在一个反应容器中标记和纯化存在于要处理的生物学样品中的感兴趣核酸的方法

本发明涉及在存在至少一种固体支持物的条件下标记核酸的方 法。

现有技术状况表明，有很多方法可用于标记核苷酸，寡核苷酸或 核酸。

第一种方法包括将标记结合在碱基上，无论所述碱基是天然的或 修饰过的。第二种方法提出将标记结合在糖上，同样，无论糖是天然 的或修饰过的。第三种方法的目的是将标记结合在磷酸上。

在碱基上进行标记被特别用于通过掺入直接标记过的核苷酸的核 酸标记方法中。

对糖进行标记的方法通常被用于通过化学合成制备的核酸探针的 场合。

对磷酸的标记还被用于在寡核苷酸的化学合成期间导入官能化的 臂和标记。

实际上，本领域技术人员在必须对核苷酸进行标记，或者对核苷 酸类似物或核酸进行标记时，倾向于将标记结合在碱基或结合在糖上， 这样可以提供更大的方便性和更多的选择。另外，这是根据对多份文 件的研究得出的结论，如EP-A-0.329.198，EP-A-0.302.175， EP-A-0.097.373，EP-A-0.063.879，US-A-5,449,767，US-A-5,328, 824，WO-A-93/16094，DE-A-3.910.151，EP-A-0.567.841(用于碱基 标记)或EP-A-0.286.898(用于糖类标记)。

将标记结合在磷酸上的技术是比对碱基或糖进行官能化的技术更 为复杂的技术，特别是考虑到磷酸的低反应性，其应用比后两者少得 多(例如，参见Jencks W.P.et al.，J.Amer.Chem Soc.，82， 1778-1785，1960)。同样，O’Donnel和McLaughlin的综述(“Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure”，p216-243， “Bioorganic Chemistry：Nucleicacids”，Ed Hecht S.M.，Oxford University Press，1996)涉及将探针导入寡核苷酸片段的方法，核 苷酸间磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。

专利申请WO-A-99/65926披露了标记合成的或天然的核糖核酸 (RNA)的方法，该方法包括断裂RNA，并且在末端磷酸进行标记。该 文献披露了可以与断裂组合用于标记的一定数量的官能团，如羟基， 胺，肼，烷氧基胺，烷基卤，苄型烷基卤基团，特别是5-(溴甲基) 荧光素衍生物。这些官能团使得能够标记核酸，但是，必须包括断裂 步骤，以便进行有效的标记，因为这种标记是在所述断裂期间释放出 来的磷酸上发生的。另外，相对RNA来说，必须添加多出很多的标记 试剂，以便实现有效的标记，这会产生由多余的标记导致的背景噪声 问题。最后，该方法对双链DNA不那么有效。

业已出现了在标记产率方面更有效的新型试剂。就标记位置来说， 这些试剂是特异性的，特别是它们不影响通过氢键形成双螺旋中涉及 的碱基的杂交特性，所述试剂对于DNA和RNA均可利用，最后，其使 得可以标记核苷酸，寡核苷酸和核酸，无论它们是天然的或通过酶促 扩增方法制备的，都同样有效。

申请人业已提出这种新的标记，它满足了上述条件，并且使用重 氮基甲基作为反应基进行所述标记。例如参见以下文献：

●专利申请WO-A-02/090319，

●专利申请WO-A-02/090584，

●申请日为2004年3月26日的尚未公开的法国专利申请： FR04/50600，名称为：“Réactifs de marquage，procédés de synth èse de tels réactifs et procédés de detection de molecules biologiques”或还可以参见

●Laayoun et al.发表在Bioconjugate Chem.2003，14，1298-1306 的文章，标题为：“Aryldiazomethanes for Universal Labeling of Nucleic Acids and Analysis on DNA Chips”，读者可以参考该文 章，以便更好地理解所述成分的合成和使用方法。

上面所列举的文献的内容被收作本文参考。

现有技术状况还披露了在导致通过特异性杂交进行检测的方法 (涉及DNA芯片，还有ELOSA平板或快速测试类型)中，在标记之前 和之后利用固定支持物，特别是二氧化硅，更特别是粉末、凝胶或磁 性颗粒的形式，来纯化核酸。在标记之前进行纯化，使得能够显著提 高标记产率，而标记后纯化使得能够决定性地改善杂交产率和信噪 比，这是良好的测试灵敏度所必需的。

这正是专利EP-B-0.389.063中所披露的情况，该专利提出了用于 分离含有复杂的生物学原材料的核酸的方法，因此，该方法包括将所 述原材料与离液物质和固相混合，所述固相能够结合核酸，这些核酸 随后从由此形成的复合物的其余部分中洗去或洗脱。

