、ＵＳＡ、０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ９．４〜９．８）で被覆し、次いで、放置して室温で一晩インキュベートした。
プレートを緩衝液（０．１％ Tween-20を含むＰＢＳ、ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液（４％ＦＣＳを含むＰＢＳ）と共に１時間インキュベートした。 ＰＢＳで希釈した、ビオチン標識したラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体（０．２５μｇ／ｍｌ、Endogen）を、試料またはヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ標準物質（０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲、Endogen）と共に室温で２時間インキュベートし、その後十分に洗浄した。 ３０分間、製造元（Endogen）より提供された方法により、ポリＨＲＰ−ストレプトアビジン溶液（Endogen）および基質として３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（BD PharMingen、San Diego、ＣＡ）と共にインキュベートしている間にシグナルが生じ、吸収を４５０ｎｍで測定した（Victor 1420 Multilabel Counter、Wallac）。 これらの実験の結果を図７に示す。 データは、試験化合物で前処理したＩＬ−１α−刺激細胞の培養上清液で検出されたＧＭ−ＣＳＦレベルの割合として示し、平均および平均の標準偏差として示す。 ４ＮＯは、２ＭＥＯよりも多くＧＭ−ＣＳＦ産生を減少させた。
続いて、その他の開示化合物について、上述したアッセイ系でそれらがＧＭ−ＣＳＦ産生を阻害する能力を試験した。 これらの結果を表４のＤ欄にまとめる。 試験した化合物のうち３つ、ＣＰ−ＤＭ−３−１１９、ＣＰ−ＤＭ−３−１０３およびＣＰ−ＤＭ−４−３５は、２−メトキシエストラジオールと比較してＨＡＳＭ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ産生を阻害しないか、またはわずかしか阻害しなかったが、１つの化合物、ＣＰ−ＤＭ−３−１０２は劇的に一層効果的であった。 この阻害作用の変化の理由は、現在明らかではなく、各時点で試験した試料の数は比較的少なかったので、試験試料の数を増やしてさらに実験することが、これらの結果を確認するのに役立つであろう。 その他の開示化合物についても、このアッセイ系を用いて試験し得るであろう。
平滑筋におけるＧＭ−ＣＳＦ産生の減少は、炎症反応の強度および期間に重要な影響をもたらし得るであろう。 さらに、グルココルチコイドなどの他の試薬はＧＭ−ＣＳＦを産生するすべての細胞型に作用してその産生を阻害すると思われるので、４ＮＯのＧＭ−ＣＳＦ産生に対する阻害効果はＧＭ−ＣＳＦを産生する多くの他の細胞型で生じるであろうと思われる。 （実施例４６）
（試験化合物が動物モデルの気道過敏症に与える影響）
気道内のアレルギー反応の病理学的根拠を特性付け、かつ、既存および新規の抗喘息薬の作用を調査するためにマウスが広く用いられてきた。 マウスモデルは、多くの研究者により、新規な抗喘息薬の潜在的な有効性の証拠を得るための臨床モデルとして認識されており（GleichおよびKitaの論文、1997）、製薬産業では広くこの目的に使用されている。 この利用は、最も重要な種類の予防薬である、グルココルチコイドの有効性を示すマウスモデルにより支持されている（例えばWalterらの論文、2002を参照のこと）。 （感作および抗原誘発）
６〜８週齢の意識のある雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、０日目および１２日目に５０μｇのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ水酸化アルミニウム中）を０．２ｍｌ腹腔内注射することにより感作させ、続いて、２０〜２８日目に３０分間、ＯＶＡ（１％ｗ／ｖ）／ＦＣＳ（５％ｖ／ｖ）のエアロゾルで誘発させた。 エアロゾルの曝露は、この齧歯類を全身プレスチモグラフ装置に入れ、次いで、薬剤をチャンバーの上側に位置する挿入口よりチャンバー内に噴霧することにより行った。 エアロゾルはチャンバーからバイアス流れによって粒子トラップに排出された。 抗原誘発は、気道抵抗の検出可能な増加を引き起こさなかった。 また、障害の兆候はない。
