Present in a biological sample to be processed in a single reaction vessel, the target nucleic acid labeling and purification process |
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| 申请号 | JP2007521998 | 申请日 | 2005-07-21 | 公开(公告)号 | JP4651666B2 | 公开(公告)日 | 2011-03-16 |
| 申请人 | ビオメリュー; | 发明人 | フレデリック ジノ，; リオネル ムヌ，; アリ ラーヨウン，; | ||||
| 摘要 | |||||||
| 权利要求 | 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； − 生体試料、 − 式（０）で表され、加熱に対して安定である、核酸用の少なくとも１つの標識試薬： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで の整数であり、かつ、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表す） 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなる、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなることを特徴とする請求項１に記載の標識及び精製方法。 前記標識試薬の導入によって、以下： − 核酸の非特異的な断片化による、多数の核酸断片の生成、及び、 − これら多数の断片の、断片化中に遊離した、３'及び／又は５'末端に位置する末端リン酸塩の標識：が可能になることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識及び精製方法。 核酸断片の３'又は５'末端の標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した反応性基の付着によって実施されることを特徴とする請求項３に記載の標識及び精製方法。 核酸断片の３'又は５'末端の断片化及び／又は標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した求核基、求電子性基又はハロゲン基の付着によって実施されることを特徴とする請求項３に記載の標識及び精製方法。 核酸の断片化は以下： − ヌクレアーゼによる酵素的手段、 − 金属陽イオンを、単独で、又は、化学的触媒、若しくは、ＲＮＡ親和性がありかつイミダゾール核若しくは置換類似体を有する任意の化学分子と併用する化学的手段、又は、 − 超音波処理又は放射線による物理的手段：によって実施されることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。 ＲＮＡ断片の３'又は５'末端の標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に結合するリン酸結合への分子Ｒ−Ｘの付着によって実施され、Ｒは標識からなり、Ｘは標識とＲＮＡの結合剤 である ことを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。 リン酸基の標識は、５−（ブロモメチル）フルオレセインを用いて実施されることを特徴とする請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。 標識試薬と核酸とを均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で接触させ、前記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（０）のものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識及び精製方法。 前記標識試薬は式（１）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表す。 ）： ことを特徴とする請求項９に記載の方法。 前記試薬は式（２）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。 前記試薬は式（３）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。 前記試薬は式（４）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。 前記試薬は式（２１）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９に記載の方法。 前記試薬は式（２２）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９に記載の方法。 前記試薬は式（２３）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。 ）： ことを特徴とする請求項９に記載の方法。 使用される前記標識試薬は、Ｒ ３及びＲ ４ （これらは、独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、ＯＣＨ ３ 、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ ；を示す）を含むことを特徴とする請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（７）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（２４）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬の構造Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −は式（５）のものである： ・Ｒ ２は検出用標識を表し、 ・ｍは１〜１００の整数であり、かつ、 ・ｐは１〜１０の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； − 生体試料、 − 式（６）で表され、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定である、核酸用の少なくとも１つの標識試薬： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｒ ３は、Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表す。 ） 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； − 生体試料、 − 式（２５）で表され、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定である、核酸用の少なくとも１つの標識試薬： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｒ ３は、Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表す。 ） 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 前記試薬は式（１４）のものである： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（２６）のものである： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（１５）のものである： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（２７）のものである： ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ）−部位を、 １〜２０回繰り返して含むことを特徴とする請求項９〜２６のいずれか１項に記載の方法。 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； − 生体試料、 − 一本鎖又は二本鎖の核酸の標識及び断片化を、以下の工程： ＊ 核酸の断片化、 ＊ 式（１９） ： の化合物から選択される標識試薬による、少なくとも１つの断片への標識の付着、 によって実施し得 る核酸用の少なくとも１つの標識試薬であって、前記試薬は共有結合で、主として前記断片の少なくとも１つのリン酸塩に結合してい る 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 前記標識試薬は式（２０）の化合物から選択される： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識であり、 ・Ｌは、少なくとも２個の共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１であり、かつ・Ｚは以下； ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表す）： ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。 Ｚは： 断片化及び標識は２工程で実施されることを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。 断片化及び標識は１工程で実施されることを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。 標識は本質的に水性の均質溶液中で実施されることを特徴とする請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。 断片化は酵素的、物理的又は化学的手段によって実施されることを特徴とする請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； − 生体試料、 − 式（８）で表され、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定である、核酸用の少なくとも１つの標識試薬： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アリール基又はアルキル基）；を示し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで の整数であり、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表し、 ・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、 ・ｍは１〜１０ の整数であり、かつ、 ・ｐは１〜１０ の整数である。 ） 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 前記試薬は式（９）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで の整数であり、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、 ・ｍは１〜１０ の整数であり、かつ、 ・ｐは１〜１０ の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。 前記試薬の式中、ｐはｍより小さい、又は、ｍと同じであることを特徴とする請求項３５又は３６に記載の方法。 前記試薬は式（１０）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、 ・ｑは１〜１０ の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬は式（１１）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示す。 ）： ことを特徴とする請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。 Ｒ ２は式（１２）： Ｒ １はＣＨ ３を含み、Ｒ ３及びＲ ４はそれぞれＨを表すことを特徴とする請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。 前記試薬の構造−（Ｌ） ｎ −は以下： ・スペルミン若しくはＮ，Ｎ'−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ジアミノブタン；ＮＨ ２ −（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＨ ２ 、又は、 ・スペルミジン若しくはＮ−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン；Ｈ ２ Ｎ−（ＣＨ ２ ） ４ −ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −ＮＨ ２ 、又は、 ・アラニン部位を含む誘導体；ＮＨ ２ −ＣＨ ２ −ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ：を含むことを特徴とする請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。 処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、 以下： ・単一の反応槽の使用、 ・以下； −生体試料、 − 式（１３）で表され、水性バッファー中で均質溶液中で接触していてよく、かつ、加熱に対して安定である、核酸用の少なくとも１つの標識試薬： ・Ｒ １は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、 ・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで の整数であり、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表し、 ・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、 ・ｍは１〜１０ の整数であり、かつ、 ・ｐは１〜１０ の整数である。 ） 、 − 前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、 − 核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、 ・反応槽内容物のインキュベート、並びに、 ・前記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法。 