该专利的内容同样被收作本文参考。

实际上，这两种技术是独立使用的，所述纯化和标记步骤是在不 同的一次性容器中完成的，操作方法同样是不同的。由于存在两个步 骤，因此必须转移液体，这是潜在的污染因素，会损失材料，并且通 常只可以中等地自动化。

另一方面，将标记和纯化组合在二氧化硅上进行的方法提供了多 种优点，到目前为止这些优点还没有受到技术人员的怀疑。

第一个优点是，根据本发明的方法，在反应介质中可以同时进行 所述标记反应和捕获，例如，通过将核酸吸附在二氧化硅的磁性小珠 上，不会导致标记效率的任何降低，因此，标记不会受到磁性二氧化 硅的存在的影响。

第二个优点是，比较而言，所述方法比以标记和纯化两个不同步 骤的方法更快速得多地进行。

本发明的第三个优点是，它能够将标记过的核酸浓缩在非常小的 0.1-10μl数量级的体积中，所述核酸结合在所述小珠上，并且能够 通过简单的标准杂交缓冲液洗脱，而不依赖于洗脱缓冲液。因此，完 全可能取消该稀释步骤，并且提高该方法的灵敏度，在杂交期间核酸 更为浓缩。

另外，由于使用磁性小珠的灵活性，以及该方法的相对简单性(加 热，洗涤，洗脱)，该方法能方便地自动化，这构成了本发明的第四 个优点。所述磁性小珠的使用特别使得能够非常容易地改变该系统的 捕获能力，只需要简单地改变所使用的小珠数量。该方法还可应用于 使用连续流体的系统中，使得能够简化洗涤步骤。因此，不需要进行 移液操作。

该方法的第五个优点在于以下事实，它能够以固体形式转移核酸， 换句话说，被吸附在二氧化硅的磁性小珠上，这使得它能够方便地用 于微量成分，这是一项目前正在快速发展的技术。

最后，第六个优点，该优点同样与该方法的自动化(所述的第四 个优点)相关，在于可以完全整合在一个试管中的方法，从核酸纯化 到在芯片上杂交，通过标记通行，当然，如果这是不需要扩增步骤的 方法的情况下。这导致了污染风险的降低，并且减少了所使用的一次 性容器的数量。

本发明实际上涉及标记和纯化存在于要处理的生物学样品中的感 兴趣核酸的方法，该方法包括：

●获取单一一个反应容器，

●将以下物质导入所述反应容器：

-所述生物学样品，

-用于标记核酸的至少一种试剂，

-能够吸附所述核酸的至少一种固体支持物，

-用于标记所述核酸和/或用于将所述核酸固定在所述支持 物上所必需的任何成分，

●温育所述反应容器的内容物，和

●分离由此标记的核酸。

根据本发明的第一种具体实施方式，上述标记和纯化方法的特征 在于，所处理的核酸可以由单链和/或双链，合成的和/或天然的DNA 和/或RNA组成。

根据本发明的第二种具体实施方式，上述标记和纯化方法的特征 在于所述标记试剂可以使得：

-所述核酸以非特异性方式断裂，以便产生多个核酸片段，和

-多个这些片段在位于3′和/或5′端的末端磷酸上被标记，所述 末端磷酸在所述断裂期间释放出来。

仍根据本发明的这第二种具体实施方式，核酸片段的3′或5′端的 标记可以通过将标记所携带的反应基结合在2′位置、3′位置或环 2′-3′-一磷酸位置上的磷酸而进行，所述位置是相对核糖而言的。

再根据本发明的这第二种具体实施方式，所述断裂和/或核酸片段 的3′或5′端的标记可以通过将标记所携带的亲核的，亲电子的或卤素 基团结合在2′位置、3′或环2′-3′-一磷酸位置上的磷酸而进行，所述 位置是相对核糖而言的。

根据实施本发明的这第二种具体实施方式的可选方式，所述核酸 的断裂可以通过以下方式进行：

-酶促方式(核酸酶)，

-化学方式(金属离子，如Mg++，Mn++，Cu++，Co++和/或Zn++离子， 联合或者不联合化学催化剂，例如N-甲基咪唑，或对RNA具有亲和力 并且具有咪唑核或经取代的类似物的任何化学分子)或

-物理方式(声处理或辐射)。

无论何种实施方式，RNA片段的3′或5′端的标记可以通过将分子 R-X结合到核糖的2’位置、3′位置或环2′-3′-一磷酸位置上结合的 磷酸而进行，其中，R由所述标记组成，而X是所述标记和RNA之间 的结合剂，如，羟基，胺，肼，烷氧基胺，烷基卤，苯基-甲基卤，碘 乙酰胺或马来酰亚胺基团。

