MOGAT-2 억제제로서 유용한 신규 벤질 술폰아미드 화합물

MOGAT-2 억제제로서 유용한 신규 벤질 술폰아미드 화합물 {NOVEL BENZYL SULFONAMIDE COMPOUNDS USEFUL AS MOGAT-2 INHIBITORS}

과량의 식이 지방의 섭취는 식이 유발 비만의 주요 원인이고, 사람들의 건강에 대해 극심한 유해 영향을 가질 수 있다. 인간의 경우에 식이 지방의 90% 초과는 트리아실글리세롤 (또는 트리글리세리드)이고, 이는 소장에 의해 거의 완전히 흡수된다. 효소 아실 CoA:모노아실글리세롤 아실트랜스퍼라제-2 (MoGAT-2)는 소장에서의 식이 지방의 흡수에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. MoGAT-2 결핍 마우스는 고 지방 식이를 공급하는 경우에 비만 발생, 글루코스 불내성, 고콜레스테롤혈증 및 지방간 발생에 대해 보호되는 것으로 입증되었다. 추가로, MoGAT-2 결핍 마우스는 식용 올리브 오일 챌린지 후에 보다 낮은 혈장 트리아실글리세롤 수준을 나타내는 것으로 또한 나타났다 (Yen, et al., Nat. Med. 2009, 15(4), 442-446).

고트리글리세리드혈증의 치료를 위한 추가 약물에 대한 필요성이 있다. MoGAT-2 수용체의 새로운 억제제에 대한 필요성이 또한 있다. 본 발명은, 고트리글리세리드혈증의 치료에 적합할 수 있는 대안적 화합물 및 치료 방법을 제공함으로써 이들 필요성 중 하나 이상을 해결한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서, L은 -CH ₂ - 및 -CH ₂ CH ₂ -로부터 선택되고; R1은 -CH ₃ 및 -CF ₃ 으로부터 선택되고; A는

로부터 선택되고; 여기서 A에 대하여, T는 CH ₂ , NH 및 O로부터 선택되고; U는 CH ₂ , NH 및 O로부터 선택되고; V는 CH ₂ , C=O, NH, N-CH ₃ 및 O로부터 선택되며, 단 T, U 및 V 중 전부는 아니지만 적어도 1개는 CH ₂ 이고, U가 O인 경우에, 각각의 T 및 V는 O 또는 N 이외의 것이고; W는 CH ₂ 및 O로부터 선택되고; X는 CH 및 N으로부터 선택되며; 단 W가 CH ₂ 인 경우에, X는 N이고, W가 O인 경우에, X는 CH이고; Y는 CH ₂ , NC ₆ H ₅ 및 O로부터 선택되고; Z는 CH ₂ 및 O로부터 선택되고; R2는 H 및 할로겐으로부터 선택되고; R3은 H, 시클로프로필 및 페닐로부터 선택되고; R4는 H 및 페닐로부터 선택되고, 여기서

한 실시양태에서 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염은 하기 예시된 입체화학을 갖는다.

상기 식에서, R1, L, A, T, U, V, W, X, Y, Z, R2, R3 및 R4는 상기 기재된 바와 같다.

본 발명은 L이 바람직하게는 -CH ₂ -인 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

화학식 I의 화합물의 한 실시양태에서, R1은 -CH ₃ 이고; 또 다른 실시양태에서, R1은 -CF ₃ 이다. 본 발명은 상기 실시양태 둘 다의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 A가 바람직하게는

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 A가

바람직하게는 T는 O 또는 N이고; U는 CH ₂ 이고; V는 O 또는 N이다.

한 실시양태에서, T 및 V는 둘 다 O이다.

또 다른 실시양태에서, T는 O이고, V는 N이다.

또 다른 실시양태에서, T 및 V는 둘 다 CH ₂ 이고, U는 O이다.

본 발명은 R2가 바람직하게는 H 및 F로부터 선택되고; 보다 바람직하게는 R2가 H인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서, L은 -CH ₂ - 및 -CH ₂ CH ₂ -로부터 선택되고; R1은 -CH ₃ 및 -CF ₃ 으로부터 선택되고; 여기서 A는

로부터 선택된다.

본 발명은 A가

로부터 선택된 것인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 염을 제공한다.

본 발명은

본 발명은

본 발명은 상기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중 하나 이상을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 고트리글리세리드혈증에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 환자에게 유효량의 상기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 고트리글리세리드혈증에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 환자에게 유효량의 상기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중 하나 이상을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 고트리글리세리드혈증의 치료에 사용하기 위한 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 고트리글리세리드혈증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공된다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 임상적 및/또는 수의학적 용도에 허용되는 것으로 간주되는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하기 위한 통상의 방법론은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); SM Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

본원에 사용된 바와 같은, 치료를 필요로 하는 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간; 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이; 또는 가금류를 지칭한다.

본 발명의 제약 제제는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 담체, 희석제 및/또는 부형제를 비롯한 공지된 성분을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않은 하나 이상의 담체, 희석제 및 부형제를 지칭한다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 그 예는 문헌 [Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (A. Gennaro, et al . eds. 19 ^th ed. Mack Publishing Co.)]에서 찾을 수 있다. 이러한 제제에 적합한 제약상 허용되는 담체, 부형제 및 희석제의 비제한적 예는 전분, 당, 만니톨 및 실리카 유도체; 결합제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 알기네이트, 젤라틴 및 폴리비닐-피롤리돈을 포함한다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에 예시된 화합물은 ACDLABS 또는 시믹스 드로우(Symyx Draw) 3.2를 사용하여 명명되고 넘버링된다.

일반 화학

본원에 사용된 하기 용어는 나타낸 의미를 갖는다: "ACN"은 아세토니트릴을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DEA"는 디에틸아민을 지칭하고; "DMEA"는 디메틸에틸아민을 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "IPA"는 이소프로필 알콜을 지칭하고; "IPA"는 이소프로필 아민을 지칭하고; "이성질체 1"은 본원에 규정된 조건 하에서의 제1 용리 이성질체를 지칭하고; "이성질체 2"는 본원에 규정된 조건 하에서의 제2 용리 이성질체를 지칭하고; "LC/MS"는 액체 크로마토그래피에 이어진 질량 분광분석법을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "MS"는 질량 분광분석법을 지칭하고; "NMR"은 핵 자기 공명을 지칭하고; "Prep"은 제조예를 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란를 지칭한다.

반응식 1은 화학식 I의 화합물의 일반적 합성을 예시한다.