前記試薬は式（１６）のものである： ・Ｒ １は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、 ・Ｒ ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、 ・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、 ・Ｒ ３及びＲ ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ ２ 、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ （Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、 ・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ ２ Ｏ−又は−ＣＨ ２ Ｓ−を表し、 ・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、 ・ｍは１〜１０ の整数であり、かつ、 ・ｐは１〜１０ の整数である。 ）： ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。 前記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ）−部位を、 １〜２０回繰り返して含み、従って−Ｚ−は−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−で表されることを特徴とする請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。 前記固体支持体はシリカ粒子からなることを特徴とする請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。 前記固体支持体はシリカで覆われた磁性粒子からなることを特徴とする請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。 固体支持体を有するシリカ粒子は、粒子径が０．１〜５００μｍ である ことを特徴とする請求項４６又は４７に記載の方法。 標識を可能にする添加成分のうちの１つは、アルコール からなる ことを特徴とする請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。 イソプロパノールは最終混合物の７０％（ｖ／ｖ）含まれることを特徴とする請求項４９に記載の方法。 細胞遊離を可能にすることによって固体支持体上への核酸の吸着を可能にする添加成分の１つは、カオトロピック薬剤からなることを特徴とする請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。 使用される前記カオトロピック薬剤は、グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素、又は、これらの誘導体の混合物であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。 使用されるグアニジウム塩は、（イソ）チオシアン酸グアニジウムであることを特徴とする請求項５２に記載の方法。 固体相−核酸複合体は、堆積させて上清を除去した後、カオトロピック物質を含む洗浄バッファーで複合体を洗浄することによって、液体から分けられることを特徴とする請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。 固体相−核酸複合体は、洗浄バッファーで洗浄した後、１種又は数種の有機溶媒で再び洗浄し、その後乾燥させることを特徴とする請求項５４に記載の方法。 固体相−核酸複合体中に存在する核酸は、複合体を洗浄及び乾燥させた後で、溶出バッファーを使用して溶出することを特徴とする請求項５５に記載の方法。 こうして得られた固体相−核酸複合体は、核酸を増幅するための成分を含む混合物を前記固体相に付着させて、あるいは、そこから溶出して、この混合物と接触させることを特徴とする請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。 インキュベート工程は、処理サンプルを５〜４５分間 、温度４５〜８５℃ で維持することを含むことを特徴とする請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。 インキュベート工程の後、前記サンプルは、少なくとも ５分間で室温に戻すことを特徴とする請求項５８に記載の方法。 処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなる、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなることを特徴とする請求項２１、２２、２８、３５又は４３に記載の標識及び精製方法。 |
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| 说明书全文 | 本発明は、少なくとも１つの固体支持体の存在下で核酸を標識する方法に関する。 先行技術によれば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は、核酸の標識方法が数多く示されている。 ある方法は、塩基が天然のものであるか修飾されたものであるかに関わらず、塩基に標識を付着させることからなる。 別の方法は、糖に標識を付着させることを提示しているが、ここでも、塩基は天然のものでも修飾されたものでも構わない。 更に別の方法は、標識をリン酸塩に付着させることを目的とする。 特に、塩基に標識を付着させることは、直接標識されたヌクレオチドを取り込むことによって核酸を標識する方法において利用されている。 糖に標識を付着させることは、化学合成によって調製された核酸プローブの場合に利用されることが多い。 リン酸塩に標識を付着させることも、オリゴヌクレオチドの化学合成の過程で、官能化されたアーム及び標識を導入するために利用されてきた。 実際、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は核酸を標識する必要のある当業者は、この付着を塩基又は糖に対して行う傾向があり、それによって、より優れた利便性、及び、より多くの代替法がもたらされる。 その上、例えば塩基については、特許文献１〜９、また糖については、特許文献１０等、数多くの文献を調べてみれば明らかになることである。 標識をリン酸塩に付着させるのは、特に、リン酸塩の反応性が弱いため、塩基又は糖を官能化させることからなる技術よりも複雑で、ほとんど用いられてこなかった（例えば、非特許文献１参照）。 同様に、プローブをオリゴヌクレオチド断片に導入する方法に関する非特許文献２では、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を効果的にアルキル化することは不可能であると考えられている。 特許文献１１は、リボ核酸（ＲＮＡ）の断片化、及び、末端リン酸塩の標識からなる、合成又は天然のＲＮＡを標識する方法を開示している。 この文献は、断片化と併用した標識に利用することができる一定数の官能基、例えばヒドロキシル基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシアミン基、ハロゲン化アルキル基、ベンジル型ハロゲン化アルキル基等、特に、５−（ブロモメチル）フルオロセイン誘導体を開示している。 これらの官能基によれば核酸の標識が可能になるが、この標識は断片化過程で遊離するリン酸塩上でなされるため、効率的に標識するためには断片化工程と組み合わせる必要がある。 更に、効率的に標識するためには、ＲＮＡに対して過剰量の標識試薬を添加しなければならないが、こうすると、過剰な標識によるバックグラウンドノイズの発生という問題が発生する。 結局のところ、この方法は、２本鎖ＤＮＡに対しては効率的に機能しない。 