无论何种实施方式，在磷酸基团上的标记可以通过5-(溴甲基) -荧光素进行。

根据一种具体实施方式，本发明的标记和纯化方法特征在于所述 标记试剂可以在实质上水性的缓冲液中与均相溶液中的核酸接触，所 述标记试剂对热稳定，并且具有结构式(0)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u是0-2的整数，优选0或1，和

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-。

根据这种具体实施方式，所述标记试剂可以具有结构式(1)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基，和

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-。

根据上述两种特征，所述试剂可以具有结构式(2)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式的第一种形式，所述试剂可以具有结构式 (3)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式的第二种形式，所述试剂可以具有结构式 (4)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式中第一种的另一种形式，所述试剂可以具 有结构式(21)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式中第一种的另一种形式，所述试剂可以具 有结构式(22)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式中第一种的另一种形式，所述试剂可以具 有结构式(23)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基。

根据上述两种实施方式的所有形式，所述试剂中，R3和R4可以彼 此独立表示：H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2 或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2。

根据上述实施方式的另一种形式，所述试剂可以具有结构式(7)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，和

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数。

根据上述实施方式的另一种形式，所述试剂可以具有结构式(24)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，和

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂的结构R2-(L)n-可 以具有结构式(5)：

其中：

●R2表示可检测标记，

●m是1-100的整数，和

●p是1-10的整数。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(6)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2， R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，和

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(25)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2， R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(14)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，和

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(26)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(15)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，和

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数。

无论上述实施方式的哪一种形式，所述试剂可以具有结构式(27)：

其中：

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u等于1，和

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数。

根据上述实施方式的所有形式，所述试剂的成分L可以包含- (O-CH2-CH2)-部分，重复1-20次，优选1-10次，更优选2-5次。

按照最先的两种实施方式，所述标记试剂可以使得按照以下步骤 对单链或双链核酸进行所述标记和断裂：

-断裂所述核酸，

-通过选自具有结构式(19)的化合物的标记试剂，将标记结合 到至少一个片段上：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，和

●Z包含可检测标记，

所述试剂是共价偶联的，并且主要偶联到所述片段的至少一个磷 酸上。

按照上述实施方式，所述标记试剂可以选自具有结构式(20)的 化合物：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2是可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的至 少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂而n等于0或l，和

●Z选自：

或 或 或

其中：

■R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR或COOR，其中，R＝烷基或芳基，和

■-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-。

按照一种实施方式，基团Z可以由以下组成：

按照另一种实施方式，所述断裂和所述标记可以以两个步骤进行。

按照另一种实施方式，所述断裂和所述标记可以在一个步骤中进 行。

按照另一种实施方式，所述标记可以在均相的，实质上水性的溶 液中进行。

按照另一种实施方式，所述断裂可以通过酶促，物理或化学方式 进行。

按照最先的两种实施方式，所述标记试剂可以在实质上水性的缓 冲液中在均相溶液中接触，所述标记试剂对热稳定，并且具有结构式 (8)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)，-(O-CH2-CH2) 3-CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u是0-2的整数，优选0或1，

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-，

●-Z-表示-NH-，-NHCO-，-CONH-或-O-，

●m是1-10的整数，优选为1-3，和

●p是1-10的整数，优选为1-3。

按照上述实施方式的一种形式，所述试剂可以具有结构式(9)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3 -CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基，和

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-，

●m是1-10的整数，优选为1-3，和

●p是1-10的整数，优选为1-3。

按照上述两种实施方式，在所述试剂的结构式中，p可以小于或 等于m。

按照上述三种实施方式，所述试剂可以具有结构式(10)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3 -CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基，和

●q是1-10的整数，优选为1-3。

按照上述四种实施方式，所述试剂可以具有结构式(11)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，和

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3 -CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基。

按照一种实施方式，所述试剂中R2可以由具有结构式(12)的 D-生物素残基组成：

按照上述六种实施方式，所述试剂中，R1由以下组成：CH3，而R3 和R4各自表示：H。

按照上述七种实施方式，所述试剂的结构-(L)n-可以由以下组 成：

●精胺或N，N′-二(3-氨丙基)-1，4-二氨基丁烷： NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或

●亚精胺或N-(3-氨丙基)-1，4-丁二胺： H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或

●包含丙氨酸部分：NH2-CH2-CH2-COOH的衍生物。

按照最先的两种实施方式，所述对热稳定的标记试剂可以在含水 缓冲液中在均相溶液中接触，并且具有结构式(13)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3 -CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基，

