[0001] 本发明属于检测方法领域，具体涉及一种用于预报人体异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法。

[0002] 生物个体在各种因子的刺激下使细胞分裂活跃，细胞数量增多，产生各种疾病，称之为异常增生，如代偿性增生、再生性增生、内分泌性增生等。异常增生与肿瘤发生密切相关。因此，有效检测或预报异常增生对预报异常增殖或肿瘤发生风险具有十分重要的意义。然而，目前国内外预报异常增生的检测方法未见报道。国内外临床使用的肿瘤标志物主要用于检测肿瘤形成后抗体或蛋白水平，不能用于预报异常增殖或肿瘤发生风险。

[0003] 硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，该系统在肿瘤的发生、发展、转移、浸润、耐药、肿瘤血管发生等方面发挥着重要作用。已有研究表明，硫氧还蛋白系统与癌症的关系密切：1)Trx和TrxR为癌症的标志性物：TrxR在肿瘤细胞中表达量是正常组织的10倍。Turunen等通过免疫组化的方法研究了Trx和TrxR在乳腺癌患者体内的表达情况，结果是Trx和TrxR在患者细胞质中的阳性率分别为67％和59％，在细胞核中的阳性率为55％和6％。并且，Trx在细胞核和细胞质中均为阳性的乳腺癌患者的癌细胞增殖很快，病程很短。Lincoln等采用免疫细胞化学法测定TrxR在人原发乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌及恶性黑色素瘤中的定位与表达，结果显示，侵袭力强的肿瘤过度表达TrxR，且增殖力强、凋亡率低、转移力高。Yoo MH等人完成的肿瘤细胞TrxR1基因敲除实验证明，TrxR1在肿瘤细胞中是必不可少的；2)Trx系统参与肿瘤发展的不同阶段，并表现出在肿瘤细胞中过量表达、促进肿瘤增殖、表达促存活信号和启动促存活过程等特点。因此，检测机体的TrxR水平对预报异常增殖或肿瘤发生具有非常重要的作用。

[0004] CN1166651C、CN1281593C、CN1242999C、CN1280279A、CN1704408A、CN1704409A、CN1704410A、CN1853627A、CN1990475A和CN200910077161.X分别公开了“具有抗炎和抗肿瘤作用R-双或糖苯丙异硒唑取代化合物”、“苯并异硒唑衍生物的免疫调节和生物治疗作用”、“苯并异硒唑衍生物及其应用”、“双苯并异唑酮类化合物及其合成和应用”、“异硒唑酮类化合物和其配合物及其应用”、“具有抗纤维化及抑制明胶酶活性的化合物及其应用”、“苯并异硒唑酮衍生物及其制备方法与应用”、“双苯并异硒唑乙烷环糊精或环糊精衍生物包合物及其制备方法和其用途”、“取代苯并异硒唑酮类化合物及其用途”、“硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物及其制备方法和其应用”。这些申请或专利所公开的内容均作为本申请的参考。

[0005] 本发明的目的在于提供一种用于预报人体异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法，所述检测方法包括测定样品(如人血或组织)中的下述指标：

[0006] 1)用DTNB直接测定样品中总巯基含量；

[0007] 2)采用特异性的硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物，选择性地抑制样本中的硫氧还蛋白还原酶活性后，再用DTNB测定样品中其他巯基物质的含量，所述的特异性的硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物为具有TrxR抑制活性的硒啉类化合物，优选为具有下述I-X结构的硒啉类有机硒化合物：

[0008]

[0009]

[0010] 其中，有机硒化合物I-X的制备、确认和应用可全文参考CN200910077161.X所公开的技术内容；

[0011] 3)用总巯基含量减去其他巯基含量，即得样品中的TrxR的含量和活性。

[0012] 进一步，所述样品选自血液或组织，优选为血液。

[0013] 本发明采用特异性的TrxR抑制剂抑制TrxR活性，通过背景扣除法测定生物样本中的TrxR活性，来预报人体异常增殖或肿瘤发生风险。

[0014] 抗氧化能力/氧化应激水平与肿瘤发生发展密切相关。抗氧化能力弱，氧化应激水平升高，则预示着肿瘤发生的可能。定量检测血液中的总巯基含量可作为机体抗氧化能力或抗氧化能力的整体水平的一项有效检测指标(Kleinman WA，Richie JP Jr.Status of glutathione and other thiols and disulfides in human plasma.BiochemPharmacol.2000 Jul 1；60(1)：19-29)。丙二醛(MDA)是脂质过氧化损伤的终产物，测定血液中的MDA含量可以有效地反映机体的氧化应激水平。

