[0001] 本发明涉及一些杂环化合物、它们制备中所使用的方法和中间体、含有它们的药物组合物和它们在治疗中的用途。

[0002] 趋化因子在各种疾病和病症的免疫应答和炎性反应中起重要作用，这些疾病和病症包括哮喘和变应性疾病及自身免疫病理(autoimmune pathology)如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和动脉粥样硬化(atherosclerosis)。这些小的分泌出的分子属于8-14kDa蛋白质的不断增加的超家族，该超家族的特征为保守的半胱氨酸基序。目前，所述趋化因子超家族包括三个表现出特征性结构基序的组，即C-X-C、C-C和C-X3-C家族。所述C-X-C和C-C家族具有序列相似性并且根据NH-近端的半胱氨酸残基对之间的单个氨基酸插入彼此区分。所述C-X3-C家族基于在NH-近端的半胱氨酸残基对之间具有三个氨基酸插入而与其它两个家族区分开。

[0003] C-X-C趋化因子包括嗜中性粒细胞的几种强效化学引诱物和活化剂，例如白细胞介素-8(IL-8)和嗜中性粒细胞活化肽2(NAP-2)。

[0004] C-C趋化因子包括单核细胞和淋巴细胞(但不包括嗜中性粒细胞)的强效化学引诱物。实例包括人单核细胞趋化蛋白1-3(MCP-1、MCP-2和MCP-3)、RANTES(调节活化、正常T细胞表达和分泌的趋化因子(Regulated on Activation，Normal T Expressed and Secreted))、嗜酸性粒细胞活化趋化因子(eotaxin)和巨噬细胞炎症蛋白1α和1β(MIP-1α和MIP-1β)。

[0005] C-X3-C趋化因子(也称作fractalkine)为中枢神经系统(CNS)的小胶质细胞以及单核细胞、T细胞、NK细胞和肥大细胞中的强效化学引诱物和活化剂。

[0006] 研究已经表明，趋化因子的作用是通过G蛋白偶联受体的亚家族介导的，在这些受体中有称为如下的受体：CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11(对于C-C家族y)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5(对于C-X-C家族)和CX3CR1(对于C-X3-C家族)。由于调节这些受体的药物可用于治疗例如以上提及的那些病症和疾病，因此这些受体是药物开发的良好目标。

[0007] PCT专利申请WO2004/011443、WO2006/024823和WO2010/007427披露了用作趋化因子受体的调节剂的嘧啶基磺酰胺衍生物。

[0008] 本发明现提供化合物，所述化合物为：(a)式(I)的吡啶磺酰胺，或(b)其药用盐。

[0009]

[0010] 本发明的代表性化合物在狗中表现出意料不到长的半衰期。在临床前物种(例如狗)中的长半衰期表明在人中的长半衰期是可获得的(Obach et al.(1997),J.Pharmacol.Exp.Ther.,283:46-58)。在人中超过12小时的半衰期与每日给药一次相称。

[0011] 此外，为了拮抗人中的靶标受体并因此产生所期望的生物作用，化合物在血浆中应以足以抑制受体功能的浓度存在，并且该浓度必须维持足够长的时间以在两次给药的间期内保持受体抑制。因此，化合物应表现出高效与长半衰期的组合。本发明的代表性化合物表现出在狗中的高效和长测量半衰期的组合。

[0012] 引起所需作用的最小浓度为Cmin，给药期(例如，对于每日一次为24小时)结束时维持Cmin的血浆中达到的最大浓度为Cmax。因此，小的Cmax/Cmin比(由长半衰期所致)是有利的，这是因为高Cmax水平更可能造成不利作用。本发明化合物经预测具有小的Cmax/Cmin比。

[0013] 另一方面，本发明化合物为非盐形式的式(I)化合物。

[0014] 在本发明中，应当理解的是，本发明化合物可表现出互变异构现象并且本说明书中的结构式可仅代表可能的互变异构形式中的一种。应当理解的是，本发明涵盖任意互变异构形式和它们的混合物，并且不仅仅限于所述式内使用的任意一种互变异构形式。

[0015] 本发明化合物的药用盐可包括用药用无毒碱例如无机碱或有机碱制备的盐。从无机碱衍生的盐可为例如铝盐、钙盐、钾盐、镁盐、钠盐或锌盐。用无机碱衍生的盐可为例如伯胺的盐、仲胺的盐或叔胺的盐。

[0016] 本发明化合物的药用盐可在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过使所述化合物单独与适当的碱反应并分离由此形成的盐来制备。

[0017] 本发明化合物可按溶剂化物(例如水合物)来制备并且本发明涵盖所有所述溶剂化物。

[0018] 本发明化合物可按式(I)化合物的体内可水解酯的形式存在。

[0019] 含有羟基的本发明化合物的体内可水解酯为例如在人或动物体内水解产生母体醇的药用酯。

[0020] 含有羟基的本发明化合物的体内可水解酯包括无机酯例如磷酸酯(包括氨基磷酸环酯)和α-酰基氧基烷基醚，以及相关化合物(其是由所述酯体内水解裂解得到母体羟基产生的)。α-酰基氧基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基和2,2-二甲基丙酰基氧基-甲氧基。与羟基形成体内可水解酯的基团包括烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和取代的苯甲酰基和苯基乙酰基、烷氧基羰基(得到烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。

[0021] 本发明化合物可按结晶形式存在。因此，根据本发明另一方面，其提供基本结晶形式的式(I)化合物或其药用盐。

[0022] 当本申请提及本发明化合物为结晶的时，通过X-射线粉末衍射数据所确定的结晶度适当地为例如大于约60%，例如大于约80%，特别是大于约90%，更特别地大于约95%。在本发明的实施方案中，通过X-射线粉末衍射数据确定的结晶度大于约98%，其中结晶度(%crystallinity)是指总样品物质中结晶的重量%。

[0023] 本申请上文提到，式(I)化合物可按为无水物的结晶形式来制备。这意味着所述结晶形式含有小于10%的式(I)化合物的一种或多种水合物形式(例如，一水合物)。

[0024] 本发明另一方面提供式(I)化合物的基本结晶的无水物(anhydrate)形式。在另一方面中，式(I)化合物不是盐形式。在另一方面中，式(I)化合物不是溶剂化物形式，即，其为“非溶剂化物(ansolvate)”。因此，术语“无水物”包括“非溶剂化物”。

[0025] 本发明另一方面提供式(I)化合物的无水结晶形式，其特征在于差式扫描量热曲线(在密闭的铝杯中在氮气气氛中，加热速度为每分钟10℃)表现出约176℃的熔化吸热起始温度。

[0026] 本发明另一方面提供式(I)化合物的结晶形式，其特征在于用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图包含以下具有近似2-θ值(°)的特征峰。

[0027] N-(6-((2R,3S)-3,4-二 羟 基 丁-2- 基 氧 基)-2-(4- 氟 苄 基 硫 基) 嘧啶-4-基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺的结晶形式A(下文中称‘形式A’):特征性差式扫描量热曲线(在密闭的铝杯中在氮气气氛中，加热速度为每分钟10℃)表现出约176℃的熔化吸热起始温度。