●A是包括至少一个共价双键的连接臂，使得重氮基和芳香环能 够共轭，而u是0-2的整数，优选0或1，

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-，

●-Z-表示-NH-，-NHCO-，-CONH-或-O-，

●m是1-10的整数，优选为1-3，和

●p是1-10的整数，优选为1-3。

按照上述实施方式，所述试剂可以具有结构式(1 6)：

其中：

●R1表示H或烷基、芳基或经取代的芳基，

●R2表示可检测标记或通过至少一个多聚体结构连接在一起的 至少两个可检测标记，

●L是包括至少两个共价键的直链的连接臂，而n是等于0或1 的整数，

●R3和R4各自独立表示：H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-， OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3 -CH2-NH-R2，或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中，R＝烷 基或芳基，

●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-或-CH2S-，

●-Z-表示-NH-，-NHCO-，-CONH-或-O-，

●m是1-10的整数，优选为1-3，和

●p是1-10的整数，优选为1-3。

按照上述十种实施方式，所述试剂的成分L可以包含-(O-CH2-CH2) -部分，重复1-20次，优选1-10次，更优选2-5次，-Z-由-NH-， -NHCO-或-CONH-表示。

无论何种实施方式，所述固体支持物可以由二氧化硅颗粒组成。

无论何种实施方式，所述固体支持物可以由用二氧化硅覆盖的磁 性颗粒组成。

按照上述两种实施方式，构成所述固体支持物的二氧化硅颗粒的 粒度可为0.1-500μm，优选为1-200μm。

无论何种实施方式，可以允许进行所述标记的所述补充成分之一 可以由醇组成，优选异丙醇。

按照上述实施方式，异丙醇可以占最终混合物的70％v/v。

无论何种实施方式，能允许进行细胞释放并因此使核酸吸附到所 述固体支持物上的所述补充成分之一可以由离液剂组成。

按照上述实施方式，所使用的离液剂可以是胍盐，碘化钠，碘化 钾，(异)硫氰酸钠，尿素或上述化合物的混合物。

按照上述实施方式，所使用的胍盐可以是(异)硫氰酸胍。

无论何种实施方式，所述固相-核酸复合物可以通过沉淀和排出上 清液而与液体分离，然后用含有离液物质的洗涤缓冲液洗涤所述复合 物。

按照上述实施方式，在用洗涤缓冲液洗涤之后，所述固相-核酸复 合物可以用一种或几种有机溶剂再次洗涤，然后进行干燥处理。

按照上述实施方式，在所述复合物洗涤和干燥之后，存在于固相- 核酸复合物中的核酸可以通过洗脱缓冲液洗脱。

无论何种实施方式，由此获得的固相-核酸复合物可以与为扩增核 酸的目的而存在的成分的混合物接触，无论所述核酸是结合在所述固 相上，或者是从它上面洗脱。

无论何种实施方式，温育步骤可以包括在45-85℃，优选为55-75 ℃，更优选65℃的温度下将处理样品保持5-45分钟，优选15-35分 钟，更优选25分钟。

按照上述实施方式，在温育步骤之后，可以在至少几分钟内，优 选5分钟内将所述样品恢复到环境温度。

“多聚体结构”被理解为表示表示由化学或生物学合成子的重复 单元形成的聚合物。一种例子是在专利申请WO-A-02/090319中的实施 例34.2中引述。技术人员如果发现以下的信息对他/她完全理解该主 题不够充足的话，可以参考上述文献。已知多种形式的可应用在本发 明中的类似结构，例如：

●线性聚合物(EP-A-0.561.722，EP-A-0.669.991)，

●支化聚合物(WO-A-01/92361)，

●颗粒(EP-A-0827552)，

●树枝状聚合物(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6, 083,708)，

●多核苷酸，和

●多肽。

如果必要的话，技术人员还可以参考上述文献，以便全面地理解 该主题。

“可检测标记”被理解为表示能够直接产生可检测信号的至少 一种标记。例如，生物素的存在被认为是直接标记，因为它是可以检 测的，即使随后有可能将其与标记过的链霉抗生物素结合。这些标记 的非限定性的列表如下：

●能产生可检测信号的酶，例如，通过比色法，荧光或发光检测， 如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，

●生色团，如荧光，发光或着色化合物，

●具有电子密度的基团，可以通过电子显微术或通过电学特性检 测，如它们的导电性，电流分析，电压分析或阻抗，

●可检测的基团，例如，它们的分子大小足以导致它们的物理和/ 或化学特性发生可检测的变化，这种检测可以通过光学方法完成，如 衍射，表面等离子体共振，表面变异，接触角变化，或物理方法，如 原子力光谱学或隧道效应，