<반응식 1>

상업적으로 입수가능하거나 또는 공지된 문헌 방법에 의해 합성된 치환된 아민 화합물 1을 또한 일반적으로 통상의 기술자에게 공지되어 있는 환원성 아미노화 조건 하에 알데히드 화합물 2와 반응시켜 화학식 3의 화합물을 제공한다. (문헌 [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations: a guide to functional group preparations, 2 ^nd edition, Page 835-846, Wiley-VCH, (1999)] 참조). 보다 구체적으로, 치환된 아민 화합물 1을 환원제, 예컨대 트리아세톡시보로히드라이드 및 산, 예컨대 아세트산의 존재 하에 디클로로메탄 (DCM) 중에서 알데히드 화합물 2와 반응시켜 화학식 3의 화합물을 제공한다. 화학식 3의 화합물을, 예를 들어 염산을 사용하여 염으로 전환시켜 히드로클로라이드 염을 형성할 수 있다. 특정한 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 바람직하게는 또한 R 또는 S 배위를 갖는 키랄 알데히드 2로 출발함으로써 제조될 수 있다.

제조예 1

(NZ)-N-[(4-브로모페닐)메틸렌]-(R)-2-메틸-프로판-2-술핀아미드

(R)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (40.5 g, 0.33 mol)를 톨루엔 (283 mL) 중 4-브로모벤즈알데히드 (65.57 g, 0.35 mol)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 혼합물 주위 온도에서 15분 동안 교반하고, 이어서 수산화나트륨 (1.34 g, 0.33 mol)을 첨가하였다. 현탁액을 주위 온도에서 12시간 동안 교반하였다. 황산나트륨 (16 g) 및 셀라이트(Celite)® (16 g)를 첨가하고, 현탁액을 15분 동안 교반하였다. 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 헥산 /EtOAc (100%에서 70% 헥산)로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (85.5 g, 88% 수율). MS (m/z): 288 (M+1).

제조예 2

N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로-에틸]-(R)-2-메틸-프로판-2-술핀아미드

순수한 (트리플루오로메틸)트리메틸실란 (109 mL, 0.74 mol)을 DMF (1.2 L) 중 테트라부틸암모늄 아세테이트 (88 g, 0.29 mol) 및 (NZ)-N-[(4-브로모페닐) 메틸렌]-(R)-2-메틸-프로판-2-술핀아미드 (85 g, 0.29 mol)의 교반 용액에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 90분 동안 교반하였다. 포화 수성 염화암모늄 용액 (1.2 L)을 첨가하고, EtOAc (4 x 400 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고; 추출물을 물에 이어서 염수 (2 x 1 L)로 순차적으로 세척하고; MgSO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 헥산 (200 mL)으로 10분 동안 연화처리하고; 여과하고; 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (81 g, 76% 수율, >98 de). MS (m/z): 358 (M+1).

제조예 3

(1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로에탄아민

HCl (디옥산 중 4 M, 226 mL, 0.9 mol)을 MeOH (670 mL) 중 N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로-에틸]-(R)-2-메틸-프로판-2-술핀아미드 (81 g, 0.23 mol)의 현탁액에 첨가하였다. 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 메틸 tert-부틸 에테르 (200 mL)로 10분 동안 연화처리하여 표제 화합물의 HCl 염을 갈색 고체로서 수득하였다. 염을 물 중에 용해시키고, 2N NaOH 용액을 혼합물의 pH가 10이 될 때까지 첨가하였다. 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (3 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고 (각각 500 mL); MgSO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (46 g, 80% 수율, 98% ee). MS (m/z): 358 (M+1).

제조예 4

N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로-에틸]메탄술폰아미드

메탄술포닐 클로라이드 (16.42 mL, 0.21 mol)를 DCM (250 mL) 중 (1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로에탄아민 (49 g, 0.19 mol), 4-디메틸아미노피리딘 (1.18 g, 9.0 mmol), 2,6-루티딘 (67 mL, 0.57 mol)의 혼합물을 0℃에서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도로 가온하고, 혼합물을 그 온도에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (300 mL)으로 희석하고, 이를 수성 HCl (2 M, 2 x 200 mL), 물 (250 mL), 이어서 염수 (250 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 수집하고; MgSO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 헥산 (200 mL)으로 10분 동안 연화처리하고; 여과하고; 고체를 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 연한 갈색 고체로서 수득하였다 (60 g, 93% 수율, 98% ee). MS (m/z): 332 (M+1).

제조예 5

N-[(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-(4-포르밀페닐)에틸]메탄술폰아미드

N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로-에틸]메탄술폰아미드 (30 g, 90 mmol), 아세트산팔라듐 (II) (0.81 g, 3.6 mmol), 부틸디-1-아다만틸포스핀 (3.89 g, 10.84 mmol) 및 테트라메틸에틸렌디아민 (10.50 g, 90 mmol) 및 톨루엔 (1.5 mL)을 2L 파르(PARR) 반응기에서 합하였다. 반응기를 합성 기체 (1:1 CO/H ₂ , 75 psi)로 채우고, 이어서 이를 밀봉하였다. 95℃로 가열하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고; 통기시키고; 이어서 반응기를 개봉하였다. 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하였다. 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 헥산/EtOAc (8:2에서 1:1)으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (22.8 g, 90%, 80% ee)을 수득하였다. 키랄 칼럼: 키랄팩(Chiralpak) AS-H (2.1x25cm, 5 uM) CO ₂ /EtOH (9:1)를 사용함으로써 키랄 순도를 풍부화시켜 표제 화합물을 수득하였다 (19 g, 75% 수율, 98% ee). MS (m/z): 282 (M+1).

제조예 6

N-[(1R)-1-(4-브로모페닐)에틸]메탄술폰아미드

메탄술포닐 클로라이드 (13.44 mL, 0.17 mmol)를 DCM (250 mL) 중 (1R)-1-(4-브로모페닐)에탄아민 (25 g, 0.12 mol) 및 트리에틸아민 (51 mL, 0.36 mol)의 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 주위 온도로 가온하고, 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 HCl (2 M, 100 ml)로 세척하였다. 유기 상을 물 및 이어서 염수 (2 x 100 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 헥산 (150 mL)으로 연화처리하고; 여과하고; 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (33.24 g, 96%, ee > 98%). MS (m/z): 278 (M+1).