[0028] 在另一个方面中，形式A具有用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图，所述衍射图具有以下位置(2-θ°)的特征峰：8.5、9.7、10.6、17.1、19.9和21.2。

[0029] 在另一个方面中，形式A具有用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图，所述衍射图具有以下位置(2-θ°)的特征峰：8.5、9.7、10.6、17.1、19.9和21.2。

[0030] 在另一个方面中，形式A具有用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图，所述衍射图具有选自以下位置(2-θ°)的至少三个特征峰：8.5、9.7、10.6、17.1、19.9和21.2。

[0031] 在另一个方面中，形式A具有用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图，所述衍射图具有选自以下位置(2-θ°)的至少两个特征峰：8.5、9.7、10.6、17.1、19.9和21.2。

[0032] 在另一个方面中，形式A具有用波长 的X-射线测量的X-射线粉末衍射图，所述衍射图具有选自以下位置(2-θ°)的至少一个特征峰8.5、9.7、10.6、17.1、19.9和21.2。

[0033] 在另一个方面中，形式A包含用波长 的X-射线测量的如图1所示的X-射线粉末衍射图特征峰。

[0034] 在另一个方面中，形式A包括基本如图2所示的特征性差式扫描量热曲线。

[0035] 适当地，本发明化合物的结晶变化形式(crystalline modification)基本不含所述化合物的其它结晶变化形式。适当地，式(I)化合物的所述结晶变化形式包含小于例如20重量%，15重量%，10重量%，5重量%，3重量%或特别是小于1重量%的该化合物的其它结晶形式。

[0036] 式(I)化合物的结晶无水物可如本申请所述通过用一种或多种适当的溶剂或它们的混合物结晶式(I)化合物来制备。无水物可通过用基本不含水的溶剂系统(其可以是已被干燥过和/或可以是已在所述结晶过程中被干燥)结晶来制备。溶剂可在结晶过程中被干燥，例如通过降低待结晶的化合物于适当有机溶剂/含水溶剂系统中的混合物中的含水量(例如，通过增加所存在的有机溶剂的量和/或通过形成共沸混合物在连续蒸馏的条件下除去水)。然而，式(I)化合物的结晶无水物也可用水和/或水/醇混合物来制备。

[0037] 无水物形式的本发明化合物通常含有不多于2%，具体地不多于1%，更具体地不多于0.5%和更具体地不多于0.2%(w/w)的水，而不论所述水是否是结合的(结晶水或其它形式)。

[0038] 为了确保所制备的本申请所述的结晶形式中不存在其它结晶形式，结晶可如下进行：通过在不存在其它结晶形式的晶核和/或晶种(seed crystals)的情况下用所期望结晶形式的晶核和/或晶种进行引晶。

[0039] 本领域技术人员将会理解的是，待结晶的化合物于溶液中的浓度和所用的溶剂系统可影响结晶温度和结晶时间。

[0040] 在任意给定的温度，不同的结晶形式在不同的有机溶剂中可能具有不同的溶解度。在该方面中，上述或其它溶剂可被用作"抗溶剂"(即，本发明化合物难溶(poorly soluble)其中的溶剂，但所述溶剂可与本发明化合物较易溶于其中的另一种溶剂混溶)，并可因此有助于所述结晶过程。

[0041] 正如本领域技术人员所理解的，所得到的结晶形式既依赖于所述结晶过程的动力学又依赖于所述结晶过程的热力学。在某些热力学条件下(溶剂系统、温度、压力和本发明化合物的浓度)，一种结晶形式可能比另一种结晶形式(或事实上任一种其它结晶形式)更稳定。然而，相比之下可能具有相对低热力学稳定性的其它结晶形式可能是动力学有利的。因此，动力学因素例如时间、杂质分布、搅动、晶种存在与否等也额外可能影响出现哪种形式。因此，本申请讨论的操作也可由本领域技术人员视需要进行调整，目的是获得式(I)化合物的具体结晶形式。

[0042] 可用标准技术干燥本发明化合物。本领域技术人员理解的是，干燥温度和干燥时间可影响本发明化合物的固态性质和/或固态形式。例如，脱水可在低湿度和/或升高的温度和/或降低的压力下发生。因此，本发明化合物的结晶无水物也可通过使水合物脱水来形成。

[0043] 本发明化合物的制备与表征可如下所述进行，通过调整本领域已知的方法或通过使用或调整实施例中所述的制备方法。例如如下文中所述，可使用X射线粉末衍射(XRPD)法容易地对本发明化合物的不同结晶形式进行表征。也可使用标准DSC技术。

[0044] 可通过遵循下面方案1中所提供的方法和本申请所述实施例中的方法来制备本发明化合物。

[0045]

[0046] 方案1

[0047] (i)乙酸钠，水，乙腈；

[0048] (ii)三氯氧化磷，苄基三乙基氯化铵，二甲氧基乙烷；

[0049] (iii)氢化钠，四氢呋喃；

[0050] (iv)碳酸铯，二环己基(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦，三(二亚苄基丙酮)二钯(0)，二噁烷；

[0051] (v)三氟乙酸，二氯甲烷。

[0052] 式(II)和(III)化合物是商购的或可用本领域技术人员熟悉的方法来合成。

[0053] 式(VI)化合物可用自先前文献中描述的方法改变所得的操作来制备(参见 例 如 Mulzer,J.et al,Liebigs Ann.Chem.,1987,7-14；Braun,M.et al,Liebigs Annalen,1995,1,29-40；Wang,B-L.et al,Tetrahedron,2007,63(51),12671-12680)。可选择地，式(VI)化合物可通过遵循下面方案2、方案3和方案3’和本申请所述实施例中提供的方法来制备:

[0054]

[0055] 方案2

[0056]

[0057] 方案3

[0058] 其中Z选自2,3,4-三-C1-4烷氧基苯基、2,4,5-三-C1-4烷氧基苯基、2,4,6-三-C1-4烷氧基苯基、3,4,5-三-C1-4烷氧基苯基、2,3-二-C1-4烷氧基苯基、2,4-二-C1-4烷氧基苯基、2,5-二-C1-4烷氧基苯基、2,6-二-C1-4烷氧基苯基、3,4-二-C1-4烷氧基苯基、3,5-二-C1-4烷氧基苯基、3,6-二-C1-4烷氧基苯基、4-苯基苯基、2-C1-4烷氧基苯基、3-C1-4烷氧基苯基、4-C1-4烷氧基苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、3,5-二硝基苯基、
1-萘甲酸基和2-萘甲酸基。具体地，Z选自3,4,5-三-C1-4烷氧基苯基、4-苯基苯基、4-C1-4烷氧基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基和3,5-二硝基苯基。在一个方案中，Z中的C1-4烷基独立地选自甲基和乙基，和Z中的C1-4烷氧基独立地选自甲氧基和乙氧基。在一个方面中，Z为3,4,5-三甲氧基苯基。

