Fluorescently tagged ligand |
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| 申请号 | JP2011158396 | 申请日 | 2011-07-19 | 公开(公告)号 | JP2012006935A | 公开(公告)日 | 2012-01-12 |
| 申请人 | Cellaura Technologies Ltd; セルオーラ テクノロジーズ リミテッドCellAura Technologies Limited; | 发明人 | GEORGE MICHAEL; HILL STEPHEN JOHN; KELLAM BARRIE; MIDDLETON RICHARD JOHN; | ||||
| 摘要 | PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a library of tagged non-peptide ligands comprising one or a plurality of ligand moieties each linked to one or a plurality of different tag moieties.SOLUTION: The library comprises a plurality of tagged ligands of formula (I): (LigJ)L(JTag)(JL(JLig)). The library further comprises one or a plurality of same or different ligand moieties Lig each linked to one or a plurality of same or different tag moieties Tag via same or different linker moieties L and same or different linking site or linking functionality Jand J. In the formula (I), Lig comprises a G-protein coupled receptor ligand, an inhibitor of an intracellular enzyme or a substrate or inhibitor of a drug transporter; and L is a single bond or is any linking moiety selected from a heteroatom such as N, O, S, P. | ||||||
| 权利要求 | 式Ｉ （ＬｉｇＪＬ）ｍＬ（ＪＴＴａｇ）ｍ（ＪＴＬ（ＪＬＬｉｇ）ｍ）ｐの複数のタグ付き非ペプチドリガンド及びその塩を含むライブラリーであって、 同じか又は異なるリンカー部分Ｌ 並びに同じか又は異なる連結部位又は連結官能基Ｊ Ｔ及びＪＬを介して１つ又は複数の同じか又は異なるタグ部分Ｔａｇに各々が連結された１つ又は複数の同じか又は異なるリガンド部分Ｌｉｇを含み、 式Ｉ 中、Ｌｉｇは、ＧＰＣＲリガンド、細胞内酵素の阻害剤又は薬物輸送体の基質若しくは阻害剤を含み； Ｌは、単結合であるか、又はＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐのようなヘテロ原子、任意選択でヘテロ原子を含有する飽和若しくは不飽和の分枝鎖若しくは直鎖のＣ１〜６００ヒドロカルビル及びそれらの組合せから選択される任意の連結部分であり、モノマーであっても、２個から３０個までのオリゴマー反復を有するオリゴマーであっても、３０個を超えて３００ 個までのポリマー反復を有するポリマーであってもよく； Ｔａｇは、任意の既知又は新規のタグ付き基質であり； ｍ は、１から３までの整数から各々独立して選択され； ｐ は、０から３までであり、 連結が、異なるＬｉｇ、ＪＬ、Ｌ、ＪＴ及び／ 又はＴａｇを含む化合物中の同じか又は異なる連結部位に存在し、同じＬｉｇ、ＪＬ、Ｌ、ＪＴ及び／又はＴａｇを含む化合物中の異なる連結部位に存在することを特徴とするライブラリー。 |
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| 说明书全文 | 本発明は以下に関する：各々が１つ又は複数の異なるタグ部分に連結された１つ又は複数のリガンド部分を含むタグ付き非ペプチドリガンドのライブラリー；このライブラリーの調製方法；ライブラリーの合理的設計及びタグ付きリガンドのライブラリーからの選択のための方法；タグ付き非ペプチドリガンドのライブラリーの調製のための、反応性非ペプチドリガンド及び反応性タグ付き基質を含むキット；それらの薬理学についての情報と関連付けられたタグ付き非ペプチドリガンド；新規タグ付きリガンド；新規リガンド前駆体及びこの前駆体の調製方法；レセプター結合（例えば、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）結合）又は細胞内酵素の阻害（例えば、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの阻害）及び薬物輸送体（例えば、ヌクレオシド輸送体又はＡＴＰ結合カセット輸送体）への薬物の結合を研究すること；より具体的には、共焦点顕微鏡法及び蛍光活性化分類及び蛍光相関顕微鏡法のような技術を使用して、細胞集団又は単一の細胞（例えば、急性に分散された細胞）においてこれらの相互作用を研究することにおける、既知及び新規のタグ付きリガンド並びにタグ付きリガンドのライブラリーの使用。 アデノシン−Ａ １レセプター（Ａ １ −ＡＲ）は、脳、心臓、脂肪組織及び筋肉を含む種々の組織において見出され、多数の状態の病態生理学において示されているＧＰＣＲである（Ｒａｌｅｖｉｃ，Ｖ．及びＢｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｊ（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５０、４１５）。 最近、Ａ １ −ＡＲ薬理学の研究は、例えば放射性リガンド結合のような技術を使用して、多数で増殖し得る細胞においてのみ充分に実施できる。 オートラジオグラフィーは、単一の細胞の研究を可能にするが結合の直接的な読み取りを可能にせず、結合の結果を得るためにフィルムを現像するのに４週間〜６週間までかかる可能性がある。 この問題点を克服するために、ごく少数の蛍光リガンドが、共焦点顕微鏡法（ＣＳＬＭ）、共焦点プレートリーダー、蛍光偏光プレートリーダー及び蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用して、単一の細胞においてレセプターを可視化すること及び定量的なレセプター−リガンド結合データを得ることにおける使用のために適合されている。 共焦点顕微鏡法は、細胞を通る断面の可視化を可能にし、細胞の縁部での蛍光体の濃度は、膜レセプターの結合を示す。 ＦＣＳは蛍光種の拡散特徴を分析し、速く拡散する遊離リガンドは、ゆっくりと拡散するレセプター結合リガンドから識別することができ、その体積が細胞膜に局在化される場合には同時に定量できる。 ＭｃＧｒａｔｈら、ＴｉＰＳ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６（第１７巻）３９３−３９９は、共焦点顕微鏡法及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用するレセプターの数を示すリガンド−レセプター複合体の量を報告するための細胞レセプターの研究において、より伝統的な放射性リガンドの代わりに蛍光リガンドを使用する可能性を概説している。 彼は、レセプターの特性を研究するのではなくレセプターの局在化に主に狙いを定めて、それらの結合部位を同定することを望んで蛍光分子をレセプターリガンドにコンジュゲート化する際に多数の試みがなされていることを述べている。 いくつかの化合物は、レセプターに結合した場合に蛍光を発するが、水相中で低いバックグラウンドノイズを与えることが報告されている。 報告された目的は、レセプターに結合した場合に蛍光を保持し、未結合の薬物が洗浄して除かれた場合に結合したままである蛍光薬物を産生することであった。 したがって、非常に高いレセプター結合親和性が必要であった。 概説された研究は、ニコチン性レセプター、βアドレノセプター、オピオイドＧＰＣＲ型レセプター、ヒスタミン、ニューロテンシン及びα−アドレノセプターに結合する蛍光リガンドを含んでいる。 この刊行物は、共焦点顕微鏡法の利点もまた概説している。 これらのリガンドの薬理学的特性を研究するためになされた試みが、上記の場合のいくつかにおいてのみ報告されている。 しかし、レセプター又はレセプターのクラスを可視化するための試みでうまくいくことが示されているものは非常に少ない。 薬理学的特性は通常、任意のレセプター結合リガンドへの蛍光体の連結によってある程度まで影響を受け、このような特性には、結合親和性及びレセプターの活性化又はその他における変化、即ちアゴニスト特性又はアンタゴニスト特性における変化が含まれる。 この蛍光リガンドの薬理学は、観察された結合結果を定量するためのいずれの研究においても既知であることが重要である。 実際、ＧＰＣＲに対する非ペプチド蛍光リガンドの合成は、深刻な問題を提示している。 合成されている細胞表面レセプターに対するいくつかの市販の非ペプチド蛍光リガンドには、ヒスタミン−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ及び（以下に記載する）ＣＧＰ１２１７７−ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＴＭＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれる： これらは、目的のタンパク質上の任意の反応性部位への非特異的結合を与え、通常、この結合の性質又は位置を知る必要はない。 しかし、これらのタンパク質は、本発明において想定された薬物（例えば、ＸＡＣ（キサンチンアミンコンジナー）など）を含む非ペプチドリガンドよりも大きい分子である。 多数のＧＰＣＲレセプターに対するリガンド結合部位はまた、レセプターの膜貫通領域内の深いところに通常存在し、したがって、薬理学的活性を保持するような方法で蛍光体に結合することは挑戦である。 これらのＢＤＩ蛍光体はどれも、ＧＰＣＲにおいて規定された特性を有するが、むしろ「付加的（ａｄｄ−ｏｎ）」プローブとして蛍光体を有する蛍光アゴニスト／アンタゴニストの特異的設計に関係しない。 したがって、まとめると、蛍光リガンド並びに特にＦＣＳ及びＣＭ結合研究に適切な非ペプチド蛍光リガンドの入手可能性は実質的に存在しない。 このような化合物の調製は型どおりの作業からは程遠く、薬理学を確立するための試みはほとんどなされていない。 上記のＭｃＧｒａｔｈが、研究されたレセプター型のいくつかを考察しただけである。 さらに、かなりの先行技術において統一されたアプローチは存在しない。 個々の研究は、特定の薬物クラス及び又は特定の蛍光体の使用に限定された蛍光リガンドシステムを扱ってきた。 このようなシステムは、得ることができる情報及び調査できるシステムの数の両方において限定的である。 したがって、親和性並びにアゴニスト特性及びアンタゴニスト特性の両方に関して確立された薬理学と共に、信頼性のある有効なレセプターの可視化及びレセプターの選択性を与える、所望のレセプターにおける結合についての新規選択的蛍光リガンドが必要とされる。 本発明者らはここで、必要とされる規定された薬理学的特徴を有する所望のＧＰＣＲに対して選択的な蛍光タグ付きリガンドの選択のための方法において使用され得る、合理的に設計された蛍光タグ付きリガンドのライブラリー及びこのライブラリーの調製のために方法を提供するための蛍光リガンド設計に学際的なアプローチを適用した。 