제조예 7

N-[(1R)-1-(4-포르밀페닐)에틸]메탄술폰아미드

N-[(1R)-1-(4-브로모페닐)에틸]-메탄술폰아미드 (10 g, 35 mmol), (1,1-비스(디페닐포스피노)-페로센)팔라듐(II)클로라이드 (733 mg, 0.9 mmol), 탄산나트륨 (3.81 g, 35 mmol) 및 DMF (50mL)를 300 mL 파르 반응기에서 합하였다. 트리에틸실란 (11.6 mL, 0.72 mmol)을 첨가하고, 반응기를 일산화탄소로 3회 퍼징하였다. 반응기를 일산화탄소 (50 psi)로 충전시키고; 밀봉하고; 혼합물을 90℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응기를 주위 온도로 냉각시키고; 생성된 혼합물을 셀라이트® 패드 상에서 여과하고; 패드를 DCM (150 mL)으로 세척하였다. 여과물을 수집하고, 여과물을 물에 이어서 염수 (2 x 80 mL)로 순차적으로 세척하였다. 유기 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 오렌지색 오일로서 수득하였다. 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 헥산/EtOAc (0에서 30% EtOAc)으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (5.6 g, 70%, ee> 98%). MS (m/z): 228 (M+1).

제조예 8

2-클로로-3-[[(2S)-옥시란-2-일]메톡시]피리딘

(R)-옥시란메탄올 (32.85 g, 443.5 mmol)을 THF (1.34 L) 중 2-클로로-3-히드록시피리딘 (52.23 g, 403.18 mmol)과 합하였다. 혼합물을 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 이를 0℃로 냉각시키고, 트리페닐포스핀 (116.33 g, 443.5 mmol)을 천천히 첨가하였다. 모든 고체를 용해시킨 후에, 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (87.92 mL, 443.5 mmol)를 반응물의 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하기에 충분히 느린 속도로 25분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 30분 동안 냉각시키면서 교반하고, 이어서 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하고, 밤새 교반을 계속하였다. EtOAc를 첨가하고, NaOH (2x 1.0 N)로 세척하였다. 유기 층을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 2:1 Et ₂ O: 헥산의 혼합물로 연화처리하고, 5분 동안 교반하였다. 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (2x 330 g SiO ₂ )를 통해, 0-66% THF / 헥산의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (32.6 g, 43.6%). MS (m/z): 186(M+1).

제조예 9

(2S)-1-아지도-3-[(2-클로로-3-피리딜)옥시]프로판-2-올

아지드화나트륨 (22.84 g, 351.3 mmol)을 물 (195 mL) 중에 용해시켰다. 별도로, 2-클로로-3-[[(2S)-옥시란-2-일]메톡시]피리딘 (32.6 g, 175.6 mmol)을 1,4-디옥산 (800 mL) 중에 용해시켰다. 물/아지드화나트륨 용액을 디옥산 용액에 천천히 첨가하고; 90℃로 가열하고; 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고, 이를 감압 하에 농축시켰다. 물을 첨가하고; EtOAc (2X)로 추출하고; 추출물을 합하고; 합한 추출물을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 수집하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 적색빛 백색 고체로서 수득하였다 (40.28 g, 92.8%). MS (m/z): 229(M+1).

제조예 10

(3S)-3-(아지도메틸)-2,3-디히드로-[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딘

(2S)-1-아지도-3-[(2-클로로-3-피리딜)옥시]프로판-2-올 (40.28 g, 176.17 mmol)을 THF (880 mL) 중에 용해시키고, 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액; 14.09 g, 352.35 mmol)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고, 그 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 1 리터의 채워진 얼음에 천천히 부어 반응물을 켄칭하였다. 디옥산을 감압 하에 제거하고, 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 추출물을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 2x330 g 실리카 겔을 사용하여, 헥산 중 0-75%의 Et ₂ O의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 생성물 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (7.5 g, 22.15%). MS (m/z): 193(M+1).

제조예 11

[(3S)-2,3-디히드로-[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딘-3-일]메탄아민

(3S)-3-(아지도메틸)-2,3-디히드로-[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딘 (7.5 g, 39.03 mmol)을 MeOH (390 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물을 감압에 적용함으로써 이를 탈기시키고, 이어서 질소 (3X)로 재충전시키고; 10% Pd/C (2.08 g, 1.95 mmol)를 첨가하고; 혼합물을 다시 탈기시켰다. 생성된 탈기된 혼합물을 주위 온도에서 수소 분위기 하에 17시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과하고, 여과물의 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 오일로서 수득하였다 (6.5 g, 100%). MS (m/z): 167(M+1).

제조예 12

3,4-디히드로-2H-1,4-벤족사진-2-카르보니트릴

2-클로로-2-프로펜니트릴 (3.0 g, 34.3 mmol), 2-아미노페놀 (3.27 g, 29.96 mmol), 아세톤 (50 mL) 및 염화칼륨 (5 g, 36.18 mmol)을 합하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 얻었다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 석유 에테르 중 1-50% EtOAc의 구배를 사용하여 용리시키면서 정제하였다. 생성물 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다 (1.5 g, 21.6%). MS (m/z): 161(M+1).

제조예 13

3,4-디히드로-2H-1,4-벤족사진-2-일메탄아민

3,4-디히드로-2H-1,4-벤족사진-2-카르보니트릴 (600 mg, 3.75 mmol)을 THF (20 mL)에 첨가하고, 이어서 수소화알루미늄리튬 (THF 중 1.0 M; 1 mL, 1.0 mmol)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. H ₂ O (1 mL)를 첨가하여 반응물을 켄칭시키고; 여과하고; 필터 케이크를 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 생성된 화합물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 DCM 중 20-50%의 MeOH의 구배를 사용하여 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (390 mg, 63.1%). MS (m/z):165(M+1).

제조예 14

4-(2,2-디에톡시에틸)-1,4-벤족사진-3-온

2H-1,4-벤족사진-3(4H)-온 (1.0 g, 6.64 mmol)을 디메틸아세트아미드 (5 mL) 중에 용해시키고; 포타슘 tert-부톡시드 (1.54 g, 13.28 mmol)를 첨가하고; 주위 온도에서 5분 동안 교반하였다. 2-브로모-1,1-디에톡시에탄 (10.1 mL, 66.4 mmol) 및 테트라-N-부틸암모늄 아이오다이드 (2.49 g, 6.64 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응물을 주위 온도로 냉각되도록 하였다. 반응 혼합물을 Et ₂ O 및 물로 희석하고; 층을 분리하고; 수성 층을 추가의 Et ₂ O로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고; Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 헥산 중 0%, 10%, 20% 및 30%의 EtOAc의 단계 구배를 사용하여 정제하였다. 목적 분획을 농축하여 표제 화합물을 왁스상 고체로서 수득하였다 (1.65 g, 93.7%).