●放射性分子，如32P，35S或125I。

所述标记优选不是放射性标记，以便避免与这些标记相关的安全 性问题。

在本发明的具体实施方式中，所述标记是可以通过电化学方法检 测的，特别是，所述标记是铁复合物的衍生物，如二茂铁。

术语“核酸”表示至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的链， 可能包含至少一个修饰过的核苷酸，例如，至少一个这样的核苷酸， 其包含修饰过的碱基，如肌苷，甲基-5-脱氧胞苷，二甲基氨基-5-脱 氧尿苷，脱氧尿苷，二氨基-2，6-嘌呤，溴-5-脱氧尿苷或能够允许杂 交的任何其他修饰过的碱基。该多核苷酸还可以在核苷酸之间的连键 处进行修饰，例如，硫代磷酸酯，H-膦酸酯，或烷基-膦酸酯；在骨架 上进行修饰，如α-寡核苷酸(FR2607507)或PNA(M.Egholm et al.，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2’O-烷基核 糖和LNA(BW，Sunetal.，Biochemistry，4160-4169，43，2004)。 所述核酸可以是天然的或合成的，寡核苷酸，多核苷酸，核酸片段， 核糖体RNA，信使RNA，转移RNA，或通过酶促扩增技术获得的核酸， 所述技术如：

●PCR(聚合酶链式反应)，参见专利US-A-4,683,195，US-A-4, 683,202和US-A-4,800,159，及其衍生形式RT-PCR(逆转录PCR)， 特别是一个步骤的方案，参见专利EP-B-0.569.272，

●LCR(连接酶链式反应)，例如，参见专利申请EP-A-0.201.184，

●RCR(修复链式反应)，参见专利申请WO-A-90/01069，

●3SR(自动维持序列复制)参见专利申请WO-A-90/06995，

●NASBA(基于核酸序列的扩增)，参见专利申请WO-A-91/02818， 和

●TMA(转录介导的扩增)参见专利US-A-5,399,491。

●RCA(滚环扩增)，US-6,576,448。

术语扩增子被用于表示通过酶促扩增技术产生的核酸。

上述任何修饰可以组合使用，只要在核酸上存在至少一个磷酸即 可。

“多肽”被理解成表示至少两个氨基酸的链。

“氨基酸”被理解为表示：

●编码蛋白的基本氨基酸，

●通过酶促作用衍生的氨基酸，如反式-4-羟基脯氨酸，

●天然但不存在于蛋白中的氨基酸，如正缬氨酸，N-甲基-L亮氨 酸，和staline(参见Hunt S.，Chemistry and Biochemistry of the amino acid，Barett G.C.，ed.，Chapman and Hall，London，1985)， 和

●通过化学基团保护的氨基酸，可用于在固体支持物上或在液相 中的合成，以及非天然的氨基酸。

“纯化步骤”被理解为特别表示是从微生物中和从在核酸纯化之 前的裂解步骤中释放的细胞成分中分离核酸。这些裂解步骤是众所周 知的，例如，可以使用披露于以下专利申请中的裂解方法：

-WO-A-00/60049，声处理裂解，

-WO-A-00/05338，组合的磁性和机械裂解，

-WO-A-99/53304，电学裂解，和

-WO-A-99/15621，机械裂解。

技术人员能够使用其他众所周知的裂解方法，如热或渗透压休克 或用离液剂如胍盐处理(专利US-A-5,234,809)。

该步骤通常可以浓缩核酸。例如，可以使用磁性颗粒(关于这个 主题，可以参见专利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，并 且业已结合在所述磁性颗粒上的核酸由此可以通过洗涤步骤纯化。如 果需要随后扩增所述核酸的话，该核酸纯化步骤是特别感兴趣的。所 述磁性颗粒的特别感兴趣的实施方式可以参见专利申请 WO-A-97/45202和WO-A-99/35500。

本文所使用的术语“固体支持物”包括可以向其上结合核酸的所 有材料。可以进行化学改性的合成材料或天然材料，可以用作固体支 持物，特别是多糖，如基于纤维素的材料，例如，纸，纤维素衍生物， 如乙酸纤维素和硝酸纤维素，或葡聚糖，聚合物，共聚物，特别是基 于苯乙烯型单体的聚合物，天然的纤维，如棉，和合成纤维，如尼龙， 无机材料，如二氧化硅，石英，玻璃和陶瓷，胶乳，磁性颗粒，金属 衍生物，凝胶等。所述固体支持物可以是微量滴定平板，薄膜，颗粒 或者大体上扁平的玻璃或硅或衍生物的板的形式。