このライブラリーは、レセプター結合能の保持及びレセプター結合能を妨害することも既知の様式で結合能を改変することもない様式での連結を提供する蛍光リガンドの選択を可能にする所望の部位での連結を有する既知又は新規の蛍光リガンドを提供するために、任意の蛍光体への連結のための化学官能基を含む好ましくは非ペプチドリガンド前駆体から得られる。 リンカー前駆体はまた、蛍光部分又は任意の他の所望の非親水性プローブへの連結に際して、改善された特性（例えば水溶性）を提供し得る。 本発明の最も広い態様において、式Ｉ 好ましくは、このライブラリーは、ＬｉｇとしてＮＥＣＡを含まず、ＴａｇとしてダンシルアミドもＮＢＤも含まず、各Ｊとして単結合を含まず、且つＬとしてＣ ３〜１２のメチレン鎖を含まない。 本発明の新規性は、特異的にタグ付きされたリガンド若しくは「薬物」（例えば、蛍光リガンド）又は既知若しくは選択可能な薬理学特性を有する「薬物」の設計に関する。 この成功のために重要なことは、各タグ又は蛍光体が得られた生成物の薬理学に対して特定の影響を有するということであり、この化合物が前駆体薬物の特性を保持すると仮定することは誤りである。 好ましくは、このライブラリーは、前駆体リガンドの特性を保持するタグ付きリガンド又は蛍光リガンドの選択のための基礎として使用できる連結部位及びリガンド部分における改変を示すライブラリーメンバーの合理的設計によって構築される。 好ましくは、このライブラリーは、非タグ付きリガンドの特性に対応する確認された特性を有する、規定され充分に特徴付けられた複数のタグ付きリガンドを含む。 ＧＰＣＲリガンドは、アデノシンレセプター、β−アドレノセプター、ムスカリン性レセプター、ヒスタミンレセプター、オピオイドレセプター、カナビノイドレセプター、ケモカインレセプター、α−アドレノセプター、ＧＡＢＡレセプター、プロスタノイドレセプター、５−ＨＴ（セロトニン）レセプター、興奮性アミノ酸レセプター（例えばグルタミン酸）、ドーパミンレセプター、プロテアーゼ活性化レセプター、ニューロキニンレセプター、アンギオテンシンレセプター、オキシトシンレセプター、ロイコトリエンレセプター、ヌクレオチドレセプター（プリン及びピリミジン）、カルシウム感知レセプター、甲状腺刺激ホルモンレセプター、ニューロテンシンレセプター、バソプレシンレセプター、嗅覚レセプター、核酸塩基レセプター（例えばアデノシン）、リゾホスファチジン酸レセプター、スフィンゴ脂質レセプター、チラミンレセプター（微量アミン）、遊離脂肪酸レセプター及びサイクリックヌクレオチドレセプターなどに対するアゴニスト又はアンタゴニストとして有効な任意の化合物から選択でき；好ましくは、ＧＰＣＲレセプターに対する、例えばａ）アデノシンレセプターアンタゴニストｂ）アデノシンレセプターアゴニストｃ）β−アドレノセプターアゴニスト及びｄ）β−アドレノセプターアンタゴニストである。 好ましくは、リガンドは非ペプチドリガンドである。 細胞内酵素の阻害剤は好ましくは、ｅ）細胞内酵素の阻害剤（例えば、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの阻害剤）；又はその誘導体若しくは類似体である。 好ましくは、このライブラリーは、表面細胞レセプターの結合若しくは細胞内の結合のため、又は生きた細胞に浸透するため若しくはそこから出るために適したタグ付きリガンドを提供する。 したがって、このライブラリーは、特異的結合適用に適切な薬理学及び特性が保持されることが予測される化合物の合理的設計を示す。 各Ｔａｇは、分子をタグ付きする分野において分子を検出するためのマーカー又はレポーター基を形成することが公知であり、且つリガンドに関する分析的研究、特に可視化において使用できる任意の実体から独立して選択でき、これには当技術分野で公知の蛍光体タグが含まれるがこれに限定されない。 さらなるＴａｇが存在してもよく、ｉｎ ｓｉｔｕで機能を果たすことができ、例えば、局所的又は標的化された治療効果又は破壊効果を有するように活性化される任意のレーザー活性化Ｔａｇであり得る。 これにより、第１段階における可視化Ｔａｇによる式Ｉの化合物の可視化、第２段階におけるレーザー活性化Ｔａｇの活性化、及び任意選択で第３段階における式Ｉの化合物又はそのフラグメントの可視化が可能となる。 例えば、レーザー活性化Ｔａｇは、標的化されたタンパク質の破壊について活性化され得るマラカイトグリーンを含んでもよい。 特定の利点において、Ｔａｇが、式Ｉの化合物において又は式Ｉの化合物によって、レセプターリガンド結合を阻害すること又は細胞内酵素若しくは薬物輸送体阻害を阻害することが予測できる化学実体である場合、このような阻害は、１つ又は複数のライブラリーメンバー中の基Ｌ及び／若しくは各Ｊの存在、又は連結の選択された部位によって、打ち消されるか又は払拭される。 好ましくは、１つ又は複数の又は各々のライブラリー化合物中の各Ｔａｇの１つ又は複数は実体Ｆｌであり、任意の既知又は新規の蛍光体を含み、それによってこのライブラリーは、その１つ又は複数又はすべてが式Ｉ' 各場合において、本発明のライブラリーは、所望の薬理学、可視化、機構などを有する、所望のレセプター、細胞内酵素における、又は薬物輸送体におけるか若しくは薬物輸送体による、所望の結合親和性阻害又は輸送のタグ付きリガンドの選択を提供する。 より好ましくは、ライブラリーは、１つ又は複数の式ＩＩから式ＩＩＩ”までの複数の化合物 ＩＩ （ＬｉｇＪ Ｌ ） ｍ ＬＪ Ｔ ＴａｇＪ Ｔ Ｌ（Ｊ Ｌ Ｌｉｇ） ｍ であり、式中、各Ｊ Ｌ及びＪ Ｔは、本明細書で上記定義の通りのＪを含み、同じでも異なってもよく、Ｌｉｇ若しくはＬ及びＴａｇ若しくはＬ又はそれらの組合せ中に本来存在する官能基から誘導でき、連結が、異なるＬｉｇ、Ｊ Ｌ 、Ｌ、Ｊ Ｔ及び／又はＴａｇを含む化合物中の同じか又は異なる連結部位に存在し、同一のＬｉｇ、Ｊ Ｌ 、Ｌ、Ｊ Ｔ及び／又はＴａｇを含む任意の２つ以上の化合物の場合には異なる連結部位に存在することを特徴とする。 １つの好ましい実施形態において、本発明は、本明細書で上記定義の通りの式Ｉの化合物のライブラリーを含み、式Ｉ中、Ｌｉｇ、Ｊ Ｌ 、Ｌ、Ｊ Ｔ及びＴａｇはすべての化合物において同じであり、これらの化合物はその連結部位が異なる。 さらに好ましい実施形態において、本発明は、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の化合物のライブラリーを含み、式中、Ｌｉｇ及びＪ Ｌはすべての化合物において同じであり、Ｌ及びＪ Ｔはすべての化合物において同じか又は類似であり、Ｔａｇはいくつかの化合物又はすべての化合物において異なる。 さらに好ましい実施形態において、本発明は、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の化合物のライブラリーを含み、式中、Ｌｉｇ−及び−Ｔａｇはすべての化合物において同じであり、−Ｌ−はすべての化合物において異なる。 このライブラリーは、３から２５０までのタグ付きリガンドを含んでもよい。 好ましくは、このライブラリーは、３から２５までのタグ付きリガンドを含む１から１０までのファミリーを含み、各ファミリーは、共通のリガンド型のリガンド部分及び３から２５までの異なるタグ部分型を含み、これらの異なるタグ部分型の少なくとも１つは蛍光タグであり、より好ましくはこれらの各々が異なる蛍光タグであるか；或いはこのライブラリーは、異なるリガンド型及び異なる蛍光体型の５から２５０までの蛍光タグ付きリガンドを含む。 異なるＦｌを含む蛍光リガンドを提供するライブラリーは、例えば、同じ色のネイティブの蛍光を識別するため又は結合部位、酵素、輸送体などの複数の型を識別するための、異なる色の蛍光を用いた結合、阻害又は輸送の研究を可能にするのに有用である。 即ち蛍光体への連結によって改変されたリガンドは典型的に、結合親和性、阻害又は輸送における変化を受けることが公知であり、適切には、本発明のライブラリーは、特定のＧＰＣＲ、細胞内酵素又は薬物輸送体についての結合親和性又は阻害又は輸送を含む各化合物の薬理学の特徴付けを含む。 好ましくは、このライブラリーは、アゴニスト、アンタゴニスト、基質若しくは阻害剤としての呼称を含む、ＧＰＣＲレセプターへの結合若しくはＧＰＣＲレセプターの阻害、又は細胞内酵素（例えば、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ）の阻害、又は薬物輸送体の阻害若しくは薬物輸送体による輸送の阻害についての薬理学、並びに結果の定量を可能にする親和性若しくは阻害などの測定に関する、このライブラリーに含まれる各タグ付きリガンドについての情報を含む。 リガンドを調製する先行技術の方法において、連結部位は多くの場合には非特異的であるか又は未知であったが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓのリガンドの場合にはせいぜい特異的又は既知ではあっても、所望の効果について予め決定も設計も合理化もされていなかった。 好ましくは、本発明のライブラリーにおいて、タグ付きリガンドは、リガンドレセプター結合、阻害若しくは輸送がより高い程度に維持されるか又はより低い程度まで改変若しくは阻害される、多数の連結部位のいずれかで連結された蛍光体を含む。 好ましくは、このライブラリーは、反応性前駆体リガンドと、反応性部位の化学官能基を有し、部位特異的な反応及び連結のための関連する試薬との反応に適した反応性蛍光体との反応から設計されたタグ付きリガンドを含み、ここでこの設計は、可能な連結部位のすべて又は多数及び得られた薬理学的特徴の徹底的な調査、並びに好ましい結合特徴、阻害特徴又は輸送特徴を提供する１つ又は複数の連結の組合せの選択の結果である。 好ましくは、Ｌｉｇは、 リンカーＬは、蛍光部分を含むように改変された場合にリガンド構造からこの蛍光部分の隔てることによってリガンドの親和性の喪失を防止することを含む多数の機能を果たすことができ、この場合、ＬｉｇとＦｌとの直接的な連結によって改変することは、リガンドの結合、阻害又は輸送を妨害し、この場合、リンカーＬは、適切な場合には、短い鎖、中間の鎖又は長い鎖の構造として設計できる。 式Ｉ又は式Ｉ'のライブラリー化合物は、リンカー部分を提供するリンカー前駆体又はその成分の１つ又は複数の反応性基とリガンド部分を提供する１つ又は複数のリガンド前駆体の反応性基との反応、及びこのリンカー前駆体の１つ又は複数の他の反応性基とタグ部分を提供する蛍光タグ前駆体のような１つ又は複数のタグ前駆体の反応性基との反応による合成から誘導される本明細書で上記定義の通りの官能基Ｊを任意選択で含んでもよい。 本発明の特定の利点において、リンカーＬ及び／又は連結部位若しくは連結官能基Ｊは、蛍光部分とリガンドとの連結を促進し、この場合、それぞれの部分の基が反応性でないか、又は立体化学若しくは他の効果が連結を阻害するか、又は市販の前駆体リガンド及び蛍光体中に存在する反応性基の反応がそれらの中に存在する官能基のための保護基を含むことを必要とし、この場合、リンカーは、短い鎖、中間の鎖又は長い鎖の構造から通常誘導される。 さらなる利点において、リンカー−Ｌ−は、３つ以上のリガンドＬｉｇ及びタグＦｌを連結するトリ官能性、テトラ官能性、ペンタ官能性又はヘキサ官能性の前駆体から誘導でき、改変されたか又はより複雑な結合、阻害若しくは輸送及び関連する薬理学（例えば、複数のレセプター部位への結合）がレセプター二両体化（例えば、ホモ二両体化又はヘテロ二両体化）を調査することを可能にする。 本発明のさらなる利点において、リンカーＬは、細胞膜の横断、疎水性、親水性などを必要に応じて促進する特性を付与でき、この場合、リンカーは通常任意の官能化された構造である。 