생물학적 활성 분자, 그의 접합체 및 치료 용도

생물학적 활성 분자, 그의 접합체 및 치료 용도 {BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES, CONJUGATES THEREOF, AND THERAPEUTIC USES}

본 개시내용은 리간드가 링커 화합물을 통해 생물학적 활성 분자에 연결되어 있는, 리간드-생물학적 활성 분자 접합체를 제공한다. 또한, 본 개시내용은 다양한 치료 적용에서 사용하기 위한 제약 조성물에서의 접합체 화합물을 제공한다.

증식성 질환은 비정상적 세포의 제어되지 않는 성장 및 확산을 특징으로 한다. 확산이 제어되지 않는 경우, 이로 인해 사망에 이를 수 있다. 비정상적 증식, 예를 들어 암은, 외부 인자 (예를 들어, 담배, 화학물질, 방사선 및 감염성 미생물) 및 내부 인자 (유전된 돌연변이, 면역계 병태, 대사로부터 발생하는 돌연변이)에 의해 유발된다. 이들 원인 인자는 함께 또는 순차적으로 작용하여 비정상적 증식을 개시 또는 촉진할 수 있다. 암은 수술, 방사선, 화학요법, 호르몬 및 면역요법에 의해 치료된다. 그러나, 보다 효과적인 항-증식 약물에 대한 필요가 있다.

이상적인 항-증식 요법은 종양 세포로의 고도 세포독성제의 표적화된 전달을 가능하게 할 것이고 정상 세포에는 영향을 미치지 않게 할 것이다. 예를 들어 메이탄신을 이용하는 종래의 화학요법 치료는, 비-암성 세포에 대한 약물의 영향으로 발생하는 독성 부작용 때문에 한계가 있다. 단백질 및 세포의 합성을 정지시키는 독소, 예컨대 슈도모나스 또는 디프테리아 독소와의 종양 표적화된 프로브 (예컨대 항체 또는 성장 인자)의 접합체의 사용을 포함한, 표적화된 약물 전달에 대한 다양한 접근법이 시도되어 왔다. 그러나, 부작용은 접합체의 비-인간 구성요소로 인해 면역계의 반응을 포함한다. 추가로, 신장 여과를 통한 순환으로부터 소실, 및 개략적 분해, 세망내피계 (RES)에 의한 흡수, 및 비-표적화된 기관 및 조직내의 축적으로 인해 약물 접합체의 반감기가 제한되었다.

또 다른 접근법은 수동적 약물 담체, 예컨대 중합체, 리포솜, 및 중합체성 미셀을 사용하여 종양 조직의 혈관 내피의 과투과성을 이용한다. 중합체성 약물 및 마크로분자는 증진된 투과성 및 체류 메카니즘으로 인해 고형 종양 내에 축적된다. 그러나, 이러한 표적화된 전달을 사용하는 장벽은 혈액으로부터 외래 미립자의 신속한 청소, 및 종양 세포를 결합하기 위한 필요한 특이성 및 선택성을 갖춘 고도로 표준화된 제약상 허용되는 약물 전달 시스템을 얻는데 있어서의 기술적 장애를 포함한다.

따라서, 표적화된 항-증식성 화합물에 대한 필요성이 존재한다.

본 개시내용은 하기 구조 화학식 I로 표시되는 접합체 화합물에 관한 것이다:

<화학식 I>

상기 식에서,

L은 부재하거나 리간드이고;

추가로 여기서,

L이 리간드인 경우에, L은 세포 또는 세포 집단에 결합할 수 있고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

D는 생물학적 활성 분자이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

추가로 여기서 R ₄ , R ₅ 및 R ₆ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나, 스페이서이다.

또한, 본 개시내용은 하기 구조 화학식 V로 표시되는 링커-생물학적 활성 화합물을 제공한다:

<화학식 V>

상기 식에서,

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

D는 생물학적 활성 분자이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

추가로 여기서 R ₄ , R ₅ 및 R ₆ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나, 스페이서이다.

또한, 본 개시내용은 하기 구조 화학식 VI으로 표시되는 링커를 제공한다.

한 실시양태에서, 링커 화합물은 하기 화학식 VI으로 표시된다:

<화학식 VI>

상기 식에서,

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나,

여기서 A ₁ , A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -SC(=S)-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

A ₄ 및 A ₅ 는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NR ₁₈ -, -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 은 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 VI의 화합물을 제공하고, 여기서 Z ₂ 는 하기 구조 화학식으로 표시된다:

-Z _2A -Z _2B -Z _2C -Z _2D -

상기 식에서,

Z _2A , Z _2B , Z _2C 및 Z _2D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

또한, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 개시내용은 비정상적 세포 성장을 지연, 감소 또는 중단시키기에 충분한 양의 화학식 I의 화합물과 비정상적 세포를 접촉시켜 비정상적 세포 성장을 지연, 감소 또는 중단시키는 것을 포함하는, 비정상적 세포 성장을 감소, 지연 또는 중단시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 개시내용은 세포를 사멸시키기에 충분한 양의 화학식 I의 화합물과 세포를 접촉시켜 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 개시내용은 종양 크기의 감소, 종양 크기 증가의 중단, 종양 증식의 감소, 또는 종양 증식의 예방을 필요로 하는 개체에게 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여 종양 크기를 감소시키거나, 종양 크기 증가를 중단시키거나, 종양 증식을 감소시키거나, 종양 증식을 예방하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 크기 증가를 중단시키거나, 종양 증식을 감소시키거나, 종양 증식을 예방하는 방법을 제공한다.

또한, 본 개시내용은 화학식 V로 표시되는 바와 같은 전구체 생물학적 활성 분자-링커 화합물에 관한 것이다. 화학식 V의 화합물은 화학식 I의 접합체 화합물에 대한 빌딩 블록을 제공한다. 게다가, 화학식 V의 화합물은 조성물, 제약 조성물 및 제약상 허용되는 염으로서 제공될 수 있다.

추가로, 본 개시내용은 의학적 장애의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물 및/또는 제약 제제 중 어느 것의 용도를 포함한다.

추가로, 본 개시내용은 종양의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물 및/또는 제약 제제 중 어느 것의 용도를 포함한다.

도 1-8 은 다양한 암 세포주를 시험관내에서 성장시켰고 나타낸 바와 같이 항체, 유리 약물, 또는 항체-약물 접합체의 연속 희석물로 처리한 것인 세포 생존율 검정의 결과를 도시한 것이다. % 생존율을 실시예 14에 제시된 방법에 따라서 측정하였다.
도 1a 는 화합물 2로 처리된 C4-2 세포 (전립선암 세포주), 화합물 3에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-3"), 화합물 3에 접합된 항-PSMA 항체 ("PSMA-3"), 및 비접합 항-PSMA 항체 ("PSMA")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 1b 는 화합물 6으로 처리된 C4-2 세포 (전립선암 세포주), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-PSMA 항체 ("PSMA-7"), 및 비접합 항-PSMA 항체 ("PSMA")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 1c 는 화합물 25로 처리된 C4-2 세포 (전립선암 세포주), 화합물 21에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-21"), 화합물 21에 접합된 항-PSMA 항체 화합물 ("PSMA-21"), 및 비접합 항-PSMA 항체 ("PSMA")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 2 는 화합물 6으로 처리된 PC3/hSTEAP1 세포 (전립선암 세포주 발현 외인성 hSTEAP1), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-STEAP1 항체 ("STEAP1-7"), 및 비접합 항-STEAP1 항체 ("STEAP1")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 3 은 화합물 6으로 처리된 T47D 세포 (유방암 세포주), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-PRLR 항체 ("PRLR-7"), 및 비접합 항-PRLR 항체 ("PRLR")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 4 는 화합물 6으로 처리된 HEK293/hEGFRvIII 세포 (외인성 hEGFRvIII을 발현하는 HEK293 세포), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII-7"), 및 비접합 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 5 는 화합물 6으로 처리된 MMT/hEGFRvIII 세포 (외인성 hEGFRvIII을 발현하는 MMT 세포), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII-7"), 및 비접합 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 6 은 화합물 6으로 처리된 U251/hEGFRvIII 세포 (외인성 hEGFRvIII을 발현하는 U251 세포), 화합물 7에 접합된 이소형 대조군 항체 ("이소형 대조군-7"), 화합물 7에 접합된 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII-7"), 및 비접합 항-EGFRvIII 항체 ("EGFRvIII")의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 7, 패널 A 및 B 는 화합물 6, 27, 29, 및 31로 처리된 HEK293 및 U87MG 세포 각각 (모두 비접합)의 세포 생존율 결과를 나타낸다.
도 8, 패널 AE 는 화합물 6, 9, 33 및 35로 처리된 HEK293, U251, C4-2, PC3 및 MMT 세포 각각 (모두 비접합)의 세포 생존율 결과를 나타낸다.

하기 설명에서 이루어진 특정 실시양태에 대한 언급은 본 개시내용의 본질을 단지 예시하는 것으로 간주된다. 추가로, 수많은 변형 및 변화가 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이기 때문에, 본원에 기재된 바와 같은 정확한 구성 및 공정에 대한 개시내용을 제한하고자 하는 것이 아니다. 따라서, 모든 적합한 변형 및등가물은 본 개시내용의 범위 내에 속하고 이하에 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 것으로서 이용될 수 있다.

본 명세서 및 하기 청구범위에서 사용된 경우 단어 "포함하다", "포함하는", "포함한다" 및 "포함한"은 설명된 특징, 정수, 구성성분, 또는 단계의 존재를 구체화하는 것이지만, 이들은 그의 하나 이상의 추가적 특징, 정수, 구성성분, 또는 단계의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다.

본원에서의 실시양태 중 어느 한 실시양태에서 사용된 일반 용어는 다음과 같이 정의될 수 있지만; 설명된 의미는 용어 자체의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "접합체"는 리간드, 링커 및 생물학적 활성 분자를 갖는 화합물을 지칭한다. 예시적 예는 화학식 I, III 및 IV의 화합물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "스페이서"는 생물학적 활성 분자로부터 리간드를 공간적으로 분리하고 세포의 링커 내부의 이화작용을 가능하게 하기 위해 사용되는 링커의 화학적 빌딩 블록을 지칭한다. 스페이서는 Z ₁ 및 Z ₂ 로 표시될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "마크롤리드"는 마크롤리드 고리를 갖는 임의의 생물학적 활성 분자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 화학식 C _n H _{2n +1} 을 갖는 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸 등을 포함한다. 전형적인 알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 9개의 탄소 원자, 1 내지 8개의 탄소 원자, 1 내지 7개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 1 내지 5개의 탄소 원자, 1 내지 4개의 탄소 원자, 1 내지 3개의 탄소 원자, 1 내지 2의 탄소 원자 또는 1개의 탄소 원자를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴"은 전형적으로 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 1가 또는 폴리시클릭 방향족 탄화수소를 지칭한다. 아릴의 예는 페닐 (예컨대 벤젠), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 인데닐, 테트라히드로나프틸 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "알케닐"은 하나 이상의 불포화 부위를 갖는 2개 이상의 탄소 원자의 지방족 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알케닐은 R ₂ C=CR ₂ 의 화학식을 갖는다. 알케닐은 에틸레닐, 비닐, 알릴 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 삼중 결합을 함유하는 일가 지방족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알키닐은 2 내지 20개의 탄소 원자이고 (하나 이상의 삼중 결합을 포함한다). 알키닐의 예는 에티닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 헥시닐 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "시클로알킬"은 1가 포화 카보시클릭 고리 라디칼을 지칭한다. 전형적인 시클로알킬은 3 내지 7원 모노시클릭 라디칼이다. 시클로알킬의 예는 시클로헥실이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로아릴"은 5 또는 6원 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴은 질소, 황 또는 산소로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 18개의 원자까지를 포함하는 융합 고리계 (하나 이상은 방향족이어야 한다)를 포함한다. 예시적 헤테로아릴은 피리디닐, 트리아졸릴, 푸릴, 피라지닐, 티에닐, 이속사졸릴, 인다졸릴, 푸라자닐, 벤조티아졸릴, 퀴나졸리닐, 및 푸로피리디닐이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로시클릴"은 전형적으로 3 내지 18개의 탄소 원자의 포화 또는 부분 포화 카르보시클릭 라디칼을 지칭하며 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소, 인, 및 황으로부터 선택된 헤테로원자이다. 헤테로시클릴은 예를 들어 모노사이클 또는 비사이클일 수 있다. 헤테로시클릴의 예는 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로피라닐, 티옥사닐, 2H-피라닐, 디옥사닐, 디티아닐, 피페리디노 등이다.