以下实施例代表了具体实施方式，而不能视为限定本发明的范围。

实施例1：PCR扩增产物在固相上的标记和裂解，然后通过 Affymetrix芯片分析：

A  Myco 16 S PCR：

该实验是在被称作“Myco 16S”的模型上进行的。

该名称表示通过PCR从180个碱基的序列制备的扩增子，所述序 列来自编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)16S核糖 体RNA的基因的片段。

培养和提取所述分枝杆菌的条件以及扩增引物由Alain Troesch. 在以下文献中披露：“Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays”，J.Clin.Microbiol.1999，37，49-55页。  

PCR是利用基因组DNA的制备物(通过PCR产生103个拷贝)作 为起始模板，用FastStart高保真PCR体系试剂盒(Roche Diagnostic Corporation，Basel，Switzerland，Reference No.：03553426001) 进行的，每一种脱氧核糖核苷酸0.2mM，引物0.3μM，酶0.4μL。

PCR循环参数如下：95℃ 4分钟，然后按照以下方案进行35次 循环：95℃ 30秒，然后55℃ 30秒，最后72℃ 30秒。然后将所述 混合物在4℃下保存直到该系统停止。

通过上述PCR得到的扩增子在下文被称作“16S PCR”。

B  在均相中标记(对照)：

在均相中的标记被用作相对于本发明的参照技术，并且被称作“对 照”。

将体积为50μL的以1/5在由试剂盒中提供的扩增缓冲液中稀释 的16S PCR与75μL的间-生物素-苯基甲基重氮基甲烷(以下称之为 “m-BioPMDAM”)(50mM，溶解在二甲基亚砜(以下称之为“DMSO”) 中)和102.5μL H2O混合，然后在95℃下温育25分钟。然后将22.5 μL的0.1M HCl添加到反应介质中，然后再次在95℃下温育5分钟。

然后使用QIAQuick试剂盒(QIAgen GmbH，Hilden，Germany. Reference No.：28306)采用供应商提供的方案纯化反应介质，然后 让它在DNA芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)上杂交。所使用的 DNA芯片是为了分析结核分枝杆菌的16S DNA的M20940序列(GenBank 保藏号)的213-415区域而设计的。该DNA芯片以及相应的杂交方案 披露于A.Troesch等的文章中：“Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays”，J.Clin.Microbiol.1999， 37，49-55页。

C  在异相中的标记和裂解：

同时平行地，按照下文所述方案对PCR进行处理。

将10μL体积的PCR(使所使用的PCR量与在段落B中所披露的 对照的量相同)与25μL的m-BioPMDAM(50mM，溶解在DMSO中)， 5μL的0.2M HCl，140μL的异丙醇(最终％＝70％v/v)，和20μL 的MagPrep磁性二氧化硅珠(Merck KGaA，Darms tadt，Germany. Reference No.：1.01193.0001)混合。

该混合物在65℃下温育25分钟，然后在环境温度下温育5分钟。 然后用250μL的7 0％异丙醇(30％v/v，溶解在H2O中)洗涤磁性残 余物三次，然后将吸附到二氧化硅上的核酸用100μL的EB缓冲液(洗 脱缓冲液，QIAgen.Reference No.：19086)的混合物洗脱，在它里 面添加了400μL的杂交缓冲液(6X SSPE(0.9M NaCl，60mM NaH2PO4， 6mM EDTA，pH7.4)和0.05％(v/v)的Triton X-100)。该缓冲液 是按照前面段落中所提到的A.Troesch等公开文献所披露的方案制备 的，以便重现用于所述对照的条件。

D  结果和结论：

在下面的表1中归纳了以百分同源性，信号强度(I)和背景噪声 (N)的形式提供的结果：

  实验   ％同源性     I     N   I/N   对照   99.3     3710     377   9.8   在固相上标记和裂解(发明)   99.3     4455     404   11.0

表1：使用本发明方法的百分同源性，信号强度(I)和背景噪声 (N)与不采用本发明方法的对照的比较性研究

总之，通过本发明的反应方法获得的结果与用以两个单独步骤即 纯化和标记的更“经典的”方法获得的结果相当。另外，当在固相上 进行标记和裂解时，反应过程短得多，时间缩短大约50％(例如，时 间为15分钟，而不是半小时)。

还发现，所测定的强度值实际上是相同的。这表明使用两种纯化 方法(QIAquick或磁性小珠)的纯化产率类似。

实施例2：在存在携带两个生物素基团的标记分子的条件下在固 相上标记和裂解：

A  在均相中标记(对照)：

将以1/10在扩增缓冲液中稀释的50μL体积的16S PCR(进行这 种稀释，是为了通过降低扩增子的浓度检验该试验的灵敏度)与溶解 在DMSO中的39.5μL的190mM N，N′-二(13-生物素酰(biotinoyl) 氨基-4，7，10-三氧杂-十三烷基)-5-(重氮基甲基)间苯二甲酰胺 (以下称之为“bisBioPDAM”)，110.5μL DMSO和15μL H2O混合， 然后在95℃下温育25分钟。然后将35μL的0.1M HCl添加到反应 介质中，然后在95℃下再温育5分钟。