제조예 15

2-(3-옥소-1,4-벤족사진-4-일)아세트알데히드

4-(2,2-디에톡시에틸)-1,4-벤족사진-3-온 (710 mg, 2.68 mmol)을 THF (5.35 mL) 중에 용해시키고, 수성 HCl (3 M, 3.57 mL, 10.7 mmol)을 첨가하였다. 주위 온도에서 7시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 질소 기체의 스트림을 사용하여 제거하고, 수성 잔류물을 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고; 물 및 포화 수성 NaHCO ₃ 으로 세척하고; Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시켰다. 여과하고, 용매를 여과물로부터 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (490 mg, 89.07%). MS (m/z): 192(M+1).

제조예 16

4-(2-아미노에틸)-1,4-벤조옥사진-3-온

아세트산암모늄 (1.3 g, 16.19 mmol)을 EtOH (15.69 mL) 중에 용해시키고; 2-(3-옥소-1,4-벤족사진-4-일)아세트알데히드 (150 mg, 0.78 mmol), 소듐 시아노보로히드라이드 (155.7 mg, 2.35 mmol) 및 수성 암모니아 (32%; 5.64 g, 105.91 mmol)를 첨가하였다. 밀봉가능한 튜브를 혼합물로 충전시키고, 튜브를 밀봉하였다. 80℃로 가열하고, 밤새 교반하였다. 그 후에, 혼합물을 주위 온도로 냉각되도록 하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. EtOAc를 첨가하고; 염수; NaHCO ₃ (포화, 수성)로 세척하고; 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 DCM 중 5%, 10% 및 20% MeOH의 단계 구배로 용리시키면서 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다 (170 mg, 80%). MS (m/z): 193(M+1).

제조예 17

메틸 3-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)프로파노에이트

3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온 (500 mg, 3.40 mmol)을 THF (20 mL) 중에 용해시키고, 수산화나트륨 (274.5 mg, 6.79 mmol)에 이어서 THF (1 mL) 중 메틸 아크릴레이트 (438.7 mg, 5.10 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 3시간 동안 교반하고; 물 (20 mL)로 켄칭하고; 이어서 EtOAc (100 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 염수로 세척하고; 유기 상을 Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 황색 오일로서 수득하였다 (530 mg, 66.9%). MS (m/z): 234(M+1).

제조예 18

3-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)프로판산

메틸 3-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)프로파노에이트 (0.3 g, 1.29 mmol)를 THF (12 mL) 및 MeOH (4 mL) 중에 용해시켰다. 수산화리튬 (0.2 g, 8.23 mmol, 4 mL H ₂ O 중)을 첨가하였다. 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 반응 혼합물로부터 감압 하에 증발시켰다. pH를 2N HCl을 사용하여 5로 조정하였다. EtOAc (60 mL)를 첨가하고; 염수로 세척하고; Na ₂ SO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다 (무색 오일, 0.27 g, 95.8%). MS (m/z): 220 (M+1).

제조예 19

tert-부틸 2-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)에틸 카르바메이트

3-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)프로판산 (150 mg, 0.53 mmol), 디페닐포스포산 아지드 (489.55 mg, 1.78 mmol), t-부틸 알콜 (10 mL) 및 트리에틸아민 (207.7 mg, 2.05 mmol)을 합하였다. 혼합물을 환류로 가열하고, 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 정제용-TLC를 통해 10% MeOH/DCM을 사용하여 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다 (270 mg, 68.0%). MS (m/z): 235(M-tBu+1).

제조예 20

(1-옥소-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-3-일)메틸 메탄술포네이트

3-(히드록시메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온 (6.0 g, 33.86 mmol)을 DCM (60 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 (7.25 g, 67.72 mmol)을 첨가하였다. 0℃로 냉각시키고, 메탄술포닐 클로라이드 (4.65 g, 40.63 mmol)를 적가하였다. 1시간 동안 교반하고; DCM으로 희석하고; 물 및 이어서 염수로 세척하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다 (8.0 g, 92%). MS (m/z): 256(M+1).

제조예 21

3-(아지도메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온

(1-옥소-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-3-일)메틸 메탄술포네이트 (3 g, 11.7 mmol)를 DMF (10 mL) 중에 용해시켰다. NaN ₃ 을 첨가하고; 70℃로 가열하고, 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시키고; 물을 첨가하고; EtOAc로 추출하였다. 추출물을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다 (1.7 g, 71.5%).

제조예 22

3-(아미노메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온

3-(아지도메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온 (1.8 g, 8.9 mmol)을 EtOAc (15 mL) 중에 용해시켰다. 질소 분위기 하에 10% Pd/C (0.2 g)를 첨가하고, 이어서 밤새 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과하고, 셀라이트®를 EtOAc로 세척하였다. MS (m/z): 177 (M+1).

제조예 23

3-(아미노메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온, 이성질체 1

3-(아미노메틸)-3,4-디히드로-2H-이소퀴놀린-1-온 (360 mg, 1.70 mmol)의 거울상이성질체를 키랄 크로마토그래피 조건 L (하기 참조)을 사용하여 분리하고, 제1 용리 이성질체를 수집하여 표제 화합물을 수득하였다 (140 mg, 47%) MS (m/z): 177(M+1).

제조예 24

tert-부틸 N-[2-(2-옥소-1,3-벤족사졸-3-일)에틸]카르바메이트

2-(3H)-벤족사졸론 (0.4 g, 2.9 mmol), tert-부틸 2-브로모에틸카르바메이트 (715.14 mg, 3.19 mmol), 포타슘 tert-부톡시드 (508.7 mg, 4.35 mmol), 아이오딘화칼륨 (0.1 g, 0.6 mmol)을 DMF (6 mL) 중에 합하였다. 80℃로 가열하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 여과하고; 여과물을 수집하고; HPLC 조건 M (하기 참조)을 통해 정제하여 표제 화합물을 유성 고체로서 수득하였다 (0.53 g, 65.6%). MS (m/z): 223(M-tBu+1).

제조예 25

1-시클로프로필-2-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)에타논

플라스크를 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메탄올 (10 g, 75.7 mmol)로 충전시키고, 85℃로 가열하고, 새로이 절단된 나트륨 (465 mg, 20.23 mmol)을 첨가하였다. 85℃로 가열하고, 1시간 동안 교반하였다. 2-브로모-1-시클로프로필에타논 (3.0 g, 18.4 mmol)을 첨가하고, 온도를 85℃에서 유지하고, 30분 동안 교반하였다. 여과하고, 고체를 ACN (20 mL)으로 세척하였다. 여과물을 수집하고, 감압 하에 농축시켰다. HPLC를 통해 조건 Z를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다. (650 mg, 16.5%). MS (m/z): 215 (M+1).