[0015] 研究证明，硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白在多种肿瘤中高度表达，并与肿瘤的发生、发展、转移、浸润、耐药、肿瘤血管发生密切相关。细胞分泌硫氧还蛋白进入外周血液，肿瘤病人血液中硫氧还蛋白的含量远高于健康人，并且与肿瘤疾病的进程和病人的生存期密切相关。因此，以硫氧还蛋白系统的功能评价为主导的，抗氧化能力/氧化应激水平的综合评价系统，符合肿瘤疾病的发生特点。

[0016] 目前，国际上采用硫代葡萄糖金(Aurothioglucose，结构式见式1)抑制法测定TrxR活性，其工作原理是：一是用DTNB测定样品中的总还原能力；二是用Aurothioglucose抑制样品中TrxR的活性后，再测定DTNB的还原能力；三是计算样品前后两次还原能力的差值来测定样品中TrxR的活性。但是，Aurothioglucose缺乏特异性，对样品中的其他巯基物质也可发生封闭作用，不适用于直接测定血液或组织样品中的TrxR活性。例如，Hill KE等(Determination of thioredoxin reductase activity in rat liver supernatant.《Anal Biochem.》，1997，Nov 1；253(1)：123-5)采用Aurothioglucose测定大鼠肝匀浆中的TrxR活性时，要先对肝匀浆进行透析处理，以除去其中的小分子巯基物质(如谷胱甘肽)后，再加入Aurothioglucose测定其TrxR活性。可见，其他小分子巯基物质(如谷胱甘肽)可干扰硫代葡萄糖金对TrxR的活性测定。另一研究结果表明，Aurothio-glucose会增加血液中巯基物质与DTNB的反应速率(Hu ML，Dillard CJ，Tappel AL In vivo effects of aurothioglucose and sodium thioglucose on rat tissue sulfhydryl levels and plasma sulfhydryl reactivity.《Agents Actions》.1988，Aug；25(1-2)：132-8)。

[0017]

[0018] 本发明所用的硒啉类化合物，尤其是硒啉类有机硒化合物I-X对TrxR具有强效的抑制作用。体外抑制试验显示，有机硒化合物I-X对哺乳动物TrxR具有强抑制作用，其半数抑制浓度为0.35μM(如图1所示)。

[0019] 本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-X对TrxR的抑制作用具有高选择性，截至目前为止，该类化合物是报道的唯一具有特异靶向的TrxR抑制剂，可有效结合在TrxR的SeCys/Cys活性位点而发挥抑制作用，从而高度选择性地抑制TrxR(如图2所示)。

[0020] 另外，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-X对TrxR的抑制作用不受体系中其他巯基物质的干扰，具有高选择性。研究表明，即使样品体系中存在高浓度的其他巯基物质时，如0.5mM还原型谷胱甘肽，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-X依然对TrxR表现高选择性的强抑制作用(如图3所示)。

[0021] 因此，本发明所用的硒啉类化合物，尤其是有机硒化合物I-X可作为TrxR的特异性抑制剂，用于测定复杂体系中TrxR酶的活性，所述复杂体系包括人血和组织样本。

[0022] 由于硫氧还蛋白还原酶可以催化还原5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)分子中二硫键，使其还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)，而TNB在405～412nm处有强烈的紫外吸收，可通过检测单位时间内TrxR催化DTNB的量来反映该酶的活性。

[0023] 本发明的目的在于提供一种预报异常增生或肿瘤发生风险的方法，包括：1)正常人群或未见异常者的TrxR活性低于1；2)异常增生人群或者异常增生高风险人群的TrxR活性大于1，总巯基量不低于30，优选不低于40；3)肿瘤病人或肿瘤高风险人群的TrxR活性大于1，总巯基量不超过30。

[0024] 本发明试剂盒的组成包括：

[0025] (一)检测试剂

[0026] 1.DTNB粉末49.8mg，避光，室温保存；

[0027] 2.NADPH粉末4.2mg，避光，-20℃保存；

[0028] 3.10×工作液(1M磷酸钾缓冲液，PH＝7.4，内含73.1mg EDTA，5mg BSA。)2mL，4℃保存；

[0029] 4.TrxR抑制剂溶液(2.5mM的有机硒化合物I-X)，100uL，-20℃保存；

[0030] 5.阳性对照：大鼠肝脏TrxR，5 Unit，-20℃保存；

[0031] 6.TNB标准品；

[0032] 所述的检测试剂可用于100次测试；

[0033] (二)其他

[0034] 1.96空板或者比色杯；

[0035] 2.酶标仪或分光光度计(405～412nm)。

[0036] 本发明试剂盒的测定过程包括：

[0037] (一)溶液的配制

[0038] 1.1×工作液(assay buffer)