然后用QIAquick试剂盒，使用生产商提供的方案纯化反应介质， 然后以与实施例1相同的方法在DNA芯片(Affymetrix，Santa Clara， CA)上杂交。

B  在异相中标记和裂解

同时平行地，按照另一种方案对以1/10稀释的相同PCR进行处 理。将50μL体积的PCR与溶解在DMSO中的39.5μL的190mM bisBioPDAM，5μL的0.4M HCl，175μL的异丙醇(最终％＝70％v/v)， 6.5μL的DMSO，和20μL的MagPrep磁性二氧化硅珠的残余物混合。

在80℃下温育该混合物15分钟，然后在环境温度下温育5分钟。 然后用250μL的70％异丙醇(30％v/v，溶解在H2O中)洗涤所述磁 性残余物三次，然后用100μL的EB缓冲液(参见上文)的混合物洗 脱吸附在二氧化硅上的核酸，向所述洗脱液中添加了400μL的杂交 缓冲液。杂交是用与实施例1相同的方式进行的。

C-结果和结论：

在下面的表2中归纳了以百分同源性，信号强度(I)和背景噪 声(N)形式提供的结果：

  实验   ％同源性   I   N   I/N   对照   99.1   1051   232   4.5   在固相上标记和裂解(发明)   99.1   4071   437   9.3

表2：使用本发明的方法的百分同源性，信号强度(I)和背景噪 声(N)与不使用该方法的对照的比较研究。

总之，通过本发明的反应方法获得的结果比用以两个单独步骤即 纯化和标记的更“经典的”方法获得的结果更好，其中使用了 bisBioPDAM，对稀释过的PCR进行。

该分子的溶解度比m-BioPMDAM更高，并且具有两个生物素基团， 也使得能够提高利用在固体支持物上进行标记的试验的灵敏度。这一 点可以通过强度值(I)以及信噪比(I/N)相对“经典的”方法提高 的改善看出。

所述反应方法和bisBioPDAM的使用，使得能够对较低拷贝数获 得坚实稳固的试验(高强度值，对试验之间变异的低敏感性)。

实施例3：在固相上对PCR扩增产物进行标记，然后在Agilent 芯片上进行定量分析：

A  HBV PCR

在下文中，术语“HBV PCR”表示来自乙型肝炎病毒的基因组的 3200碱基对片段的PCR扩增产物，它是用以下方法制备的。

通过PCR扩增包含在体积为15μL的来自细胞培养物的上清液中 的大约103个拷贝的肝炎(HBV)DNA，使用Expand高保真试剂盒 (Roche Diagnostic corporation，Basel，Switzerland.Reference No.：1732641)。

供参考，该试剂盒中使用的最终反应介质包含1.5mM的MgCl2， 200μM的每一种dNTP，和2.6单位的Taq和Pow DNA聚合酶的混合 物；将0.3μM的序列如下的引物P1和P2：

P1：5’-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCTAATCA-3’

P2：5’-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’，

添加到所述混合物中，以便能够扩增预期的3200核苷酸片段。

有关该PCR的说明可以参见Gunther S.et al.的文章：“Anovel method for efficient amp lification of whole hepatitis B virus genome permits rapid functional analysis and reveals deletion mutants in immunosuppressed patients”，Journal of Virology， September 1995，5437-5444页。

使用该HBV PCR，以便可得到作用于比myco模型长得多的核酸序 列的PCR(3200个碱基，而不是myco 16S的180个)，以便研究在两 种差别非常大的模型中磁性小珠的捕获产率。

B  捕获产率的测定：

按与实施例1所述相同方法扩增的Mycoplasma tuberculosis的 16S基因的一部分的PCR扩增产物，以及平行地HBV PCR产物，按以 下方式处理：

将10μL体积的PCR与25μL的m-BioPMDAM(50mM，溶解在DMSO 中)，5μL H2O，140μL异丙醇(最终％＝70％v/v)，和20μL的 MagPrep磁性二氧化硅珠混合。

在65℃下温育该混合物25分钟，然后在环境温度下温育5分钟。 然后用250μL的70％异丙醇(30％v/v，溶解在H2O中)洗涤所述磁 性残余物三次，然后用50μL的EB缓冲液洗脱吸附在二氧化硅上的 核酸。