好ましくはＬは、飽和又は不飽和の単結合又は二重結合、−Ｏ−、−Ｓ−、アミン、ＣＯＯ−、アミド、−ＮＮ−ヒドラジン；並びに飽和又は不飽和の置換されているか又は置換されていないＣ １〜６００ 、好ましくはＣ １〜３００ 、より好ましくはＣ １〜１００の分枝鎖又は直鎖の脂肪族、芳香族、脂環式及びそれらの組合せから選択され、これらのいずれかは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含むことができ、任意選択の置換基が、Ｃ １〜２０の脂肪族、芳香族又は脂環式の置換基のいずれかから選択され、これらの置換基のいずれかは、本明細書で上記定義の通りの１つ又は複数のヘテロ原子、ヒドロキシ、チオール、ハロ、アミン、ヒドラジン、オキソ、シアノ、カルボニルなどを含んでもよい。 より好ましくはＬは、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ；並びに任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み（このヘテロ原子は本明細書で上記定義の通りである）、任意選択で本明細書で上記定義の通りに置換された、分枝鎖又は直鎖のＣ １〜５０のアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アミノ、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール及びそれらの組合せ（例えば、アラルキル、アラルキルアミノ、アラルキルアミドなど）から選択され、置換基は、規定された通りのＣ １〜１２の脂肪族、芳香族又は脂環式の置換基、ヒドロキシ、チオール、ハロ、アミン、オキソ、カルボニルなどから選択される。 Ｊ Ｌ及びＪ Ｔは、飽和又は不飽和の単結合又は二重結合、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ、アミド、ヒドラジン、カルボニル、オキソ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、チオキシなどから選択される、蛍光体及び／又はリガンドへの連結のための反応性基又は反応性部位から誘導された官能基を含んでもよい。 Ｌが単結合又は二重結合を含む場合、Ｊ Ｌ及びＪ Ｔは、存在する場合には、リンカーと蛍光部分及び／又はリガンド部分から誘導された蛍光体との連結のための反応性基又は反応性部位から誘導された官能基を含んでもよい。 好ましくは、部分Ｊ Ｌｍ ＬＪ Ｔｍは、モノ、ジ、トリ、テトラ、ペンタ若しくはヘキサ−アミノ、アルキルチオ、アルコキシ、カルボン酸、及びそれらの組合せ、より好ましくはモノ、ジ若しくはトリ−アミノアルキルチオ、アミノアルコキシ、アルコキシカルボン酸、アルコキシアミンなどを含む。 好ましくは、Ｊ Ｌｍ ＬＪ Ｔｍは、モノ、ジ若しくはトリ−アミノメンタン、アミノエタン、チオエタン、エタン、アミノアシルから、ポリペプチドから、又はモノ又はポリエチレングリコールのジ若しくはトリアミン又はチオのようなジアミン又はジチオのようなそれらのモノ又はポリエーテル誘導体から選択される。 好ましくは、本明細書で上記定義の通りのリンカー部分Ｊ Ｌｍ ＬＪ Ｔｍは、本明細書で上記定義の通りの単結合若しくは二重結合又は単一の原子若しくは基を含むか、或いはモノ官能性、ジ官能性、トリ官能性又はテトラ官能性の直鎖又は分枝鎖又は環式の置換されているか又は置換されていない式Ｌ． Ｉ： 好ましくは、Ｊ、Ｊ'及びＪ”の各々は独立して、本明細書で上記定義の通りの単結合若しくは二重結合、ＮＲ Ｌ 、−Ｏ又は−Ｓ又は−Ｃ（Ｏ）又は−ＮＲＣ（Ｏ）又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲであり、 より好ましくは、Ｊ Ｌｍ ＬＪ Ｔｍは、単結合であるか、又は式 ＪＡｑ Ｌ Ｒ Ｌ Ｊ” より好ましくは、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の各化合物が、本明細書で以下に定義の通りの部分Ｌｉｇ及びＬを含み、式中、 のものであり、 のものであり、 のものであり、 の非ペプチドであり； のような、ｍ−ＣＨ ２ ＯＨ、ｐ−ＯＨフェニル、ｍ−，ｐ−ジヒドロキシフェノール若しくはｍ−，ｍ−ジヒドロキシフェノール、ｍ−，ｍ−ジＣｌ、ｐ−ＮＨ ２フェノール、ｐ−ＯＨ、ｍ−ＣＯＮＨ ２フェノール又は５−ＯＨ、８−キノリンなどが含まれ； から選択されるような、任意選択でＯＨによって置換され、Ｎ、Ｏから選択されるヘテロ原子を任意選択で含み、好ましくはエーテルＯを含む、Ｃ １〜６の分枝鎖若しくは直鎖の脂肪族、Ｃ ６〜１０の芳香脂肪族から選択され； の非ペプチドであり、 であり、 Ｌ． ｄは、Ｒ． ｃ ２として存在し得るか、又は本明細書で上記定義の通りの連結部位若しくは連結官能基Ｊを構成することができ、Ｌ及びその部分式について本明細書で上記定義の通りであり、適切には、本明細書で上記定義の通りの式Ｌ． Ｉ又はその部分式のものであり、より好ましくは単結合又はＬ． ａについて本明細書で上記定義の通りであり； のものであり、 から選択され、式中、Ｒ． ｅ １からＲ． ｅ ４までは、上記定義のＲ． ａ １からＲ． ａ ４までと同じであるか、或いは式中、Ｒ． ｅ ３は、任意選択でヒドロキシ一置換若しくは多置換又はハロ一置換若しくは多置換されたＣ ５〜９の直鎖若しくは分枝鎖のアルキルであるか、或いはオルト−ＯＥｔ、 のようなアルコキシ、スルホニルなどによって任意選択で置換されたアリールであり、 のものであり、 は、０個又は１個のＮヘテロ原子を含み、且つ は、０個、１個又は２個のＮヘテロ原子を含み、且つ不飽和であるか又は１個若しくは２個の−Ｃ＝Ｃ−基若しくは−Ｃ＝Ｎ−基を含み； のものであり、 本明細書で上記定義の通りの連結部位Ｊは、適切には、結合も阻害も輸送も阻害しない、任意の性質及び位置（即ち任意の部位）のものである。 レセプター結合は複雑であり、特異的結合部位が利用可能であることを必要とし、且つ／又は特定の蛍光リガンドコンフォメーションを必要とし得る。 本発明のライブラリーの蛍光リガンドは、本明細書で上記定義の通りのリガンド部分と蛍光部分とを連結する異なる連結部位によって特徴付けることができる。 結合、阻害又は輸送の挙動及び本発明の蛍光リガンドにおいて変化しないままである特異的標的部位の包括的な知識から、本発明者らは、結合、阻害又は輸送及び薬理学的特性の所望される保持に適切な連結部位を選択するための方法を決定することが可能であった。 好ましくは、式Ｉ又は式Ｉ'の化合物は、可能な結合、阻害又は輸送の部位の選択肢を露出するすべての機能的な連結配置を示す化合物を含む。 Ｆｌは、任意の赤色吸収色素、緑吸収色素、近赤外吸収色素、青色吸収色素など及び他のクラスの色素を含んでもよい。 適切には、Ｆｌは、特にフルオレセイン、ＦＩＴＣを含むフルオレセイン誘導体並びにＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）及びその誘導体のようなフルオレセイン様分子、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（商標）、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）及びその誘導体、クマリン及び誘導体、塩化ダンシルの誘導体を含むナフタレン又はその類似体若しくは誘導体、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）、ＥｖｏＢｌｕｅ及びその蛍光誘導体、ピレン及びピリジルオキサゾール誘導体、シアニン色素、ｄｙｏｍｉｃｓ（ＤＹ色素及びＡＴＴＯ色素）及びその蛍光誘導体、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ色素及び誘導体、市販のＢｏｄｉｐｙ（商標）色素を含むＢＤＩ色素、エリスロシン、エオシン、ピレン、アントラセン、アクリジン、蛍光フィコビリンタンパク質及びそれらのコンジュゲート並びにフルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ）マイクロビーズ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ誘導体を含む、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）を含むＲｈｏｄａｍｉｎｅ及びその蛍光誘導体、並びにイソシアネート反応性基、スクシンイミジルエステル反応性基又はジクロロトリアジニル反応性基を使用してアミン基にカップリングされたＲｈｏｄｏｌ より好ましくは、Ｆｌは、フルオレセイン誘導体並びにＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）及びその誘導体のようなフルオレセイン様分子、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（商標）、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）及びその誘導体、クマリン及び誘導体、塩化ダンシルの誘導体を含むナフタレン又はその類似体若しくは誘導体、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）、ＥｖｏＢｌｕｅ及びその蛍光誘導体、ピレン及びピリジルオキサゾール誘導体、シアニン色素、ｄｉｏｎｉｃｓ（ＤＹ色素及びＡＴＴＯ色素）及びその蛍光誘導体、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ色素及び誘導体、市販のＢｏｄｉｐｙ（商標）色素を含むＢＤＩ色素、エリスロシン、エオシン、ＦＩＴＣ、ピレン、アントラセン、アクリジン、蛍光フィコビリンタンパク質及びそれらのコンジュゲート並びにフルオレセイン化マイクロビーズ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ誘導体を含む、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）を含むＲｈｏｄａｍｉｎｅその誘導体、並びにＲｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ（商標）から選択される。 より好ましくは、Ｆｌは、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）、Ｃｙ５．５若しくはＣｙ５又はそれらの類似体、ＢＯＤＩＰＹ（商標）６３０／６５０及びその類似体、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６４０、ＤＹ−６５０若しくはＤＹ−６５５又はそれらの類似体、ＡＴＴＯ ６５５若しくはＡＴＴＯ ６８０又はそれらの類似体、ＥｖｏＢｌｕｅ ３０又はその類似体、Ａｌｅｘａ ６４７又はその類似体を含む。 適切には、Ｆｌは、本明細書で上記定義の通りの部分Ｊによるリガンドへの連結を促進する反応性基を含むか又は含むように改変された、上記市販の蛍光体のいずれかから誘導される。 好ましくはＦｌは、本明細書で上記定義の通りのライブラリーにおいてリガンドの結合、阻害又は輸送を可視化するのに適切な誘導体又は誘導体の基を形成するように改変された上記市販の蛍光体のいずれかを含んでＪ Ｔ −ｔ−Ｆｌを構成し、式Ｊ Ｔ −ｔ−Ｆｌ中、Ｊ Ｔは本明細書で上記定義の通りであり、本明細書で上記定義の通りの前駆体リガンドへの連結から誘導された官能基を含み、連結基−ｔ−を任意選択で含んでもよく、この連結基−ｔ−は、近位の不飽和部分若しくはアリール部分を含み、中程度に短い鎖、中間の鎖若しくは長い鎖のアルキニル部分又はシクロアルキル部分を含み、且つカルボキシル、スルホネート又はＯ若しくはＳのようなヘテロ原子のような本明細書で上記定義の通りの反応性基を介した連結から誘導された部分、或いは臭化メチルのようなハロゲン化アルキル、ハロアセトアミド、スルホン酸エステル若しくは同様の求電子基での連結から誘導されたメチレンを含む。 例えば、Ｆｌは、化合物の蛍光をスペクトルの赤の部分にシフトさせ、吸収最大値を上昇させるか又は連結基能を果たす、例えばヘテロアリール又はアルケニル（例えば、モノエニル基、ジエニル基又はトリエニル基）である、蛍光改変機能を果たす置換基−ｔ−を含んでもよい。 