본원에 사용된 바와 같은 어구 "제약상 허용되는 염"은 본원에 기재된 접합체 화합물, 예를 들어 화학식 I, III, IV 및 V의 화합물의 유기 및 무기 염 둘 다를 지칭한다. 염은 제약상 허용되는 염이고 술페이트, 시트레이트, 니트레이트, 포스페이트, 아스코베이트, 브로마이드, 글루코네이트, 벤조에이트, 옥살레이트, 판토테네이트 등을 포함한다. 본원에서의 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전 원자뿐만 아니라 1개 이상의 반대 이온을 포함할 수 있다는 점을 주목한다. 제약상 허용되는 염으로서 본원에서의 접합체 화합물의 제법은 통상의 기술자에게 주지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 인간 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는 예를 들어 CDR에서, 특히 CDR3에서, 인간 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는, 또 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 그래프트된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 그것이 투여되는 목적하는 효과를 초래하는 양을 지칭한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라질 것이고, 공지된 기법을 사용하는 통상의 기술자에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).

리간드 및 결합 파트너

본원에 기재된 접합체 화합물 실시양태의 유효성은 리간드의 그의 리간드 결합 파트너를 결합하는 선택성에 따라 달라진다.

한 실시양태에서, 리간드는 포유동물내에서 소정의 결합 파트너에 일부 특이성으로 결합할 수 있는 임의의 분자이며 여기서 상호작용으로 치료 용도를 초래할 수 있다. 일부 측면에서 리간드는 세포 또는 세포 집단에 결합할 수 있다.

본원에 사용하기 위한 리간드는 항체, 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 바이러스 수용체, 인터류킨, 또는 임의의 다른 세포 결합 또는 펩티드 결합 분자 또는 물질을 포함한다.

한 실시양태에서 리간드는 항체이다. 본원에 정의된 바와 같이, 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (Fab, Fab', 및 F(ab)2, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 트리바디(tribody) 등), 및 이중특이적 항체를 지칭한다. 본원에서의 항체는, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 6,596,541 및 미국 공개 번호 2012/0096572에 기재된 방법을 사용하여 인간화될 수 있다.

리간드가 항체인 경우, 이는 폴리펩티드이고 막관통 분자 (예를 들어, 수용체) 또는 성장 인자일 수 있는 항원 결합 파트너에 결합한다. 예시적 항원은, 분자, 예컨대 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질 단백질; 알파 1-항 트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 vmc, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰 빌레브란드스(von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된, 발현 및 분비된 정상 T-세포); 인간 마크로파지 염증성 단백질 (MlP-I-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질(Muellerian-inhibiting substance); 릴랙신(relaxin) A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타락타마제; DNase의; 19E; 세포 독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 성장 인자 또는 호르몬에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 뼈-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2), 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF- β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(I-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUCI, MUCI6, STEAP, CEA, TENB2, EphA 수용체, EphB 수용체, 폴레이트 수용체, FOLRI, 메소텔린, 크립토, 알파v베타6, 인테그린, VEGF, VEGFR, EGFR, 트랜스페린 수용체, lRTAI, lRTA2, lRTA3, lRTA4, lRTA5; CD 단백질, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CDII, CDI4, CDI9, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CDI52, 또는 하나 이상의 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체와 결합하는 항체 (미국 공개 번호 2008/0171040 또는 미국 공개 번호 2008/0305044에 개시되고 이들 공개의 전문이 참조로 포함됨); 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해 촉진 인자(decay accelerating factor); 바이러스 항원, 예를 들어 HIV 피막(envelope)의 부분 등; 수송 단백질; 호밍(homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDlla, CDllb, CDllc, CDI8, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 AFP, ALK, B7H4, BAGE 단백질, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9 (탄산탈수효소 IX), 카스파제-8, CD20, CD40, CD123, CDK4, CEA, CLEC12A, c-kit, cMET, CTLA4, 시클린-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, 엔도글린, Epcam, EphA2, ErbB2/Her2, ErbB3/Her3, ErbB4/Her4, ETV6-AML, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질 (예를 들어, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/EBNA1, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, IGF1R, LGR5, LMP2, MAGE 단백질 (예를 들어, MAGE-1, -2, -3, -4, -6, 및 -12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Muc1, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NGEP, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PDGFR-α, PDGFR-β, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, PLAC1, PRLR, PRAME, PSCA, PSGR, PSMA (FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, STn, 수르비빈, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TNFRSF17, TRP-1, TRP-2, 티로시나제, 및 유로플라킨-3, 및 상기-기 재된 폴리펩티드 중 어느 한 폴리펩티드의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

리간드는 또한 안키린 반복 단백질, 인터페론, 림포카인, 예컨대 IL-2 또는 IL-3, 호르몬 유사 인슐린 및 글루코코르티코이드, 성장 인자, 예컨대 EGF, 트랜스페린, 피브로넥틴 유형 III 등을 포함할 수 있다.

본원에서의 실시양태는 치료 용도에 표적 특이적이다. 한 실시양태에서, 특정 유형의 종양에 대해 공유되거나, 과다발현되거나 변형되는 항원 또는 종양의 유형에 특이적인 항원을 포함하는, 종양 항원으로서 정의된 항원과 상호작용하고 결합하는 리간드가 제조된다. 예는, 알파-액티닌-4와 폐암, ARTC1과 흑색종, BCR-ABL 융합 단백질과 만성 골수성 백혈병, B-RAF, CLPP 또는 Cdc27과 흑색종, CASP-8과 편평세포 암종, 및 hsp70-2와 신장 세포 암종뿐만 아니라 다음의 공유된 종양-특이적 항원, 예를 들어: BAGE-1, GAGE, GnTV, KK-LC-1, MAGE-A2, NA88-A, TRP2-INT2도 포함한다.

생물학적 활성 분자

본원에서의 생물학적 활성 분자는 포유동물에서 치료 용도를 갖는 임의의 분자를 갖는 임의의 분자를 포함한다. 전형적 실시양태에서 분자는, 혈관계 또는 림프계내로 방출되는 분자와 비교하여 포유동물 내에서 표적에 유익하게 전달되며, 특히 세포에 유익하게 전달된 다음에 세포 내에 포함된다 (예를 들어, 세포내함입).

한 측면에서, 생물학적 활성 분자는 세포 성장의 억제, 지연, 감소, 및/또는 예방을 초래하는 화합물이다. 생물학적 활성 분자는 또한 괴사 또는 아폽토시스를 통해 세포 사멸을 초래할 수 있다. 본원에 기재된 접합체 화합물에서 사용하기 위한 예시적 생물학적 활성 분자는, 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1, DM4 등), 아우리스타틴 (예를 들어, MMAE, MMAD, MMAF 등), 두오카르마이신 (예를 들어, MGBA), 돌라스타틴, 유독소(toxoid), 및 다른 화학치료 유효 약물을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 생물학적 활성 분자의 다른 구체적 예는, 예를 들어 1-데히드로도테스토스테론, 2-피롤리노독소루비신, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 액티노마이신 D, 안트라시클린, 안트라마이신 (AMC), 블레오마이신, 부술판, 칼리케아미신, 카르무스틴 시스플라틴, 콜치신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 시클로포스파미드, 시타라빈, 시토칼라신 B, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카르바진, 디브로포만니톨, 디히드록시 안트라신 디온, 독소루비신, 에메틴, 에피루비신, 에티디움 브로마이드, 에토포시드, 그라미시딘 D, 글루코코르티코이드, 리도카인, 로무스틴 (CCNU), 메클로르에타민, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 모르폴리노-독소루비신, 프로카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 , 피롤로벤조디아자핀, 시비로마이신, 스트렙토조톡신, 탁솔, 테노포시드, 테트라카인, 티오에파 클로르암부실, 트리코테센, 투불리신, 빈크리스틴, 및 전술한 것들의 임의의 것의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함한다.

한 실시양태에서 생물학적 활성 분자는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체이다. 본원에서 사용하기 위한 예시적 메이탄시노이드는, 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408]에 기재되어 있다.

링커 물질

본 개시내용은 2개의 간격을 둔 화학적 모이어티를 화학적으로 공유적으로 연결할 수 있는 링커 화합물을 포함한다. 링커는 2개의 모이어티를 간격을 두고 연결하며, 예를 들어 링커는 리간드 및 생물학적 활성 분자를 연결할 수 있다. 한 측면에서, 링커는 자기 희생적이며 여기서 링커는 2개 이상의 상이한 화학적 모이어티를 연결하고 효소의 존재하에 상기 화학적 모이어티 중 하나 이상을 방출한다. 또 다른 측면에서, 링커는 분석제(analytical agent), 생체분자, 표적화제, 검출가능한 표지, 진단제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 화학적 모이어티에 부착될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 생물학적 활성 분자 및 리간드를 부착한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 생물학적 활성 마크롤리드 및 리란드를 부착한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 생물학적 활성 마크롤리드 및 그의 항체 또는 단편을 부착한다.

한 측면에서, 링커는 리간드를 치료제 및 마커와 공유적으로 연결하는데 유용한다. 또 다른 측면에서, 링커는 부착된 모이어티의 화학적 및/또는 전신적 안정성을 개선시킨다. 또 다른 측면에서, 링커는 부착된 모이어티의 생체내 독성을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 링커는 부착된 모이어티의 약동학, 약력학, 및/또는 생체이용률을 개선시킨다. 한 측면에서, 링커는 약리학상 유효 형태에서 표적 세포 또는 세포 집단 내의 또는 근처의 부위에서 생물학적 활성 분자를 절단(cleave)하고 방출한다. 한 측면에서, 절단은 효소에 의해 수행된다. 한 측면에서, 효소적 절단를 위한 링커에 대한 절단가능한 기는 펩티드 결합, 에스테르 연결, 및 디술피드 연결을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 측면에서, 링커는 pH 변화를 통해 절단된다.

한 실시양태에서, 링커 화합물은 하기 화학식 VI로 표시된다:

<화학식 VI>

상기 식에서,

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나,

여기서 A ₁ , A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

A ₄ 및 A ₅ 는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NR ₁₈ -, -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 은 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 VI의 화합물을 제공하고, 여기서 Z ₂ 는 하기 구조 화학식으로 표시된다:

-Z _2A -Z _2B -Z _2C -Z _2D -

상기 식에서,

Z _2A , Z _2B , Z _2C 및 Z _2D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 VI의 화합물을 제공하고, 여기서 Z ₁ 은 하기 구조 화학식으로 표시된다:

-Z _1A -Z _1B -Z _1C -Z _1D -

상기 식에서,

Z _1A , Z _1B , Z _1C 및 Z _1D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 A가 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신, 시스테인 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산인 화학식 VI의 화합물을 제공한다.

또 다른 한 측면에서, 본 개시내용은 A가 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드인 화학식 VI의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 X가

여기서 R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ 이고;

추가로 여기서 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₁₃ 및 R ₁₄ 는 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이고; R ₁₅ 는 임의로 치환된 알킬인 화학식 VI의 화합물을 제공한다.