薬物が気道過敏症の進行に与える影響を確認するために、薬物療法を施した。 薬物療法は、ＯＶＡに最初に曝した日（２０日目）の前日（１９日目）に開始し、マウスをＯＶＡで誘発させた期間を通して続けた。 薬物療法は、４ＮＯまたは２ＭＥＯを毎日１回、ＯＶＡ曝露の２時間前に、体積１００μＬの１０％ＤＭＳＯ／９０％ピーナツ油をビヒクルとして腹腔内または経口のいずれかで各５０ｍｇ／ｋｇで投与することからなる。
２６〜２８日の感作および誘発手順後、気管支収縮剤であるメタコリンに応答した気道閉塞を測定した。 マウスをケタミン／キシラジンの混合物で麻痺させた。 気管開口術を行い、カテーテルを頚静脈に挿入し、メタコリンを静脈内に投与した。 次いで、マウスを全身プレスチモグラフに入れ、人工呼吸器を装着した（１回呼吸量１０ｍｌ／ｋｇで１５０呼吸／分）。 一方のポートがプレチスモグラフの内部に結合され、他方が気管内カニューレに結合された差圧変換器で肺圧差を測定した。 呼気流率を、呼吸気流計を用いて測定した。 静脈内のメタコリン（１〜１０００μｇ／ｋｇ、４分間隔の場合）に応答した気道抵抗の変化を、Buxco pulmonary mechanics analyzerを用いてオンラインで測定した。
これらの実験の結果を図８および９に示す。
２ＭＥＯまたは４ＮＯのいずれかを５０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に供与することによるオボアルブミン誘発マウス（ｖｅｈ−ＯＶＡ）の治療が、腹腔内投与されたメタコリンに対する気道反応性に与える影響を図８に示す。 試験化合物を５０ｍｇ／ｋｇ／日で経口で供与した場合の治療効果を図９に示す。 データは、ベースライン値からの呼吸抵抗の変化で表し、平均および平均の標準偏差として示す。
ＯＶＡ誘発（veh-OVA）により増加したメタコリンに対する気道反応性を、非誘発マウス（veh-SAL）で検出されたものと比較した。
腹腔内または経口で投与した場合、４ＮＯまたは２ＭＥＯの両方共、誘発後に示された呼吸抵抗の増加を減少させることが可能であった。 （実施例４７）
（試験化合物がヒト肺線維芽細胞の増殖に与える影響）
ヒト肺移植患者由来の柔組織の試料を胸膜から切除し、１ｍｍ ２未満の小片に切り刻み、血清（１０％）および抗菌剤（ＨＡＳＭ培養のために使用）を含む最少量のＤＭＥＭでプラスチック製培養皿に付着させた。 組織小片を皿の底面に付着させた後、さらに培養液を加えた。 培養液は週に２回取り替え、移植片培養物を形成し、この時点で組織小片を除去し、細胞を毎週トリプシンに曝すことにより１：３の分割比で継代し、肺線維芽細胞培養物を調製した。
試験化合物の存在または非存在下で、肺線維芽細胞を血清欠乏性のＤＭＥＭで２４時間培養し、次いで、３００ｐＭ ｂＦＧＦで４８時間刺激し、その後回収し、生存細胞を計数した。 これらの実験の結果を図１１に示す。 増加した肺線維芽細胞数を、１〜１０００ｎＭの濃度範囲の４ＮＯＭで阻害した。 ４ＮＯは、同じ濃度範囲でｂＦＧＦに対する肺線維芽細胞の増殖反応を著しく減少させた。 続いて、一連の開示化合物を上記アッセイ系を用いて調べた。 結果を表４のＥ欄にまとめる。 データは、少なくとも３体のドナー由来の細胞系での３つの別々の実験の最小値のｂＦＧＦ（３００ｐＭ）により誘発される増殖の阻害の平均および平均の標準偏差として示す。 １μＭで、４ＮＯＭおよびいくつかの他の化合物は有意な阻害活性を示した。 柔組織の線維芽細胞の増殖は肺線維症の進行で重要である。 したがって、現在の観察は、開示化合物が気道および肺の繊維化状態の治療可能性を有していることを示唆している。
気道線維芽細胞もまた気道のバイオプシーからの移植片培養により得た。 さらに限定した一連の実験は、３μＭの４ＮＯおよび４ＮＯＭがｂＦＧＦ（３００ｐＭ）で誘発される増殖をそれぞれ５５±２０％および５０±２４％減少させたことを示した。 したがって、これらの化合物は多様な組織源からの線維芽細胞に対して活性を有していると思われ、このことは線維芽細胞の機能障害に関連する疾患の治療可能性を示唆している。 さらに、これは、線維芽細胞本来のものである、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトロンビンにより誘発される増殖に対するそれぞれ２６±１２％および６８±１０％の４ＮＯおよび４ＮＯＭの阻害効果により支持され、このことは化合物が身体の他の部位で抗繊維化活性を有していることを当然予期し得るであろうことを示唆している。
これらのアッセイを、これらおよび他の組織源由来の線維芽細胞に対する他の開示化合物の抗増殖活性を測定するのに用いてもよい。 （実施例４８）
（試験化合物がサイクリンＤ１発現に与える効果）