標識効率という観点においてより効率的な新規の試薬が現れた。 これらは標識位置について特異的であって、かつ、特に、水素結合を介して二本鎖形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響を与えることなく、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に使用することができ、また、最終的に、天然、又は、酵素増幅により調製可能なヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を無差別に標識することができる。 本出願人は、上記条件を満たす標識であって、標識するための反応性基としてジアゾメチル基を用いる新規の標識を既に提示している。 これは、例えば、特許文献１２〜１４、又は、非特許文献３の事例であり、そのような成分の合成方法及び使用方法をより明確に理解するために読者は参照することが可能である（上記した文献の内容は、本明細書中に参照する）。 更に、先行技術は、具体的にはシリカ製の、より具体的には粉末状、ゲル状又は磁性粒子状の、固体支持体を使用することにより、標識前又は標識後に核酸を精製して、特異的ハイブリダイゼーション（ＤＮＡチップに関連するが、ＥＬＯＳＡプレート又は迅速試験型でもある）によって検出することについて記載している。 標識する前に精製すると標識効率を大幅に改善でき、また、標識した後に精製するとハイブリダイゼーション率及びシグナル／ノイズ比を明白に改善できるため、試験感度を良好にするためには必要である。 特許文献１５の場合は、複雑な出発生物原料を含む核酸を単離するための方法を提案するものであり、この方法は出発原料とカオトロピック性物質及び固体相との混合を含み、この固体相は核酸を付着させることができて、その後洗浄又は溶出することによって、生成した複合体の残渣から取り除くことができるものである。 この特許の内容は本明細書中に参照する。 Ｊｅｎｃｋｓ Ｗ． Ｐ． ら，Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ，８２，１７７８−１７８５，１９６０ Ｏ'Ｄｏｎｎｅｌ ａｎｄ Ｍｃ Ｌａｕｇｈｌｉｎ，" Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ"，ｐ２１６−２４３ ｉｎ "Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ "，Ｅｄ Ｈｅｃｈｔ Ｓ． Ｍ． ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６ Ｌａａｙｏｕｎら，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００３，１４，１２９８−１３０６ ａｎｄ ｅｎｔｉｔｌｅｄ：" Ａｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅｓ ｆｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ＤＮＡ Ｃｈｉｐｓ " 実際、これらの２つの技術は独立して使用される、すなわち、精製工程及び標識工程は、別々の使い捨て容器中で別々の操作方法により実施される。 このように２つの工程が存在すると、液体を移す必要があり、潜在的な汚染因子及び材料のロスを伴い、一般的には適度に自動化する必要がある。 一方、標識とシリカ上での精製とを組み合わせると多くの利点があるが、これはまだ当業者の知るところではない。 第一の利点は、反応媒体中において標識反応とシリカ磁気ビーズ上での核酸の捕獲（例えば吸着による）とを同時に行うことができる本発明の方法によれば、標識効率は全く減少せず、従って、その標識も磁気シリカの存在による影響を受けないという点である。 第二の利点は、この方法は比較的、標識及び精製という別々の２工程を行う方法よりも操作が非常に早いという点である。 本発明の第三の利点は、標識された核酸をごく少量（約０．１〜１０μｌ）まで濃縮することができ、核酸がビーズに付着していて、かつ、溶出バッファーを使用しなくても単純で標準的なハイブリダイゼーションバッファーによる溶出が可能であるという点である。 従って、希釈工程を完全に省いて、かつ、方法の感度が改善されることによって、核酸がハイブリダイゼーション中に更に濃縮され得る。 さらに、この方法は、磁気ビーズの使用が順応的であり、かつ、過程（加熱、洗浄、溶出）が比較的単純であるために、容易に自動化することができ、これは第四の利点である。 特に、磁気ビーズを使用すれば、ビーズの使用量を単純に変えるだけで、系の捕獲キャパシティーを非常に容易に変えることができる。 この方法は、連続的に流動させる系においても使用することができ、これによって、洗浄工程を単純化することができる。 この方法では、液体をピペットで移すことはない。 この方法の第五の利点は、実際、固体状の核酸を移すことができ、言いかえれば、シリカ磁気ビーズ上に吸着させることができ、これによって、近年急速に進歩している技術であるマイクロコンポーネント（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）において容易に利用できるという点である。 最後に、第六の利点は、特に、方法の自動化（上述：第四の利点）にも関連するが、この方法によれば、核酸の精製から、標識、チップ上のハイブリダイゼーションまでを、１本のチューブの中で完全に統合できるということであるが、言うまでもなく、これは、増幅工程を必要としない方法の範囲内にこの方法が含まれる場合にあてはまる。 この方法によれば、汚染危険性が低減され、かつ、使用される使い捨て容器を減らすことにつながる。 本発明は本質的に、処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、以下： 本発明の第一の実施形態によれば、上記の標識及び精製方法は、処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなっていてもよく、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなっていてもよいということを特徴とする。 本発明の第二の実施形態によれば、上記の標識及び精製方法は、上記標識試薬が以下： また、本発明のこの第二の実施形態によれば、核酸断片の３'又は５'末端の標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した反応性基の付着によって実施できる。 また、本発明のこの第二の実施形態によれば、核酸断片の３'又は５'末端の断片化及び／又は標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した求核基、求電子性基又はハロゲン基の付着によって実施できる。 本発明のこの第二の実施形態の選択肢としての方法によれば、核酸の断片化は以下： いずれの実施形態においても、ＲＮＡ断片の３'又は５'末端の標識は、リボースの２'位、３'位又は環状２'−３'−モノリン酸塩位に結合するリン酸結合への分子Ｒ−Ｘの付着によって実施することができ、Ｒは標識からなり、Ｘは標識とＲＮＡの結合剤であり、例えば水酸基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシアミン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化フェニルメチル基、ヨウ化アセトアミド基又はマレイミド基等である。 いずれの実施形態においても、リン酸基の標識は、５−（ブロモメチル）フルオレセインを用いて実施することができる。 