제조예 26

1-시클로프로필-2-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)에탄올

1-시클로프로필-2-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)에타논 (1.2 g, 5.6 mmol), MeOH (20 mL) 및 소듐 테트라히드로보레이트 (310 mg, 8.19 mmol)를 용해시켰다. 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시켰다. 물 (30 mL)을 첨가하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 추출물을 합하고; 염수로 세척하고; MgSO ₄ 상에서 건조시켰다. 여과하고; 여과물을 수집하고; 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다 (1.2 g, 99%). MS (m/z): 199 (MH ₂ O +1).

제조예 27

3-(2-시클로프로필-2-히드록시에톡시)프로판-1,2-디올

1-시클로프로필-2-((2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시)에탄올 (1.1 g, 5.09 mmol)을 MeOH (20 mL) 중에 용해시키고, HCl (Et ₂ O 중 1 M; 18 mL, 18 mmol)을 첨가하였다. 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 표제 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (880 mg, 98.2%). MS (m/z): 199 (M+23).

제조예 28

2-(알릴옥시)-2-페닐아세테이트

메틸 2-히드록시-2-페닐아세테이트 (1.5 g, 9.03 mmol) 및 3-브로모프로프-1-엔 (1.6 g, 13.23 mmol)을 THF (15 mL) 중에 용해시켰다. 산화은 (4.15 g, 17.91 mmol)을 첨가하고, 80℃로 마이크로웨이브 조사와 함께 2시간 동안 가열하였다. 물질을 여과하고; 고체를 THF (30 mL)로 헹구고; 여과물을 감압 하에 농축하였다. 플래쉬 크로마토그래피를 통해 DCM 및 석유 에테르 (1:1)의 용액을 사용하여 정제하여 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다 (600 mg, 32.2%). MS (m/z): 207(M+1).

제조예 29

2-(알릴옥시)-2-페닐아세테이트

2-(알릴옥시)-2-페닐아세테이트 (1.2 g, 5.82 mmol)를 THF (40 mL) 중에 용해시키고, 수소화알루미늄리튬 (THF 중 1M; 6.40 ml, 6.4 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2시간 동안 교반하고; 빙수 (650 mg)를 첨가하여 반응물을 켄칭시키고; 또 다른 20분 동안 교반하였다. 여과하고, 고체를 THF (20 ml)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다 (850 mg, 81.97%). MS (m/z): 195 (M+18).

제조예 30

2-(옥시란-2-일메톡시)-2-페닐에탄올

2-(알릴옥시)-2-페닐아세테이트 (850 mg, 4.77 mmol)를 DCM (40 mL) 중에 용해시키고, m-클로로퍼옥시벤조산 (1.5 g, 8.69 mmol)을 한번에 첨가하였다. 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시키고, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 DCM 중 10% MeOH를 사용하여 용리시키면서 정제하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (900 mg, 97.2%). MS (m/z): 195 (M+1).

제조예 31

2-(옥시란-2-일메톡시)-1-페닐에탄올

2-(옥시란-2-일메톡시)-1-페닐에탄올을 본질적으로 제조예 30의 방법에 의해 제조하였다. MS (m/z): 212 (M+18).

제조예 32

트랜스-(5-페닐-1,4-디옥산-2-일)메탄올

트랜스-2-(옥시란-2-일메톡시)-2-페닐에탄올 (800 mg, 4.12 mmol)을 20 mL DCM 중에 용해시키고, (1S)-(+)-10-캄포르술폰산 (95 mg, 0.409 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 환류로 가열하고, 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시키고, 크로마토그래피 조건 R (하기 참조)을 통해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다 (330 mg, 41.25%).

표 1에서의 하기 화합물을 본질적으로 제조예 32의 방법에 의해 제조하였다.

<표 1>

제조예 35

트랜스 5-페닐-1,4-디옥산-2-일)메틸벤젠술포네이트

트랜스-5-페닐-1,4-디옥산-2-일)메탄올 (311 mg, 1.6 mmol), p-톨루엔술포닐 클로라이드 (336 mg, 1.76 mmol), N,N-디메틸피리딘아민 (195 mg, 1.57 mmol), 트리에틸아민 (0.35 mL, 2.51 mmol) 및 DCM (20 mL)을 합하였다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 DCM으로 용리시키면서 정제하였다. 목적 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (510 mg, 91.4%). MS (m/z): 349 (M+1)

표 2에서의 하기 화합물을 본질적으로 제조예 35의 방법에 의해 제조하였다.

<표 2>

제조예 38

트랜스-2-아지도메틸-5-페닐-1,4-디옥산

트랜스-5-페닐-1,4-디옥산-2-일)메틸벤젠술포네이트 (510 mg, 1.46 mmol)를 DMF (10 mL) 중에 용해시켰다. 아지드화나트륨 (152 mg, 2.34 mmol)을 DMF 용액에 한번에 첨가하였다. 혼합물을 105℃로 가열하고, 2시간 동안 교반하였다. H ₂ O (20 mL)로 켄칭하고, EtOAc (3x20 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고; MgSO ₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다. (319 mg, 99.4%). MS (m/z): 242 (M+23).

표 3에서의 하기 화합물을 본질적으로 제조예 38의 방법에 의해 제조하였다.

<표 3>

제조예 41

(트랜스-5-페닐-1,4-디옥산-2-일)메탄아민

트랜스-2-아지도메틸-5-페닐-1,4-디옥산 (319 mg, 1.46 mmol), 트리페닐포스핀 (765 mg, 2.92 mmol), 및 THF (20 mL) 및 H ₂ O (5 mL)를 합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다우엑스(Dowex) AG 50W-X8 양이온 교환 수지 (암모늄 형태, 200-400 메쉬, 1g)를 반응물에 첨가하고, 주위 온도에서 20분 동안 교반하였다. 여과하고, 수지를 THF (10 mL)에 이어서 H ₂ O (10 mL)로 순차적으로 세척하였다. SCX 수지를 MeOH 중 NH ₃ (120 mL 7N)으로 헹굼으로써 용리시키고, 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 무색 오일로서 수득하였다 (280 mg, 99.6%). MS (m/z): 194 (M+1).

표 4에서의 하기 화합물을 본질적으로 제조예 41의 방법에 의해 제조하였다.