増殖実験では、ヒト気道平滑筋細胞を上述のように培養した。 細胞は、２４時間血清欠乏状態にし、トロンビン（０．３Ｕ／ｍｌ）で８時間刺激し、その後サイクリンＤ１のウエスタンブロット法のためのタンパク質を回収した。 ＨＡＳＭを４ＮＯ（０．０１μＭ〜１μＭ）と共にプレインキュベートすることにより、サイクリンＤ１タンパク質レベルで濃度依存性の減少を生じた。 これらの結果を、図１０に図示する。 サイクリンＤ１の減少は、Ｓ期への細胞の移行が遅れ、かつ／または縮小されるであろうこと、したがって、それが増殖アッセイの４８時間の時点で観察された細胞数の減少を一部説明するであろうことを示唆している。 （実施例４９）
（試験化合物がヒト気道平滑筋細胞遊走に与える影響）
アッセイを開始する前に、直径６．５ｍｍおよび孔径８ｍｍのCostar transwell培養インサート（Corning Inc、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチン（ウシの皮膚、Sigma、ＵＳＡ）により一晩４℃で被覆した（Boyden chamberアッセイの改良）。 アッセイ開始前に、ＨＡＳＭ細胞を２４時間血清欠乏状態にした。 試験化合物の１つで３０分間前処理をしまたは前処理をしないで、細胞をtranswellインサートの上部に加えた。 血小板由来増殖因子（ＢＢ）（１ｎｇ／ｍｌ）を下側の区画に加え、細胞遊走を刺激し、チャンバーおよび細胞を５時間放置した。 この期間後に、付着細胞を有するメンブランをＰＢＳで洗浄し、２分間、DiffQuick（Lab Aids、Ａｕｓ）固定液で固定化し、次いで、DiffQuickで染色した。 次いで、メンブランをＰＢＳで２回洗浄し、インサートをはがし、スライドに置いた。 メンブランを光学顕微鏡により視覚化し、遊走した細胞の数を５つのフィールドで（×４００）、３回ずつ計数した。 この実験の結果を図１２に示す。
多孔質膜の下側に現れているＨＡＳＭの数を計数し、その応答を前処理なしのＰＤＧＦに応じて遊走する細胞数の割合として示した。 ２ＭＥＯまたは４ＮＯのいずれかで前処理したＨＡＳＭは、ＰＤＧＦに応答する遊走レベルの有意な減少を示した。 （実施例５０）
（平滑筋および線維芽細胞に関連する疾患のin vitroでの評価）
（血管平滑筋）
血管平滑筋の増殖に対する薬物の影響の評価は、血管リモデリングの阻害において有用性を有する薬物の活性に関する十分確立した選別法である。 血管リモデリングは、動脈性（冠血管など）の血管形成後に全身性および肺高血圧症、アテローム性動脈硬化症、および再狭窄を生じる。 （血管平滑筋の増殖）
詳細に記載された前述した方法（CampbellおよびCampbellの論文、1993）にしたがって、血管平滑筋を培養する。 血管平滑筋は、ラット大動脈、ウシ大動脈、またはウシ肺動脈のいずれかから得る。 内皮を剥離して除き、内膜を外膜から切除した。 次いで、内膜を小さい（２ｍｍ ３ ）断片に切り刻み、コラゲナーゼおよびエラスターゼで１つまたはいくつかの細胞の懸濁液となるまで消化させた。 次いで、細胞懸濁液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２％ウシ胎児血清を含む）（ＦＣＳ）で２回洗浄し、細胞を１つの７５ｃｍ ２フラスコ内の抗菌剤および１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に蒔いた。 細胞をトリプシン（０．１％ｗ／ｖＥＤＴＡを含むＣａ ２＋を含まないＰＢＳ中で０．５％ｗ／ｖ）に曝して毎週継代する（Tomlinson、Croftらの論文、1994）。 ＶＡＳＭ増殖を、サブコンフルエント密度の１０ ４細胞／ｃｍ ２で細胞を６ウェル組織培養プレートに蒔いて評価した。 ７２時間後に、培地をウシ胎児血清が欠乏した培地に取り替える。 さらに２４時間後に、細胞を、インスリン、セレンおよびトランスフェリンを含む血清フリー培地サプリメントと共に一連の濃度の特定のマイトジェンで刺激する。 この適用化合物を評価すべき場合には、これらを１ｐＭから１０μＭの濃度範囲でマイトジェンの３０分前に加える。 マイトジェンと共に細胞を４８時間インキュベートした後、細胞をトリプシンに曝して組織培養プレートから除く。 細胞懸濁液を１０００ｇ（外界温度）の遠心分離により単離し、細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳに再懸濁させ、その後、血球計算器を用いて計数する。 さらに、細胞のアリコートをヨウ化プロピジウムと共にＲＮＡ分解酵素を含む透過性固定化緩衝液の存在下および非存在下でインキュベートし、生存不能な細胞の計数を可能とし、また以前の研究で記載されたＤＮＡ含量のフローサイトメトリーによる評価用に細胞を調製する（Berk、Elderらの論文、1990; Fernandes、Guidaらの論文、1999）。