特定の実施形態によれば、本発明による標識及び精製方法は、標識試薬と核酸とを均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で接触させることができ、上記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（０）のものであることを特徴とする。 （式中、 この特定の実施形態によれば、上記標識試薬は式（１）のものであってよい。 （式中、 上記２つの特性によれば、上記試薬は式（２）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態の第一の変形形態によれば、上記試薬は式（３）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態の第二の変形形態によれば、上記試薬は式（４）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態の第一のものの別の変形形態によれば、上記試薬は式（２１）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態の第一のもののまた別の変形形態によれば、上記試薬は式（２２）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態の第一のものの更に別の変形形態によれば、上記試薬は式（２３）のものであってよい。 （式中、 上記試薬の上記２つの実施形態のすべての変形形態によれば、Ｒ ３及びＲ ４は、独立していてもよく、以下；Ｈ、ＮＯ ２ 、ＯＣＨ ３ 、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ３ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ３ −（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ） ４ −ＣＨ ２ −ＮＨ−Ｒ ２ ；を示し得る。 上記の実施形態の別の変形形態によれば、上記試薬は式（７）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のまた別の変形形態によれば、上記試薬は式（２４）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬の構造Ｒ ２ −（Ｌ） ｎ −は式（５）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（６）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２５）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（１４）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２６）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（１５）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２７）のものであってよい。 （式中、 上記の実施形態の変形形態の全体によれば、上記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含んでいてよい。 一番最初の２つの実施形態によれば、上記標識試薬は、一本鎖又は二本鎖の核酸の標識及び断片化を、以下の工程： （式中、 上記実施形態によれば、上記標識試薬は式（２０）の化合物から選択され得る。 （式中、 （式中、 上記方法の一変形形態によれば、Ｚ基は以下からなっていてよい。 上記方法の別の変形形態によれば、断片化及び標識は２工程で実施することができる。 上記方法の別の変形形態によれば、断片化及び標識は１工程で実施することができる。 上記方法の別の変形形態によれば、標識は本質的に水性の均質溶液中で実施することができる。 上記方法の別の変形形態によれば、断片化は酵素的、物理的又は化学的手段によって実施することができる。 最初の２つの実施形態によれば、上記標識試薬は、本質的に水性のバッファー中で均質溶液中で接触していてよく、上記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（８）のものである。 （式中、 上記実施形態の一変形形態によれば、上記試薬は式（９）のものであってよい。 （式中、 上記２つの実施形態によれば、上記試薬の式中、ｐはｍより小さくてもよいし、ｍと同じであってもよい。 上記３つの実施形態によれば、上記試薬は式（１０）のものであってよい。 （式中、 上記４つの実施形態によれば、上記試薬は式（１１）のものであってよい。 （式中、 上記試薬の一実施形態によれば、Ｒ ２は式（１２）のＤ−ビオチン残基からなっていてよい。 上記試薬の上記６つの実施形態によれば、Ｒ １はＣＨ ３を含み、Ｒ ３及びＲ ４はそれぞれＨを表す。 上記７つの実施形態によれば、上記試薬の構造−（Ｌ） ｎ −は以下： 最初の２つの実施形態によれば、加熱に対して安定な上記標識試薬は、水性バッファー中で均質溶液中で接触していてよく、かつ、式（１３）のものである。 （式中、 上記実施形態の一変形形態によれば、上記試薬は式（１６）のものであってよい。 （式中、 上記１０つの実施形態によれば、上記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ ２ ）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含んでいてよく、従って−Ｚ−は−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−で表すことができる。 いずれの実施形態においても、上記固体支持体はシリカ粒子からなっていてよい。 いずれの実施形態においても、上記固体支持体はシリカで覆われた磁性粒子からなっていてよい。 上記２つの実施形態によれば、固体支持体を有するシリカ粒子は、粒子径が０．１〜５００μｍ、好ましくは１〜２００μｍであってよい。 いずれの実施形態においても、標識を可能にする添加成分のうちの１つは、アルコール、好ましくはイソプロパノールからなっていてよい。 上記実施形態によれば、イソプロパノールは最終混合物の７０％（ｖ／ｖ）含まれていてよい。 いずれの実施形態においても、細胞放出を可能にすることによって固体支持体上への核酸の吸着を可能にする添加成分の１つは、カオトロピック薬剤からなっていてよい。 上記実施形態によれば、使用される上記カオトロピック薬剤は、グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素、又は、これらの化合物の混合物であってよい。 上記実施形態によれば、使用されるグアニジウム塩は、（イソ）チオシアン酸グアニジウムであってよい。 いずれの実施形態においても、固体相−核酸複合体は、堆積させて上清を除去した後、カオトロピック物質を含む洗浄バッファーで複合体を洗浄することによって、液体から分けることができる。 上記実施形態によれば、固体相−核酸複合体は、洗浄バッファーで洗浄した後、１種又は数種の有機溶媒で再び洗浄し、その後乾燥させることができる。 上記実施形態によれば、固体相−核酸複合体中に存在する核酸は、複合体を洗浄及び乾燥させた後で、溶出バッファーを使用して溶出することができる。 いずれの実施形態においても、こうして得られた固体相−核酸複合体は、核酸を増幅するための成分を含む混合物を上記固体相に付着させて、あるいは、そこから溶出して、この混合物と接触させることができる。 