好ましいＢＯＤＩＰＹ（商標）（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）蛍光体には、可視スペクトルにわたるものが含まれ、米国特許第４，７７４，３３９号；同第５，１８７，２８８号；同第５，２４８，７８２号；同第５，２７４，１１３号；同第５，４３３，８９６号；同第５，４５１，６６３号に列挙されるものが含まれる。 この群の好ましいメンバーは、上記の特許（これらの内容は、参照として本明細書中に組み込まれる）に記載されるような任意のヘテロアリール置換されたＢＯＤＩＰＹ（商標）色素から選択される。 適切には、ＢＯＤＩＰＹ（商標）構造を含むＪ Ｔ −ｔ−Ｆｌは、１つ又は２つの縮合環によって任意選択で改変され、アルキル、アルコキシ、アリール、複素環式などのような１つ又はいくつかの置換基によって任意選択で置換された、二フッ化ジピロメテンボロン（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ）コアによって特徴付けられ、式Ｊ Ｔ −ｔ−Ｆｌ中、１つの置換基−ｔ−は、本明細書で上記定義の通りのリガンド前駆体への本明細書で上記定義の通りの連結のために適合されており、この置換基−ｔ−は、近位の不飽和部分若しくはアリール部分を任意選択で含み、中程度に短い鎖、中間の鎖若しくは長い鎖のアルキニル部分又はシクロアルキル部分を含み、且つカルボキシル、スルホネート又はＯ若しくはＳのようなヘテロ原子のような本明細書で上記定義の通りの反応性基を介した連結から誘導された部分、或いは臭化メチルのようなハロゲン化アルキル、ハロアセトアミド、スルホン酸エステル若しくは同様の求電子基での連結から誘導されたメチレンを含む。 Ｆｌは、米国特許第５，１８７，２８８号中のように、化合物の蛍光をスペクトルの赤の部分にシフトさせ、吸収最大値を上昇させるヘテロアリール又はアルケニル（例えば、モノエニル基、ジエニル基又はトリエニル基）である、本明細書で上記定義の通りの置換基−ｔ−を含んでもよいか；或いは米国特許第５，３３０，８５４号中のように、（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯ ２ Ｈ（式中、ｎ＝５〜２２である）を含む脂肪酸側鎖に好ましくは連結された１つ又は複数のアリール、カルボニルなどの基に連結されたアルケニル置換基、より好ましくはアリールオキシメチレンを介してカルボニルに連結されたアルケニル置換基を含んでもよいか；或いは米国特許第６，００５，１１３号中のように、アリールアルケニルアリール基を含んでもよい。 より好ましくはＦｌは、式Ｆｌ １ ： のものであり、式Ｆｌ １中、 であり、式中、 好ましくは、Ｒ ２，３からＲ ４，５までの各々又はすべてが、ヘテロアリール、より好ましくは単環単一ヘテロ原子（例えば、ピロール、チオフェン、フラン）又は単環２ヘテロ原子構造（例えば、オキサゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール、イミダゾール）、又は複数環（例えば、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイミダゾール）、又は複数環１ヘテロ原子構造（例えば、ベンゾフラン、インドール）、好ましくはチエニルである。 より好ましくは、Ｆｌは、その可能な連結配置又は連結部位のいずれかを含む、以下に示されるような式ＦＬ． Ａ１又は式ＦＬ． Ａ２のＢＯＤＩＰＹコア構造から選択され、各場合において＝は側鎖の結合部位を示し： このＦＬ． Ａ１は好ましくは、その可能な連結配置又は連結部位のいずれかを含むＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ又はＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）又はＢＯＤＩＰＹ ＦＬエチレンジアミンを含むか又はこれらから誘導され： ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬエチレンジアミン（ＸはＣＯＮＨ（ＣＨ ２ ） ２ ＮＨ ２である）又はＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（ＸはＣＯＯＨである） このＦＬ． Ａ２は好ましくは、その可能な連結配置又は連結部位のいずれかを含むＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０又はＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０臭化メチル： ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０ Ｘ 最も好ましくは、そのスクシンイミジルエステル（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０ Ｘ−ＳＥ）を含むか又はこれらから誘導される。 好ましくは、この方法はコンビナトリアル法である。 好ましくはこの方法は、本明細書で上記定義の通りの連結官能基Ｊ、Ｊ Ｌ又はＪ Ｔを形成する１つ若しくは複数の若しくは異なる反応性基Ｙ Ｌ又はＹ Ｌｉｇを含む式ＩＶ及び／又は式ＩＶ'： 好ましくは、式Ｖ又は式Ｖ'のいくつかの化合物又は各化合物において、Ｔａｇは本明細書で上記定義の通りのＦｌであり、それにより、この方法は、その１つ又は複数又はすべてが本明細書で上記定義の通りの式Ｉ'のものである複数の化合物を含むライブラリーを調製するための方法である。 適切には、反応性基Ｙ Ｌｉｇ 、Ｙ Ｌ 、Ｙ Ｔは、例えば、置換反応又は付加反応若しくは付加−脱離反応により、本明細書で上記定義の通りの連結に適切な反応性官能基を有する。 置換反応は、本明細書で上記定義の通りの求電子性反応性部位と求核性試薬反応性部位との反応から適切に選択され： である。 好ましくは、式ＩＶ又は式ＶＩ'の化合物は保護基を含まず、反応及びそれぞれの反応性部位の選択によって、官能基の分解を伴わずに、任意選択でＶＩの化合物を介してＶ又はＶ'の化合物との反応が可能であるか；或いは式ＩＶ又は式ＩＶ'の化合物は、周囲条件下（例えば、中性ｐＨ、室温などの下）での除去のために適合された１つ又は複数の保護基を含む。 好ましくは、この方法は、完全に脱保護された（即ち、保護基を必要としない）リガンドとの反応を可能にするようにか又は穏やかな条件下で除去できる存在する保護基との反応を可能にするように反応性基Ｙが選択される反応を含み、例えば、Ｙ Ｌｉｇ又はＹ Ｌ又はＹ Ｔの１つはアミン又はアルコール又はチオールを含み、他はスクシンイミドエステルを含む。 反応性基の選択が式ＩＶ又は式ＩＶ'の化合物の保護を必要とする場合、保護基は好ましくは、穏やかな条件下での除去を可能にするものであり、好ましくは、周囲条件（例えば室温）又はＬｉｇ． ｂ中の官能基（例えばグリコシド基）を害さない条件下で除去されるベンジルオキシカルボニルなどを含む。 本発明の方法は、化学選択性の使用による、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の化合物の高い収率によって特徴付けられ、非化学選択的な反応性基又は保護基の使用によって収率を損なう公知の方法よりも優れている。 好ましくは、式Ｉ又は式Ｉ'の化合物は以下によって得られる： 式ＩＶ、式ＩＶ'、式Ｖ'、式Ｖ'又は式ＶＩの化合物は、市販のものであっても公知の手段で調製されてもよい。 リンカーは独立した実体として取り付けることができるか、又は本明細書で上記定義の通りの合成方法の一部として構築でき、好ましくは、それらの反応の前に、リガンド部分又は蛍光部分にさらなる置換基として合成される。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式Ｉの化合物の調製方法が提供され、この方法は、本明細書で上記定義の通りの式ＩＶ又は式ＩＶ'の化合物と式Ｖ又は式Ｖ'の化合物と、任意選択でさらにＶＩとの反応を含む。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式ＩＶの化合物の調製方法が提供され、この方法は、リガンド前駆体Ｌｉｇを、市販の場合には入手するステップ又は当技術分野で公知の経路によって調製するステップ、及びリンカー前駆体ＶＩ”又は必要な場合にはその成分と反応させるステップ、及び／又は１つ若しくは複数の反応性部位Ｙ若しくはＹ Ｌｉｇ若しくはＹ Ｌを生成するステップを含む。ＩＶの保護が必要とされる可能性があり、この場合、反応の後に、この反応の間に存在する任意の保護基を除去し、周囲条件下で除去できる保護基で任意選択で置換することが行われる。反応性基Ｙ又はＹ Ｌｉｇ又はＹ Ｌは、本明細書で上記定義の通りの基から好ましくは選択される。 好ましくは、この方法は以下を含む： 本発明の特定の利点において、リンカー部分Ｌは、蛍光部分とリガンド部分との連結を促進し、この場合、部分は反応性でないか、立体化学若しくは他の効果が連結を阻害するか、又は式ＩＶ若しくは式ＩＶ'及び式Ｖ若しくは式Ｖ'の市販の化合物中に存在する反応性基の反応が、それらの中に存在する官能基のための保護基を含むことを必要とし、この場合、リンカーは通常、二官能性の短い鎖、中間の鎖又は長い鎖の構造である。 本発明のさらなる利点において、リンカーＬは、細胞膜の横断、疎水性、親水性などを必要に応じて促進する特性を付与でき、この場合、リンカーは通常任意の官能化された構造である。 好ましくは、本明細書で上記定義の通りの式ＶＩのリンカー前駆体は、ヘテロ原子種（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ又はＰを提供する種）、又は任意選択でヘテロ原子を含む飽和若しくは不飽和の分枝鎖若しくは直鎖のＣ １〜６００反応性炭化水素及びそれらの組合せから選択され、モノマーであっても、２個から３０個までのオリゴマー反復を有するオリゴマーであっても、３０個を超えて３００個までのポリマー反復を有するポリマーであってもよく、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、チオキシ、アミン、ヒドラジン、カルボニルなどから選択される、リガンド及び蛍光体への連結のための反応性基又は反応性部位を含む。 リンカーが単結合を含む場合、反応性部位は通常式ＩＶ'の化合物上に存在し、それによって式Ｖ又は式Ｖ'の化合物と反応性である。 好ましくは、式ＶＩの化合物は、式ＩＶ又は式Ｖの３つ以上のリガンドとタグとを連結するための、３つ、４つ、５つ又は６つの反応性部位を含む。 好ましくは、リンカー前駆体は、本明細書で上記定義の通りの部分Ｌを生成するか又は部分Ｌに寄与する任意の基質から選択される。 適切には、式ＶＩのリンカー前駆体は、合理的に設計された官能基を含み且つ本明細書で上記定義の通りの部分Ｌ中に官能基を提供する反応性部位を含む、短い鎖、中間の鎖又は長い鎖である。 好ましくは、式ＶＩのリンカー前駆体は、モノアミン、ジアミン若しくは混合アミン、ヒドロキシ、チオール、カルボン酸、酸塩化物、酸フッ化物、酸臭化物、（酸ハロゲン化物）、イソシアネートＮＣＯ、イソチオシアネートＮＣＳ、ハロゲン化物、ハロゲン化アルキル、アルデヒド、エポキシド、塩化スルホニルＳＯ ２ Ｃｌ又はヒドラジンＮＨＮＨ ２であり、より好ましくは、モノ、ジ若しくはトリ−アミノメンタン、アミノエタン、エタンチオール、ヒドロキシエタン、アミノ酸から、ポリペプチドから、或いはモノ又はポリエチレングリコールのジ若しくはトリ−アミン又はチオールのようなジアミン又はジチオールのようなそれらのモノ又はポリエーテル誘導体から選択される。 