특정 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 링커, 생물학적 활성 분자, 및 다른 화합물은 항체 또는 항원-결합 분자 내에서 특정의 아미노산에서의 부착을 통해 항체 또는 항원-결합 분자에 연결될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적 아미노산 부착은, 예를 들어 리신 (예를 들어, US 5,208,020; US 2010/0129314; 문헌 [Hollander et al., Bioconjugate Chem . , 2008, 19:358-361]; WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; 및 US 2012/0585592 참조), 시스테인 (예를 들어, US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; 및 US 7,750,116 참조), 셀레노시스테인 (예를 들어, WO 2008/122039; 및 문헌 [Hofer et al., Proc. Natl . Acad . Sci ., USA, 2008, 105 :12451-12456] 참조), 포르밀 글리신 (예를 들어, 문헌 [Carrico et al ., Nat. Chem . Biol . , 2007, 3:321-322]; [Agarwal et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 2013, 110 :46-51], 및 [Rabuka et al ., Nat. Protocols , 2012 , 10 :1052-1067] 참조), 비-천연 아미노산 (예를 들어, WO 2013/068874, 및 WO 2012/166559 참조), 및 산성 아미노산 (예를 들어, WO 2012/05982 참조)를 포함한다. 링커는 또한 탄수화물에 대한 부착을 통해 항원-결합 단백질에 접합될 수 있다 (예를 들어, US 2008/0305497, 및 문헌 [Ryan et al ., Food & Agriculture Immunol . , 2001, 13 :127-130] 참조) 및 디술피드 링커 (예를 들어, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, 및 문헌 [Shaunak et al ., Nat. Chem. Biol. , 2006, 2 :312-313] 참조)를 포함한다.

특정 다른 실시양태에 따르면, 링커, 생물학적 활성 분자, 예컨대 약물은 항체 또는 항원-결합 분자내에서 특정의 아미노산에서의 부착을 통해 항체 또는 항원-결합 분자에 연결되어 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다.

화합물

한 측면에서, 본 개시내용은 하기 구조 화학식 I로 표시되는 생물학적 활성 분자 및 리간드 접합체를 제공한다:

<화학식 I>

상기 식에서,

L은 부재하거나 리간드이고;

추가로 여기서,

L이 리간드인 경우에, L은 세포 또는 세포 집단에 결합할 수 있고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

D는 생물학적 활성 분자이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나,

여기서 A ₁ , A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

A ₄ 및 A ₅ 는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NR ₁₈ -, -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 은 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 분자가 세포독성 생물학적 활성 마크롤리드인 화합물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 마크롤리드로서 하기 화학식 II로 표시되는 바와 같은 메이탄시노이드를 제공한다:

<화학식 II>

상기 식에서, A ₆ , A ₇ , A ₈ , A ₉ 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, N-알킬 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-NH-, -C(=S)-S-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ 이고, 추가로 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고; R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

또 다른 실시양태에서, 메이탄시노이드는 하기 구조 화학식 IIa로 표시된다:

<화학식 IIa>

한 측면에서, 본 개시내용은 리간드 (L)이 특이적으로 표적화된 세포 집단에 결합할 수 있는 것인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 리간드 (L)이 단백질, 항체, 항체의 단편, 핵산, 항원 결합 스캐폴드 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 리간드 (L)이 항체 또는 그의 단편인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 리간드 (L)이 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 항체 또는 그의 단편이 Z ₂ 와 공유적으로 부착되어 있는 황 기를 포함하는 것인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 I의 화합물을 제공하고, 여기서 Z ₂ 는 하기 구조 화학식으로 표시된다:

-Z _2A -Z _2B -Z _2C -Z _2D -

상기 식에서,

Z _2A , Z _2B , Z _2C 및 Z _2D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 항체 또는 그의 단편이 Z _2A 와 공유적으로 부착되어 있는 황 기를 포함하는 것인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 I의 화합물을 제공하고, 여기서 Z ₁ 은 하기 구조 화학식으로 표시된다:

-Z _1A -Z _1B -Z _1C -Z _1D -

상기 식에서,

Z _1A , Z _1B , Z _1C 및 Z _1D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 분자 (D)가 Z ₁ 과 공유적으로 부착되는 것인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 A가 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신, 시스테인 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

또 다른 한 측면에서, 본 개시내용은 A가 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 X가

여기서 R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ 이고;

추가로 여기서 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₁₃ 및 R ₁₄ 는 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이고; R ₁₅ 는 임의로 치환된 알킬인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

또 다른 한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 III의 화합물을 제공한다:

<화학식 III>

상기 식에서,

Ab는 항체 또는 그의 단편이고;

AA ₁ -AA ₂ 는 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고;

A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ , 치환 또는 비치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

R ₁₃ 및 R ₁₄ 는 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이고; R ₁₅ 는 임의로 치환된 알킬이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이고; DM은 하기 구조로 표시된다 (예를 들어, 화학식 IIa의 화합물):

한 실시양태에서, 본 개시내용은

q가 4이고;

R ₁ 및 R ₃ 이 각각 독립적으로 -O-, -S-, NR ₄ , -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 이 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 이 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ , R ₁₂ 가 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;

A ₃ 이 알킬인 화학식 III의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 구조 IIIa 및 IIIb로 표시되는 화학식 III의 화합물을 제공한다:

<화학식 IIIa>

<화학식 IIIb>

상기 식에서, Ab는 항체 또는 그의 단편이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 IV의 화합물을 제공한다:

<화학식 IV>

상기 식에서,

Ab는 항체 또는 그의 단편이고;

AA ₁ -AA ₂ 는 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고;

R ₁ 은 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₄ 는 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ , 치환 또는 비치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

DM은 하기 구조로 표시된다:

한 실시양태에서, 본 개시내용은

q가 4이고;

R ₁ 이 -O-, -S-, NR ₄ 및 -CR ₅ R ₆ -으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

추가로 여기서 R ₄ , R ₅ 및 R ₆ 이 각각 독립적으로 H 또는 알킬인 화학식 IV의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 구조 IVa로 표시되는 화학식 IV의 화합물을 제공한다:

<화학식 IVa>

상기 식에서, Ab는 항체 또는 그의 단편이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 V의 화합물을 제공한다.

<화학식 V>

상기 식에서,

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

D는 생물학적 활성 분자이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

X는 부재하거나, 치환 또는 비치환된 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고;

Y는 부재하거나,

여기서 A ₁ , A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

A ₄ 및 A ₅ 는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NR ₁₈ -, -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 은 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화학식 V의 화합물을 제공하고, 여기서

Z ₂ 는 하기 화학식 VII로 표시되고:

<화학식 VII>

-Z _2A -Z _2B -Z _2C -Z _2D -

추가로 여기서,

Z _2A , Z _2B , Z _2C 및 Z _2D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

Z ₁ 은 하기 화학식 VIII로 표시되고:

<화학식 VIII>

-Z _1A -Z _1B -Z _1C -Z _1D -

여기서,

Z _1A , Z _1B , Z _1C 및 Z _1D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

A는 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;

X는

여기서 R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ 이고;

추가로 여기서 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₁₃ 및 R ₁₄ 는 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이고; R ₁₅ 는 임의로 치환된 알킬이다.

생물학적 활성 분자 (D)는 임의로 하기 구조 화학식 II의 치환된 메이탄시노이드일 수 있다:

<화학식 II>

상기 식에서,

A ₆ , A ₇ , A ₈ , A ₉ 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, N-알킬 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, OC(=O)-NR ₄ 이고, 추가로 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 분자가 하기 화학식 II로 표시되는 임의로 치환된 메이탄시노이드인 화학식 V의 화합물을 제공한다:

<화학식 II>

상기 식에서,

A ₆ , A ₇ , A ₈ , A ₉ 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, N-알킬 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, OC(=O)-NR ₄ 이고, 추가로 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 분자가 하기 구조 화학식으로 표시되는 메이탄시노이드인 화학식 V의 화합물을 제공한다:

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 구조 화학식 Va, Vb, Vc, Vd, 및 Ve로 표시되는 화학식 V의 화합물을 제공한다:

<화학식 Va>

<화학식 Vb>

<화학식 Vc>

<화학식 Vd>

<화학식 Ve>

한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 IX의 화합물을 제공한다:

<화학식 IX>

상기 식에서,

D는 생물학적 활성 분자이고;

Y ₁ 은

여기서 R _3a 및 A _3a 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Z ₁ 은 하기 구조 화학식으로 표시되고:

-Z _1A -Z _1B -Z _1C -Z _1D -

여기서,

Z _1A , Z _1B , Z _1C 및 Z _1D 는 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 , -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 , -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-N(R ₄ ), -OC(=S)-N(R ₄ )-, -C(=S)-N(R ₄ )-, -N=C=S, -N=C=O,

여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고, R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 분자가 세포독성 생물학적 활성 마크롤리드인 화학식 IX의 화합물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 활성 마크롤리드가 메이탄시노이드인 화학식 IX의 화합물을 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 메이탄시노이드가 화학식 II로 표시되는 것인 화학식 IX의 화합물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 메이탄시노이드가 화학식 IIa로 표시되는 것인 화학식 IX의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화합물의 IC ₅₀ 이 약 10 nM 초과인 화학식 IX의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 화합물이 화학식 I의 상응하는 화합물보다 약 10배 덜 세포독성인 화학식 IX의 화합물을 제공한다.

또 다른 한 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 X의 화합물을 제공한다:

<화학식 X>

상기 식에서,

Ab는 항체 또는 그의 단편이고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

Z ₂ 및 Z ₁ 은 각각 독립적으로 부재하거나 스페이서이고;

A는 천연 또는 비-천연 아미노산, 또는 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;

W는 부재하거나, -O-, -S-, -CR ₅ R ₆ -, -NR ₄ -이고;

X는 부재하거나, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴이고, 여기서 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

Y는 부재하거나,

여기서 A ₁ , A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

A ₄ 및 A ₅ 는 각각 독립적으로 -O-, -S-, -NR ₁₈ -, -CR ₅ R ₆ -이고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₁₈ 은 H, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 및 아실은 임의로 치환되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이고;

DM은 하기 구조로 표시된다:

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 구조 Xa로 표시되는 화학식 X의 화합물을 제공한다:

<화학식 Xa>

상기 식에서 a는 1 내지 10의 정수이다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 화학식 XI의 화합물을 제공한다:

<화학식 XI>

상기 식에서,

Ab는 항체 또는 그의 단편이고;

AA ₁ -AA ₂ 는 발린-시트룰린, 시트룰린-발린, 리신-페닐알라닌, 페닐알라닌-리신, 발린-아스파라긴, 아스파라긴-발린, 트레오닌-아스파라긴, 세린-아스파라긴, 아스파라긴-세린, 페닐알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-페닐알라닌, 류신-아스파라긴, 아스파라긴-류신, 이소류신-아스파라긴, 아스파라긴-이소류신, 글리신-아스파라긴, 아스파라긴-글리신, 글루탐산-아스파라긴, 아스파라긴-글루탐산, 시트룰린-아스파라긴, 아스파라긴-시트룰린, 알라닌-아스파라긴, 아스파라긴-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이고;

a는 1 내지 10의 정수이고;

q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고;

A ₃ , R ₁ 및 R ₃ 은 각각 독립적으로 부재하거나, 아미노산, 2-20개의 아미노산을 갖는 펩티드, 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -CR ₅ R ₆ -, -O-, -C(=O)-, -OC(=O)-, -C(=O)-O-, -OC(=O)-O-, -C(=O)-(CH _x ) _p1 -, -C(=O)-O-(CH _x ) _p1 -, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-, -(CH _x ) _p1 -C(=O)-O-, -(O-(CH ₂ ) _p2 -) _p3 -, -((CH ₂ ) _p2 -O-) _p3 -, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -SC(=S)-, -SC(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO ₂ -, -NR ₄ -, -N(R ₄ )-C(=O)-N(R ₈ )-, -N(R ₄ )-C(=O)O-, -N(R ₄ )-C(=O)-, -C(=O)-N(R ₄ )-, -C(=O)-N(R ₄ )-C(=O)-, -OC(=O)-NR ₄ -이고, 여기서 알킬, 알키닐, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 임의로 치환되고;

R ₁₇ 은 O, S, NR ₁₈ , CR ₅ R ₆ 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R ₄ , R ₅ , R ₆ 및 R ₈ 은 각각 독립적으로 H이거나, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ 및 R ₁₂ 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, NR ₁₃ R ₁₄ , 니트로, 시아노, -OH, -OC(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-R ₁₅ , -C(=O)-OR ₁₅ , -C(=O)-NR ₁₃ R ₁₄ , 치환 또는 비치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴이고;

R ₁₃ 및 R ₁₄ 는 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이고; R ₁₅ 는 임의로 치환된 알킬이고;

p1, p2 및 p3은 각각 독립적으로 0, 또는 1 내지 100의 정수이고;

x는 0, 1 또는 2이고;

DM은 하기 구조로 표시된다:

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 구조 XIa로 표시되는 화학식 XI의 화합물을 제공한다:

<화학식 XIa>

상기 식에서 a는 1 내지 10의 정수이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 A가 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드인 화학식 I, III, IV, V, 및 X의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 펩티드가 프로테아제에 의해 절단가능한 것인 화학식 XI의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 A가 종양 조직에서 발현된 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드인 화학식 I, III, IV, V, 및 X의 화합물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 펩티드가 종양 조직에서 발현된 프로테아제에 의해 절단가능한 것인 화학식 XI의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 A가 카텝신 또는 플라스민인 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드인 화학식 I, III, IV, V, X의 화합물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 펩티드가 카텝신 또는 플라스민인 프로테아제에 의해 절단가능한 것인 화학식 XI의 화합물을 제공한다.