[0039] 取2mL的10×工作液(0.5M磷酸钾缓冲液，PH7.4)用去离子水定容至20mL(内含73.1mg乙二胺四乙酸(EDTA)，5mg牛血清白蛋白(BSA))，室温下使用，可供100孔检测；

[0040] 2.称取39.6mg DTNB溶解于10mL的1×工作液中，避光室温保存，现用现配；

[0041] 3.称取4.2mg NADPH溶解于2ml的1×工作液中，避光4℃待用，临用前避光恢复至室温；

[0042] 4.TrxR抑制剂工作液(25μM)：取10μl抑制剂储备液(2.5mM)，加入1×工作液，稀释至1mL，供50孔检测，室温下使用。

[0043] (二)操作步骤

[0044] 1.取96孔板，板底洁净透明，在405nm处无干扰吸收；

[0045] 2.样品孔加入：20μl样品+60μl 0.1M磷酸钾缓冲液；

[0046] 3.样品+抑制剂孔加入：20μl样品+20μl抑制剂工作液+40μl0.1M的1×工作液(0.05M磷酸钾缓冲液)；

[0047] 4.将加样后的96孔板置于37℃，避光孵育1h；

[0048] 5.向各个样孔加入20μl的NADPH工作液后，再加入100μl的DTNB工作液，室温下，波长405nm处，立即记录初始吸光度值(A0s)并连续测定420s吸光度值(A420s)。

[0049] 或者各孔加样方式见表1。

[0050] 表1加样方式

[0051]

[0052] ※根据TrxR活性决定，可不设阳性对照组。

[0053] 各物质终浓度为：5mM的5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，0.2mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)，10mM的EDTA，0.2mg/mL的BSA，2.5μM的有机硒抑制剂。

[0054] 结果计算，

[0055] 其中，ΔA/min＝[(A样品420s-A样品0s)-(A样品抑制剂420s-A样品抑制剂0s)]/7min；可得硫氧还蛋白还原酶活性，即每分钟每mL样品催化DTNB的纳摩尔量。附图说明

[0056] 图1乙烷硒啉对大鼠动物硫氧还蛋白还原酶的体外抑制活性；

[0057] 图2乙烷硒啉对谷胱甘肽还原酶的抑制作用；

[0058] 图3谷胱甘肽对乙烷硒啉酶抑制作用的影响。

[0059] 以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

[0060] 实施例1TrxR活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究采用本发明的试剂盒，测定了58例临床检测为正常人和20人次肿瘤病人的血液中硫氧还蛋白还原酶的活性，用于预报人体发生异常增生或肿瘤发生的风险。

[0061] 表2TrxR活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070] 注：异常增生程度依次为：正常，正常-(需要复查或定期检查)，正常--(异常增生相关)，TRCA/正，TRCA+，TRCA++，TRCA+++，TRCA+++++，大于TRCA+++++(TRCA代表肿瘤病人TR水平，+代表TR活性程度)。

[0071] 由表2可见，44例未见异常者有7例提示有异常增生表现，建议定期检查，且70％正常人群的TrxR活性低于1；14例有异常增生人群的TrxR活性大于1，且总巯基量在30以上；多数肿瘤病人的TrxR大于1，且总巯基量不超过30。

[0072] 实施例2TrxR活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究

[0073] 本发明的检测方法用于预报300例人次的异常增生或肿瘤发生风险，得出：超过70％的人群未见异常者，其TrxR活性低于1；超过70％的异常增生人群的TrxR活性大于1，总巯基量在30以上；70％以上的肿瘤病人的TrxR活性大于，总巯基量不超过30。

[0074] 表3本方法与临床诊断比较

[0075]

[0076] 本表中数据基于总例数300中绝对临床正常，绝对临床评价异常增生，临床已判断为肿瘤病人的三种人群得出

[0077] 本发明的检测方法用于预报表2中78例人的肿瘤发生风险，得出：80％以上肿瘤病人的TrxR活性大于1，而总巯基量在30-40，且与正常人群的TrxR活性和总巯基量存在显著差异。

[0078] 与目前临床上广泛使用的甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)检测法相比(通常检测敏感45％-60％)，本发明的预报方法的敏感性显著高于CEA和AFP检测法，具有临床应用价值。

[0079] 表4临床恶性肿瘤中AFP和CEA检测结果

[0080]

[0081] 其中，AFP和CEA数据源自陈永伟等，《放射免疫学杂志》，2001年，第14卷第5期：318。