同时平行地，按照相同的方案对相同的PCR溶液进行标记(用H2O 取代了异丙醇)，然后按照QIAquick方案纯化，并且以50μL的最 终体积洗脱。

使用供应商提供的方案，在BioAnalyser 2100(Agilent，Palo Alto，CA，Unites States of America，Reference No.：G2940CA) 上分析纯化产物和最初的PCR，以便对它们进行定量。

C  结果和结论：

所获得的值如下面的表3所示：

   起始     QIAgen     发明 HBV(ng/μL)     8.2     3.6     7.7 ％产率     44     94

Myco(ng/μL)     2.7     0.94     2.6 ％产率     35     9 6

表3：通过现有技术的经典方法和本发明方法在反应介质中核酸 捕获产率的比较。

总之，以上结果与在芯片上获得的结果表明，重新释放到反应介 质中的核酸的量很少。对于QIAgen试剂盒来说，所述捕获的主要部分 发生在较小尺寸的片段，这使得它可以用于杂交的裂解产物，在必须 裂解PCR产物的某些场合下在DNA芯片上杂交(例如，参见Zhang Y. et al.“Reproducible and inexpensive probe preparation for oligonucleotide arrays”，发表于Nucleic Acids Res.2001，29， e66)。在本实施例中所提供的结果可以显示，使用磁性小珠的方法 能够捕获更宽的片段大小范围。这使得这种技术具有更大的灵活性， 因为它可以通过改变裂解而从各种不同大小的PCR产物获得具有适合 预期应用的大小的标记过的DNA片段，而没有任何特殊的技术限制。

实施例4：在固相上标记和裂解基因组DNA，然后在Affymetrix 芯片上分析：

A  基因组DNA的制备：

所述基因组DNA在下面将被称作“gDNA”，是从在胰胨豆胨培养 基(bioMérieux，Marcy，France.Reference No.：41146)中培 养18小时的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的液体培养 物中提取的。

将所述gDNA按照生产商提供的方案在“Genomic Tips 500”离 子交换柱(QIAgen.Reference No.：10262)上纯化，并且通过测定 260nm波长下的吸光度进行定量。

B  gDNA的标记和杂交：

将含有大约109个拷贝的细菌基因组的10μL体积的gDNA与25μL 的m-BioPMDAM(50mM，溶解在DMSO中)，5μL的乙酸钠pH＝3， 140μL的异丙醇(最终％＝70％v/v)，和20μL的MagPrep磁性二 氧化硅珠(Merck)混合。

该混合物在65℃下温育25分钟，然后在环境温度下温育5分钟。 然后用250μL的70％异丙醇(30％v/v，溶解在H2O中)洗涤所述磁 性残余物三次，然后用100μL的EB缓冲液混合物洗脱吸附在二氧化 硅上的核酸，在所述洗脱液中添加了400μL的杂交缓冲液(3M氯化 四甲基铵，10mM Tris，pH7.8，0.01％Tween-20，500μg/mL乙酰 化的牛血清白蛋白，和100μg/mL鲱鱼精子DNA。该溶液是按照 Affymetrix在它的用户手册中提供的方案制备的：CustomSeq resequencing Array protocol Version 2.0)。

将该混合物杂交在Affymetrix芯片上，该芯片是为了分析16S 基因而设计的，它的特征和操作方案可以参见以下文章：G.Vernetet al.“Species differentiation and antibiotic susceptibility testing with DNA microarrays”，J.Appl.Microbiol.，2004， 96，59-68页，和C.Jay et al.“16S rRNA gene-based identification of Staphylococcus species using high density DNA probe array”， 10th international Symposium on staphylococci and Staphylococcal infections，Tsukuba，October 2002。

C  结果和结论：

在下面的表4中提供了以百分同源性，信号强度(I)和背景噪声 (N)形式给出的结果：

  实验     ％同源性     I     N     I/N   在固相上标记和裂解(发明)     92.9     2799     599     4.7

表4：利用本发明的gDNA处理方法的百分同源性，信号强度(I) 和背景噪声(N)结果

总之，该结果是非常令人满意的。93％的百分同源性使得能够以 理想的方式鉴定被分析的细菌种类，并且可以将其与能够在芯片上鉴 定的其他菌种区分。

由于能够在与用于纯化经标记的DNA相同的磁性小珠上纯化 gDNA，整个方法可以在一个相同的试管中完成(从细菌菌落到可用于 杂交的DNA)，通过手工处理或用自动化装置处理。

从本发明的角度来看，使用诸如NASBA或TMA的其他扩增技术可 以获得相同的结果，这些技术能够直接制备RNA扩增子。