いずれの実施形態においても、インキュベート工程は、処理サンプルを５〜４５分間、好ましくは１５〜３５分間、さらに好ましくは２５分間、温度４５〜８５℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６５℃で維持することを含んでよい。 上記実施形態によれば、インキュベート工程の後、上記サンプルは、少なくとも数分間、好ましくは５分間で室温に戻すことができる。 「多量体構造」という用語は、化学的又は生物学的なシントンの繰り返し単位から形成される重合体を意味するものとする。 国際公開第０２／０９０３１９号パンフレットの明細書の実施例３４．２に一例が記載されている。 当業者は、以下で展開される情報が、本件を完全に理解するのに不十分であると思ったならば、この文献を参照する必要がある。 本発明において利用できる構造体の多くの改変型、例えば、以下のもの等が知られている。 ・線状重合体（欧州特許出願公開第０５６１７２２号明細書、欧州特許出願公開第０６６９９９１号明細書）、 「検出用標識」という用語は、検出可能なシグナルを直接的に生成することができる少なくとも１つの標識を意味するものとする。 例えば、ビオチンは、後に標識ストレプトアビジンと組み合わせることができる場合であっても、検知可能であることから、直接標識と見なされる。 これらの標識の非限定的な一覧は以下の通りである。 本発明の特定の実施形態において、上記標識は電気化学的に検出可能であり、具体的には、上記標識はフェロセン等の鉄錯体の誘導体である。 「核酸」という用語は、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、又は、その他ハイブリダイゼーションを可能にする任意の修飾塩基等の修飾塩基を含む、少なくとも１つのヌクレオチド等の、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを任意に含み得る、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの鎖を意味するものである。 また、このポリヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート若しくはアルキルホスホネート等のヌクレオチド間結合のレベルで、又は、例えば、アルファ−オリゴヌクレオチド（仏国特許出願公開第２６０７５０７号明細書）若しくはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１８９５−１８９７，１９９２）若しくは２'−Ｏ−アルキルリボース及びＬＮＡ （ＢＷ， Ｓｕｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１６０−４１６９， ４３， ２００４）等の、骨格のレベルで修飾することができる。 核酸は、天然若しくは合成のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、又は、以下のような酵素的増幅技術によって得られる核酸であってよい： これらの修飾物のそれぞれは、少なくとも１つのリン酸塩が核酸に存在するかぎり、組み合わせることができる。 「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸の鎖を意味するものとする。 「精製工程」という用語は、具体的には、微生物、及び、核酸精製に先行する溶解工程で放出される細胞構成成分から核酸を分離することを意味するものである。 これらの溶解工程はよく知られており、一例としては、以下の特許出願に記載されている溶解法を用いることができる： 一般的に、この工程によって、核酸を濃縮することが可能となる。 例として、磁性粒子を用いることができ（この点については、米国特許出願公開第４６７２０４０号明細書及び米国特許出願公開第５７５０３３８号明細書参照）、従って、これらの磁性粒子に付着した核酸を洗浄工程により精製することが可能となる。 この核酸精製工程は、前記核酸を引き続き増幅したい場合に、特に有利である。 これらの磁性粒子の特に興味深い実施形態は、国際公開第９７／４５２０２号パンフレット及び国際公開第９９／３５５００号パンフレットに記載されている。 本明細書で用いられている「固体支持体」という用語は、核酸が付着することができるすべての物質を含む。 場合によっては化学的に修飾されていてもよいが、合成された物質又は天然物質を固体支持体として使用することができ、具体的には、例えば紙等、セルロースを用いる材料、セルロースアセテート若しくはニトロセルロース等のセルロース誘導体、又は、デキストラン等のポリサッカライド；ポリマー、具体的にはスチレン型モノマーを用いたコポリマー、綿等の天然繊維、及び、ナイロン等の合成繊維；シリカ、水晶、ガラス、セラミックス等の無機材料；ラテックス；磁性粒子；金属誘導体、ゲル等が、固体支持体として用いられる。 固体支持体は、微量滴定用プレート、膜、粒子、又は、実質的に平面のガラス若しくはシリコンのプレートという形であってもよく、又は、派生物でもよい。 添付の実施例は、具体的な実施形態を代表するものであって、本発明の範囲を制限するものと見なすべきではない。 ＜ＰＣＲ増幅産物の固体相上における標識及び開裂、これに続くアフィメトリックス製チップ上の分析＞ この名前は、結核菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の断片に由来する１８０塩基配列の、ＰＣＲによる増幅産物を指す。 結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の培養及び抽出、並びに、増幅プライマーに関する条件は、Ａｌａｉｎ Ｔｒｏｅｓｃｈの文献（”Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙｓ” ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９９， ３７， ｐａｇｅｓ ４９ ｔｏ ５５）中に記載されている。 ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ（ＰＣＲによりコピー数１０ ３ ）の組織標本を出発鋳型とし、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（スイス バーゼル）、照会Ｎｏ．： ０３ ５５３ ４２６ ００１）により、デソキシリボヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）それぞれを０．２ｍＭ、プライマー０．３μＭ、及び、酵素０．４μＬを使用して実施される。 ＰＣＲサイクルのパラメータは以下の通りである：９５℃４分間、その後、次のプロトコルに従って３５サイクル：９５℃３０秒間、次に５５℃３０秒間、最後に７２℃３０秒間。 その後、混合物を４℃で保持して、系を停止させる。 上記ＰＣＲによって得られる増幅産物は、用語「１６Ｓ ＰＣＲ」として下記に参照される。 Ｂ − 均質相（コントロール）中における標識均質相中における標識は、本発明の参照技術として使用され、「コントロール」と呼ぶこととする。 キット中の増幅バッファー中で１／５に希釈した１６Ｓ ＰＣＲの容量５０μＬを、メタビオチンフェニルメチルジアゾメタン（以下で「ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ」と呼ぶ）（以下で「ＤＭＳＯ」と呼ぶジメチルスルホキシド中に５０ｍＭ）７５μＬ及びＨ ２ Ｏ １０２．５μＬと混合し、その後、９５℃で２５分間インキュベートする。 その後、０．１Ｍ ＨＣｌ ２２．５μＬを反応媒体に添加し、続いて９５℃で５分間再びインキュベートする。 その後、ＱＩＡＱｕｉｃｋキット（キアゲン社（ドイツ ヒルデン）、照会Ｎｏ．