培養した細胞におけるin vitroでの平滑筋の増殖の調節を評価している以前の研究は、アテローム性動脈硬化症などの平滑筋関連の疾患を治療するのに有用な薬物の増殖抑制効果を示しており（HupfeldおよびWeissの論文、2001; Mattingly、Gibbsらの論文、2002）、したがってこれらのアッセイを、開示化合物の有効性を予想するのに用いてもよい。 （平滑筋肥大）
平滑筋の肥大反応は、高血圧症、気管壁リモデリング、および前立腺肥大症を含むいくつかの疾患で重要である。 培養した平滑筋の肥大反応は、非固定細胞懸濁液中の前方散乱光量を測定することにより評価し得る（Uhal、Ramosらの論文、1998）。 細胞を６ウェル組織培養プレートに蒔き、４８〜７２時間後に、培地を２４時間ウシ胎児血清が欠乏しているものと取り替える。 潜在的な肥大因子を、７日までの様々な期間の間、インスリン、トランスフェリンおよびセレンの混合物と共に加え、この時点でトリプシンに短時間曝して付着細胞を回収する。 細胞を２％ウシ胎児血清およびヨウ化プロピジウム含有ＰＢＳ中でインキュベートして、生存不能な細胞を分析から排除することを可能とする。 前方散乱光の増加は、細胞の大きさの増大を示す。 さらに、肥大は細胞１つ当たりのタンパク質の量を測定することにより（Isaeff、Goyaらの論文、1993; Blennerhassett、Bovellらの論文、1999）または培地のＤＮＡ量に対して標準化されたタンパク質合成速度を測定することにより（McKay、de Jongsteらの論文、1998）間接的に測定し得る。 （平滑筋収縮機能）
血管、気道、子宮、膀胱および胃腸の平滑筋の調製は、３７℃に維持したガラスで被覆された器官槽内の標準的な生理食塩水（例えば、Krebs液）中で行う。 組織は、環または条片として調製し、次いで一端がクランプに固定され、他端が従前に較正された力変換器に結合された金属フック間に吊るす。 ２ＭＥＯアナログの影響を、１ｐＭから１０ １０μＭの上昇濃度で器官槽に直接加えることにより調べる。 その特定の組織に関連のある刺激に対する調製物の収縮または弛緩応答のいずれかに与えるアナログの影響を調べることにより、間接的効果を評価する。 これらの方法は、一般的な用法であり、以下の引用文献に例示されている（Armour、Lazarらの論文、1984; Arthur、Yinらの論文、1997; Andersen、Weisらの論文、1999）。 （平滑筋のサイトカイン産生）
適当な刺激をかけた場合に、多様な組織源の平滑筋が広い範囲の異なるサイトカインを産生する能力を有していることが明らかであった（John、Auらの論文、1998）。 サイトカイン産生は、培地に保存し、特にリポ多糖類、インターロイキン−１α、腫瘍壊死因子−αを含むサイトカイン産生に対する刺激に加えて２ＭＥＯアナログと共にインキュベートした細胞の上澄液を回収することにより容易に測定される。 平滑筋により産生されるサイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−８、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳを含む。 これらのサイトカインを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定して、分泌されたタンパク質レベルを決定する。 さらに、各サイトカインごとに特異的なメッセンジャーＲＮＡを実時間ＰＣＲまたはノーザンブロット法により定量的に測定し得る。 （線維芽細胞の機能）
異なる組織源の培養線維芽細胞において測定可能な線維芽細胞の機能のいくつかは、線維芽細胞が病原に寄与する疾患の活性の前兆とみなされている。 このような疾患としては、これらに限定するものではないが、肺線維症、閉塞性細気管支炎などの気道繊維症、心臓繊維症および他の組織で発生する繊維症が挙げられる。 これらの機能としては、増殖、サイトカイン産生、細胞外マトリックス産生、細胞遊走および収縮が挙げられ、また、病変に関連する臓器由来の線維芽細胞の細胞培養で容易に測定される（Bishop、Mitchellらの論文、1993; Butt、Laurentらの論文、1995; Dube、Chakirらの論文、1998）。 （線維芽細胞の培養）
線維芽細胞は、皮膚、肺実質、気道バイオプシー、心臓組織および包皮を含む広い範囲の組織バイオプシーから培養してもよい。 気道バイオプシー由来の線維芽細胞は、移植片培養により育成される（Dube、Chakirらの論文、1998）。 さらに、線維芽細胞生存特性が疾患過程により変わる可能性がある場合には、線維芽細胞は肺末梢部などの繊維性臓器のバイオプシー組織からも得られる（Ramos、Montanoらの論文、2001）。 （実施例５１）