조성물

본원에서의 실시양태는 화학식 I, III, IV, V, X, 또는 XI의 접합체 화합물뿐만 아니라 그의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 측면에서 화합물은 추가로 화학식 IIIa, IIIb, IVa, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Xa, 또는 XIa의 화합물로 표시된다.

본원에서의 실시양태는 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 또는 XI의 화합물뿐만 아니라 그의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다.

조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물일 수 있다. 일부 측면에서 제약 조성물은 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 또는 XI의 화합물 또는 그의 혼합물의 제약상 허용되는 염이다. 일부 다른 측면에서 제약 조성물은 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 또는 XI의 화합물 또는 그의 혼합물의 제약상 허용되는 염이다.

적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제 및 부형제는 관련 기술분야에 주지되어 있고 임상적 상황 근거(warrant)로서 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및 부형제의 예는, 적당한 조성물 pH의 유지를 위한 완충제 (예를 들어, 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 락테이트 완충제, 옥살레이트 완충제 등), 담체 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민), 식염수, 폴리올 (예를 들어, 트레할로스, 수크로스, 크실리톨, 소르비톨 등), 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리옥솔레이트 등), 항미생물제, 및 항산화제를 포함한다.

그렇게 원하는 경우, 본원에서의 제약 조성물은 제2 또는 그 초과의 치료제 (예를 들어, 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 접합체 화합물에 대한 아주반트, 항-종양제, 항생제, 항-염증제 등)를 포함할 수 있다. 제2 치료제는 동일한 조성물에 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI의 화합물로서 포함될 수 있거나, 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI의 화합물과 별개로 (투여 시간, 또는 유형 및 위치에 의해) 투여될 수 있다.

생물학적 활성 분자의 통상의 기술자는 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI의 화합물 각각을 생성된 화합물이 여전히 출발 화합물과 유사한 특이성 및/또는 활성을 보유하는 방식으로 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 관점에서, 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI의 화합물의 생물학적 활성 분자 (D)는 생물학적 활성 분자의 유사체 및 유도체 중 어느 것이든 및 모두를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서 생물학적 활성 분자는 마크롤리드이고 추가로 메이탄신 또는 메이탄신의 유사체이다 (문헌 [Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4392-4408]에 기재된 바와 같음).

한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 I, III, IV, X, XI (IIIa, IIIb, IVa, Xa, 및 XIa 포함)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 I, III, IV, V, IX, X, XI (IIIa, IIIb, IVa, Va, Vb, Vc, Vd, 및 Ve, Xa, 및 XIa 포함)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 V (Va, Vb, Vc, Vd, 및 Ve 포함)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 IX의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 화학식 V 및 IX (Va, Vb, Vc, Vd, 및 Ve 포함)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

사용 방법

상기 기재된 바와 같이, 리간드 (L)이 링커에 부착하고 그렇게 함으로써 생물학적 활성 분자에 부착하여 공유 접합체를 형성하도록 다양한 관능기를 갖는 화학식 I, III, IV, X, 및 XI의 접합체 화합물이 제조될 수 있다. 리간드는 특히 접합체 화합물을 리간드 결합 파트너, 전형적으로 폴리펩티드 또는 기타 예컨대 항원에 표적화한다. 전형적인 실시양태에서, 접합체는 비정상적 세포 성장을 겪는 세포 또는 증식성 장애에 관여된 세포 상에서 발견되는 결합 파트너를 갖는 리간드를 포함하도록 설계된다. 놀랍게도, 화학식 I, III, IV, X, 및 XI의 접합체 화합물은 각각의 화합물의 링커가 접합체에 의해 결합된 세포 내부에서 이화되도록 설계되었다. 그와 같이, 본원에서의 접합체 실시양태를 통한 생물학적 활성 분자의 전달은 정상적으로는 너무 독성이어서 통상적으로 투여할 수 없을 생물학적 활성 분자를 전달할 수 있게 한다. 본원에서의 실시양태는 이들 분자를 비정상적 세포 성장을 겪는 세포 또는 증식성 장애에 관여된 세포에 고도로 선택적이고 특이적으로 전달할 수 있게 한다 (세포 외부에서의 이화작용으로 인해, 생물학적 활성 화합물을 예를 들어 혈액계 또는 림프계로 방출하는 것과 비교하여).

통상의 기술자가 구상할 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 공유 접합체 화합물은 또한 임의의 유형의 유용한 생물학적 활성 분자를 전달하는데 사용될 수 있고 임의의 유형의 세포 집단에 선택적으로 표적화될 수 있으며, 예를 들어 접합체는 항-증식성 약물을 비정상적 성장을 겪는 세포에 또는 항-바이러스 약물을 바이러스로 감염된 세포에 전달하는데 사용될 수 있다 (선택된 리간드가 적당한 세포 결합 파트너를 인식하는 한).

이러한 관점에서, 본원에 기재된 접합체 화합물 실시양태를 위한 사용 방법이 제공된다.

본원에 기재된 제약 조성물은 포유동물에서 비정상적 세포 성장을 억제, 지연 및/또는 예방하는데 또는 다양한 증식성 장애 또는 질환 상태의 치료에서 유용하다. 전형적인 실시양태에서 포유동물은 인간이다 (본원에서의 실시양태는 인간에 관하여 기재될 것이다). 다른 포유동물은 영장류, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 소, 낙타 등을 포함한, 검출가능한 증식성 장애를 앓을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. 게다가, 제약 조성물의 접합체 화합물은 비정상적 세포 성장을 겪는 세포에 대한 선택적인 표적화를 위해 또는 본원에 기재된 다양한 증식성 장애 또는 질환 상태의 치료를 위해 설계된다.

그와 같이, 본원에서의 실시양태는 인간에게 치료 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 비정상적 세포 성장의 억제 또는 증식성 장애의 치료 방법을 포함한다.

치료 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물의 투여는 상이한 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소, 경피, 비강내, 또는 기관지내 투여에 의해 수행될 수 있다. 본원에서의 제약 조성물은 또한, 예를 들어 바이올리스틱(biolistic) 전달 (본원에서의 제약 조성물을 예를 들어 폐 또는 뇌 종양에 바이올리스틱 전달)에 의해 (비정상적 세포 성장과 직접 또는 간접적으로 접촉하는) 비정상적 세포 성장 부위에 직접 투여될 수 있다. 본원에서의 제약 조성물의 투여를 위한 투여 요법은 담당 의료 전문가 또는 다른 통상의 기술자에 의해서뿐만 아니라 특정 임상적 상황을 기초로 결정될 것이다. 제약 분야에 주지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 인간, 즉, 환자에 대한 투여량은, 환자 크기, 환자의 체표면적, 환자의 연령 및 전체적인 건강, 환자의 성별, 투여의 시간 및 경로, 및 제2 치료제의 존재를 포함한 다수의 인자에 따라 달라진다. 일부 경우에서 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 접합체 화합물은 용량당 1 ㎍ 내지 100 mg/kg 체중의 양으로 존재할 수 있다 (연속 주입이 투여 경로로서 고려되는 경우, 분당 1 pg/kg 체중 만큼의 적은 양이 고려될 수 있음을 주목한다). 제약 조성물은 1일 및 수일, 수주, 수개월, 또는 수년에 걸쳐 1회 이상 투여될 수 있다.

증식성 장애 또는 질환, 예를 들어 종양의 치료는, 종양 크기를 감소시키고, 종양에서의 괴사 또는 아폽토시스를 유발하고, 종양을 사멸시키고, 종양의 크기 증가를 중단시키고/거나 종양의 침습 또는 전이를 예방하는 방법을 포함한다.

비정상적 세포 성장의 억제, 또는 증식성 장애의 치료 방법에 따라 치료될 수 있는 병상(medical condition)의 예는, 임의의 유형의 악성종양(malignancy), 예를 들어 폐암, 결장암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 간암, 난소암, 피부암, 림프종, 백혈병 등; 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 루푸스, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증; 바이러스 감염, 예를 들어 CMV 감염, HIV 감염, AIDS, 간염, HPV 감염; 통증; 정신 장애; 및 염증성 질환을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 제약 조성물은 또한 포유동물에서 바이러스 감염, 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환 등의 예방 또는 치료에서 유용하다.

한 측면에서, 본 개시내용은 비정상적 세포 성장을 지연, 감소 또는 중단시키기에 충분한 양의 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물과 비정상적 세포를 접촉시켜 비정상적 세포 성장을 지연, 감소 또는 중단시키는 것을 포함하는, 비정상적 세포 성장을 감소, 지연 또는 중단시키는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 세포를 사멸시키기에 충분한 양의 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물과 세포를 접촉시켜 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 종양 세포를 사멸시키기에 충분한 양의 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물과 종양 세포를 접촉시켜 종양 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

하나의 다른 측면에서, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것 및 추가로 추가의 요법을 순차적으로 또는 연속적으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 추가의 요법이 방사선 요법, 화학요법, 또는 이 둘의 조합인 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것 및 추가로 추가의 요법을 순차적으로 또는 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것 및 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 장애를 앓고 있는 개체에게 화학식 I, III, IV, X, 및/또는 XI의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것 및 추가로 추가의 요법을 순차적으로 또는 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 것 또는 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.

한 측면에서, 치료되는 의학적 장애는 종양, 암, 감염성 질환, 신경변성 질환, 골 장애 및 심혈관계 질환으로부터 선택된다.

본원에서의 실시양태는 또한 화학식 V의 화합물의 전구체 또는 빌딩 블록으로부터 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서 화학식 V의 화합물은 또한 화학식 V의 화합물이 제약 조성물인 치료 적용에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서 화학식 V의 화합물은 화합물 I, III, IV, IX, X, 및/또는 XI의 조성물 또는 제약 조성물 중 어느 것이든지에 포함될 수 있다.

최종적으로, 본원에서의 실시양태는 화학식 I, III, IV, V, IX, X, 및/또는 XI로 표시된 바와 같은 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다.

접합체의 제조

리간드-생물학적 활성 분자 접합체 화합물은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기법에 의해 생성될 수 있다. 리간드-생물학적 활성 분자 접합체 화합물은 리간드 단위, 생물학적 활성 분자, 및 임의로, 생물학적 활성 분자 및 리간드를 연결하는 링커를 포함한다. 리간드로의 생물학적 활성 분자 및/또는 링커의 공유결합적 부착은, 리신의 아민 기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카르복실산 기, 시스테인의 술프히드릴 기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티를 포함한, 리간드의 아미노산 잔기, 예를 들어 항체를 사용하는 각종의 반응을 사용하여 완수될 수 있다.

추가로, 본원에 기재된 다양한 실시양태에 따른 접합체는 관련 기술분야에서 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 접합체를 제조하기 위한 예시적 프로토콜은 이하에 실시예에서 제공된다. 그러나, 예를 들어 WO 2009/134977, 미국 특허 번호 7,811,572 및 미국 특허 번호 6,441,163에 기재된 프로토콜을 포함한, 다른 공지된 방법을, 프로토콜을 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 제조하는데 사용하는 한 사용할 수 있다. 이들 참고 문헌은 그의 의도된 목적을 위해 참조로 포함된다.