好ましくは、式ＶＩのリンカー前駆体は、Ｆｌへの連結のための１つ若しくは複数の反応性末端基を提供する、Ｃ １〜１２の置換されているか若しくは置換されていないアルキルアミン、アミノ酸、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどのいずれかから選択され、より好ましくは、環式アミン若しくは直鎖アミンを含む（ジ）アミン、より好ましくはジアミンメンタン、又はジアミノエチレン、アミノ酸若しくはポリペプチドから選択されるか、或いはモノエーテルジアミン若しくはポリエーテルジアミン（例えばポリエチレングリコールジアミン）から、より好ましくはＨ ２ Ｎ（ＣＨ ２ ） ４ ＮＨＣＯ ２ ＣＨ ２ Ｐｈ、Ｈ ２ Ｎ（ＣＨ ２ ） ５ ＮＨＣＯ ２ ＣＨ ２ Ｐｈ、Ｈ ２ Ｎ（（ＣＨ ２ ） ２ Ｏ） ２ （ＣＨ ２ ） ２ ＮＨＣＯ ２ ＣＨ ２ Ｐｈ及びＨ ２ Ｎ（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨＢｏｃ（式中、ｎは２から８までである）から選択される。 好ましくは、リンカー前駆体は、式Ｙ Ｌｍ Ｌ． ＩＹ Ｌｍの１つ、２つ又は３つの反応性部位を有する、直鎖又は分枝鎖又は環式の置換されているか又は置換されていないアルキルを含み、式中、Ｌ． Ｉは本明細書で上記定義の通りである。 好ましくは、各Ｙ Ｌは、Ｈ、ＣＯ ２ Ｈ、ＮＨ ２ 、Ｏ、Ｐ、Ｓ、及び反応に際して単結合、アルキル（例えばメチレン）、アルキン、アルケン、ＮＨ、ＮＲ、Ｏ、ＮＲＣＯ、Ｓ、ＣＯ、ＮＣＯ、ＣＨＨａｌ、Ｐなどを提供する基から独立して選択され、ここでＨａｌは、塩素、ヨウ素、臭素から選択される任意のハロゲンであるか、又はＹ Ｌは、保護離脱基Ｚ Ｌ （例えば、−ＮＨＣＯ ２ ＣＨ ２ Ｐｈ、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ハロゲン、アミン、脂肪族、Ｎ−アルキルカルボキサミド、Ｂｏｃなど）を含む。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りのライブラリーから式Ｉの化合物を選択するための方法が提供され、この方法は、本明細書で上記定義の通りの方法を使用した本明細書で上記定義の通りの式Ｉの化合物のライブラリーの合理的な設計、このライブラリー中の複数の化合物又はすべての化合物についての薬理学を決定するステップ、及び所望の標的において所望の薬理学を示す化合物を選択するステップを含む。 好ましくは、この方法は、化合物の予備的ライブラリーを調製するステップ、結合、阻害などを評価するためにスクリーニングを実施するステップ、このスクリーニングにおいて同定された化合物を有益な特性を有するとして選択するステップ、並びに最適化されたライブラリーを調製するために、このスクリーニングからの指標に基づいて部分の性質若しくは連結の連結位置によって改変又は官能化するステップを含む。 本発明の特定の利点において、このスクリーニングからの分子の薬理学及び光化学は、ライブラリーの設計へとフィードバックする。 このリンカーストラテジーは、いくつかの場合、使用されるタグに特異的であり、それによってタグを改変することはリンカーを改変することを必要とし得る。 本発明者らは驚くべきことに、他の部分の結果的な改変なしに部分を改変することが、例えば結合することができない不活性化合物を生じ得ることを見出した。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の既知又は新規の化合物が提供され、ここでこの化合物は、阻害（ｐＫ Ｂ ）若しくは拮抗（ｐＫ Ｉ ）結合定数についての値と共に、且つ任意選択で規定された阻害若しくは拮抗を示す単一の生きた細胞における薬理学的結合の蛍光画像と共に、本明細書で上記定義の通りのＧＰＣＲレセプターを発現する細胞、又はサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼのような細胞内酵素若しくは本明細書で上記定義の通りの薬物輸送体を発現する細胞に関して規定され、レセプター結合若しくはレセプター機能の阻害若しくは拮抗として与えられる、励起最大及び発光最大として与えられるスペクトル特性、蛍光半減期及び発光量子収率並びに薬理学の形態でのその薬理学的特性に関する情報と関連付けられる。 好ましくは、この化合物は、その薬理学的特性に関する情報と関連付けられ、ここで薬理学は、細胞又はタンパク質に関して（ここでこの細胞は、ＧＰＣＲ、細胞内酵素若しくは薬物輸送体を発現するか、又はこのタンパク質は、ＧＰＣＲ、細胞内酵素若しくは薬物輸送体である）、好ましくは本明細書で上記定義の通りのＧＰＣＲレセプター（好ましくはアデノシンレセプター（例えば、Ａ １ −レセプター、Ａ ２Ａ −レセプター、Ａ ２Ｂ −レセプター及びＡ ３ −レセプター）、β−アドレノレセプター（例えば、β １ −アドレノセプター、β ２ −アドレノセプター及びβ ３ −アドレノセプター）又は同様のレセプターから選択される）を含むＣＨＯ細胞、或いは細胞内酵素（例えば、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ）の阻害剤又は本明細書で上記定義の通りの薬物輸送体の基質若しくは阻害剤を含むＣＨＯ細胞に関して；より好ましくは、ヒトのアデノシンＡ １ −レセプター若しくはβ−アドレノセプター、又は細胞内酵素の阻害剤（例えば、細胞内ホスホジエステラーゼの阻害剤）を発現するＣＨＯ細胞に関して、規定される。 この薬理学的特性は、アゴニスト刺激されたセカンドメッセンジャー産生についてのＥＣ ５０値若しくはアゴニスト刺激されたセカンドメッセンジャー産生の拮抗についてのｐＫｉ値、又は細胞内酵素若しくは薬物輸送体の刺激若しくは阻害についての基質Ｋ ｍ値若しくはアンタゴニストＫ ｉ値として与えられる。 好ましくは、新規化合物は本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'のものであり、より好ましくは、本明細書で上記定義の通りの式Ｌｉｇ． ａ ｍ Ｌ． ａ−Ｆｌ． ａ ｎから式Ｌｉｇ． ｅ ｍ Ｌ． ｅＦｌ． ｅ ｎまでから選択されるが、以下を条件とする： 任意選択でさらに、 好ましくは、本発明のリガンド又は蛍光リガンドは、その結合親和性及びその機能的活性を保持するアゴニストであるか、又は蛍光部分Ｆｌへの連結の際若しくは蛍光部分Ｆｌに連結される場合にその結合親和性を保持するアンタゴニストである。 蛍光リガンドは、永久的、半永久的又は一過的に結合するような親和性を有してもよい。 即ち、蛍光リガンドは、未結合のリガンドが洗浄で除去された場合に、結合したままであっても洗浄して除去されてもよい。 本発明の蛍光リガンドは、本来的に光学活性であってもよく、公知の様式で官能化されて光学活性になってもよく、任意のこのようなリガンドは、その光学活性異性体のラセミ体又はその１つとして存在し得る。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式Ｖ若しくは式Ｖ'の任意の適切なタグへの連結に有用な、本明細書で上記定義の通りの式ＩＶ若しくは式ＶＩ'の新規反応性リガンド又はそれらのライブラリーが提供されるが、以下を条件とする： 好ましくは、式ＩＶの化合物（成分は本明細書で上記定義の通りである）及び反応性基Ｙ Ｌｉｇを含む新規リガンド−リンカーは本明細書で上記定義の通りであり、好ましくは本明細書で上記定義の通りの式ＬｉｇＬ． Ｉ又は式Ｌｉｇ． ＬＩ'のものである。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式Ｖ若しくは式Ｖ'の新規蛍光体リンカー又はそのライブラリーが提供される。 本発明のさらなる態様において、レセプター若しくはレセプター結合を可視化するため、蛍光リガンドの薬理学的特性を評価するため、標的レセプターに結合する新規化学実体の高スループットスクリーニングにおける、細胞内酵素を阻害すること又は薬物輸送若しくは薬物輸送体の基質を阻害することにおける、薬物輸送体若しくは輸送に適切な薬物を研究することにおける、健康な組織若しくは罹患組織を識別することなどにおける、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ若しくは式Ｉ'の蛍光リガンド又はそのライブラリーの使用が提供される。 好ましくはこの使用は、任意の蛍光検出技術、より好ましくは共焦点顕微鏡法又は蛍光相関分光法を使用することを含む。 好ましくは、この使用により、リガンド親和性定数及び本明細書で上記定義の通りのレセプター型、細胞内酵素又は薬物輸送体の部分集団の濃度を計算することが可能となる。 本発明のさらなる態様において、レセプターの結合若しくは阻害、細胞内酵素の阻害又は薬物の輸送若しくは阻害及び可視化のための方法が提供され、この方法は、それらの結合若しくは阻害又はそれらによる輸送を促進するような様式で本明細書で上記定義の通りの蛍光リガンドをサンプルと接触させるステップ、及び蛍光又はその位置における変化を検出するステップを含む。 サンプルは、細胞、細胞抽出物、細胞ホモジネート、精製されたタンパク質若しくは再構成されたタンパク質、組換えタンパク質又は合成タンパク質などから選択される細胞材料を含んでもよく、式Ｉの化合物についての標的を含む。 細胞材料を含むサンプルは、植物、動物、真菌、原生生物、細菌、古細菌又はこのような生物から誘導された細胞系から誘導できる。 サンプルを調製するために使用される動物細胞又は植物細胞は、健康であっても機能不全であってもよく、白血病又は癌のような疾患の診断において任意選択で使用される。 本発明の好ましい実施形態において、このサンプルは、哺乳動物細胞、その抽出物及びホモジネートを含む。 好ましくは、サンプルは生きた細胞材料を含み、より好ましくは個々の細胞若しくは細胞内区画を含み、最も好ましくは生きた細胞中のＧＰＣＲ、細胞内酵素若しくは薬物輸送体、これらのタンパク質を含む膜、可溶化されたレセプター、酵素若しくは薬物輸送体若しくはＧＰＣＲのアレイを含む。 細胞材料は、細胞を培養すること又は細胞中でタンパク質を発現させることによって公知の様式で得ることができる。 好ましい実施形態において、この細胞材料は、ＧＰＣＲ、酵素又は薬物輸送体を発現する細胞である。 ＧＰＣＲはおそらく、現在及び将来の薬物治療のための単一の最も重要なクラスの標的である。 より好ましくは、このサンプルは、アデノシンＡ １ −レセプター、アデノシンＡ ２Ａ −レセプター、アデノシンＡ ２Ｂ −レセプター及びアデノシンＡ ３ −レセプター、β １ −アドレノセプター、β ２ −アドレノセプター及びβ ３ −アドレノセプターから選択されるＧＰＣＲレセプターを含むか、或いは細胞内酵素（例えば、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ）の阻害剤を含み、最も好ましくは、ヒトのアデノシンＡ １ −レセプター若しくはβ−アドレノセプター、又は細胞内酵素の阻害剤（例えば、細胞内ホスホジエステラーゼの阻害剤）を発現するＣＨＯ細胞を含む。 細胞材料は、例えばＧＦＰタグ付きＧＰＣＲ、ＧＦＰタグ付き細胞内酵素及びＧＦＰタグ付き薬物輸送体のようにＧＦＰで、又は蛍光抗体が標的化されたネイティブのレセプター、細胞内酵素若しくは薬物輸送体でタグ付きすることによって蛍光リガンドとの接触の前にタグ付きでき、細胞のレセプター、酵素若しくは輸送体の可視化並びに蛍光リガンドとのオーバーレイを可能にする。 レセプターは、膜サンプル中又は急性に分配された細胞サンプル中に提供できる（例えば、急性に分配された細胞中のＡ １ −ＡＲのような内因性レセプター）。 アデノシンレセプター結合部位は、このレセプターのポケット内の深いところに位置し、それによって、リンカーを有する蛍光リガンドは、好ましい蛍光（アンタゴニスト）アゴニストである。 リガンドを改変すること及びアンタゴニスト結合活性を保持することにおいてはかなりの自由があるものの、アゴニスト活性化活性即ち結合に際してレセプターの機能を活性化する活性を保持するのはより困難である。 薬物輸送体の基質の薬物輸送のための方法は、細胞の細胞質ゾル中への式Ｉの化合物の取り込みを追跡するためである（この輸送体が細胞中に薬物を移動させる場合）か、或いは細胞に基質を充填した後、細胞からの式Ｉの化合物の消失及び細胞外培地におけるその出現を追跡するためである（この輸送体が細胞の外へ薬物を移動させる場合−例えば、この輸送体がＡＴＰ駆動ポンプである場合）。 