２８ ３０６）を供給元のプロトコルに従って使用して反応媒体を精製し、続いてＤＮＡチップ（アフィメトリクス社、カリフォルニア州サンタクララ）上にハイブリダイズさせる。 ＤＮＡチップは、結核菌の１６Ｓ ＤＮＡのＭ２０９４０配列（ＧｅｎＢａｎｋ照会Ｎｏ．）の２１３−４１５領域を分析するためのものを使用する。 このＤＮＡチップは、対応するハイブリダイゼーションプロトコルと共に、Ａ． Ｔｒｏｅｓｃｈらの文献中に記載されている（”Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｉｆａｍｐｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙｓ” ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９９， ３７， ｐａｇｅｓ ４９ ｔｏ ５５）。 Ｃ − 不均一相中における標識及び開裂並行して、下記に記載されるプロトコルによって、ＰＣＲ産物を処理する。 （パラグラフＢ中に記載されるコントロールと同量のＰＣＲ産物を使用するために）ＰＣＲ産物の容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）２５μＬ、０．２Ｍ ＨＣＬ ５μＬ、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ（メルク社（ドイツ ダルムシュタット）、照会Ｎｏ．１．０１１９３．０００１）２０μＬと混合する。 この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。 その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ ２ Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー（溶出バッファー、キアゲン社、照会Ｎｏ．１９０８６）１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー（６Ｘ ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ 、６ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４））及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０５％（ｖ／ｖ）を混合したもので溶出する。 このバッファーは、上記パラグラフ中に記載したＡ． Ｔｒｏｅｓｃｈらの文献中に記載されるプロトコルに従って調製され、コントロールに対する条件を再現する。 Ｄ − 結果と結論相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表１中にまとめる。 表１：本発明を使用する方法、及び、本発明を使用しないコントロールにおける、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の比較 結論として、本発明による反応方法で得られた結果は、別個の２工程（精製及び標識）を用いる「より古典的な」方法で得られた結果と類似している。 さらに、この反応方法は、固体相上の標識及び開裂にかかる時間が約５０％も短縮され、非常に短い（すなわち、３０分から１５分になる）。 また、強度の測定値が実際に同じであることも分かる。 このことから、２通りの精製方法（ＱＩＡｑｕｉｃｋ又は磁気ビーズ）のいずれを用いても精製収率が同様であることが示される。 ＜２つのビオチン基を有する標識分子の存在下における固体相上の標識及び開裂＞ その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを供給元のプロトコルに従って使用して反応媒体を精製し、続いて、実施例１と同様の方法でＤＮＡチップ（アフィメトリクス社（カリフォルニア州サンタクララ））上にハイブリダイズさせる。 Ｂ − 不均一相中における標識及び開裂並行して、１／１０に希釈した同じＰＣＲ産物を、別のプロトコルによって処理する。 ＰＣＲ産物の容量５０μＬを、ＤＭＳＯ中の１９０ｍＭ ｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭ３９．５μＬ、０．４Ｍ ＨＣＬ ５μＬ、イソプロパノール１７５μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、ＤＭＳＯ ６．５μＬ、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬの残りと混合する。 この混合物を、８０℃で１５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。 その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ ２ Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー（上記参照）１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー４００μＬを混合したもので溶出する。 ハイブリダイゼーションは、実施例１と同様の方法で実施される。 Ｃ − 結果と結論相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表２中にまとめる。 表２：本発明を使用する方法、及び、本発明を使用しないコントロールにおける、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の比較 結論として、本発明による反応方法で得られた結果は、希釈ＰＣＲ産物に対してｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭを使用した場合に、別個の２工程（精製及び標識）を用いる「古典的な」方法で得られた結果より良好である。 また、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭより可溶性が高くてビオチン基を２つ有するこの分子を使用することによって、固体支持体上での標識を用いる試験の感度を改善できる。 これについては、強度値（Ｉ）及び信号対雑音比（Ｉ／Ｎ）が「古典的な」方法と比較して改善されていることが認識できる。 従って、反応方法及びｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭを使用することによって、少ないコピー数についてロバスト検定を実施することができる（強度値が高く、試験間での差異に対する感度が低い）。 ＜固体相上のＰＣＲ増幅産物の標識、これに続くアジレント社製チップ上の定量分析＞ 細胞培養由来の上清の容量１５μＬ中に含有される肝炎（ＨＢＶ）ＤＮＡの約１０ ３コピーを、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（スイス バーゼル）、照会Ｎｏ．１７３２６４１）を使用して、ＰＣＲによって増幅する。 ここで、キット中で使用される最終反応媒体は、ＭｇＣｌ ２ １．５ｍＭ、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、及び、Ｔａｑ及びＰｏｗ ＤＮＡポリメラーゼの混合物２．６ユニットを含む；プライマーＰ１及びＰ２ ０．３μＭ（配列は以下： ＰＣＲについての上記記載は、文献中に記載されている（Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｓ．ら、”Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｐｅｒｍｉｔｓ ｒａｐｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９５， ｐａｇｅｓ ５４３７ ｔｏ ５４４４）。 このＨＢＶ ＰＣＲを使用すれば、ｍｙｃｏモデルのものよりずっと長い核酸配列（ｍｙｃｏ １６Ｓでは１８０であるところ、３２００塩基）に作用するＰＣＲを使用することができ、これによって、２つの全く異なるモデル上における磁気ビーズの捕獲率を研究することができる。 Ｂ − 捕獲率の測定実施例１中に記載する方法と同様に増幅したマイコプラズマ結核の１６Ｓ遺伝子の一部のＰＣＲ増幅産物と、並行してＨＢＶ ＰＣＲ産物とを、次の方法で処理する。 ＰＣＲ産物の容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）、Ｈ ２ Ｏ ５μＬ、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬと混合する。 この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。 その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ ２ Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー５０μＬで溶出する。 並行して、同じＰＣＲ溶液を同じプロトコル（イソプロパノールをＨ ２ Ｏで置き換える）に従って標識し、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋプロトコルに従って精製して、最終容量５０μＬ中に溶出する。 精製物質、及び、最初のＰＣＲ産物を、ＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒ ２１００（アジレント社（米国カリフォルニア州パロアルト）、照会Ｎｏ．Ｇ２９４０ＣＡ）を使用して、供給元のプロトコルに従って分析し、これらを定量する。 Ｃ − 結果と結論得られた値を、下記表３中に示す。 表３：先行技術の古典的方法と本発明による方法との、反応媒体中の核酸の捕獲率の比較 結論すると、これらの結果と、チップ上で得られた結果とから、反応媒体中への核酸の再有利が少ないことが示される。 ＱＩＡｇｅｎキットに関して、捕獲の大部分は小断片上で生じるため、ハイブリダイズした開裂物質と共に使用することができる（ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションにはＰＣＲ産物の開裂が必要な場合がある（例えば、Ｚｈａｎｇ Ｙ．ら、”Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｂｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ”， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００１， ２９， ｅ６６参照）。本例中に示す結果によれば、磁気ビーズと共に使用するプロトコルによって、大きさが広範囲に渉る断片を捕獲可能であるということが示され得る。これによって技術の順応性が高くなる、というのは、大きさが非常に広範囲に渉るＰＣＲ産物から、開裂の改変によって、特別の技術的拘束もなく、使用目的に好適な大きさの標識ＤＮＡ断片を得ることができるからである。 ＜ゲノムＤＮＡの固体相上における標識及び開裂、これに続くアフィメトリックス製チップ上の分析＞ 「Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐｓ ５００」イオン交換カラム（キアゲン社、照会Ｎｏ．１０２６２）上で供給元のプロトコルに従ってｇＤＮＡを精製し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量する。 Ｂ − ｇＤＮＡの標識及びハイブリダイゼーション細菌ゲノムを約１０ ９コピー含むｇＤＮＡの容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ ２５μＬ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）、酢酸ナトリウム５μＬ（ｐＨ＝３）、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬ（メルク社）と混合する。 この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。 その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ ２ Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー４００μＬを混合したもので溶出する（テトラメチルアンモニウムクロリド ３Ｍ、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ、ｐＨ７．８：０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、アセチル化ウシ血清アルブミン５００μｇ／ｍＬ、及び、ニシン精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍＬ）。 このバッファーは、アフィメトリクス社提供のユーザーマニュアル中のプロトコルに従って調製する（ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｒｒａｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）。 この混合物を、１６Ｓ遺伝子を分析するためのアフィメトリクス社製チップ上でハイブリダイズさせ、その特性及び操作プロトコルは文献中に記載される（Ｇ． Ｖｅｒｎｅｔら、”Ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２００４， ９６， ｐａｇｅｓ ５９ ｔｏ ６８、並びに、Ｃ． Ｊａｙら、”１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｒｒａｙ”， １０ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ， Ｔｓｕｋｕｂａ， ｏｆ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２）。 Ｃ − 結果と結論相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表４中にまとめる。 表４：本発明を使用するｇＤＮＡ処理方法についての、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の結果 結論として、この結果は非常に良好である。 相同％が９３％であることにより、分析された細菌種を理想的な方法で識別でき、かつ、チップ上で識別可能な他の種からこれらを区別することができる。 標識ＤＮＡの精製に使用するものと同じ磁気ビーズ上でｇＤＮＡを精製できることが分かったため、プロトコルの全体（細菌コロニーから、ＤＮＡのハイブリダイズ準備まで）を１本のチューブ中で実施して、手動で又は自動装置中で処理することができる。 本発明の観点から見て同様の結果が、ＲＮＡアンプリコンを直接生成するＮＡＳＢＡ又はＴＭＡ等の他の増幅技術を用いても得ることができる。 |
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