[0059] 方案3中所示的方法的一个具体方面显示在方案3’中。

[0060]

[0061] 方案3’

[0062] 其中R’为C1-4烷基。具体地，R’独立地选自甲基和乙基。在另一个方面中，R’为甲基。

[0063] 方案3中说明的用于制备式(VI)化合物的新方法较先前的方法具有步骤数目更少的益处。因此，本发明另一个方面为从式(XII)化合物制备式(VI)化合物。本发明另一个方面为从式(XI)化合物制备式(VI)化合物。本发明另一个方面为从式(XII’)化合物制备式(VI)化合物。本发明另一个方面为从式(XI’)化合物制备式(VI)化合物。

[0064] 可通过遵循本申请所述实施例中提供的方法来制备式(VIII)化合物。本发明另一个方面提供化合物，所述化合物为(a)式(VIII)的氮杂环丁烷磺酰胺，或者(b)其盐，下文中称作“本发明中间体”。

[0065] 在方案3中，将E-巴豆醇常规地用干燥剂预干燥。适当干燥剂的实例为分子筛(例如， (埃)分子筛)。所述预干燥的E-巴豆醇可在有机溶剂中，在异丙氧基钛存在下与L-(+)-二-异丙基酒石酸酯或L-(+)-叔丁基酒石酸酯反应，然后与有机过氧化物例如氢过氧化枯烯反应，接着与Z-COOH反应，得到式(XI)化合物。在一个方面中，该步骤中的溶剂和反应物中的总水含量相对于E-巴豆醇而言不超过0.038摩尔当量。

[0066] 可通过以下方法将式(XI)化合物转化成式(XII)化合物：在有机溶剂中，在酸催化剂(catalytic acid)例如对甲苯磺酸的存在下，使式(XI)化合物与二甲氧基丙烷反应，并且随后加入温和的碱水溶液例如碳酸氢钾水溶液。可选择地，可使用非水性碱，然后进行水性后处理。

[0067] 式(XII)化合物可通过与碱反应转化成式(VI)化合物。适当的碱为例如氢氧化钠。

[0068] 式(XI’)化合物或其盐为新的并且形成了本发明的另一个方面。式(XII’)化合物或其盐为新的并且形成了本发明的另一个方面。

[0069] 本发明另一个方面提供的是本发明中间体在制备调节趋化因子受体活性的化合物中的用途。本发明另一方面提供的是本发明中间体在制备式(I)化合物或其药用盐中的用途。

[0070] 本发明化合物具有作为药物的活性，具体是作为趋化因子受体(特别是CXCR2)活性的调节剂的用途，并且可用于在人和非-人动物中处置(治疗性或预防性)病症/疾病，所述病症/疾病因趋化因子的过度或失调产生而加剧或是因趋化因子的过度或失调产生导致的。所述病症/疾病的实例包括(其中每种病症/疾病独立地作为实例给出或以它们的任意组合形式给出):

[0071] (1).呼吸道：气道阻塞性疾病，包括慢性阻塞性肺病(COPD)；哮喘例如支气管哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘和粉尘性哮喘，特别是慢性或顽固性哮喘(例如迟发型哮喘和气道高反应性)；支气管炎；急性过敏性萎缩性鼻炎和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎、肥大性鼻炎、化脓性鼻炎、干燥性鼻炎和药物性鼻炎；膜性鼻炎包括格鲁布性(croupous)鼻炎、纤维蛋白性(fibrinous)鼻炎和假膜性鼻炎和腺病性鼻炎；季节性过敏性鼻炎，包括神经性鼻炎(花粉热)和血管运动性鼻炎；结节病、农民肺和相关疾病、纤维化肺和特发性间质性肺炎；

[0072] (2).骨和关节：类风湿性关节炎、骨关节炎、血清阴性脊柱关节病(包括强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎和莱特病(Reiter’s disease)、贝切特病(Behcet’s disease)、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)和全身性硬化；

[0073] (3).皮肤：牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎或其它湿疹性皮肤病、脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱性天疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿(angiodermas)、血管炎、红斑、皮肤嗜酸粒细胞增多、葡萄膜炎、斑秃或春季结膜炎；

[0074] (4)胃肠道：腹部疾病、直肠炎、嗜酸性胃肠炎、肥大细胞增多症、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、肠易激病(irritable bowel disease)、非炎症性腹泻、具有远离肠作用的食物相关变态反应(例如偏头痛、鼻炎或湿疹)；

[0075] (5)中枢和外周神经系统：神经变性疾病和痴呆病，例如阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化和其它运动神经元病、克-雅病
(Creutzfeldt-Jacob’s disease)和其它阮病毒病、HIV脑病(AIDS痴呆综合征)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、额颞痴呆(frontotemporal dementia)、卢伊体痴呆(Lewy body dementia)和血管性痴呆；多发性神经病例如吉-巴综合征(Guillain-Barrésyndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy)、多灶性运动神经病(multifocal motor neuropathy)、神经丛病(plexopathies)；CNS脱髓鞘，例如多发性硬化症、急性播散性/出血性脑脊髓炎和亚急性硬化性全脑炎；神经肌肉障碍，例如重症肌无力和兰-伊综合征(Lambert-Eaton syndrome)；脊椎病，例如热带痉挛性轻瘫症和僵体综合征；瘤外综合征，例如小脑变性和脑脊髓炎；CNS创伤；偏头痛；和中风；

[0076] (6).其它组织和系统疾病-动脉粥样硬化、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、红斑狼疮、全身性狼疮、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、I型糖尿病、肾病综合征、嗜酸性筋膜炎、高IgE综合征、瘤型麻风和特发性血小板减少性紫癜；手术后粘连和脓毒症；

[0077] (7).同种异体移植物排斥：在例如肾脏、心脏、肝脏、肺脏、骨髓、皮肤或角膜移植后后出现的急性和慢性同种异体移植物排斥；或慢性移植物抗宿主病；

[0078] (8).癌症：特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、恶性黑色素瘤、前列腺癌和鳞状细胞肉瘤和肿瘤转移、非黑素瘤性皮肤癌和化学预防转移酶(chemoprevention metastase)；

[0079] (9)疾病-其中，血管发生与升高的CXCR2趋化因子水平相关(例如，NSCLC，糖尿病性视网膜病)；

[0080] (10)囊性纤维化病；

[0081] (11)烧伤&慢性皮肤溃疡；

[0082] (12)再生性疾病–例如排卵障碍、月经障碍和植入障碍、早产障碍、子宫内膜异位障碍；

[0083] (13)再灌注损伤-在心脏、脑、四肢和其它器官中的再灌注损伤，抑制动脉粥样硬化。

[0084] 因此，本发明提供式(I)化合物或其药用盐，其用在治疗中。

[0085] 因此，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其互变异构体或其药用盐，其用在治疗中。