（平滑筋および線維芽細胞に関連する病変の評価における前臨床動物モデル）
（アテローム性動脈硬化症／再狭窄）
アテローム性動脈硬化症／再狭窄の動物モデルの多くは、血管内膜損傷の進行に与える薬物の影響を評価するために一般に用いられる（Karasの論文、2002; HodginおよびMaedaの論文、2002）。 このようなモデルの利点が、近年の出版物で論じられている（Van Put、Van Hoveらの論文、1995; Hickey、Makdissiらの論文、1996）。 程度の差はあれＡｐｏＥ欠損症を示すマウスモデルは、食事の調節により加速され得るアテローム性動脈硬化部の進行を示す。 さらに、頸動脈の周囲に非密封性カフを用いたウサギのモデルは、最小の直接的内皮損傷がある７〜１０日の期間内に新たな内膜損傷を誘発する。 アテローム性動脈硬化症のこれらのモデルは通常新規抗アテローム硬化性剤の選別に用いられており、ヒト疾患に活性がある化合物の多くがこのモデルでも活性であることを示している（Arthur、Yinらの論文、1997; Karasの論文、2002）。 このモデルでは、内皮損傷の進行前に内皮機能不全が検出可能である。 アテローム性動脈硬化症の様々な複合モデルで、粥腫崩壊を誘発することが可能であり、ＡｐｏＥ欠損症マウスモデルでも報告されている（Rekhterの論文、2002）。 再狭窄は、ラット頸動脈内皮でのバルーンカテーテル表皮削剥により、より具体的にモデル化し得る（Nili、Zhangらの論文、2002）。 （前立腺肥大）
前立腺肥大は、フェニレフリンなどの交感神経様作用薬の皮下注射により慢性的に治療したラットまたはマウスで調査する（Marineseらの論文、2003）。 （肺高血圧）
実験動物の肺高血圧の進行は、低酸素に慢性曝露させることによりまたはモノクロタリンを注射することにより誘発させ得る（JefferyおよびWanstallの論文、2001; Wanstall、Gambinoらの論文、2002）。 マウスまたはラットの低酸素症は右心室肥大を引き起こし、これは１０％の酸素を含む環境下で４週間動物を飼育した後、組織学的方法により検出し得る肺動脈の厚みを増大させる。 （全身性高血圧）
特許請求の範囲に現在記載されている化合物の降圧作用を評価するための膨大な数のモデルがある。 ＰｕｂＭｅｄなどの電子データベースを参照することにより、熟練した研究者は異なる種から様々なモデルを選択することが可能となるであろう。 試薬は遺伝子成分を有するモデル（例えば、自然発生高血圧ラット、ＳＨＲで）、有意な腎臓成分を有するモデル、ならびに同時発生的な肥満および／または糖尿病を有するモデルで評価されることは十分理解されるであろう（例えば、Haff、Pageらの論文、1977; Dominiczak、Devlinらの論文、1997; Sechiの論文、1999; Gerin、Pickeringらの論文、2000; StollおよびJacobの論文、2001; Sugiyama、Yagamiらの論文、2001を参照のこと）。 さらに、全身性血圧に与える影響の測定に加えて、左心室肥大などの関連する病変（左心室：全体重比の比として決定）を判定する。 （繊維症）
実験動物で多くの繊維症のモデルがあるが、ブレオマイシン誘導は疾患誘発の最も一般的な一手法であると思われる。 例えば、１４日間にわたるマウスの局所的な皮下注射は、容易に測定可能な皮膚の厚みおよび皮膚のコラーゲン含量の増加を伴う皮膚の硬化を誘発する（Murota、Hamasakiらの論文、2003）。 開示化合物の評価に特定の関連があるものとしては、ブレオマイシンの気管内注入により誘発されるよく特徴付けされた肺繊維症のモデルがある（Chang、Nakaoらの論文、1980; Evans、McAnultyらの論文、1990; Tani、Yasuokaらの論文、1991）。
ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７の活性を、肺繊維症のブレオマイシンモデルを用いて調査した（Underwoodらの論文、2000）。 ブレオマイシン誘発の日に、マウスがブレオマイシンを受ける２時間前に４ＮＯを毎日投与することを開始した。 次いで、４ＮＯ（５０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内注射による）を１４日間を通じて投与した。 マウスはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の注射も毎日受けた（腹腔内注射による）。 対照およびブレオマイシン処置した他の２つのマウスの集団は毎日ＢｒｄＵを含むビヒクルの腹腔内注射を受けた。 ビヒクルは、１０％ジメチルスルホキシドのピーナツ油からなった。