<표 4>

실시예 1

N-{(1S)-1-[4-({[(3S)-2,3-디히드로[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딘-3-일메틸]아미노}메틸)페닐]-2,2,2-트리플루오로에틸}메탄술폰아미드 히드로클로라이드

[(3S)-2,3-디히드로-[1,4]디옥시노[2,3-b]피리딘-3-일]메탄아민 (9.71 g, 58.4 mmol), N-[(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-(4-포르밀페닐)-에틸]-메탄술폰아미드 (16.43 g, 58.4 mmol) 및 MeOH (292 mL)를 합하였다. 4Å 분자체 (30 mL)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 질소 분위기 하에 1시간 동안 교반하였다. 수소화붕소나트륨 (8.84 g, 233.7 mmol)을 조금씩 첨가하고, 주위 온도에서 10분 동안 교반하면서, 반응을 MS 및 ¹ H NMR을 통해 모니터링하였다. H ₂ O를 천천히 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 셀라이트®를 통해 여과하였다. 여과물을 수집하고; 용매를 감압 하에 제거하고; 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 (5% MeOH/DCM) 중 0-100%의 (DCM 중 5% (2N NH ₃ /MeOH))의 구배를 사용하여 생성물을 용리시켰다. 생성물 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 유리 염기를 잔류물로서 수득하였다. 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, HCl (Et ₂ O 중 1N; 87.7 mL, 87.7 mmol)을 교반하면서 첨가하였다. 첨가 완료 후에 10분 동안 교반하고, 이어서 용매를 감압 하에 제거하여 표제 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (12.9 g, 47.3%). MS (m/z): 432 (M-Cl).

표 5에서의 하기 실시예를 본질적으로 실시예 1의 방법에 의해 제조하였다. 표 5에서의 모든 하기 실시예를 키랄 출발 물질로부터 출발함으로써 및/또는 하기 나타낸 크로마토그래피 칼럼 및 조건을 사용함으로써 단일 이성질체로서 단리하였다.

<표 5>

실시예 31

N-{(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-[4-({[2-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)에틸]아미노}메틸)페닐]에틸}메탄술폰아미드 히드로클로라이드

tert-부틸 2-(1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)에틸카르바메이트 (220 mg, 0.76 mmol)를 DCM (3 mL) 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (1 mL, 13.23 mmol)을 첨가하였다. 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 이어서 1,2-디클로로에탄 (20 mL) 중에 용해시켰다. N-[(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-(4-포르밀페닐)-에틸]-메탄술폰아미드 (150 mg, 0.53 mmol), 아세트산 (0.05 mL, 0.87 mmol) 및 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (642.3 mg, 3.03 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 잔류물을 얻고, 잔류물을 MeOH (2 mL)로 희석하였다. 잔류물을 정제용 TLC를 통해 DCM 중 10% MeOH를 사용하여 정제하여 무색 오일을 수득하였다. 오일을 MeOH (3 mL) 중에 용해시키고, HCl (디에틸 에테르 중 1M; 0.5 mL, 0.5 mmol)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (10 mg, 3.7%). MS (m/z): 456 (M-Cl).

실시예 32

N-{(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-[4-({[2-(2-옥소-1,3-벤족사졸-3(2h)-일)에틸]아미노}메틸)페닐]에틸}메탄술폰아미드 히드로클로라이드

N-{(1S)-2,2,2-트리플루오로-1-[4-({[2-(2-옥소-1,3-벤족사졸-3(2h)-일)에틸]아미노}메틸)페닐]에틸}메탄술폰아미드 히드로클로라이드를 본질적으로 실시예 31에 대한 제조 방법에 의해 제조하였다. MS (m/z) 444 (M-Cl).

표 6은 이들이 상기 실시예로부터 다양해지는 크로마토그래피 조건을 제공한다.

<표 6>

MOGAT-2 억제 검정

인간 MoGAT-2에 대한 화합물의 시험관내 억제 활성을 본 검정에서 평가하였다. MoGAT-2는 장내 트리글리세리드 재합성 경로에서 올레오일 기를 올레오일-CoA로부터 모노올레오일-글리세롤 ("MAG")에 이동시켜 디올레오일-글리세롤 ("DAG")을 형성한다. 본 검정은 친수성 분자보다 소수성 분자를 선택적으로 추출하는 마이크로신트(Microscint) E 추출의 장점을 취하여 ¹⁴ C-올레오일-CoA를 ¹⁴ C-DAG로부터 분리하였다.

유전자 조작된 곤충 SF9 세포는 인간 MoGAT-2를 발현한다. 세포 용해물을 프로테아제 억제제 (로슈(Roche) Cat# 11873580001)를 함유한 20 mM의 NaCl 중에서 제조하였다. 인간 MoGAT-2를 발현하는 SF9 세포를 20 x2초 동안 15,000 rpm에서 균질화시켰다 (PT-3100 폴리트론(Polytrone)). 균질물을 4℃에서 10분 동안 1000 g에서 원심분리하였다. 단백질 정량화 및 활성 시험을 위해 상청액을 개별 튜브에 수집하였다. 글리세롤 모노올레에이트 기질 (스펙트럼 케미칼(Spectrum Chemical), CAS#25496-72-4)을 크로마토그래피로 정제하였다. 모노아실글리세롤 (MAG) 기질을 인지질 소포 (디올레오일 포스파티딜콜린 "DOPC")에서 제조하였다. MAG/DOPC 소포를 20 mM 농도의 총 지질 (MAG 및 DOPC)로 제조하였다. 총 지질에 대한 MAG의 상이한 몰비를 화합물 스크리닝 (8.9%) 또는 화합물 동역학적 연구 (2.6-40%)를 위해 제조하였다. 적절한 양의 정제된 MAG 및 DOPC (아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids) # 850375C)를 클로로포름 중에 유리 튜브 내에서 혼합하였다. 후속적으로, N ₂ 기체의 스트림 하에 클로로포름을 증발시킨 다음, 30분 동안 감압 하에 건조시켰다. 목적하는 총 지질 농도를 위해 적절한 양의 완충제 (트리스(Tris)-Cl pH 7.4, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA)를 건조된 MAG/DOPC 혼합물에 첨가하였다. MAG/DOPC 용액을 용액이 투명해질 때까지 초음파처리하였다. 동적 광 산란을 사용하여 소포 크기를 측정하여 균일성을 확인하였다.