[0086] 便利地，本发明化合物用于治疗其中趋化因子受体属于CXC趋化因子受体亚家族的疾病，更便利地，靶标趋化因子受体为CXCR2受体。

[0087] 可用本发明化合物治疗的具体病症为癌症、血管发生与升高的CXCR2趋化因子水平相关的疾病和炎症性疾病例如哮喘、过敏性鼻炎、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、骨关节炎或骨质疏松。当上面所列的每种病症/疾病独立地作为实例给出或以它们的任意组合形式给出时，其代表本发明的独立实施方案。

[0088] 本发明化合物也可用于治疗趋化因子受体属于CCR趋化因子受体亚家族的疾病，更便利地，所述靶标趋化因子受体为CCR2b受体。

[0089] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐，其用作药物。

[0090] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐，其用作用于治疗调节趋化因子受体活性是有利的人类疾病或病症的药物。

[0091] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐，其用作用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、癌症、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、骨关节炎或骨质疏松的药物。

[0092] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗的药物中的用途。

[0093] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗调节趋化因子受体活性是有利的人类疾病或病症的药物中的用途。

[0094] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、癌症、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、骨关节炎或骨质疏松的药物中的用途。

[0095] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗哮喘、过敏性鼻炎或COPD的药物中的用途。

[0096] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗COPD的药物中的用途。

[0097] 在另一个方面中，本发明提供如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐在制备用于治疗哮喘的药物中的用途。

[0098] 在本说明书的上下文中，除非给出相反的具体说明，术语"治疗"也包括预防。术语"治疗的"和"治疗地"应该相应地解释。

[0099] 本发明进一步提供治疗趋化因子介导的疾病的方法，其中所述趋化因子结合于趋化因子受体(特别是CXCR2)，所述方法包括向患者给药治疗有效量的本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐。

[0100] 本发明也提供在患有或处于炎症性疾病尤其是哮喘、过敏性鼻炎、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、骨关节炎或骨质疏松的风险中的患者中治疗所述疾病的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐。

[0101] 本发明也提供在患有或处于炎症性疾病尤其是哮喘、过敏性鼻炎或COPD的风险中的患者中治疗所述疾病的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐。

[0102] 对于上述治疗用途，所给予的剂量理所当然地会随所使用的化合物、给药模式、所期望的治疗和适应症而变化。

[0103] 式(I)化合物及其药用盐可单独使用，但通常是以药物组合物的形式给予，在所述药物组合物中，式(I)化合物/盐(活性成分)与药用助剂、稀释剂或载体缔合。基于给药模式，所述药物组合物可便利地包含例如0.05至99%w(重量百分比)，更便利地为0.05至80%w，甚至更便利地为0.10至70%w，和更便利地为0.10至50%w活性成分，所有重量百分比都是基于总组合物。

[0104] 本发明还提供药物组合物，其包含本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐和药用助剂、稀释剂或载体。

[0105] 本发明进一步提供制备本发明药物组合物的方法，所述方法包括将本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐与药用助剂、稀释剂或载体混合。所述药物组合物可以溶液剂、混悬剂、七氟烷气雾剂和干粉制剂的形式局部给药(例如，给药于肺和/或气道或给药于皮肤)；或全身给药，例如通过以片剂、胶囊剂、糖浆剂、粉末剂或颗粒剂的形式口服给药，或通过以溶液剂或混悬剂的形式非经肠给药，或通过皮下给药或通过以栓剂的形式直肠给药或透皮给药。便利地，本发明化合物口服给药。

[0106] 除了它们作为治疗药的用途，式(I)化合物和它们的药用盐也在用于评估趋化因子调节活性在实验室动物(例如猫、狗、兔、猴子、大鼠和小鼠)中的作用的体外和体内试验系统的开发和标准化中用作药理学工具，其为进行新治疗药研究的一部分。

[0107] 本发明进一步涉及联用疗法，其中将式(I)化合物其药用盐或包含式(I)化合物的药物组合物或制剂与用于治疗以下任一种疾病的疗法和/或药物同时或依次给药，所述疾病为：哮喘、过敏性鼻炎、癌症、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、肠易激综合征、骨关节炎或骨质疏松。

[0108] 本发明还提供药物组合物，其包含如本申请前面所定义的式(I)化合物或其药用盐和药用助剂、稀释剂或载体。

[0109] 除了它们作为治疗药的用途，式(I)化合物和它们的药用盐也在用于评估趋化因子调节活性在实验室动物(例如猫、狗、兔、猴子、大鼠和小鼠)中的作用的体外和体内试验系统的开发和标准化中用作药理学工具，其为进行新治疗药研究的一部分。

[0110] 本发明进一步涉及联用疗法，其中将式(I)化合物其药用盐或包含式(I)化合物的药物组合物或制剂与用于治疗以下任一种疾病的疗法和/或药物同时或依次给药，所述疾病为：哮喘、过敏性鼻炎、癌症、COPD、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、肠易激综合征、骨关节炎或骨质疏松。

[0111] 具体地，为了治疗炎性疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、肠易激综合征、COPD、哮喘和过敏性鼻炎，将本发明化合物与下列药物联用：TNF-α抑制剂(例如抗TNF单克隆抗体(例如英夫利昔单抗(Remicade)、CDP-870和D2E7)和TNF受体免疫球蛋白分子(例如依那西普(Enbrel))，非选择性COX-1/COX-2抑制剂(例如吡罗昔康或双氯芬酸；丙酸类，例如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬或布洛芬；芬那酸类(fenamate)，例如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸或阿扎丙宗；吡唑酮类，例如保泰松；水杨酸盐(酯)，例如阿司匹林)，COX-2抑制剂(例如美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔或艾托考昔)，低剂量氨甲蝶呤，来氟米特(lefunomide)；环索奈德，羟氯喹，右旋青霉胺(d-penicillamine)，或金诺芬或非经肠给药的金或口服给药的金。对于炎症性肠病和肠易激综合征，其它便利的药物包括柳氮磺吡啶和5-ASAs、局部和全身类固醇类、免疫调节剂和免疫抑制剂、抗生素类、probiotics和抗-整联蛋白。

[0112] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪氧化酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪氧化酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂，例如齐留通，ABT-761，芬留顿，替泊沙林，Abbott-79175，Abbott-85761，N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺酰胺，2,6-二叔丁基苯酚腙，甲氧基四氢吡喃，例如Zeneca ZD-2138，化合物SB-210661，吡啶基取代的2-氰基萘化合物，例如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，例如L-746,530；或吲哚或喹啉化合物，例如MK-591，MK-886或BAY×1005。

[0113] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：白三烯LTB4、LTC4、LTD4或LTE4的受体拮抗剂，选自吩噻嗪-3-酮，例如L-651,392；脒基化合物，例如CGS-25019c；苯并噁胺(benzoxalamine)，例如昂唑司特；苯甲脒(benzenecarboximidamide)，例如BIIL284/260；或化合物，例如扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP45715A)或BAY×7195。

[0114] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：PDE4抑制剂，包括同工型PDE4D的抑制剂。