生理食塩水に溶かした１２５ｍＵｎｉｔを含む３５ｐｌの経鼻投与の一滴の液滴としてブレオマイシンを１日目に投与した。 Penthrane吸入麻酔薬によりマウスを最初軽く麻痺させた。 マウスによる液滴の鼻孔への適用および液滴の吸入後、マウスを角度４５°に維持してブレオマイシンの肺への分布を可能とさせた。 体重を実験を通して測定した。 ブレオマイシン投与後１２日目から１４日目の間の実験終了時に、マウスをケタミンおよびキシラジンの混合物で麻痺させ、呼吸抵抗およびコンプライアンスを全身プレチスモグラフ（Buxco Inc.）を用いて記録する準備をした。 マウスに１５０呼吸／分、１回呼吸量１５０μＬで、人工呼吸器を装着させた。 ５分の安定化後、耐性およびコンプライアンスの値を記録し、動物を致死量のペントバルビタール（pentabarbitone）により屠殺した。
次いで、各集団の半分の動物を、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）にかけてＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を得て、浸潤細胞の数を血球計算法により計数した。 集団の半分の動物の肺を瞬間凍結させた。 集団の残りの半分のマウスの肺を２５ｃｍＨ ２ Ｏの圧力で緩衝生理食塩水の注入により固定し、２０分後に同じ固定液を含むビーカーに移した。 次いで、これらの検体をパラフィン処理し、後に切片化し（５ミクロン切片）、検体を得た治療集団について盲検とした研究者により標準的方法でヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて形態を分析させた。 さらに、切片はMasson's trichrome染色を用いてコラーゲンの染色もした。 さらに切片をＢｒｄＵ陽性細胞核用に準備した。 この染色があれば、ＢｒＤＵが投与された期間に細胞がＤＮＡ合成を行ったことを示し、したがって細胞増殖の指標としての役割を果たす。 表６に示した組織領域は、倍率１００倍で肺切片の画像を記録し、これらの画像をパワーポイントファイルにインポートすることにより決定した。 記録画像全体をカバーする少なくとも１０個の交点を有するオーバーレイグリッドを、領域を確認するために用い、次いで、倍率６００×で調べて、Image pro softwareにより記録した。
次いで、３６点のオーバーレイを記録画像に適用し、組織と交わるグリッド点の数を１０個の選択したフィールドごとに決定した。 表６に示したデータは、組織と重なるグリッド点の割合を示す。
繊維症のスコアを、低倍率（倍率１０×）の画像で形態学的に決定されるように繊維症領域をトレースし、肺全体の横断面を含む切片の全領域の割合としてこれを表すことにより決定した。 繊維症の領域内で、繊維性病変の重症度の評価を６段階評価を用いて行った。 ここで０は、正常な肺組織の構造を示し、６は線維芽細胞および炎症細胞浸潤物を有する空隙の完全な硬化を示す。 表６に示すデータは、患部割合×その重症度の平均を示す。
細胞増殖を、主要な気道でＢｒｄＵ陽性核の数を測定し、核の合計数の割合として示すことにより、２つの肺葉の各々の主要な実質内気道で決定した。 細胞は、気管壁において、形態および位置に基づいて、上皮または間葉（平滑筋または線維芽細胞）であると同定した。 データは、４ＮＯ処置が選択的に間葉細胞の増殖を減弱化させることを示している。
３つの集団のマウスの最初の体重は、差異はなかった。 １２〜１４日の治療の後、対照マウスは体重が増え、ブレオマイシン／ビヒクルマウスは体重が減り、ブレオマイシン／４ＮＯで処置した集団は有意な変化を示さなかった。 ビヒクル／ブレオマイシンで処置したマウスでは、気道抵抗が顕著に増加したが、ブレオマイシン／４ＮＯで処置したものでは増加しなかった。 ４ＮＯ処置に関わりなく、ブレオマイシン処置マウスでは、コンプライアンスは顕著に減少した。 ビヒクル／ブレオマイシンで処置したマウスでは、ＢＡＬＦ中の炎症性リンパ球／白血球の数は顕著に増加したが、ブレオマイシン／４ＮＯ処置したものでは増加しなかった。 ブレオマイシン／ビヒクルマウスでは、繊維症スコアおよび組織の領域の両方とも増加したが、ブレオマイシン／４ＮＯ処置したものでは増加しなかった。