한 실시양태에서, 접합체는 i) 리간드를 링커와 반응시켜 변형된 리간드-링커 화합물을 형성시키는 것; ii) 임의로 리간드-링커 화합물을 정제하는 것; iii) 생물학적 활성 분자, 예를 들어 마크롤리드를, 리간드-링커에 접합시켜 화학식 I, III, IV, X, 또는 XI의 접합체를 형성시키는 것; 및 iv) 접합체를 정제함으로써 제조할 수 있다.

대안적 실시양태에서, 접합체는 생물학적 활성 분자를 링커 (Z ₁ )의 제1 구성성분과 반응시킨 후, 연속 반응시켜 Y, X, W, A 및 Z ₂ , 또는 그의 조합의 첨가를 포함한, 링커를 구축함으로써 제조할 수 있다.

대안적 실시양태에서, 접합체는 리간드, 링커 및 생물학적 활성 마크롤리드를 단일 반응으로 반응시킴으로써 제조한다. 일단 본 발명에 따른 접합체를 제조하면 이들을 정제할 수 있다.

접합체 화합물의 세포독성의 확인

한 실시양태에서, 본원에 기재된 접합체 화합물을 시험관내에서 다양한 암 세포주의 증식을 억제하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 시험관내 세포독성 검정을 관련 기술분야에 공지된 방법 (문헌 [Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49(14), 4392-408] 참조)을 사용하고 본원에서의 실시예 7에서 예시된 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, 접합체 화합물을 미리결정된 일 수 동안 시험관내에서 도말된 암 세포에 적용할 수 있고 생존 세포를 공지된 방법에 의한 검정으로 측정할 수 있다. 적당한 대조군을 이용하여 IC ₅₀ 값일 수 있는 결과의 타당성을 보장할 수 있다. 본원에서의 접합체 화합물의 시험관내 효능의 예는 도 1 및 2에서 볼 수 있다. 추가적 생체내 효능을 사용하여 제시된 접합체 화합물 효능을 - 예를 들어 누드 마우스 모델을 사용하여 확인할 수 있다.

상기 명세서, 실시양태 및 데이터는 본 발명의 조성물의 제조 및 사용의 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 많은 실시양태가 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있기 때문에, 본 발명은 이하에 첨부된 청구범위에 있다.

본원 및 이하에 실시예에서 인용된 모든 참고문헌은 명시적으로 그 전문이 참조로 포함된다.

이하에 제시된 실시예 및 설명을 제공하여 본 발명을 예시한다. 통상의 기술자는 이들 실시예가 단지 예로서 제공되는 것이고 본 발명을 제한할 목적을 의도하는 것이 아님을 인식할 것이다.

실시예

실험 세부사항

양성자 NMR 스펙트럼 (UV에 의해 검출될 수 없는 화합물의 경우)을 배리언 이노바(Varian Inova) (300) MHz 기기 상에서 획득하였으며, 한편 질량 스펙트럼을 전기 분무 이온화 공급원과 트리플 쿼드(triple-quad) 이온 트랩(trap) 분석기를 이용하는 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC/MSD 상에서 수집하였다. 브루커(Bruker) 울트라플레익스트림(ultraFleXtreme) MALDI-TOF-TOF 질량 분석계를 사용하여 적절한 접합체를 분석하였다. 모든 출발 물질 및 용매는, 달리 언급되지 않는 한, 상업적으로 구매하였고 정제 없이 사용하였다.

실시예 1

단계 1: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-알라닌 ( 2 )

표제 화합물을 미국 특허 출원 2007/0037972 A1에 기재된 방법을 사용하여 메이탄시놀 ( 1 )로부터 금색 고체로서 제조하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N-[4-(아미노-시트룰린-발린- 헥산 아미드-6-말레이미딜)벤질]카르바메이트 ( 3 ):

선행 단계의 생성물 ( 2 , 0.020 g, 0.031 mmol) 및 p-NO ₂ -Ph-카르보네이토-Bn-Cit-Val-말레이미드 (MA-VC-PAB-PNP, 0.027 g, 0.037 mmol; 콘코르티스 바이오시스템즈(Concortis Biosystems))를 원뿔형 바이알(conical vial)에서 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 약 0.25 mL)에 용해시키고, 브로크만(Brockmann) I 염기성 알루미나 (0.10 g)로 처리하고, 바이알을 아르곤으로 퍼징하고, 반응을 4일 동안 주위 온도에서 교반하였다. 이어서 혼합물을 여과하고, 고체를 아세토니트릴/물로 세척하고, 여액을 HPLC를 통해 5u, 30x150 mm 페노메넥스 게미니(Phenomenex Gemini) C18 칼럼 상에서 직접 정제하였다 (물 중 30 - 90% 아세토니트릴, 이 둘 내의 0.1% TFA, 25분에 걸쳐, 15 mL/분). 가장 순수한 분획을 밤새 동결건조시켜 표제 화합물을 담황색 고체 (0.021 g, 55%)로서 수득하였다.

실시예 2

단계 1: N- tert - 부톡시카르보닐 -베타-알라닌 숙시네이트 에스테르 ( 4 )

표제 화합물을 관련 기술분야에 주지된 방법 ( cf .- Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4401)에 의해 시판 Boc-β-알라닌으로부터 제조하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- Boc -β-알라 ( 5 )

선행 단계의 생성물 ( 4 , 0.45 g, 1.51 mmol) 및 메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌 ( 2 , 0.30 g, 0.23 mmol)을 3:1 아세토니트릴:물 (8 mL)에 용해시키고, 1M 수성 NaHCO ₃ (0.5 mL)로 처리하고, 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응이 TLC에 의해 완료되었을 때, 이어서 이를 10분 동안 염수와 함께 교반하고 에틸 아세테이트 (EtOAc)로 3회 추출하였다. 이어서 합해진 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하고 진공 중에 건조시켜 금색 시럽을 얻고 20 g 실리카겔 카트리지 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (15분에 걸쳐 EtOAc 중 0 - 10% MeOH) 표제 화합물을 백색 고체 (0.084 g, 43%)로서 수득하였다.

단계 3: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-β-Ala ( 6 )

선행 단계의 생성물 ( 5 , 0.080 g, 0.095 mmol)을 아세토니트릴/물/트리플루오로아세트산 (4 mL)의 3:1:1 혼합물에 용해시키고 26시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 조 반응 혼합물을 40 g C18 실리카겔 칼럼 상에 직접 주입하고 ISCO 콤비플래시(CombiFlash)를 통해 용리시키고 (물 중 10 - 90% 아세토니트릴, 각각의 용매 중의 0.1% TFA, 18분에 걸쳐, 40 mL/분), 합해진 순수한 분획을 동결건조시켜 표제 화합물을 담황색 고체 (0.025 g, 31%)로서 수득하였다.

단계 4: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3-N- 메틸 -N-[4-(아미노-시트룰린-발린-헥산아미드-6-말레이미딜)벤질]카르바메이트 ( 7 )

선행 단계의 생성물 ( 6 , 0.014 g, 0.019 mmol) 및 MA-VC-PAB-PNP (0.020 g, 0.027 mmol; 콘코르티스 바이오시스템즈)를 4:1 아세토니트릴/물 (2.5 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NaHCO ₃ (0.5 mL)로 처리하고, 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응물을 C18 실리카 상에서 역상 크로마토그래피에 의해 직접 정제하였다 (아세토니트릴/물 구배 중 0.1% TFA 사용). 최종 칼럼 분획을 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.002 g, 8%)로서 수득하였다.

실시예 3

단계 1: 3 - 메틸디티오 -프로피온산 숙시네이트 에스테르 ( 8 )

표제 화합물을 문헌 [Widdison et al. J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4392-4408]의 방법을 사용하여 3-메르캅토프로피온산으로부터 백색 고체로서 제조하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3- 메틸디술피드 ( 9 )

선행 단계의 생성물 ( 8 , 2.96 g, 11.9 mmol) 및 메이탄신-3-N-메틸-L-알라닌 ( 2 , 1.54 g, 2.37 mmol)을 4:1 아세토니트릴/물 (25 mL)에 용해시키고, 포화 수성 NaHCO ₃ (2 mL)로 처리하고, 24시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 염수로 처리하고, EtOAc로 3회 추출하고, 수성 층을 NaCl로 포화시키고, EtOAc로 다시 추출하고, 합해진 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여액을 진공 중에 농축하여 금색 시럽 (약 4.5 g)을 얻고 이를 80 g 실리카겔 카트리지 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (30분에 걸쳐 헥산 중 0 - 100% EtOAc) 표제 화합물을 백색 고체 (1.14 g, 61%)로서 수득하였다.

단계 3: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미드 -3- 티올 ( 10 )

표제 화합물을 문헌 [Whitesides et al. (J. Org. Chem., 1991, 56, 2648-2650)]에 기재된 방법의 수정판을 사용하여 제조하였다. 선행 단계의 생성물 ( 9 , 2.42 g, 3.09 mmol)을 아세토니트릴 (30 mL)에 용해시키고, 물 (30 mL) 중 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (8.23 g, 28.7 mmol)의 용액으로 처리하고, 포화 수성 NaHCO ₃ (5 mL)를 첨가하여 pH를 3으로 상승시키고, 플라스크를 Ar으로 퍼징하고, 반응물을 고무 셉텀(rubber septum) 하에 주위 온도에서 교반하였다 (비등으로 인해 환기됨). 2시간 후, 반응물을 염수 (약 100 mL)로 처리하고, 5분 동안 Ar로 버블링하고 (유리 메틸메르캅탄을 제거하기 위해), 상을 분리하였다. 수성 상을 EtOAc로 2회 추출하고, NaCl로 포화시키고, EtOAc로 2회 더 추출하였다. 이어서 합해진 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하고 진공 중에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (2.24 g, 98%)로서 수득하였다.

단계 4: 4 -아미노-(N- 벤질옥시카르보닐 )벤질아민 ( 14 )

4-아미노벤질아민 (1.00 g, 8.18 mmol) 및 트리에틸아민 (1.20 mL, 8.61 mmol)을 N ₂ 하에 무수 테트라히드로푸란 (THF, 10 mL)에 용해시키고, 염수/얼음조에서 교반하면서 냉각하고, 무수 THF (10 mL) 중 벤질 클로로포르메이트 (1.20 mL, 8.41 mmol)의 용액으로 20분에 걸쳐 적가 처리하였다. 첨가가 완료된 후, 얼음조를 제거하고 반응물을 20시간 동안 주위 온도에서 교반한 다음에, 소결된 유리 펀넬 상에서 여과하여 불용물을 제거하였다. 고체를 EtOAc로 세척하고, 여액을 진공 중에 증발시키고, 잔류물을 40 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (헥산 중 0 - 100% EtOAc, 20분에 걸쳐, 40 mL/분). 순수한 시행중인(mid-running) 분획을 진공 중에 증발시켜 표제 화합물을 연황색 고체 (1.47 g, 70%)로서 수득하였다.

단계 5: 6 - 말레이미딜헥산산 숙시네이트 에스테르 ( 20 )

표제 화합물을 문헌 [Marnett et al. (J. Med. Chem., 1996, 39, 1692-1703)]의 것과 유사한 방법에 의해 시판 6-아미노카르포산으로부터 무색 검으로서 제조하였다.

단계 6: Boc -발린- 숙시네이트 ( 11 )

표제 화합물을 관련 기술분야에 주지된 방법 ( cf .- Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4401)에 의해 Boc-Val-OH로부터 백색 고체로서 제조하였다.

단계 7: Boc -발린-시트룰린 ( 12 )

선행 단계의 생성물 ( 11 , 4.23 g, 13.5 mmol)을 아세토니트릴 (70 mL)에 용해시키고, 물 (30 mL) 중 L-시트룰린 (3.20 g, 18.3 mmol)의 용액 및 NaHCO ₃ 의 포화 용액 (18 mL)으로 처리하고, 플라스크를 N ₂ 로 퍼징하고, 반응물을 24시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 혼합물을 진공 중에 농축하여 아세토니트릴을 제거하고, EtOAc로 1회 세척하여 비극성 불순물을 제거하고, 수성 층을 NaCl로 포화시키고 10% HCl로 pH 3으로 산성화하였다. 생성된 탁한 혼합물을 EtOAc 중 10% 이소프로판올로 4회 추출하고, 합해진 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여액을 진공 중에 농축 및 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (4.53 g, 90%).