[0115] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：抗组胺性H1受体拮抗剂，例如西替利嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿司咪唑、氮 斯汀或氯苯那敏。

[0116] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：胃保护性H2受体拮抗剂。

[0117] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：α1-和α2-肾上腺素受体激动剂、血管收缩药、拟交感神经药，例如丙己君、苯福林、苯丙醇胺、伪麻黄碱、盐酸萘甲唑啉、盐酸羟甲唑啉、盐酸四氢唑啉、盐酸木甲唑啉或盐酸乙基去甲肾上腺素。

[0118] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：抗胆碱能药，例如异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平或替仑西平。

[0119] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：β1-至β4-肾上腺素受体激动剂，例如间羟异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、异丙去甲肾上腺素、阿布叔醇、沙丁胺醇、福莫特罗、沙美特罗、特布他林、奥西那林、甲磺酸比托特罗或吡布特罗；甲基黄嘌呤，包括茶碱和氨茶碱；色甘酸钠；或毒蕈碱受体(M1、M2和M3)拮抗剂。

[0120] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：I型胰岛素样生长因子(IGF-1)模拟物。

[0121] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：全身性副作用减小的吸入性糖皮质激素，例如泼尼松、泼尼松龙、氟尼缩松、曲安奈德、二丙酸倍氯美松、布地奈德、丙酸氟替卡松或糠酸莫米松。

[0122] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂，所述基质金属蛋白酶(MMP)为例如溶基质蛋白酶(stromelysin)、胶原酶或明胶酶或蛋白聚糖酶(aggrecanase)；特别是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、溶基质蛋白酶-1(MMP-3)、溶基质蛋白酶-2(MMP-10)和溶基质蛋白酶-3(MMP-11)或MMP-12。

[0123] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：趋化因子受体功能的其它调节剂，所述趋化因子受体为CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11(对于C-C家族)；CXCR1、CXCR3、CXCR4和CXCR5(对于C-X-C家族)和CX3CR1(对于C-X3-C家族)。

[0124] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：抗病毒药，例如奈非那韦、AZT、阿昔洛韦和泛昔洛韦和防腐化合物例如Valant。

[0125] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：心血管药物例如钙通道阻断剂、降脂药物例如他汀类、贝特类、β-阻断剂、ACE抑制剂、加压素-2受体拮抗剂和血小板聚集抑制剂。

[0126] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：CNS药物例如抗抑郁药(例如舍曲林)、抗-帕金森药物(例如司来吉兰、L-多巴、Requip、Mirapex、MAOB抑制剂例如司来吉兰(selegine)和雷沙吉兰、comP抑制剂例如托卡朋、A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、多巴胺激动剂和神经元一氧化氮合酶的抑制剂)和抗-阿尔茨海默氏病例如多奈哌齐、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或metryfonate。

[0127] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：(i)类胰蛋白酶(tryptase)抑制剂；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗剂；(iii)白介素转化酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)MAP激酶抑制剂；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽B1受体和激肽B2受体拮抗剂；(x)抗痛风药，例如秋水仙碱；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌醇；(xii)排尿酸药，例如丙磺舒、磺吡酮或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌剂；(xiv)转化生长因子(TGFβ)；(xv)血小板源性生长因子(PDGF)；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(xviii)辣椒素油(capsaicin cream)；(xix)速激肽NK1受体和速激肽NK3受体拮抗剂，选自NKP-608C；SB-233412(他奈坦(talnetant))；和D-4418；(xx)弹性酶抑制剂，选自UT-77和ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂(TACE)；(xxii)诱导的一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂；或(xxiii)TH2细胞上表达的化学引诱物受体同源分子(CRTH2拮抗剂)。

[0128] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：抗骨质疏松药，例如雷洛昔芬(roloxifene)、屈洛昔芬、拉索昔芬或fosomax；和免疫抑制剂例如FK-506,雷帕霉素、环胞霉素(cyclosporine)、硫唑嘌呤或氨甲喋呤。

[0129] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用：用于治疗骨关节炎的现有治疗药物。用在联用中的适当药物包括标准的非甾类抗炎药(下文称为NSAID’s)，例如吡罗昔康、双氯芬酸；丙酸类，例如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬或布洛芬；芬那酸类，例如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸或阿扎丙宗；吡唑酮类，例如保泰松；水杨酸盐(酯)，例如阿司匹林；COX-2抑制剂，例如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔或艾托考昔；止痛药或关节内治疗药，例如皮质类固醇或透明质酸，例如海尔根(hyalgan)或欣维可(synvisc)；或P2X7受体拮抗剂。

[0130] 本发明还涉及本发明化合物与以下药物的联用:用于治疗癌症的现有治疗药物。用在联用中的适当药物包括:

[0131] (i)在医用肿瘤学中使用的抗增殖/抗肿瘤药或其组合，例如烷基化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安或亚硝基脲)；抗代谢剂(例如抗叶酸剂，例如氟嘧啶样5-氟尿嘧啶或替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲、吉西他滨或紫杉醇(( )))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素，例如阿霉素、博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、更生霉素或光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花属生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春地辛或长春瑞滨，和紫杉烷，例如泰素(taxol)或泰索帝(taxotere))；和拓扑同工酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷、安沙可林、托泊替康或喜树碱)；

[0132] (ii)细胞生长抑制药，例如抗雌激素药(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬或iodoxyfene)；雌激素受体下调剂(例如氟维司群)；抗雄激素药(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特或乙酸环丙孕酮)；LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林或布舍瑞林)；孕激素(例如乙酸甲地孕酮)；芳构酶(aromatase)抑制剂(例如为阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)或依西美坦)；或5α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺)；

[0133] (iii)抑制癌细胞侵入的药物(例如金属蛋白酶抑制剂(例如马立马司他)或尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能抑制剂)；

[0134] (iv)生长因子功能抑制剂，例如：生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗TMerbb2抗体曲妥单抗[Herceptin ]或抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])；法尼基转移酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼,AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼(erlotinib),OSI-774)或6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟
苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))；血小板源性生长因子家族抑制剂；
或肝细胞生长因子家族抑制剂；

[0135] (v)抗血管生成药，例如抑制血管内皮生长因子的作用的抗血管生成药(例TM如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[Avastin ]、在国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856或WO98/13354中披露的化合物)；或通过另一种机制发挥作用的化合物(例如利诺胺、整联蛋白αvβ3功能抑制剂或血管生长抑素(angiostatin))；

[0136] (vi)血管损伤剂，例如考布他汀A4或在国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434或WO02/08213中披露的化合物；

[0137] (vii)反义疗法，例如指向以上所列靶标之一的反义疗法，例如ISIS2503、抗ras反义物；

[0138] (viii)基因治疗方法，包括例如：置换异常基因(例如异常的p53或异常的BRCA1或BRCA2)的方法；GDEPT(基因介导的酶前药治疗)方法，例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的GDEPT方法；和提高患者化疗或放疗耐受的方法，例如多种药物抵抗基因疗法；或