好ましくは、この方法は、細胞中に化合物を移動させる平衡輸送体を介した細胞中への薬物の輸送をモニタリングするステップ、次いでこの第１の平衡輸送体の阻害剤を適用するステップ及びＡＴＰ駆動ポンプ輸送体を介した細胞の外への薬物の輸送をモニタリングするステップを含む。 薬物輸送体の阻害の方法は、細胞表面上の輸送体への結合を検出することによってモニタリングできる。 本発明に従う結合又は阻害又は検出のための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ 低いバックグラウンド蛍光を示すリガンドを用いると、共焦点顕微鏡法又はＦＣＳのいずれかを実施する前に洗浄によって未結合のリガンドを除去する必要がない。 したがって、時間依存的及び濃度依存的の両方の様式で、経時的に蛍光を測定することが可能である。 共焦点顕微鏡法（ＣＳＬＭ）により、膜レセプターの結合を示す細胞縁部での蛍光体の濃縮を示す、細胞を通る断面の可視化が可能である。 可視化は、個々の細胞を通る「スライス」が観察できるような、当技術分野で公知の特定の焦点平面のものである。 異なる着色チャネルが、異なる蛍光体型を可視化するために選択できる。 ＦＣＳは、それらの光子放射のパターンを統計的に分析することによって、非常に小さい励起体積（＜１０ −１５ ｌ）を通る蛍光種の拡散特徴を分析する非侵襲性の技術である。 したがって、速く拡散する遊離リガンドは、ゆっくりと拡散するレセプター結合リガンドから識別することができ、その体積が細胞膜に局在化される場合には同時に定量できる。 好ましくは、ＦＣＳを組み込む方法は、１０ −１５ ｌ未満の共焦点体積中の蛍光強度における変動を測定することを含む。 これらの変動の統計的分析により、存在する蛍光分子の拡散速度（即ち質量）及び濃度についての情報が得られる。 したがって、遊離リガンド（速く拡散する）及び結合リガンド（ゆっくりと拡散する）は、単一の細胞上で同時に定量できる。 ＦＣＳ（蛍光相関分光法）は、溶液中での分子相互作用の研究のために、粒子の蛍光発光における変動を、粒子質量及び濃度のようなパラメータと相関させる。 ＦＣＳは本質的に、密に収束されたレーザービームによる分析を介して、顕微鏡検出体積（１０ −１５ ｌ）中の蛍光タグ付き分子の自発的な蛍光強度の変動をモニタリングする。 これらの変動は、所定の分子の質量に直接依存する粒子の拡散速度又は拡散時間についての情報を提供する。 小さく、したがって迅速に拡散する分子がレーザーの光路を通過する場合、これらの分子は迅速に変動する蛍光強度パターンを生じるが、より大きい分子がビームを通過する場合、これらの分子はより持続される蛍光のバーストを生じる。 結果として、例えばリガンド結合の結果としての生体分子の質量の増大は、得られた生体分子の拡散時間の増大として検出される。 蛍光顕微鏡法は、感度及び速度を伴って、単一細胞又は細胞内のレベルでレセプターを局在化するために使用できる。 この方法において、高い親和性のタグ付きリガンドは、ＧＰＣＲレセプターサブタイプ（例えば、アデノシンレセプターなど）の分子特徴、それらの領域的分布及び細胞局在化の解明を助けることができる。 本発明のさらなる態様において、蛍光リガンドに対する蛍光標的（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ付きレセプター、緑色蛍光タンパク質タグ付き細胞内酵素又は緑色蛍光タンパク質タグ付き薬物輸送体）の使用が提供される。 この場合、蛍光リガンドのスペクトル特徴は、蛍光リガンド及び蛍光レセプター、蛍光細胞内酵素又は蛍光薬物輸送体の両方の位置の別々の検出を可能にするように選択される。 次いで、交差相関蛍光相関分光法又は蛍光強度測定が、単一の測定でのリガンド−レセプター相互作用、リガンド−酵素相互作用、リガンド−薬物輸送体相互作用又は薬物輸送相互作用の定量的分析を可能にする。 これは、ＧＦＰ−タンパク質転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）アッセイを含む先行技術の方法及び蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を含む先行技術のアッセイとは別個である。 図１はこのアプローチを例示する。 本発明のさらなる態様において、市販の抗体に対する短いエピトープタグ（例えば、ｍｙｃ、血球凝集素、ＦＬＡＧ）を発現するようにそのＮ末端又は天然のドメイン上で改変された細胞表面ＧＰＣＲが提供される。 次いでこれはＣＨＯ細胞中で発現され、このタグ配列に対する蛍光抗体が、ＧＦＰタグ付きタンパク質について上記されたように、蛍光リガンド−レセプター相互作用の２色分析を提供するために生きた細胞中で使用される。 本発明のさらなる態様において、ＧＦＰタグ付きタンパク質について上記されたように、蛍光リガンド−レセプター相互作用の２色分析を提供するために生きた細胞中で使用される、このタグ配列に対する蛍光抗体との使用のための請求項３７に記載の改変された細胞表面ＧＰＣＲを発現するＣＨＯ細胞が提供される。 本発明のさらなる態様において、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の化合物と、細胞系、このような細胞系から誘導された膜又はこの細胞系から可溶化されたタンパク質として提供されるこれらの化合物に対する標的とを含むキットが提供される。 この細胞由来の材料は、以下の３つの形態の１つで提供できる：（１）緑色蛍光タンパク質タグ付きレセプター、緑色蛍光タンパク質タグ付き細胞内酵素若しくは緑色蛍光タンパク質タグ付き薬物輸送体を発現する細胞由来；（２）市販の蛍光抗体に対するエピトープタグを発現する細胞由来；又は（３）特異的蛍光抗体がこれにも提供される野生型タンパク質。 代替的実施形態において、本明細書で上記定義の通りの式Ｉ又は式Ｉ'の化合物、及びネイティブ（非組換え体）細胞において使用できるネイティブタンパク質に対する蛍光抗体を含むキットが提供される。 各場合において、式Ｉ又は式Ｉ'の化合物及び蛍光抗体又は緑色蛍光タンパク質のスペクトル特徴は、最適な２色交差相関蛍光相関分光法（単一光子又は多光子）を可能にするように選択される。 本発明はここで、添付の図面及び実施例及び添付の合成スキームを参照して非限定的な様式で例示されている。 １ −レセプターのＣ末端に融合された緑色蛍光タンパク質に由来する蛍光、並びにｃ）蛍光の重複を示し、したがってリガンド結合がレセプターに特異的であることを確認する、ａ）及びｂ）からのオーバーレイされた画像。 スキームにおいて： スキーム２及び３は、リンカー前駆体Ｚ Ｌ '−Ｌ−Ｚ Ｌからのリガンド前駆体Ｌｉｇ−Ｌ−Ｚ Ｌの合成を含む、２つのアデノシンレセプターアゴニストＬｉｇ−Ｌ−Ｆｌ Ｌの合成のための合成経路を示す。 スキーム４は、リンカー前駆体Ｚ Ｌ '−Ｌ−Ｚ Ｌからのリガンド前駆体Ｌｉｇ−Ｌ−Ｚ Ｌの合成を含む、２つのβアドレノセプターアゴニストＬｉｇ−Ｌ−Ｆｌ Ｌの合成のための合成経路を示す。 実施例Ａ〜Ｃ 材料及び方法 （分析的ＲＰ−ＨＰＬＣを、１．０ｍＬ／分の流速でＶｙｄａｃ Ｃ ８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を使用して、９９６ ＰＤＡ溶離液検出を用いてＷａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ ＬＣシステムで実施した。使用した移動相は以下であった：溶媒Ａ、水（ヘリウムバブルによって脱気した）；溶媒Ｂ、アセトニトリル（超音波処理によって脱気した））。 Ａ． 合成（実施例Ａ１） スキーム１ ＸＡＣ−ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０を、ＸＡＣの第１級アルキルアミン基をＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−６３０／６５０−Ｘ−スクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させることによって合成した。 ＸＡＣ及びＢＹ６３０を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で室温で２時間攪拌し、生成物をＨＰＬＣによって精製した。 ＸＡＣ及び類似体を、Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ １９８５、２８、１３３４−１３４０の方法によって合成した。 ＴＯＦ ＥＳ＋実測値９７４．３９９８（Ｃ ５０ Ｈ ５５ ＢＦ ２ Ｎ ９ Ｏ ７ Ｓは９７４．４００６を要求する） スキーム２ ＥＳ＋実測値８８５．４（Ｃ ４３ Ｈ ４８ ＢＦ ２ Ｎ ９ Ｏ ７ Ｓは８８５．４を要求する） Ｎ ６ −アミノブチル−５'−デオキシ−５'−オキソ−５'−エチルアミノアデノシン（ＡＢＥＡ）を、市販の試薬から６工程で合成した。 ＡＢＥＡの第１級アミン基を、蛍光体ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０−Ｘ−スクシンイミジルエステル（ＢＹ−６３０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でアシル化して、ＢＹ６３０−ＡＢＥＡを得て、これをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（スキーム３）。 この合成は、式Ｈ ２ Ｎ（ＣＨ ２ ） ４ ＨＮＣＯＯＣＨ ２ Ｐｈのリンカー前駆体を使用して、スキーム３中に示される： スキーム３ リンカー改変されたリガンド、式ＩＶの化合物２'，３'−イソプロピリデンイノシン１の合成：イノシン（５．３６ｇ、０．０２ｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（ｔｏｓｉｃ ａｃｉｄ）一水和物（３．８０ｇ、０．０２ｍｏｌ）を２，２−ジメトキシプロパン（５０ｃｍ ３ ）及びアセトン（２００ｃｍ ３ ）の混合物中に懸濁し、１８時間攪拌した。 炭酸水素ナトリウム（２．５２ｇ、０．０２ｍｏｌ）及び水（４０ｃｍ ３ ）を添加し、この懸濁物を１５分間攪拌した。 この懸濁物をエバポレートして一定体積にし、粗製生成物を残留水から再結晶化させて、アセトニド１（３．７１ｇ、６０％）を白色針状体として得た；融点２６６〜２６８℃（Ｈ ２ Ｏから）（ｌｉｔ．，２６６℃）；［α］ ２２ Ｄ ２'，３'−イソプロピリデン−５'−オキソイノシン２：アセトニド１（３．０８ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ＴＥＭＰＯ（３１３ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びヨードソベンゼン（ｉｏｄｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）ジアセテート（７．０９ｇ、２２ｍｍｏｌ）を、ＭｅＣＮ：Ｈ ２ Ｏ（１：１、５０ｃｍ ３ ）中に溶解し、光を排除して４時間攪拌した。 その溶媒を得られた懸濁物から注意深くエバポレートし、その反応残渣を引き続いてアセトン及びジエチルエーテルで粉砕し、酸２（２．６７ｇ、８３％）を白色粉末として得た；融点２２４〜２２９℃（ジエチルエーテルから）（ｌｉｔ．，２７４〜２７６℃）；（実測値：Ｃ，４８．５５；Ｈ，４．３；Ｎ，１７．０。Ｃ １３ Ｈ １４ Ｎ ４ Ｏ ６はＣ，４８．４５；Ｈ，４．４；Ｎ，１７．４％を要求する）；δ Ｈ （２５０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）１．３３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ３ ）、１．