단계 8: Boc -발린-시트룰린-아미노-4- 벤질아미노 -N- 벤질옥시카르바메이트 ( 15 )

선행 단계의 생성물 ( 12 , 3.08 g, 8.23 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 30 mL, 분자체 상에서 건조됨)에 용해시키고, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 2.31 g, 11.2 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt, 1.51 g, 11.2 mmol)로 처리하고, 플라스크를 N ₂ 로 퍼징하고 1시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 이어서 DMF (15 mL) 중의 4-아미노-(N-벤질옥시카르보닐)벤질아민 ( 14 , 2.30 g, 8.97 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 또 다른 3일 동안 교반하고, 소결 유리 펀넬 상에서 여과하고, 고체를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여액을 1:1 물/포화 NaHCO ₃ (100 mL)로 세척하고, 수성 층을 10% 이소프로판올/EtOAc로 3회 추출하고, 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과 동안 불용성 겔이 형성되고 이를 메탄올/EtOAc로 용해시켰다. 여액을 진공 중에 농축하여 검상 금색 겔을 수득하고 이를 디에틸 에테르 (50 mL)로 처리하고, 초음파처리하고, 여과하고, 흡입-건조시켜 담황색 고체를 얻었다. 이를 330 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (디클로로메탄 중 0 - 10% 메탄올, 100 mL/분) 표제 화합물을 담황색 고체 (4.07 g, 81%)로서 수득하였다.

단계 9: Boc -발린-시트룰린-아미노-4-벤질아민 ( 16 )

선행 단계의 생성물 ( 15 , 3.04 g, 4.96 mmol) 및 활성탄 상 10% 팔라듐 (0) (0.286 g, 0.269 mmol)을 N ₂ 스트림 하에 메탄올 (50 mL) 및 빙초산 (0.57 mL, 9.95 mmol)으로 처리하고, 반응물을 각각 N ₂ , 이어서 수소로 수분 동안 버블링시키고, 1시간 동안 주위 온도 및 압력 하에 수소 벌룬 하에 격렬히 교반하였다. 반응이 TLC에 의해 완료되었을 때, 벌룬을 제거하고, 현탁액을 N ₂ 로 수분 동안 버블링시키고, 셀라이트 521 상에서 여과하였다. 셀라이트를 메탄올로 세척하고, 여액을 진공 중에 증발 건조시키고, 잔류물을 디에틸 에테르로 1회 연화처리하고 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (2.95 g, 99%)로서 수득하였다.

단계 10: Boc -발린-시트룰린-아미노-4- 벤질이소티오시아네이트 ( 17 )

선행 단계의 생성물 ( 16 , 0.586 g, 0.979 mmol)을 N ₂ 하에 건조 테트라히드로푸란 (20 mL) 및 건조 N,N-디메틸포름아미드 (5 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (0.40 mL, 2.87 mmol)으로 처리하고, 얼음조에서 냉각하고, 5분에 걸쳐 이황화탄소 (0.10 mL, 1.66 mmol)로 적가 처리하였다. 반응물을 주위 온도로 가온하고 2시간 동안 교반하고, 얼음에서 다시 냉각하고, p-톨루엔술포닐 클로라이드 (0.281 g, 1.47 mmol)로 처리하였다. 주위 온도로 가온하고 18시간 동안 교반한 후, 반응물을 1:1 물/염수로 세척하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하고, 수성 층을 NaCl로 포화시키고, EtOAc로 2회 더 추출하고, 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 증발된 여액을 20 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (EtOAc 중 0 - 100% 아세토니트릴, 35 mL/분), 디클로로메탄으로 공비혼합하고 고진공 하에 건조시킨 후 표제 화합물을 금색 고체 (0.391 g, 77%)로서 수득하였다.

단계 11: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3-N-[4-(아미노-시트룰린-Boc-발린)-벤질]-디티오카르바메이트 ( 18 )

선행 단계의 생성물 ( 17 , 0.068 g, 0.131 mmol) 및 메이탄신-3-N-메틸-L-(S)-알라닌-프로판아미드-3-티올 ( 10 , 0.048 g, 0.065 mmol)을 Ar 하에 건조 THF (3 mL)에 용해시키고, 시린지를 통해 트리에틸아민 (0.050 mL, 0.359 mmol)으로 처리하고, 18시간 동안 고무 셉텀 하에 주위 온도에서 교반하였다. 반응물을 진공 중에 농축하고, 10% 이소프로판올/에틸 아세테이트에 용해시키고, 0.5N 수성 HCl로 세척하였다. 수성 층을 10% IPA/EtOAc로 3회 추출하고, 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 증발된 여액을 12 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (EtOAc 중 0 - 20% 메탄올, 30 mL/분) 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (0.042 g, 51%).

단계 12: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3-N-[4-(아미노-시트룰린-발린)-벤질]-디티오카르바메이트 ( 19 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 3 (화합물 6 )의 방법에 의해 선행 단계의 생성물 ( 18 , 0.014 g, 0.011 mmol)로부터 금색 고체 (0.016 g, 100%)로서 제조하였다. 화합물을 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 13: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3-N-[4-(아미노-시트룰린-발린-헥산아미드-6-말레이미딜)벤질]-디티오카르바메이트 ( 21 )

선행 단계의 생성물 ( 19 , 0.055 g, 0.032 mmol)을 1:1 아세토니트릴/물 (4 mL)에 용해시키고, 1N 수성 NaHCO ₃ (0.5 mL) 및 아세토니트릴 (6 mL) 중 6-말레이미딜헥산산 숙시네이트 에스테르 ( 20 , 0.070 g, 2.27 mmol)의 용액으로 처리하고, 플라스크를 고무 셉텀 하에 Ar로 퍼징하였다. 반응물을 5시간 동안 주위 온도에서 교반한 후, 이를 3일 동안 -20℃에서 보관한 후에 주위 온도로 다시 가온하고 염수로 희석하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 합해진 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 증발된 여액을 12 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (18분에 걸쳐 EtOAc 중 0 - 20% 메탄올, 25 mL/분) 표제 화합물을 담황색 고체 (0.011 g, 26%)로서 수득하였다.

실시예 4

단계 1: N-(4- 아미노메틸 -페닐)-아세트아미드 히드로클로라이드 ( 23 )

표제 화합물을 문헌 [King et al. (J. Am. Chem. Soc., 1992, 114 (8), 3033)]의 방법에 의해 4-아미노벤질아민으로부터 연황색 고체로서 제조하였다.

단계 2: N-(4- 이소티오시아네이토메틸 -페닐)-아세트아미드 ( 24 )

선행 단계의 생성물 ( 23 , 0.277 g, 1.38 mmol)을 THF (4.5 mL) 및 DMF (2.0 mL)에 용해시키고, N2 하에 얼음에서 냉각하고, 트리에틸아민 (0.66 mL, 4.73 mmol)으로 처리한 다음에, 이황화탄소 (0.125 mL, 2.07 mmol)로 적가 처리하였다. 반응물을 주위 온도로 가온하고, 3시간 동안 교반한 다음에, 얼음에서 다시 냉각하였다. p-톨루엔술포닐 클로라이드 (0.274 g, 1.45 mmol)로 처리한 후, 반응물을 18시간 동안 교반하면서 서서히 주위 온도로 가온하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 10% 수성 HCl로 pH 2로 산성화하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 증발된 여액을 20 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (20분에 걸쳐 EtOAc 중 0 - 50% 아세토니트릴, 30 mL/분) 표제 화합물을 크림-색상의 고체 (0.157 g, 55%)로서 수득하였다.

단계 3: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌- 프로판아미딜 -3-N-[4-( 아세트아미딜 )벤질]-디티오-카르바메이트 ( 25 )

선행 단계의 생성물 ( 24 , 0.093 g, 0.45 mmol) 및 실시예 3, 단계 3의 생성물 ( 10 , 0.070 g, 0.095 mmol)을 아세토니트릴 (MeCN, 2 mL) 및 건조 DMF (1 mL)에 용해시키고, 염기성 알루미나 (활성화됨, 브로크만 I, 0.357 g)로 처리하였다. 플라스크를 아르곤으로 퍼징한 후, 반응물을 2일 동안 주위 온도에서 교반하고, 여과하고, 고체를 메탄올/아세토니트릴로 세척하였다. 증발된 여액을 12 g 실리카겔 칼럼 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 (15분에 걸쳐 EtOAc 중 0 - 50% 아세토니트릴, 25 mL/분) 보다 완만한 생성물 분획을 진공 중에 농축하여 불순물이 섞인 담황색 검을 얻었다. 이를 RP-HPLC에 의해 정제하고 (페노메넥스 게미니 C18, 30x150 mm 칼럼, 물 중 30 - 90% 아세토니트릴, 이 둘 내의 0.1% TFA) 순수한 분획을 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.016 g, 18%)로서 수득하였다.

실시예 5

메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-β-알라닌 ( 27 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 1-3의 방법에 의해 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로파노에이트 (26)로부터 담황색 고체로서 제조하였다.

실시예 6

메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-γ- 아미노부티르아미드 ( 29 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 1-3의 방법에 의해 N-Boc-GABA-OH ( 28 )로부터 담황색 고체로서 제조하였다.

실시예 7

메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N-Me-γ- 아미노부티르아미드 ( 31 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 1-3의 방법에 의해 N-Boc-N-Me GABA-OH ( 30 )로부터 담황색 고체로서 제조하였다.

실시예 8

단계 1: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 카르복시 -6-[3,4- 디히드로 -2-(tert-부톡시카르보닐)-1H-이소퀴놀린]

메이탄-3-N-메틸-L-(S)-알라닌 ( 2 , 0.034 g, 0.052 mmol), 시판 N-Boc-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-6-카르복실산 ( 32 , 0.019 g, 0.069 mmol), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 0.024 g, 0.125 mmol)를 중량을 재어 교반 바를 갖춘 환저 플라스크에 도입하고 디클로로메탄 (3 mL)에 용해시키고, 플라스크를 Ar로 퍼징하고 고무 셉텀으로 밀봉하고, 반응물을 주위 온도에서 교반하였다. 2일 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고 묽은 수성 NaHCO ₃ 로 세척하고, 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 합해진 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 이어서 증발된 여액을 ISCO 시스템을 통해 12 g 레디셉 골드(RediSep Gold) 실리카겔 칼럼 상에서 정제하고 (12분에 걸쳐 EtOAc - 5:5:1 EtOAc/DCM/MeOH, 30 mL/분), 합해진 TLC-순수한 분획을 증발시키고 진공 중에 건조시켜 표제 화합물을 담색 고체 (0.026 g, 55%)로서 수득하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 카르복시 -6-(1,2,3,4- 테트라히드 로이소퀴놀린) ( 33 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 3 (화합물 6 )의 방법에 의해 선행 단계의 생성물 (0.025 g, 0.027 mmol)로부터 백색 고체 (0.013 g, 52%)로서 제조하였다.

실시예 9

단계 1: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 카르복시 -4-[1-( tert - 부톡시카르보닐 )-피페리딘]

표제 화합물을 실시예 8, 단계 1의 방법에 의해 메이탄-3-N-메틸-L-(S)-알라닌 ( 2 , 0.045 g, 0.069 mmol) 및 시판 1-t-부톡시카르보닐피페리딘-4-카르복실산 ( 34 , 0.024 g, 0.105 mmol)으로부터 백색 고체 (0.027 g, 46%)로서 제조하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 카르복시 -4-피페리딘 ( 35 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 3 (화합물 6 )의 방법에 의해 선행 단계의 생성물 (0.025 g, 0.029 mmol)로부터 백색 고체 (0.012 g, 50%)로서 제조하였다. 상이한 구배 및 개질제를 사용하여 C18 칼럼 상에서 화합물을 정제하였다 (물 중 20 - 80% MeCN, 이 둘 내의 0.05% 아세트산). 순수한 분획을 동결건조시켜 표제 화합물 (0.008 g, 35%)을 수득하였다.