[0139] (ix)免疫治疗方法，包括例如：提高患者肿瘤细胞免疫原性的活体外和体内方法，例如用细胞因子(例如白介素2、白介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)转染；降低T细胞无反应性的方法；使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的树突细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；和使用抗个体基因型抗体的方法。

[0140] 现在通过参考下面的:具体描述、实施例和生物数据来说明(但不限制)本发明。

[0141] 具体描述

[0142] 下表总结了所测量的本发明化合物的体外效力和所测量的狗体内半衰期。

[0143]

[0144] 在临床前物种(例如狗)中的长半衰期表明在人中的基本相当的半衰期是可获得的(Obach et al,1997)。本发明化合物在狗中测量的半衰期为3.7小时。

[0145] 此外，为了在给药间隔内产生所期望的生物作用，化合物除长半衰期外还必须表现出高效力。本发明化合物表现出高效力(pIC508.4)和在狗中所测量的长半衰期(3.7小时)的必要组合。

[0146] 生物数据

[0147] 效力(pIC50)-配体结合测定

[0148] 将来自American Type Culture Collection的人胚胎肾293细胞(HEK293细胞)用人CXCR2cDNA(RefSeqNM_001557)(先前已克隆到真核表达载体pIRES-Neo2中(Clontech))转染。选择抗遗传霉素(Invitrogen)细胞种群进行CXCR2的稳定表达，并且通过在96-孔组织培养板中进行的稀释克隆法(0.3个细胞/孔)来生成克隆。

[0149] 在10ml冰冷却的低渗缓冲液(20mM HEPES，1mM EDTA，0.1mM DTT，0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物和0.1mg/L杆菌肽，pH7.4)中用5mM丁酸钠预处理24小时并使其膨胀10分钟后，收集最高表达克隆(克隆6，通过FACS分析识别的)的细胞。离心后(200g,5min,4℃)，将细胞重新悬浮在低渗缓冲液中并用polytron组织匀浆机(处理3x10秒)准备膜。将所述匀浆离心(200g,10min,4℃)以除去细胞碎片，将所得上清液高速(15,000g,60min,4℃离心。将膜重新悬浮在低渗缓冲液中，在Dounce匀浆机中匀化10次并在-80℃贮存。

[0150] 所有测定都是在黑色、384-孔板(Greiner)中进行的。在冰上，将CXCR2膜与凝集素生物素预混合1小时。将SpheroTM珠子(抗生物素蛋白链菌素聚苯乙烯颗粒,6.0-8.0μm)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤并在旋转器上在室温用CXCR2膜-凝TM
集素生物素混合物预涂覆30分钟。将膜-涂覆的Sphero 珠子在PBS(1900g,5min)中
647
洗涤两次并与最终测定浓度为1nM的化合物Alexa IL-8(Albachem)和测定缓冲液(汉克斯平衡盐溶液(Invitrogen)，其含有10m MHEPES,0.1%(w/v)明胶和0.25mg/ml杆菌肽,pH7.4)连续稀释来孵育。所述测定是在1.25%(v/v)二甲基亚砜(DMSO)存在下在40μl
647
最终体积中进行的。在不存在竞争化合物的情况下确定Alexa IL-8的总结合并且在存在0.3μM1-(4-氯-2-羟基-3-氨磺酰基-苯基)-3-(2,3-二氯苯基)脲的情况下确定
647
Alexa IL-8的非特异性结合。将所述板在室温孵育2.5小时，然后在FMAT8200(Applied
647
BioSystems)上读数。确定pIC50值，其为使特异性Alexa IL-8结合减少50%所需的化合物摩尔浓度的负对数。

[0151] 使用上述方案，本发明化合物经发现具有8.4的pIC50值。

[0152] 狗半衰期(测量值)

[0153] 下面描述了用于在雄性Beagle狗内获得体内药代动力学参数的方法。其适用于任意化合物但可需要基于诸如溶解度、测定敏感性、预期清除率和半衰期这样的参数进行调整，此时缺省制剂(default formul ation)、剂量水平或取样间期可能是不适当的。本申请描述的方法代表了标准方法，可对该标准方法进行经确证的和有文献记载的调整。

[0154] 剂量制备

[0155] 制备1mg·mL-1的标准剂量溶液。推荐的剂量媒介物(如果所述化合物在等渗盐水中不是充分可溶的)为10%DMSO:90%无菌水或盐水，其中用1MHCl或NaOH进行pH调节。将所需质量的化合物溶解在DMSO中，然后加入水。通过以下方式测定所述化合物在剂量溶液中的浓度：将等分液(一式三份)稀释至标称浓度，从中取出10μl加入到50μl空白血浆中并与试验样品一起分析。

[0156] 给药

[0157] 通过历时30分钟输注到一对Beagle狗(11-15kg)的尾静脉来静脉内给药化合物-1(约1mL·kg )。通过重量损失估测所递送的剂量。

[0158] 样品收集和分析

[0159] 提取血液样品(～1ml)并装到EDTA处理的采样管中，并且在样品采集后迅速通过离心(以13000rpm进行3分钟)来准备血浆。在24小时内，在预定的时间(例如，0、5、15、30、35、45、60、90、120、180、240、300、360、420、720、1440分钟)提取样品。通过质谱定量确定血浆中一种或多种分析物的浓度。视需要，将实验样品用空白血浆稀释，目的是确保它们在标准曲线的范围内。

[0160] 制备标准品和QC

[0161] 标准原液溶液和质量控制原液溶液以1mg/ml的浓度将单独称重的化合物在甲醇中制备，然后进一步稀释至100μg/ml。将所述标准品和QC原液在甲醇中人工稀释并根据下表加到血浆中:

[0162]

[0163]

[0164] 将上述溶液A-K(通过连续稀释所述标准原液制备的)各10μl和10μL溶液B、F和J(通过连续稀释QC原液制备的)加入到含有50μl空白血浆的96孔1.2mL聚丙烯管中。所制备的标准曲线的最终浓度和QC样品的最终浓度显示在上面的表中。

[0165] 制备样品

[0166] 向试验样品、剂量试验、标准品和QC中各加入100μL(90μl用于剂量试验、标准品和QC)甲醇，然后加入100μl内标。然后将所述样品用盖子盖住，通过反复倒转进行混合，然后在3500rpm离心20分钟。将每种样品的等分液(120μL)转移到微孔滴定板中，准备通过HPLC/MS-MS进行分析。

[0167] 质谱

[0168] 使用带有HP1100HPLC系统的TSQ700或TSQ或SSQ7000质谱仪。使用APCI源或ESI源。覆盖在所述试验样品中发现的浓度范围的标准品和QC样品预期在标称浓度的25%内。