マウスの肝臓で繊維症を誘発させる四塩化炭素と共にカルボニル鉄を投与するなどの代わりの繊維症の動物モデルも利用可能である（Arezzini、Lunghiらの論文、2003）。 マウスの気道の繊維症は、従前にオボアルブミンの腹腔内注射により感作されたマウスにオボアルブミンを繰り返し投与することにより誘発させ得る（Blyth、Whartonらの論文、2000; Kuhn、Homerらの論文、2000; Wills-Karpの論文、2001）。 （肺炎症）
リポ多糖（ＬＰＳ）の投与により生じる肺炎症モデル（Bozinvskiらの論文、「マウス肺におけるＬＰＳに対する先天性免疫応答はＴＬＲ−４の抑制を介したＧＭ−ＣＳＦの中和によって抑制され、逆転する」、Am J Physiol LCMP (2004) 286: L877-L885）を、特定の開示化合物が肺炎症を阻止する能力を調査するために用いた。
肺炎症に与える影響を確認するために、雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ビヒクル（ブレオマイシンの実験で上述したもの）、ＣＰ−ＤＭ−４−３５または４ＮＯのいずれかを各々１５０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内注射することにより準備し、２時間後に、以前に記載したようにＬＰＳ ３５μＬ（合計ＬＰＳ １μｇでは）を鼻腔内投与した。 ＬＰＳ投与の２４時間後、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与によりマウスを屠殺し、気管をカニューレ処理してＢＡＬをできるようにし、炎症性リンパ球および白血球の計数用に採取して、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬キットを用いてタンパク質レベルを決定した。 さらに、ＢＡＬＦ中の活性ＭＭＰ−９量を、十分確立した手順を用いて酵素電気泳動法により決定した（例えば、Johnson S、Knox Aの論文、「マトリックスメタロプロテイナーゼ−２の自己分泌産生はヒト気道平滑筋増殖に必要とされる」、1999 Dec; 277 (6 Pt 1): L1109-17参照のこと）。 ４ＮＯおよびＣＰ−ＤＭ−４−３５の両方とも細胞数を減少させるという傾向があったにもかかわらず、ＬＰＳ（１μｇ）は、各集団でＢＡＬＦの細胞数を著しく増加させた（表７）。 ＢＡＬＦ中のタンパク質レベルはＬＰＳ／ビヒクルマウスで増加したが、ＬＰＳ誘導前に４ＮＯまたはＣＰ−ＤＭ−４−３５で前処置したものでは増加しなかった。 ＬＰＳ／ビヒクル処置動物では、活性ＭＭＰ−９レベルは顕著に増加したが、ＬＰＳ誘導前に４ＮＯまたはＣＰ−ＤＭ−４−３５で前処置したものでは増加しなかった。
肺炎症におけるグルココルチコイド化合物の既知の抗炎症活性およびこれらの化合物が他の組織でも炎症を阻害するという既知の能力を考慮すると、本願で開示されている化合物が身体の他の部位で抗炎症活性を有するであろうという妥当な予想がされる。
（実施例５２）
（平滑筋および線維芽細胞に関連する病変の臨床的評価）
喘息の臨床的評価については近年の文献によく記載されている。 新規抗喘息薬を、特定の重症度の喘息の現在最も実践的な治療と比較して評価することを検討中である。 中等度の喘息では、救命（短時間作用型β作動薬）治療の使用率、経口グルココルチコイドまたは入院の短期コースの要件として定義される喘息の悪化の数、ＦＥＶ １ 、日誌カードに基づく排尿症状スコア、生活の質、喘息対照の損失なしのグルココルチコイド保持レベルを含む新たな治療を評価するために、いくつかの臨床的エンドポイントが用いられるであろう（Lemanske、Sorknessらの論文、2001; Lemanske、Nayakらの論文、2002）。 いくつかの研究で、試験的治療の開始時と終了時に得た気道バイオプシーで喘息病理の再構築成分を特に調べてきた（Sont、Willemsらの論文、1999)。 このようなバイオプシーでは、平滑筋および結合組織の量、細胞の増殖のマーカーを示す細胞分画、および上皮損傷の度合を測定することが実行可能である（Druilhe、Wallaertらの論文、1998; Benayoun、Druilheらの論文、2003）。 （再狭窄）
再狭窄は、いくつかのエンドポイントにより臨床試験で評価し得る。 間接的転帰には、心筋梗塞の罹患および狭心症の罹患が含まれる。 さらに、新生内膜は、Ｘ線撮影または超音波系のアプローチを用い、血管造影により直接測定し得る（Topol、Califfらの論文、1994; Brack、Rayらの論文、1995; Leon、Baimらの論文、1998; Serruys、Foleyらの論文、2001）。 （肺繊維症）