검정 완충제는 100 mM 트리스, pH 7.5 (인비트로젠(Invitrogen) 15567-022), 11% DMSO, 250 mM 수크로스 (시그마(Sigma) S-0389), 1 mM EDTA 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 다이아그노스틱(Roche Diagnostic) 12454800)로 이루어져 있다. 시험 화합물을 완충제에 기질 및 효소와 함께 첨가하였다. 반응을 위한 최종 농도는 0.016 mg/mL SF9 세포 추출물, 20 μM 올레오일-CoA (3.5 μM ¹⁴ C-올레오일-CoA), 초음파처리된 소포 형태의, 8.9:91.1 (몰비) MAG:DOPC로 구성된 1.26 mM 총 지질이다. AESSM (12.5%의 100% 변성 EtOH; 11% DI H ₂ O; 2.5% 1.0N NaOH; 59% 이소프로판올 (말린크로트(Mallinckrodt) 3031-08); 15% 헵탄 (옴니 솔브(Omni Solv) HX0078))을 부피 기준으로 첨가함으로써 실온에서 90분의 인큐베이션 후 반응을 중지하였다. 마이크로신트 E를 첨가한 다음, 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 적어도 4시간의 평형 후 섬광 계수기 상에서 계수하였다. 농도 vs 상대 MoGAT-2 활성을 플로팅함으로써 엑셀 피트(Excel Fit) 소프트웨어 (버전 4; 데이터를 4-파라미터 비선형 로지스틱 방정식 (에이베이스 이퀘이션(ABase Equation) 205)을 사용하여 분석함)를 사용하여 IC ₅₀ (반수 최대 억제에 이르는 농도)을 계산하였다.

본원에 예시된 모든 화합물은 100 nM 미만의 IC ₅₀ 을 갖는다. 실시예 1은 2.28 nM의 IC ₅₀ 을 나타낸다. 결과는 예시된 화합물이 본 검정에서 MoGAT-2의 억제제임을 입증한다.

MOGAT-2 세포 검정의 억제 활성

세포 환경에서 인간 MoGAT-2에 대한 화합물의 억제 활성을 본 검정에서 평가하였다. 카코(Caco)-2는 인간 결장 암종 세포주이고, 장 상피 세포에 대한 모델로서 흔히 사용된다. 카코-2는 MoGAT-2를 발현하지 않으며, 따라서, 인간 MoGAT-2는 안정한 형질감염을 통해 상기 세포주 내로 조작되었다. MAG 유사체, 2-O-헥사데실글리세롤 (HDG)은 가수분해되지 않고 생성된 생성물은 질량 분광분석법으로 용이하게 모니터링되기 때문에, HDG를 세포 MoGAT-2 활성을 검출하는데 사용하였다. 기질을 초음파처리된 소포 형태의 DOPC와의 혼합물로서 사용하여 세포에 전달하였다.

카코2 세포를 100 mm 디쉬에 시딩하여 완전 배지 (3/1 DMEM: F12 + 10% FBS + 20 mM HEPES + 겐타마이신) 중에 24시간 후에 80% 전면생장되도록 하였다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠)을 사용하여 세포를 hMoGAT-2 플라스미드 (MOGAT-2-pCDNA3.1-Hygro)로 형질감염시켰다. 형질감염 혼합물에 6시간 노출 후, 세포를 PBS 중에서 3회 세척한 다음, 배지를 첨가하였다. 세포를 추가의 18시간 인큐베이션 동안 인큐베이션하고, 세포를 트립신화하고, 이를 100 mm 디쉬 내로 연속 희석하였다. 완전 배지 + 400 μg/ml 히그로마이신을 첨가하고, 클론이 나타날 때까지 인큐베이션하였다. 클론을 단리시키고, 24웰 디쉬에 옮기고, 전면생장으로 성장시켰다. 퀴아젠 RNAeasy(Qiagen RNAeasy) 키트를 사용하여 이들 클론으로부터 RNA를 제조하였다. 7900 시퀀스 검출 시스템(Sequence Detection System) (ABI) 상에서 ABI 목록화 검정 (HS00228262)을 사용하여 택맨(Taqman) 분석을 수행하였다. 이들 클론으로부터의 용해물을, 염소 폴리클로날 항체 (산타 크루즈(Santa Cruz), SC-32392)를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하여 MoGAT-2에 상응하는 38 kD 단백질인 인간 MoGAT-2 발현을 확인하였다.

2-O-헥사데실글리세롤 ("HDG", 바이오신스 케미스트리 앤드 바이올로지 (Biosynth Chemistry & Biology), # H-1806, 20 mg/ml의 562.7 μl) 및 DOPC (20 mg/ml의 14.3 ml)를 유리 튜브에서 클로로포름 중에 혼합하고, 먼저 N ₂ 기체 하에 및 이어서 감압 하에 추가 30분 동안 건조시켰다. 20 ml의 완충제 (150 mM 트리스-Cl pH 7.4, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA)를 건조된 HDG/DOPC 혼합물에 용액이 투명해질 때까지 초음파처리하면서 첨가하였다. 카코2 세포를 37℃, 5% CO ₂ 에서 밤새 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 플레이트 ("셀 플레이트") 내에 플레이팅하였다. 성장 배지를 제거하고, 세포를 2% BSA (시그마)를 함유하는 DMEMF12 (3:1) 배지 (깁코(GIBCO)) 93-0152DK) 중의 시험 화합물로 30분 동안 전처리하였다. 세포를 40 μM의 올레산 및 800 μM의 8.9:91.9 (몰비) HDG/DOPC를 함유하는 2% BSA DMEMF12 (3:1) 배지 중의 한 시험 화합물로 4시간 동안 처리하였다. 세포를 50 μl의 트립신 용액으로 트립신화하고, 50 μl의 PBS를 첨가하였다. 세포를 드라이 아이스 상에서 즉시 동결시키고, LC-MS 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 세포를 하기와 같이 클로로포름/메탄올로 추출하였다: 세포를 2 ml 플레이트에 옮기고; 세포 플레이트를 200 μL 메탄올로 세척한 다음, 메탄올 세척물을 2 ml 플레이트에 옮기고; 세포 플레이트를 200 μL PBS로 다시 세척하고, PBS 세척물을 2 ml 플레이트에 옮겼다. 클로로포름 (400 μL)을 내부 표준 (19.52 ng/mL) DAG (15:0,15:0 (시그마)), D5-TAG (39.03 ng/mL) CDN (16,16,16)과 함께 2 mL 플레이트에 첨가하였다. 밀봉된 2 mL 플레이트를 위 아래 (10x)로 돌린 다음, 볼텍싱하고, 회전시켰다. 400 μL의 하부 층을 2 mL 플레이트로부터 제거하고, 또 다른 플레이트 "최종 플레이트"의 웰에 첨가하였다. CHCl ₃ :MeOH (400 μL 2:1)를 2 mL 플레이트에 첨가하였다. 밀봉된 2 mL 플레이트를 다시 위 아래 (10x)로 돌린 다음, 볼텍싱하고, 회전시켰다. 220 μL의 하부 층을 2 mL 플레이트로부터 제거하고, 최종 플레이트에 첨가하였다. 최종 플레이트를 건조시키고, 500 mL의 IPA로 재구성하였다. 최종 플레이트를 밀봉하고, 5분 동안 진탕시켰다. 10 μl의 샘플을 최종 플레이트로부터 할로 C8 칼럼 (2.1 x 50, 2.7 uL 입자 크기) 상에 주입하였고, 이를 10 μL 루프를 갖는 립(Leap) 오토 샘플러를 사용하여 60℃에서 유지시키고, 시마즈 용매 전달 시스템에 접속시켰다. 채널을 모니터링하여 D5 C16 TAG 내부 표준 뿐만 아니라 에테르 TAG, 및 C52 및 C54 천연 TAG에 대한 데이터를 수집하였다. 용매 A는 80/20 H ₂ O/메탄올과 20 μM 아세트산암모늄이었다. 용매 B는 50/50 IPA/THF와 20 μM 아세트산암모늄이었다. 유량은 0.4 mL/분이었다. 세척 용매는 H ₂ O/MeOH 및 DCM이었다. 엑스칼리버(Xcalibur) 소프트웨어를 사용하여 관심 피크의 면적을 추출하고, 데이터를 엑셀로 송출하여, 이를 하기 식에 사용하였다: (에테르 TAG의 면적/C54 천연 TAG의 면적)/ IS의 면적. 이러한 비는 각각의 웰에서 세포 수의 변화량을 효과적으로 설명한다.