[0169] 结果

[0170] 药代动力学数据和制表是用无隔分析工具和Excel实现的。简言之，将血浆浓度的自然对数对时间作图，从而显示浓度-时间分布。使用4数据点的最小值单独确定每只动物的消除半衰期(其被定义为当初始分布期结束(伪稳态)时，浓度消除一半所需的时间)。相关的曲线下面积(AUC)经证实为>50%，从而确保治疗相关的半衰期得以评估。当所述PK分布由于疑似肠-肝脏再循环而为三期时，将末期从所述分布中除去以计算所述PK参数包括半衰期。引用的半衰期值表示两只Beagle狗的最小值的均值。

[0171] 使用上述方案，本发明化合物经发现在狗中具有3.7小时的半衰期。

[0172] 测量人肝脏固有清除率(CLint)

[0173] 对于大多数药物，它们血浆清除率的大部分是由肝代谢导致的。固有清除率(CLint)为化合物经历代谢的潜能的量度(measure)并且在考虑了血浆蛋白结合和肝脏血流的情况下，可与体内肝清除率相关。因此，CLint可被用作预测化合物在人内的半衰期的重要参数。

[0174] 试验描述

[0175] 下面的描述概括了用于自人肝细胞孵育物评估固有清除率(CLint)的方法，使用不含HSA(人血清白蛋白)的悬浮液缓冲液并维持在pH7.4的生理条件。

[0176] 为了使技术人员能再现该实验方法的操作特征，提及所述实验方法的初期验证和结束时所使用的试剂的具体供应商和目录号。该剂量不排除用适当的可选择试剂进行替代，其中文献记载的相应说明或随后的实验证实所述替代不显著影响所述测定的操作特征。

[0177] 肝细胞分离和估测收率和存活力

[0178] 冷藏保存的人肝细胞(多供体)是从Cellzdirect(Carlsbad,U.S.)购买的并且贮存在液氮中。将细胞重新悬浮在无蛋白的肝细胞悬浮液缓冲液(配方:2.34g Na HEPES，-10.4g D-果糖，DMEM(1L粉末等同物,Sigma；w/1g.l 葡萄糖,w/Na丙酮酸盐,w/o NaHCO3,w/o酚磺酞)，用Milli-Q水补足1L，用1M HCl使pH为7.4)中。将冷藏保存的细胞解冻，从而如下准备待用:将每小瓶细胞浸在37℃的水浴中并轻轻震摇约2分钟，直到所有冰已融化。然后将解冻的细胞悬浮液加至15ml预温热的于圆底离心管中的肝细胞悬浮液缓冲液中并通过倒转所述离心管轻轻混合。将所述细胞悬浮液在环境温度(～26℃)以600rpm离心5分钟，吸出上清液并弃去。将颗粒轻轻地再悬浮于肝细胞缓冲液(每小瓶细胞1.5ml)中以得到均质细胞悬浮液。

[0179] 将细胞悬浮液的一份等分液(0.2mL)用0.2ml无蛋白悬浮液缓冲液稀释。向经稀释的细胞中加入0.2mL锥虫蓝溶液(0.4%w/v)，然后轻轻搅拌。1分钟后，用巴斯德吸管吸出样品并通过毛细作用填充到改进的Neubauer计数室中。然后用倒置显微镜对所述细胞进行计数(仅中心方形区域)，活细胞是能够排除所述染料，而非-活细胞被染色。活细胞在所述制剂中的百分比如此计算:

[0180]

[0181] 活细胞的浓度如下计算:-1 4

[0182] 活细胞ml = 活细胞计数x10x3x50

[0183] 计数操作一式两份地进行。

[0184] 将细胞悬浮液用适当体积的无蛋白悬浮液缓冲液稀释，得到所需浓度的活细胞并且在冰上贮存最长1小时，然后使用。

[0185] 实验操作

[0186] 将待孵育的实验化合物自0.1mM于DMSO中的浓缩的原液溶液(1%v/v最终溶剂6
浓度)加至适当体积的(0.3ml)于适当小瓶中的无蛋白悬浮液缓冲液中。将浓度为2x10-1
细胞·ml (最终孵育细胞浓度的两倍，通过锥虫蓝排除确定存活力>85%)的适当体积(>0.3ml)的细胞放置在单独的小瓶中，并且将两个小瓶都用37℃的水浴预孵育。

[0187] 预孵育5分钟后，向所述缓冲液和化合物中加入适当体积的细胞(0.3ml)，目的是6 -1
使最终细胞浓度为1x10细胞·ml 和使化合物浓度为1μM，并且使反应继续进行。

[0188] 在适当的时间点(例如，5、15、30、45、60、75、90和120分钟)，从孵育混合物中提取等分液(40μl)并加至3体积的甲醇中以终止所述反应并使肝细胞变性。也进行对照孵育，在该对照孵育中省略了细胞。一旦所述孵育已被淬灭，将所述样品混合，在–20℃或更低温度贮存2小时以帮助蛋白质析出，然后在3600rpm和4℃离心15分钟。将上清液转移到微滴定板中并通过HPLC-MSMS使用下面的方法作为适当的起始点进行分析:

[0189] 溶剂:A:0.1%甲酸/甲醇和B:0.1%甲酸/水(v/v)

[0190] 柱:Waters Xterra C1820x3.9mm,3.5μm-1

[0191] 流速:1.5ml.min

[0192] 梯度:0%B保持0.3分钟，历时0.7分钟从0%至100%B，在100%B维持0.2分钟，历时0.01分钟从100%至0%B。

[0193] 数据分析和计算方法

[0194] 将所得的经孵育化合物的峰面积录入到Excel空白表格中并生成ln[残余浓度]对时间曲线，并由该曲线评估残余斜率t1/2。然后将所述数据处理与一-室药代动力学模型拟合(akin)，并且使用消除速率常数(k)=ln(2)/t1/2可得到如下面方程给出的以t1/26 -1
表达CLint的方程，其中体积以ml·10 细胞 表达：

[0195]

[0196] 然后确定母体化合物由所述孵育导致的损失的t1/2和CLint。

[0197] 使用上面方案，本发明化合物经发现具有2.9(±0.94)μL/min/106细胞的人肝细胞固有清除率。

[0198] 在人中低的代谢清除率通常导致明显较长的人半衰期。预测在人中的代谢清除率的方法是本领域技术人员公知的。例如，可从所测量的体外人肝细胞固有清除率数据、所测量的体外人血浆蛋白结合数据和所测量的分配系数(logD7.4)预测人代谢清除率(具体参见Austin et al(2005),Drug Metab.Dispos.,33,419-425；and Riley et al(2005),Drug Metab.Dispos.,33,1304-1311)。

[0199] 测量人血浆蛋白结合(hPPB)

[0200] 药物与血浆蛋白结合的程度是确定体内效力和药代动力学的关键因素。用于确定血浆蛋白结合的方法牵涉所述化合物在37℃在血浆和缓冲液之间的平衡透析。然后使用带有质谱(MS)检测的高压液相色谱法(HPLC)确定化合物在血浆和缓冲液中的浓度。所述透析方法牵涉同时使用最多10种化合物的混合物。在浓度为所述测定中使用的浓度的情况下，单独使用化合物的结果和以混合物形式使用化合物的结果之间没有显著差异。