실시예 10

단계 1: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 메틸 -베타-알라닌-N-[4-( tert - 부톡시카르보닐 -발린-시트룰린-아미노)벤질옥시]-카르바메이트

Boc-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시-(p-니트로페닐옥시)-카르보네이트 ( 36 ) (WO 2005112919에 따라 제조됨) (0.092 g, 0.143 mmol), 실시예 2, 단계 3의 생성물 ( 6 , 0.110 g, 0.130 mmol), 및 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAT, 0.037 g, 0.272 mmol)을 DMF (7 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (0.100 mL, 0.717 mmol)으로 처리하고, 마개가 있는 플라스크에서 주위 온도에서 교반하였다. 18시간 후, 반응 혼합물을 진공 중에 농축하여 오일을 얻고, 디클로로메탄에 용해시키고, ISCO 콤비플래시를 통해 24 g 레디셉 골드 칼럼 상에서 정제하였다 (에틸 아세테이트 중 0-20% 메탄올). 이어서 생성물 분획을 진공 중에 증발시켜 표제 화합물을 담황색 고체 (0.129 g, 80%)로서 수득하였다.

단계 2: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 메틸 -베타-알라닌-N-[4-(발린-시트룰린-아미노)벤질옥시]-카르바메이트 ( 37 )

표제 화합물을 실시예 2, 단계 3 (화합물 6 )의 방법에 의해 선행 단계의 생성물 (0.128 g, 0.103 mmol)로부터 백색 고체 (0.074 g, 63%)로서 제조하였다.

단계 3: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 메틸 -베타-알라닌-N-[4-(4-{ 이소티오시아네이토 -페닐}-티오우레이도-발린-시트룰린-아미노)벤질옥시]-카르바메이트 ( 39 )

선행 단계의 생성물 ( 37 , 0.037 g, 0.029 mmol)을 바이알에서 테트라히드로푸란 (THF, 5 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (0.020 mL, 0.143 mmol)으로 처리하고, 생성된 용액을 15분에 걸쳐 THF (10 mL) 중의 1,4-페닐렌디이소티오시아네이트 ( 38 , 0.055 g, 0.286 mmol)의 교반 용액을 함유하는 플라스크에 적가하였다. 바이알을 THF (2 mL)로 세정하고 용액을 반응 플라스크에 첨가하고, 이를 고무 셉텀으로 밀봉하였다. 24시간 동안 주위 온도에서 교반한 후, 반응물을 진공 중에 농축 건조시키고, 조 생성물을 아세토니트릴에 용해시키고, 0.45 um PTFE 막 상에서 여과하였다. 이어서 여액을 ISCO를 통해 30 g C18 레디셉 골드 칼럼 상에서 정제하고 (물 중 20 - 80% MeCN, 두 용매 중의 0.05% HOAc) 가장 순수한 분획 (LC에 의해)을 합하고, -78℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.023 g, 59%)로서 수득하였다.

실시예 11

단계 1: 1 -(4-아미노-부틸)- 말레이미드

디클로로메탄 (10 mL) 중 시판 Boc-1-아미노부틸-4-말레이미드 (0.304 g, 1.13 mmol)의 용액을 트리플루오로아세트산 (1.00 mL, 13.1 mmol)으로 처리하고, 플라스크를 Ar로 퍼징하고, 고무 셉텀 및 버블러 벤트(bubbler vent)로 밀봉하고, 주위 온도에서 교반하였다. 반응물을 18시간 후 TLC에 의해 완료하여, 이를 진공 중에 농축하고, 디에틸 에테르로 2회 연화처리하고, 진공 중에 건조시켜 검을 얻었다. 이를 에테르로 2회 더 연화처리하고 (스팻툴라로 스크레이핑(scraping)하면서), 경사시키고, 진공 중에 다시 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.321 g, 100%)로서 수득하였다.

단계 2: 1 -(4- 이소티오시아네이토 -부틸)- 말레이미드 ( 41 )

선행 단계의 생성물을 아세토니트릴 (MeCN, 3 x 40 mL)에 용해시키고 회전식 증발기를 통해 60℃에서 진공 중에 농축하였다. 건조된 생성물 (0.650 g, 2.45 mmol)을 플라스크에서 MeCN (75 mL) 및 클로로포름 (30 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (1.0 mL, 7.35 mmol)으로 처리하고, 생성된 용액을 10분에 걸쳐 질소 하에 클로로포름 (25 mL) 중 1,1'-티오카르보닐디-2,2'-피리돈 (0.68 g, 2.94 mmol)을 함유하는 플라스크에 적가하였다. 반응물을 18시간 동안 주위 온도에서 교반하고, 반응물을 진공 중에 농축 건조시키고, 조 생성물을 디클로로메탄 (DCM)에 용해시키고 플래시 칼럼 크로마토그래피를 통해 120 g 실리카겔 레디셉 골드 칼럼 상에서 정제하였다 (DCM 중 0 - 10% MeOH). 가장 청결한 분획 (LC에 의해)을 합하고 농축 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.26 g, 50%)로서 수득하였다.

단계 3: 메이탄신 -3-N- 메틸 -L-(S)-알라닌-N- 메틸 -베타-알라닌-N-[4-(4-{ 말레이미딜부틸 }-티오우레이도-발린-시트룰린-아미노)벤질옥시]-카르바메이트 ( 42 )

실시예 10, 단계 2의 생성물 ( 37 , 0.029 g, 0.023 mmol)을 건조 DMF (2 mL)에 용해시키고, 건조 시린지를 통해 디이소프로필에틸아민 (0.020 mL, 0.115 mmol)으로 처리한 다음에, 건조 DMF (2 mL) 중 선행 단계의 생성물 ( 41 , 0.026 g, 0.124 mmol)의 용액으로 처리하였다. 반응 플라스크를 Ar로 퍼징하고, 고무 셉텀으로 밀봉하고, 반응물을 주위 온도에서 교반하였다. 18시간 후 반응은 LCMS에 의해 80% 완료된 것으로 보였으므로, 이를 진공 중에 증발시켜 오일을 얻고, MeCN/물에 용해시키고, 플래시 칼럼 크로마토그래피를 통해 30 g C18 레디셉 골드 칼럼 상에서 정제하였다 (물 중 20 - 80% MeCN, 두 용매 내의 0.05% HOAc). LCMS에 의해 가장 청결한 분획을 합하고, 잠시 회전증발시키고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (0.020 g, 65%)로서 수득하였다.

실시예 12

접합체 제조 및 특성화

실험의 초기 설정을 위해, 4개의 항체를 이하의 절차를 사용하여 본 개시내용의 다양한 링커-약물 화합물에 접합하였다. 이들 실험에서 사용된 4개의 항체는, (1) WO 2007002222A2에 제시된 바와 같은 클론 AB-PG1-XG1-006의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 PSMA 항체, (2) WO 2008052187A2에 제시된 바와 같은, hIgG1로서 발현되는, 클론 mu120의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 STEAP1 항체, (3) WO2013075048A1에 제시된 바와 같은 클론 131의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 EGFRvIII 항체, 및 (4) 2013년 8월 21일에 출원된, 미국 출원 일련 번호 61/868,185 (이 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 제시된 바와 같은 클론 H1H6953N의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 PRLR이었다. 모든 모노클로날 항체를 CHO 세포에서 발현시켰고 단백질 A에 의해 정제하였다. 종양학과 무관한 면역 항원으로부터 유래된 비-결합 대조군을 또한 사용하였다.

화합물 3 , 7 , 21 및 42 에 대한 접합 방법

50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5에서의 항체 (10 mg/ml)를 30분 동안 37℃에서 1 mM 디티오트레이톨로 처리하였다. 겔 여과 (G-25, pH 4.5 아세트산나트륨) 후, DMSO (10 mg/ml) 중 말레이미도 링커 페이로드 유도체 (1.2 당량/SH 기)를 감소된 항체에 첨가하고 혼합물을 1 M HEPES (pH 7.4)로 pH 7.0으로 조정하였다. 1시간 후에 반응물을 과량의 N-에틸 말레이미드로 켄칭하였다. 접합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하고 멸균 여과(sterile filter)하였다. 단백질 및 링커 페이로드 농도를 UV 스펙트럼 분석에 의해 측정하였다. 크기-배제 HPLC는 사용된 모든 접합체가 >95% 단량체성임을 밝혀냈고, RP-HPLC는 <0.5% 비접합 링커 페이로드가 있음을 밝혀냈다. 수율은 단백질을 기준으로 표 1에 보고하였다. 모든 접합된 항체를 문헌 [Hamblett et al, Cancer Res., 2004 10 7063]에 따른 링커 페이로드 로딩 값에 대해 UV에 의해 분석하였다. 결과를 표 1에 요약하였다.

화합물 39 에 대한 접합 방법

50 mM 카르보네이트, 150 mM NaCl, pH 9.0 중의 항체 (2-5 mg/ml)에, 15 부피% 디메틸 아세트아미드를 첨가하였다. DMSO (10 mg/ml) 중의 링커 페이로드 유도체 39 (5-10 당량)를 항체에 첨가하고 혼합물을 4-12시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 접합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하고 멸균 여과하였다. 단백질 및 링커 페이로드 농도를 UV 스펙트럼 분석에 의해 측정하였다. 크기-배제 HPLC는 사용된 모든 접합체가 >95% 단량체성임을 밝혀냈고, RP-HPLC는 <0.5% 비접합 링커 페이로드가 있음을 밝혀냈다. 이들 접합체의 경우, 항체에 대한 페이로드 비를 MALDI-TOF에 의해 측정하였다 (표 1).

<표 1>

실시예 13

시험관내 항체-약물 접합체 (ADC) 무세포(cell-free) 효소 검정

카텝신 B 인큐베이션

시험관내 무세포 효소 검정 절차를 문헌 [Dubowchik, et al., Bioconjugate Chem. 2002 13 855]으로부터 채택하였다. DAR은 PRLR-7을 보정하였고 이소형 대조군-7 농도는 25 mM 아세트산나트륨 완충제, 1 mM EDTA, pH 5.0 중 7.00 uM으로 설정하고 37℃에서 예비-인큐베이션하였다. 카텝신 B (시그마(Sigma) # C8571)를 2 당량의 카텝신 B 스톡에 대해 1 당량의 30 mM DTT, 15 mM EDTA를 이용하여 15분 동안 실온에서 활성화하였다. 활성화된 카텝신 B 용액을 ADC 용액에 1:750 몰비로 첨가하였다. 샘플을 24시간 기간에 걸쳐 37℃에서 인큐베이션하고 HPLC (HISEP)-UV 검출 또는 LC-MS 검출 중 어느 하나를 위해 분취하였다 (하기 참조).

LC-MS 검출

지정된 시점에서, 소량의 분취액을 제거하고 냉 메탄올의 부피를 기준으로 2 당량과 합하였다. 상청액을 회수하고 머크(Merck) 크로모리스(Chromolith) 패스트그라디언트(FastGradient) RP-18e, 2x50 mm 칼럼, 5분에 걸쳐 H ₂ O 중 10 내지 90% MeCN과, 두 용매 내의 0.05% HOAc 및 유량 1 mL를 사용하여, 화합물 6 을 산출하는 카텝신 B 링커 페이로드 절단에 대해 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS)에 의해 분석하였다. 용리액 프로파일을 254 nm에서 모니터링하였다. 카텝신 B를 이용하는 37℃에서 인큐베이션되는 분취액 모두는 질량 735 M+H (C36H51ClN4O10에 대한 계산치, 734.3)로 5.1분에서 용리하는 화합물 6 을 함유하였고 카텝신 B를 이용하지 않은 분취액 중 어떤 것도 6 을 전혀 함유하지 않았다. 이는 또한 실시예 2, 단계 3으로부터 순수한 화합물 6 의 주입에 의해 확인되었다

HPLC ( HISEP )-UV 검출

용액을 지정된 시점에서 "있는 그대로" 주입하였다. 하기 구배 방법을 이용하였다: 완충제 A 100% 100 mM NH4OAc, pH 7.0 및 완충제 B 100% 아세토니트릴, 유량 0.4 mL/분, 5 내지 70% 완충제 B, 슈펠코(Supelco) LC-HISEP 상에서; 150 mm x 4.6 mm, 칼럼. 용리액 프로파일을 280 nm 및 252 nm에서 모니터링하였다. 카텝신 B 인큐베이션된 ADC의 분취액 모두는 19.4분에서 용리하는 종을 함유하였다. 순수한 화합물 6 은 동일 구배 조건 하에 동일한 체류 시간에서 용리한다. 19.4분 종은 카텝신 B를 이용하지 않은 분취액에는 존재하지 않았다.