이 MOGAT-2 세포 기반 검정에 대한 결과는 표 7에서 하기에 제공되고, 표 7에 열거된 실시예가 세포 환경에서 인간 MoGAT-2를 억제하는 것으로 입증되었다.

<표 7>

*실험수

개 오일 볼루스 모델에서의 약리학적 효과

소장에서 발견된 MoGAT-2를 억제하는 것은 과도한 지방 섭취에 의해 유발되는 고트리글리세리드혈증을 치료하는데 유용할 수 있다. MoGAT-2의 억제는 트리글리세리드의 재합성을 파괴하고, 이는 장으로부터의 트리글리세리드의 분비를 감소시킨다. 따라서, MoGAT-2 억제는 신체를 통한 결과적인 순환을 위한 트리글리세리드의 장 내로의 결과적인 분비를 유발하는 특이적인 과정을 방해한다. 혈액계에서 측정 시에 장 내로의 TAG 분비를 유발하는 MoGAT-2를 억제하는 예시된 화합물 중 하나 이상의 능력을 평가하기 위해, 다음 프로토콜을 따를 수 있다:

21마리 수컷 비글을 각 연구에 등록시키고, 각 개가 9-13kg의 체중을 갖도록 선택하였다. 개들을 표준 광 주기 (12시간 명 및 12시간 암)로; 실온: 72 ± 8℉에서; 및 30% - 70% 상대 습도에서 케이지에 수용하였다. 연구 개시 이전에 16시간 동안 개를 금식시킨 다음, 공복의 개에게 비히클 (1% HEC, 0.25%, 트윈(Tween) 80, 소포제) 또는 상기 비히클 중 시험 화합물 중 하나를 투여하였다. 투여 1시간 후에 시간 0 샘플용으로 개를 채혈하였다 (경정맥으로부터 0.5 ml). 시간 0 샘플의 수집 직후에 개에게 올리브 오일 (시그마 카탈로그#: O-1514, 5 ml/kg)을 투여하였다. 화합물 / 비히클 투여 후 1.5, 2, 3, 5, 7 및 9시간에 얼음 상의 EDTA 튜브 내로 샘플을 수집하였다. 샘플을 15분 동안 9000 cpm에서 원심분리하고, 로슈 히타치(Roche Hitachi) 917을 사용하여 혈장 전체 트리글리세리드에 대해 분석하였다 (로슈 카탈로그 번호 1877771). 혈장 TAG18.1_18.1_18.1 측정을 위해, 샘플을 추출하고, 10 μL의 혈장을 사용하여 MoGAT-2 세포 검정에서 상기 기재된 것과 유사하게 LC/MS/MS 분석을 수행하였다.

분석물은 902.8 m/z의 질량을 갖는 TAG 18:1 18:1 18:1의 [M+NH4]+ 이온이고; 내부 표준은 829.8 m/z의 질량을 갖는 D5 TAG 16:0 16:0 16:0이다. TAG 18:1 18:1 18:1 상대량에서 902.8 m/z의 603.5 m/z 딸 이온 (TAG 18:1 18:1 18:1) 및 829.8 m/z의 556.5 m/z 딸 이온 (D5 TAG 16:0 16:0 16:0 내부 표준)의 비의 변화를 보고하였다. 전체 TAG AUC - 기준선 TAG AUC로부터의 순 혈장 TAG AUC를 그래프패드 프리즘4(Graphpad Prism4)를 사용하여 계산하였다: (순 AUC _TAG = 오일 볼루스 후 AUC _TAG - 0시간에서의 AUC _TAG ). 혈장 트리글리세리드의 퍼센트 억제를 다음과 같이 계산하였다: (순 TAG AUC의 오일 볼루스 군 평균 - 화합물 처리된 순 TAG AUC의 오일 볼루스 군 평균 / 순 TAG AUC의 오일 볼루스 군 평균) * 100. 최종 통계 분석은 대조군과의 비교를 위해 일원 아노바(One way Anova)의 던넷(Dunnett) 방법을 사용하였다. 모든 순 TAG AUC 값을 연구 내에 가변성을 제한하기 위해 비교용으로 순위 매겨진 평균된 AUC로 변환시켰다. 생체내에서 MoGAT-2 활성을 억제하고 TAG 흡수를 감소시키는 본 발명의 예시된 화합물의 능력은 본 검정에 따라 추가로 평가될 수 있다.

실시예 2를 이 모델에서 10 mg/kg 용량으로 평가하였다. 통계적으로 유의한 (p <0.05) 감소가 순환에서 트리글리세리드의 오일 볼루스-유도된 변동을 평가하는데 사용되는 파라미터 둘 다에 대해 관찰되었다. 결과는 다음과 같았다: 전체 트리글리세리드에서의 77% 감소 및 TAG 18.1_18.1_18.1에서의 67% 감소.

본 발명의 예시된 화합물은, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa. 1990]에서 발견된 바와 같은 용인된 관행에 따라 제약 조성물로 용이하게 제제화될 수 있다.

치료의 또는 다른 의료인은 치료를 필요로 하는 개인의 치료를 위한, 특히 고트리글리세리드혈증의 치료를 위한 화합물의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 바람직한 제약 조성물은 경구 투여를 위해 정제 또는 캡슐로 제제화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 본 발명의 화합물을 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 유효량으로 포함할 수 있다.