臨床研究における肺繊維症の状態は、ばち指、放射線学的異常および肺機能検査などの臨床的測定により証明される（talmadge king）。 これらの疾患の特徴と疾患の進行との関連性および新規治療の評価におけるこれらの重要性は、利用可能な文献の系統的概説に基づくコンセンサスにより実証されてきた（Lipinski、Blackらの論文、1975; Kingの論文、2000; King、Toozeらの論文、2001; Selman、Kingらの論文、2001）。 （平滑筋および線維芽細胞に関わるその他の疾患）
線維芽細胞および平滑筋機能が変化する他の疾患における新規薬剤の評価に、様々な十分確立された臨床的手順が利用可能である。 熟練した研究者は、ＰｕｂＭｅｄなどの公有のドメインデータベースをサーチすることによりこれらの手順を評価および実行することが可能であろう。
本発明の趣旨および範囲を逸脱しなければ多くの改変がなされてもよいことは、本発明の当業者には理解されるであろう。
有用な参考として、下記表に本明細書を通じて用いられている化合物ＩＤ番号およびそれらの関連する化学名を挙げる。
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ヒト気道平滑筋培養細胞でトロンビン媒介細胞分割を抑制する２−メトキシエストラジオール（２ＭＥＯ）の効果および効力を２つの化合物、すなわち４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）および４ＮＯＭ（ＣＰ−ＤＭ−３−９１）と比較して示す図である。 ５％のウシ胎仔血清に応じるＩＩ型気道上皮細胞系Ａ５４９の増殖を抑制する２ＭＥＯ、４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）および４ＮＯＭ（ＣＰ−ＤＭ−３−９１）の効果および効力の比較を示す図である。 ５％のウシ胎仔血清または３００ｐＭの上皮成長因子に応じるエストロゲン受容体を発現している乳房腫瘍細胞系ＭＣＦ７の増殖を抑制する２ＭＥＯおよび４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果および効力の比較を示す図である。 ５％のウシ胎仔血清に応じるウシ大動脈内皮の培養細胞の増殖を抑制する２ＭＥＯおよび４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果および効力の比較を示す図である。 組織培養プラスチック上で培養されたヒト気道平滑筋細胞の塩基性線維芽細胞成長因子の媒介による増殖を抑制する４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）およびデキサメタゾンの効果および効力の比較を示す図である。 コラーゲンでコーティングされたサイラスティック上で培養されたヒト気道平滑筋細胞の塩基性線維芽細胞成長因子の媒介による増殖を抑制する４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）およびデキサメタゾンの効果および効力の比較を示す図である。 ヒト気道平滑筋培養細胞からのインターロイキン１の媒介による顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の放出を抑制する２ＭＥＯおよび４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果および効力の比較を示す図である。 オボアルブミンに感作されたマウスにおける気管支収縮剤メタコリンの静脈内チャレンジに対する気道過敏症を抑制する、腹腔内投与された２ＭＥＯおよび４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果および効力の比較を示す図である。 オボアルブミンに感作されたマウスにおける気管支収縮剤メタコリンの静脈内チャレンジに対する気道過敏症を抑制する、経口投与された２ＭＥＯおよび４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果および効力の比較を示す図である。 塩基性線維芽細胞成長因子による刺激に応じる肺線維芽細胞の増殖を抑制する４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）および４ＮＯＭ（「４ＮＯ−ｍｅｎｏｘ」）（ＣＰ−ＤＭ−３−９１）の効果および効力の比較を示す図である。 ヒト気道平滑筋細胞によるトロンビンで媒介されるサイクリンＤ１タンパク質の発現に及ぼす４ＮＯＭ（ＣＰ−ＤＭ−３−９１）によるプレインキュベーションの影響を示す図である。 血小板由来成長因子（ＢＢ）で誘発されるヒト気道平滑筋細胞の移動を抑制する２ＭＥＯまたは４ＮＯ（ＣＰ−ＤＭ−２−１１−７）の効果の比較を示す図である。 |