５１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ３ ）、４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ １．６，Ｃ ４' Ｈ）、５．３６〜５．４４（２Ｈ，ｍ，Ｃ ２' Ｈ及びＣ ３' Ｈ）、６．３０（１Ｈ，ｓ，Ｃ １' Ｈ）、８．０２（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、１２．４２（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ；δ Ｃ （６９．２ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）２５．１、２６．７（２×アセトニド）、８３．９、８５．８、９０．０（４×ＣＨ）、１１２．９（４°）、１２４．４（４°）、１４０．０（ＣＨ）、１４５．８（ＣＨ）、１４８．２（４°）、１５６．８（４°）、１７１．８（Ｃ＝Ｏ）；ｍ／ｚ（ＥＳ＋）３２３（ＭＨ＋）、１３７（Ｍ−リボース）。 ６−クロロ−６−デオキシ−５'−エチルアミノ−２'，３'−イソプロピリデン−５'−オキソ−５'−デオキシイノシン３：（厳しく乾燥した反応条件及び不活性雰囲気下であることに注意すること）酸２（９６７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ ３ （１５ｃｍ ３ ）中に懸濁し、これにＮ，Ｎ−ＤＭＦ（５８１μＬ、７．５ｍｍｏｌ）及びＳＯＣｌ ２ （１．０９ｃｍ ３ 、１５ｍｍｏｌ）を添加した。 この懸濁物を熱油浴中に配置し、還流で６時間維持した。 得られた溶液をエバポレートし、黄色油をＴＨＦ（２０ｃｍ ３ ）中に５℃で溶解した。 エチルアミン（ＴＨＦ中２．０Ｍ溶液、３．７５ｃｍ ３ 、７．５ｍｍｏｌ）を滴下し、５℃で１５分間攪拌し、室温まで温めた。 溶媒をエバポレートし、残渣をＤＣＭ（２５ｃｍ ３ ）中に溶解し、水（２×２０ｃｍ ３ ）及び飽和ブライン溶液（２×２０ｃｍ ３ ）で洗浄した。 有機画分を乾燥させてエバポレートして黄色油を残し、これをシリカでのカラムクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製して、表題化合物３（５２５ｍｇ、４８％）を黄色シロップ状物として得た；［α］ １９ Ｄ −１２．９（ｃ ０．５０ ＣＨＣｌ ３中）；δ Ｈ （２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ ３ ；Ｍｅ ４ Ｓｉ）０．７８（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．３，ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、１．４１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ３ ）、１．６４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ ３ ）、２．９０〜３．１１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、４．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ １．９，Ｃ ４' Ｈ）、５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ６．２及び２．３，Ｃ ２' Ｈ）、５．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ６．２及び１．９，Ｃ ３' Ｈ）、６．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ ２．３，Ｃ １' Ｈ）、６．２８（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ）、８．３５（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、８．６８（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）；δ Ｃ （６９．２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ ３ ；Ｍｅ ４ Ｓｉ）１４．２（ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、２５．０、２６．９（２×アセトニド）、３３．９（ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、８２．９、８３．４、８６．７、９２．０（４×ＣＨ）、１１４．６（４°）、１３２．３（４°）、１４４．８（ＣＨ）、１５０．９（４°）、１５１．９（４°）、１５２．２（ＣＨ）、１６８．１（Ｃ＝Ｏ）；ｍ／ｚ（ＥＳ−）３６６（（Ｍ−Ｈ） − ）、１５３（Ｍ−リボース）。 Ｎ ６ −（４−ベンジルオキシカルボニルアミノブチル）−５'−エチルアミノ−２'，３'−イソプロピリデン−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン４：塩化物３（３３７ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１０ｃｍ ３ ）中に溶解し、これにＮ−ベンジルオキシカルボニルブタン−１，４−ジアミン（３０５ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１５９μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。 この溶液を熱油浴中に配置し、還流で１８時間維持した。 得られた溶液をエバポレートし、黄色油をシリカでのカラムクロマトグラフィー（２．５％ ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製して、表題化合物４（４４ Ｎ ６ −（４−ベンジルオキシカルボニルアミノブチル）−５'−エチルアミノ−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン５：アデノシン誘導体４（２６１ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を、１ＭのＨＣｌ （水溶液） ：１，４−ジオキサン（１：１、４ｃｍ ３ ）中に溶解し、５０℃の油浴中に配置して４時間攪拌した。 得られた溶液をｐＨ約８に調整し（飽和ＮａＨＣＯ ３（水溶液） ）、ＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃ（３×５ｃｍ ３ ）で抽出した。 合わせた有機画分を乾燥させてエバポレートし、その粗製生成物を分取層クロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製して、表題化合物５（１６０ｍｇ、６６％）を無色油として得た；δ Ｈ （２５０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）１．０８（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．２，ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、１．４５〜１．６２（４Ｈ，ｍ，Ｃ ２ Ｈ ２ 及び Ｃ ３ Ｈ ２ ）、２．９８〜３．０６（２Ｈ，ｍ，Ｃ １ Ｈ ２ ）、３．１７〜３．２６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、３．３７〜３．５３（２Ｈ，ｍ，Ｃ ４ Ｈ ２ ）、４．１２〜４．１６（１Ｈ，ｍ，Ｃ ３' Ｈ）、４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ １．１，Ｃ ４' Ｈ）、４．５８〜４．６５（１Ｈ，ｍ，Ｃ ２' Ｈ）、４．９９（２Ｈ，ｓ，ベンジル ＣＨ ２ ）、５．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ６．５，Ｃ ２' −ＯＨ）、５．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ４．２，Ｃ ３' ＯＨ）、５．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ７．６，Ｃ １' Ｈ）、７．２５〜７．３４（６Ｈ，ｍ，芳香族及びＮＨ）、８．０１（１Ｈ，ｂｒ ｓ，カルバメート ＮＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、８．３９（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、８．９４（１Ｈ，ｔ，Ｊ ５．６，アミド ＮＨ）；δ Ｃ （６９．２ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）１４．９（ＣＨ ２ ＣＨ ３ ）、２６．６、２７．１、３３．４、３９．５、４０．３（５×ＣＨ ２ ）、６５．３（ベンジル ＣＨ ２ ）、７２．２、７３．３、８４．９、８８．０（４×ＣＨ）、１２０．２（４°）、１２７．９（ＣＨ）、１２８．５（ＣＨ）、１３７．５（ＣＨ）、１４０．６（４°）、１５２．６（ＣＨ）、１５４．９（４°）、１５６．３（４°）、１６９．３（４°）；ｍ／ｚ（ＥＳ＋）５１４（ＭＨ＋）。 Ｎ ６ −（４−アミノブチル）−５'−エチルアミノ−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン（ＡＢＥＡ）６：アデノシン誘導体５（４８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ：Ｈ ２ Ｏ：ＡｃＯＨ（９：０．９：０．１、５ｃｍ ３ ）中に溶解し、これに、１０％ 蛍光リガンド、式Ｉの化合物ＡＢＥＡ−ＢＹ６３０（３）の合成：ＡＢＥＡ ６（５．７４ｍｇ、１５．１μｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で光を排除してＮ，Ｎ−ＤＭＦ（１ｃｍ ３ ）中に溶解した。 Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０−Ｘ−スクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（５．０ｍｇ、７．５５μｍｍｏｌ、１ｃｍ ３のＮ，Ｎ−ＤＭＦ）の溶液を添加し、この反応を４時間攪拌した。 この溶液をエバポレートし、粗製生成物を分取層クロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ−ＤＣＭ）によって精製して、表題化合物７（３）（５．２４ｍｇ、７５％）を紫色粉末として得た；ｍ／ｚ（ＥＳ＋）実測値９４７．３７（Ｃ ４５ Ｈ ５１ ＢＦ ２ Ｎ １０ Ｏ ７ ＳＮａは９４７．３６を要求する）。 ＡＢＥＡ−ＢＹ６３０ のリンカー前駆体を使用して、化合物（３）について記載した通りにスキーム３の方法を使用して合成した。 を有するＡＰＥＡ−ＢＹ６３０が得られた。 Ｒ ｔ ８．６分（３０％〜１００％ ｖ／ｖ Ｂ、２５分）。 のリンカー前駆体を使用して、化合物（３）について記載した通りにスキーム３の方法を使用して合成し、ここで、以下の中間体１〜３はそれぞれ、スキーム３中に示される構造４〜７の類似体である。 Ｎ ６ −（８−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３，６−ジオキサオクチル）−５'−エチルアミノ−２'，３'−イソプロピリデン−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン１：δ Ｈ （４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ ３ ）０．