본 실시예의 결과는 부분적으로 유의한데, 그 이유는 6 의 카텝신 B 단백질 가수분해는 효소가 존재하는 세포에서 ADC의 내입(internalization) 후에만 일어나야 하기 때문이다. 항체는 표적화된 세포에 직접 세포독성 페이로드를 전달하기 때문에 표적을 벗어난(off target) 효과는 감소되어야 한다.

실시예 14

시험관내 세포독성 검정

본 실시예에서, 시험관내 항원-발현 종양 세포를 사멸시키는 다양한 항체-약물 접합체의 능력을 평가하였다.

세포를 PDL-코팅된 96 웰 플레이트에서 완전 성장 배지 중 웰당 375 (MMT/hEGFRvIII), 1500 (U251/hEGFRvIII), 2000 (HEK293/hEGFRvIII), 또는 3000개 (C4-2, PC3/hSTEAP1, T47D, 및 U87-MG) 세포로 시딩하고 밤새 성장시켰다. 세포 생존율 곡선, 연속 희석된 접합체 또는 유리(free) 대표적 페이로드를 500 nM 내지 1 pM에 이르는 범위의 최종 농도로 세포에 첨가하고 3일 동안 인큐베이션하였다. MMT/hEGFRvIII, U251/hEGFRvIII, HEK293/hEGFRvIII, C4-2, PC3/hSTEAP1, 및 U87-MG 중에서 생존율을 측정하기 위해, 세포를 CCK8 (도진도(Dojindo)과 최종 1-3 시간 동안 인큐베이션하고 450 nm (OD450)에서의 흡광도를 플렉스스테이션3 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)) 상에서 측정하였다. T47D에서의 생존율을 측정하기 위해, 세포를 4% 포름알데히드 + 3 ug/ml 훽스트(Hoechst) 중에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 훽스트 염색된 핵의 영상을 이미지엑스프레스 마이크로(ImageXpress Micro) XL (몰레큘라 디바이시즈) 상에서 획득하고 핵 계수를 콜럼버스(Columbus) 분석 소프트웨어 (퍼킨엘머(PerkinElmer))로 측정하였다. 백그라운드 OD450 수준 (CCK8) 또는 디기토닌 (40 nM) 처리 세포로부터의 핵 계수를 모든 웰에서 빼고 생존율을 미처리 대조군의 백분율로서 표기하였다. IC ₅₀ 값을 10-점 반� �� 곡선에 걸쳐 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 결정하였다 (그래프패드프리즘(GraphPad Prism)). 모든 곡선 및 IC ₅₀ 값을 페이로드 당량에 대해 보정하였다.

이소형 대조군 결합 초과 271배에서 PSMA를 음성 발현하는 C4-2 세포 (전립선암주)에서, 메이탄시노이드 접합체 PSMA-3, PSMA-7, 및 PSMA-21은 3.8, 0.5, 및 8.3 nM 각각의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 1). 네이키드(naked) PSMA 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

이소형 대조군 결합 초과 352배에서 hSTEAP1을 발현하는 PC3/hSTEAP1 세포 (전립선암주)에서, 메이탄시노이드 접합체 STEAP1-7은 4 nM의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 2). 네이키드 STEAP1 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

이소형 대조군 결합 초과 14배에서 PRLR을 음성으로 발현하는 T47D 세포 (유방암주)에서, 메이탄시노이드 접합체 PRLR-7은 1.0 nM의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 3). 네이키드 T47D 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

이소형 대조군 결합 초과 360배에서 hEGFRvIII을 발현하는 HEK293/hEGFRvIII 세포에서, 메이탄시노이드 접합체 EGFRvIII-7은 0.4 nM의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 4). 네이키드 EGFRvIII 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

이소형 대조군 결합 초과 280배에서 hEGFRvIII을 발현하는 MMT/hEGFRvIII 세포에서, 메이탄시노이드 접합체 EGFRvIII-7는 0.3 nM의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 5). 네이키드 EGFRvIII 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

이소형 대조군 결합 초과 165배에서 hEGFRvIII을 발현하는 U251/hEGFRvIII 세포 (교모세포종 암주)에서, 메이탄시노이드 접합체 EGFRvIII-7은 0.3 nM의 IC ₅₀ 값을 갖는다 (도 6). 네이키드 EGFRvIII 항체는 어떤 항-증식 활성도 없었다.

제시된 방출된 페이로드 ("유리 약물")의 시험관내 세포독성을 또한 상기 기재된 다양한 세포주에서 시험하고 비교용으로 접합된 항체와 함께 플로팅하였다 (도 1 내지 6에서 폐쇄 네모 (■) 참조). 링커-페이로드 3 및 7 의 경우 제시된 방출된 페이로드 2 및 6 각각을 세포 검정에서 직접 사용할 수 있는데, 그 이유는 이들이 안정하기 때문이다. 그러나, 링커-페이로드 21의 경우 방출된 페이로드는 술프히드릴 화합물 10일 것으로 제시된다. 10은 매우 반응성 화합물일 수 있기 때문에, 이는 불확실한 결과를 야기할 것이고, 화합물 25 을 선택하여 이들 검정에서 방출된 페이로드를 나타냈다.

별도의 실험 설정에서, 화합물 6 을, 아미노 유사체 27 , 29 , 및 31 과 함께, 항-증식 활성에 대해 HEK293 및 U87MG에서 검정하였다 (도 7). 이들 화합물 모두 >30 nM IC ₅₀ 값을 가졌으며 이는 이들이 적절한 링커를 통해 항체에 부착되는 경우에만 고도로 세포독성임을 나타내는 것이다. (이들 실험의 경우, 디기토닌을 이용한 백그라운드 보정은 수행하지 않았다).

실험의 또 다른 설정에서, 화합물 6 , 9 , 33 , 및 35 를 항-증식 활성에 대해 HEK293, U251, C4-2, PC3, 및 MMT에서 검정하였다 (도 8). 아미노 화합물 6 , 33 , 및 35 는 표 2에 열거된 바와 같이 IC ₅₀ 을 달리하였다. 효능의 추세는 9 > 33 > 35 > 6 에 따르며 검정된 5개의 세포주에 대해 일관되었다.

<표 2>

어떤 이론에 의해 구속됨이 없이, 이들 실험의 결과는 본 개시내용의 화합물의 "방출된" 또는 "유리 약물" 형태 (즉, 항체에 접합되지 않은 화합물)가, 대부분의 경우, 표적화 항체에 접합되는 경우보다 실질적으로 덜 세포독성임을 입증한다. 본 개시내용의 이러한 특징은 본 발명의 화합물을 포함하는 항체-약물 접합체는, 세포 사멸 특성이 표적 항원의 부위에서 특이적으로 집중될 것이기 때문에, 부작용이 거의 더 없거나 원하지 않는 독성을 덜 야기할 것임을 시사한다.

실시예 15

항- EGFRvIII 항체 약물 접합체는 생체내 EGFRvIII 양성 유방암 동종이식편 모델에서 종양 성장의 강력한 억제제이다

본 실시예에서, 예시적 항-EGFRvIII 항체 H1H1863N2의 2개의 상이한 항체-약물 접합체를 생체내 종양 성장을 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. (H1H1863N2의 아미노산 서열 및 다양한 특성은 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 2014년 3월 11일에 출원된 US 61/950,963에서 제시되어 있다). H1H1863N2는 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR); 서열 5를 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR); 서열 2, 3 및 4 각각을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 서열 6, 7 및 8 각각을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함한다.

제1 ADC는 H1H1863N2를 비-절단성 MCC 링커를 통해 메이탄시노이드 DM1에 접합시켜 (예를 들어, US 5,208,020 및 미국 출원 20100129314 참조) "H1H1863N2-MCC-DM1"을 생성시킴으로써 생성시켰다. 제2 ADC는 H1H1863N2를 7에 접합시킴으로써 "H1H1863N2-7"을 산출함으로써 생성시켰다. 실시예 14에 기재된 검정 포맷을 사용하여 MMT/EGFRvIII 세포에 대한 시험관내 세포독성에 대해 시험하는 경우, H1H1863N2-MCC-DM1은 12 nM의 IC ₅₀ 을 나타냈지만 H1H1863N2-7은 단지 0.8 nM의 IC ₅₀ 을 나타냈다. 따라서, 시험관내에서, 항-EGFRvIII ADC H1H1863N2-7은 MCC 링커를 통해 DM1에 접합된 상응하는 항체보다 훨씬 더 강력한 종양 세포 사멸을 나타냈다.

MCC-DM1 및 7에 접합된 항-EGFRvIII 항체의 생체내 효능을 비교하기 위해, EGFRvIII 양성 유방암 동종이식편 보유 면역손상(immunocompromised) 마우스에서 연구를 수행하였다. 간략히 설명하면, 종양 동종이식편은 암컷 CB17 SCID 마우스 (타코닉(Taconic), 뉴욕주 허드슨)의 왼쪽 옆구리에 0.5x10 ⁶ 개 MMT/EGFRvIII 세포의 피하 이식에 의해 확립하였다. 일단 종양이 140 mm ³ 의 평균 부피에 이르면 (~제8일), 마우스를 7개의 군으로 무작위화하고, MCC-DM1 또는 7 링커-약물 포맷 중 어느 하나를 사용하여 항-EGFRvIII ADC를 투여하였다. MCC-DM1 또는 7 링커-약물 포맷 중 어느 하나를 사용하여 비-결합 ADC를 포함한, 대조군 시약, 및 PBS 비히클을 또한 평가하였다. ADC를 1주에 걸쳐 3회 1 및 5 mg/kg으로 투여한 후에 비히클 단독으로 투여된 군에서 대략 2000 mm ³ 의 평균 종양 크기가 달성될 때까지 모니터링하였다. 이 시점에서, 종양 성장 억제를 계산하였다.

비히클 치료군에 비한 평균 종양 크기를 다음과 같이 계산하였다: 종양을 비히클 군의 평균 크기가 1000 mm ³ 에 이를 때까지 캘리퍼로 1주 2회 측정하고; 종양 크기를 식 (길이 x 폭 ² )/2를 사용하여 계산하였다. 종양 성장 억제를 다음 식: (1-((T _최종 -T _최초 )/(C _최종 -C _최초 )))*100 [여기서 T (치료군) 및 C (대조군)는 비히클 군이 1000 mm ³ 에 이른 당일에 평균 종양 질량을 나타낸다]에 따라 계산하였다. 결과는 표 3에 요약하였다.

<표 3>

반복 용량으로 투여된, 항-EGFRvIII 항체-약물 접합체 및 대조군의 투여 후 종양 크기 및 종양 성장 억제

본 실시예에서 나타난 바와 같이, 가장 큰 종양 억제는 5 mg/kg H1H1863N2-7이 투여된 마우스에서 관찰되었고, 여기서 최초 종양의 퇴축이 관찰되었다. 5 mg/kg H1H1863N2-7을 이용한 치료로부터 생긴 102%의 종양 성장 억제는 5 mg/kg H1H1862N2-MCC-DM1 (83%)을 이용한 종양의 치료 후에 관찰된 것에 비해 상당히 더 컸다. H1H1863N2-MCC-DM1과 비교하여 H1H1863N2-7에 의해 유도된 종양 성장 억제의 우세함은 1 mg/kg 용량에서도 유지되었다. MCC-DM1 또는 7를 사용하여 대조군 ADC로 치료한 군에서는 어떤 항-종양 효과도 관찰되지 않았다.

UPDATED SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> BIOLOGICALLY ACTIVE MACROLIDES, CONJUGATES THEREOF, AND THERAPEUTIC USES <130> 1550A-WO <140> PCT/US14/29757 <141> 2014-03-14 <150> 61/792,216 <151> 2013-03-15 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Tyr Val Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 3 <211> 7 <212 > PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ile Gly Thr Ala Gly Ala Thr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <22 3> Synthetic <400> 7 Ala Ala Ser 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5