８８（３Ｈ，ｔ Ｊ ７．３，Ｅｔ ＣＨ ３ ）、１．３８（３Ｈ，ｓ，アセトニド ＣＨ ３ ）。 １．６２（３Ｈ，ｓ，アセトニド ＣＨ ３ ）、３．０３〜３．１６（２Ｈ，ｍ，Ｅｔ ＣＨ ２ ）、３．４０〜３．９３（１４Ｈ，ｍ，６×リンカーメチレン，Ｃ ３' Ｈ，Ｃ ４' Ｈ）、４．６７（１Ｈ，ｓ，Ｃ ２' Ｈ）、５．１１（２Ｈ，ｓ，ベンジル ＣＨ ２ ）、５．３２（１Ｈ，ｓ，Ｃ １' Ｈ）、５．８０（１Ｈ，ｂｒ ｓ，カルバメート ＮＨ）、６．５５（１Ｈ，ｂｒ ｓ， Ｃ ６ −ＮＨ）、７．０２（１Ｈ，ｂｒ ｓ，アミド ＮＨ）、７．２８〜７．３７（５Ｈ，ｍ，芳香族 ＣＨ）、７．６４（１Ｈ，ｂｒ ｓ，アデニン ＣＨ）、８．２９（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）。 Ｎ ６ −（８−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３，６−ジオキサオクチル）−５'−エチルアミノ−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン２：δ Ｈ （４００ＭＨｚ；ＤＭ Ｎ ６ −（８−アミノ−３，６−ジオキサオクチル）−５'−エチルアミノ−５'−オキソ−５'−デオキシアデノシン３：δ Ｈ （４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ ６ ）１．０５（３Ｈ，ｔ Ｊ ７．１，Ｅｔ ＣＨ ３ ）、１．８６（２Ｈ，ｂｒ ｓ，−ＮＨ ２ ）、２．７１〜２．８０（２Ｈ，ｍ，リンカー ＣＨ ２ ）、３．１７〜３．２６（２Ｈ，ｍ，Ｅｔ ＣＨ ２ ）、３．４１〜７３（１０Ｈ，ｍ，５×リンカー ＣＨ ２ ）、４．１５（１Ｈ，ｂｒ ｍ，Ｃ ３' Ｈ）、４．３４（１Ｈ，ｓ，Ｃ ４' Ｈ）、４．４７〜４．５４（１Ｈ，ｍ，Ｃ ２' Ｈ）、５．９５（２Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｃ ２' −ＯＨ，Ｃ ３' −ＯＨ）、６．０１（１Ｈ，ｄ Ｊ ７．５，Ｃ １' Ｈ）、７．９２（１Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｃ ６ −ＮＨ）、８．３１（１Ｈ，ｂｒ ｓ，アデニン ＣＨ）、８．４４（１Ｈ，ｓ，アデニン ＣＨ）、８．９５（１Ｈ，ｔ Ｊ ５．６，アミド ＮＨ）。 以下の式： を有するＡＢＩＰＥＡ−ＢＹ６３０が得られた。 第１のアプローチにおいて、蛍光体が引き続いて結合されるサルメテロール側鎖上にリンカーが置換される。 第２のアプローチにおいて、サルメテロールのネイティブのアルキル側鎖を、リンカー及び蛍光体で置換する。 この場合、本発明によれば、結合、蛍光及び活性の保持は不確実であり、したがって確認が必要であり、有用な化合物を提供するために、蛍光リガンドに関する情報が提供される必要がある。 スキーム４ であり、化合物４ａ を生じる。 ２． クレンブテロール−ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０（９） （実施例Ａ４） １． ＣＧＰ １２１７７−ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０（５） ３． ＩＣＩ１１８５５１−ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０（７） Ｂ． 薬理学（実施例Ｂ１） サイクリックＡＭＰ及びリン酸イノシトールの蓄積のアッセイと共に、［ ３ Ｈ］ＤＰＣＰＸ結合を、ヒトＡ １ −レセプターを発現するＣＨＯ−Ａ１細胞で実施した。 画像を、５％の胎仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地：Ｈａｍ' ＸＡＣ−ＢＹ６３０及びＢＹ６３０自体の分光分析により、それらのピーク励起波長（それぞれ、６３０ｎｍ、６３２ｎｍ）及び発光波長（６５０ｎｍ、６５３ｎｍ）が実質的に異ならないことが示された。 ＣＨＯ−Ａ１細胞膜での［ ３ Ｈ］ＤＰＣＰＸ結合研究により、ＸＡＣ−ＢＹ６３０がＸＡＣよりもＡ １ −ＡＲに対する低い親和性を有することが示された（ｐＫｉ＝７．７９±０．１３及び６．８２±０．１１、それぞれＸＡＣ及びＸＡＣ−ＢＹ６３０、平均±標準誤差平均、ｎ＝４）。 ＸＡＣ−ＢＹ６３０はまた、５'−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン媒介性のｃＡＭＰ産生の阻害（見かけのｐＫ Ｂ ＝６．９８±０．１５対ＸＡＣについて８．０６±０．２４、ｎ＝３）及びリン酸イノシトール産生の刺激（見かけのｐＫ Ｂ ＝６．２６±０．２０対ＸＡＣについて７．４６±０．０８、ｎ＝４）の両方で、競合的Ａ １ −ＡＲアンタゴニストとして挙動した。 共焦点画像化により、ＸＡＣ−ＢＹ６３０が、時間依存的様式及び濃度依存的様式で、膜に局在化したＡ １ −ＡＲに結合したことが示された。 ＸＡＣ−ＢＹ６３０（２５ｎＭ〜２５０ｎＭ）の結合が５分後に検出され、３０分間のインキュベート後にこの膜に優勢に位置した。 ＸＡＣ−ＢＹ６３０の膜結合はレセプター特異的であった。 なぜなら、３０分間のＤＰＣＰＸ（１０ −８ Ｍ〜１０ −６ Ｍ）とのプレインキュベーションが、膜結合の濃度依存的な阻害を引き起こしたからである（３０分、５０ｎＭ）。 これらの研究は、ＸＡＣ−ＢＹ６３０が、初代組織及び細胞系においてＡ １ −ＡＲを可視化するために使用できる、適度な親和性を有する機能的Ａ １ −ＡＲアンタゴニストであることを示している。 蛍光相関分光法（ＦＣＳ）。 ヒトＡ １ −ＡＲ又はＡ １ −ＡＲ−Ｔｏｐａｚ融合物のいずれかを発現するＣＨＯ細胞を、ガラス底の８ウェルプレート上で培養し、生きた細胞の測定のために準備した。 ＦＣＳ測定を、ｘ−ｙ配置についてＡｘｉｏｃａｍ ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃｏｒ ２を使用して実施した。 細胞を、示された時間にわたって２２℃でリガンドと共にインキュベートし、共焦点体積を上側の膜上に配置した。 データを、１５秒間のプレブリーチの後に２×３０秒間にわたって収集し、Ｚｅｉｓｓ ＡＩＭソフトウェアを使用してマルチパラメータの等式を使用して分析した。 最初に、Ａ １ −ＡＲ−Ｔｏｐａｚ融合タンパク質（Ａ １ −ＡＲ−Ｔｐｚ）の拡散特徴を、ＣＨＯ−Ａ１Ｔｐｚ細胞において決定した。 自動補正分析により、Ａ １ −ＡＲについての拡散時間（τ Ｄ ）が１５．０±０．９ｍｓ（平均±標準誤差平均、ｎ＝８４）であることが示された。 蛍光体内の光学事象（「明滅」）によっておそらく引き起こされる第２の成分（τ Ｄ ＝１１８±１４μｓ）もまた観察された。 緩衝液中のＸＡＣ−ＢＹ６３０のＦＣＳ分析により、単一成分の拡散が示された（τ Ｄ ＝６０±２μｓ、ｎ＝１０）。 ＸＡＣ−ＢＹ６３０（１ｎＭ〜４０ｎＭ、１０分〜６０分、ｎ＝７１）と共にインキュベートしたＣＨＯ−Ａ１細胞の上側の膜上に、２つのさらなるゆっくりと拡散する種が、遊離リガンドに加えて検出された。 第１の成分は、Ａ １ −ＡＲ−Ｔｐｚについて見られる拡散時間と類似の拡散時間（τ Ｄ１ ＝１７．４±１．１ｍｓ；６９／７１細胞）を有した。 このことは、これがレセプター結合リガンドであることを示唆する。 第２は、非常にゆっくりと拡散する成分であった（τ Ｄ２ ＝３４５±４１ｍｓ、６１／７１細胞）。 ８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）とのプレインキュベーション（１μＭ、３０分）後、τ Ｄ２は、３１個の細胞中３０個において存在し、このことは、この成分が非特異的結合であることを示唆する。 しかし、τ Ｄ１成分は、３１個の細胞中１７個においてのみ存在した。 さらに、１５ｎＭのＸＡＣ−ＢＹ６３０に３０分間曝露された細胞において、τ Ｄ１成分の量は、ＤＰＣＰＸによって５１．８±１４．９レセプター／μｍ ２から１３．６±５．４レセプター／μｍ ２に低下し（それぞれｎ＝８及び４、スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）、このことは、この成分がＡ １ −ＡＲ結合リガンドであることをさらに示唆する。 本発明者らは、単一の生きた細胞においてＡ １ −ＡＲへの結合を定量するため及びレセプター拡散を測定するためにＦＣＳを使用した。 さらなる開発により、急性に分散された細胞における内因性Ａ １ −ＡＲの定量的レセプター−リガンド結合が可能となる。 これらの研究は、ＸＡＣ−ＢＹ６３０が、初代組織及び細胞系においてＡ １ −ＡＲへの結合を可視化及び測定するために使用できる、適度な親和性を有する機能的Ａ １ −ＡＲアンタゴニストであることを示している。 ＣＨＯ−Ａ１ｆｏｓ細胞において、ＢＹ６３０−ＡＢＥＡ及びＡ １ −ＡＲアゴニストＮ ６ −シクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ）の両方が、用量依存的な様式でルシフェラーゼ発現を刺激した（ＣＰＡ及びＢＹ６３０−ＡＢＥＡについてそれぞれ、７．０１±０．０４（ｎ＝６）及び６．７６±０．１８（ｎ＝５）のｐＥＣ ５０ 、平均±標準誤差平均）。 濃度応答曲線が、１０ｎＭのＤＰＣＰＸによって競合的様式で右側にシフトして、ＣＰＡ及びＢＹ６３０−ＡＢＥＡに対してそれぞれ、８．７２±０．０３及び９．０５±０．１０のｐＫ ｄ値を生じたので（ｎ＝３）、刺激はＡ １ −ＡＲレセプターによって媒介された。 より高い用量のＤＰＣＰＸ（１００ｎＭ）により、ＣＰＡ刺激について８．６２±０．０２のｐＫ ｄが得られたが、ＢＹ６３０−ＡＢＥＡに対する応答は完全に遮断された（ｎ＝３）。 レセプターの可視化のために、ＣＨＯ−Ａ １細胞を、６０分間まで１００ｎＭのＢＹ６３０−ＡＢＥＡと共にインキュベートした。 膜へのリガンドの結合は５分後に検出可能であり、３０分後にはかなりのものであった（ｎ＝３）。 これは、ＤＰＣＰＸとのプレインキュベーション（１μＭ、３０分）によって実質的に低下したので、結合はＡ １ −ＡＲに対するものであった。 さらに、ＣＨＯ−Ａ１Ｔｐｚ細胞における実験により、膜におけるリガンド蛍光と蛍光タグ付きＡ １ −ＡＲからの蛍光との同時局在化が示された。 結果が図１中に示され、この図は、以下の共焦点顕微鏡法画像化から取った画像を示す：ａ）赤色のチャネルで観察された、ＣＨＯ細胞に対する本発明の蛍光リガンドのリガンド結合に由来する蛍光、ｂ）緑色のチャネルを介して観察された、レセプターの位置を示す、ＣＨＯ細胞によって発現された緑色蛍光タンパク質に由来する蛍光、及びｃ）蛍光の重複を示し、したがってリガンド結合がレセプターに特異的であることを確認する、ａ）及びｂ）からオーバーレイされた画像。 結論として、本発明者らは、ヒトＡ １ −ＡＲに対する新規蛍光アゴニストリガンドを合成することに成功している。 このリガンドは、急性に分散された細胞及び細胞系の両方において内因性Ａ １ −ＡＲレセプターの局在化をモニタリングすることにおいて有用である。 Ｃ． 薬理学的データと関連付けられたリガンド（実施例Ｃ１） 合成及び分析：上記Ａ１を参照のこと。 蛍光タグ付きリガンドを、本明細書で上記定義の通りの本発明の方法によって得る。 蛍光タグ付きリガンドを、本明細書で上記定義の通りの本発明の方法によって得る。 このライブラリーは、各リガンドについてのデータシート（上記のＣ．）を含む。 次いで、ライブラリーを所望のレセプターでの結合についてスクリーニングするために選択し、所望のレセプターに対する最適の薬理学を与える蛍光リガンドを選択した。 スクリーニングすべきライブラリーの選択は、ポジティブの選択を生じるために必要とされる類似体を提供するライブラリーの合理的な設計によって促進される。 |
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