[0201] 实验描述

[0202] 首先通过在透析缓冲液中浸泡最短1小时来制备膜(分子量截断值为5000)。然后将所述透析膜固定在透析槽(dialysis cell)中。

[0203] 制备化合物于二甲基亚砜(DMSO)中的原液溶液。该步骤和所有随后的液体操作步骤都常规地用Tecan液体操作机器人进行。使用最多5种化合物的混合物。每种化合物在混合物中的浓度通常为1mM。对所述化合物进行选择，从而使每种混合物含有的化合物彼此之间全部具有至少5单位的分子量差异。

[0204] 冷冻血浆(EDTA抗凝血剂)通常用于人血浆结合实验。在使用前即时地用1M HCl将血浆的pH调整至7.4。

[0205] 然后将化合物的原液DMSO溶液(7.5μL)与血浆(750μl)一起加至透析槽中。对于每种混合物，一式两份地进行该操作。这得到1%DMSO于血浆中的溶液，其中每种化合物的浓度为10μM(如果所述原液溶液为标准的1mM)。然后将所述透析槽密封，固定在Dianorm旋转器单元并在37℃平衡18小时。在所述透析槽进行平衡的同时，用DMSO原液溶液生成优化的HPLC/MS方法，从而用在所述血浆和缓冲液样品的最终分析中。

[0206] 平衡后，将所述槽打开并用Tecan液体操作机器人从每个透析槽的血浆部分和缓冲液部分取出等分液。然后将空白血浆加至缓冲液样品中，和将缓冲液加至所述血浆样品中，从而使每种样品在6-倍稀释的血浆的基质中。然后从DMSO原液溶液和空白6-倍稀释的血浆制备标准品。四种标准品的浓度通常为50nM、150nM、500nM和2500nM。

[0207] 然后用带有MS检测的HPLC(这实现了化合物的混合物的反褶积)分析所述样品和标准品。所述HPLC方法包括正向冲洗柱转换技术，该技术允许直接注射所述经稀释的血浆。

[0208] 计算结果

[0209] 用MassLynx软件对所述色谱图进行加工，所述软件自动计算混合物中每种化合物的校准曲线，然后补入缓冲液和血浆样品的浓度。这些浓度仍需要对所述血浆的稀释进行校正。使用下面的方程从MassLynx数据计算结合百分比:

[0210]

[0211] 分子中的因子1.2补偿了血浆对含水样品的小稀释。分母中的因子6用于校正缓冲液对血浆样品的6-倍稀释。

[0212] 从所述浓度数据计算每种化合物的游离%(100-结合%)，然后记录。

[0213] 使用上面的方案，本发明化合物经发现具有0.11(±0.05)的人血浆蛋白结合(游离%)。

[0214] 测量在pH7.4时的分配系数(LogD7.4)

[0215] 将待试验化合物(1mg)分配至单独的1-mL聚丙烯小瓶中，与1-辛醇(700μL)一起保留在96-孔板中，并用0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.4)预饱和。然后将所述板震摇过滤，接着离心(以800g进行15分钟)以使任意不溶的固体沉降。然后通过将所述1-辛醇溶液(100μL)汇集到12-mL玻璃样品管的板中来制备10(或更少)种化合物的最多24种混合物。溶液的汇集是用专定算法进行的，从而使每种混合物中的化合物彼此不具有2道尔顿内的单-同位素重量，实现所述混合物的组分在MS量化过程中的轻易溶解。化合物的汇集是用机器人进行的并且是用自动生成的专定工作表控制的。如果混合物含有小于10种化合物，则加入1-辛醇(用0.02M磷酸盐缓冲液[pH7.4]预饱和)以将1-辛醇相的总体积补足至1mL。然后向每种混合物中加入1-辛醇-饱和的磷酸盐缓冲液(0.02M,pH7.4,2mL)，接着震摇(以450rpm进行30分钟)并离心(以800g进行15分钟)。然后将每种分层的混合物的最终1-辛醇相和水相用机器人分离。第一步是提取1-辛醇相的一份等分液(20μL)，用于LC分析(使用液态1-辛醇)。第二部是移出过量的1-辛醇相以使所述水相暴露。这是通过从所述样品管内的不同位置反复抽吸1-辛醇进行的。所述分离的最后一步是提取一份水性等分液(50μL)。将所述1-辛醇和水性等分液用DMSO连续稀释以得到用于LC/MS分析的最终样品。制备每种最终1-辛醇相的五种连续稀释液，浓度覆盖10000-倍范围。将来自这些溶液的MS峰用于生成log(峰面积)对log(相对浓度)校准线。也制备了每种最终水相的覆盖100-倍浓度范围的三种连续稀释液，并且从这三种稀释液中选择一种在所述校准线的范围内最佳拟合的稀释液的LC/MS峰面积，实现所述相对浓度的内插。为了使移行的程度最小，LC/MS分析的顺序是以所述1-辛醇的最小浓缩的稀释液开始，然后是更浓的稀释液，接着是两次空白注射液，随后是水相的增加浓度的稀释液。从1-辛醇的一种相对浓度与插补的水溶液的相对浓度的比例计算Log D7.4，然后校正所述1-辛醇溶液和水溶液的稀释度。

[0216] 使用上述方案，本发明化合物经发现具有1.9的LogD7.4。

[0217] 参考实施例

[0218] 现在通过下面的非限制实施例并且参考附图来说明本发明。

[0219] 可使用下面的缩写:

[0220]

[0221]1

[0222] 当给出时，H NMR谱是在Bruker Avance600(600MHz)、Bruker DRX500(500MHz)、Bruker300(300MHz)或Varian UnityInova500MHz,400MHz或300MHz设备记录的。将氯仿-d的中间峰(CDCl3；δH7.27ppm)、二甲基亚砜-d6的中间峰(d6-DMSO；δH2.50ppm)或甲醇-d4的中间峰(CD3OD；δH3.31ppm)或四甲基甲硅烷的内标(TMS；δH0.00ppm)中的任一个用作参考。样品溶液也可含有内标(例如，马来酸、2,3,5,6-四氯硝基苯或苯甲酸苄酯)用于测定确定和/或含有添加的三氟乙酸，从而从分析物响应中除去可交换的质子信号(例如，来自马来酸的信号)。光谱数据被记录为一系列化学位移(δ，以ppm为单位)，用标准缩写描述每个信号(s= 单峰，d= 双峰，m= 多重峰，t= 三重峰，q= 四重峰，br= 宽峰等)。本领域已知的是，化学位移和J-耦合常数可因样品制备差异例如分析物浓度和是否包含添加剂(例如NMR测定标准品或三氟乙酸)而发生轻微变化。

[0223] 大规模反应是在安装有热传递夹套和配备有适当辅助仪器的不锈钢或玻璃衬里钢反应器中进行的。

[0224] 质谱是在Agilent MSD(+ve和–ve APCI和/或电喷雾(例如，以多模式))或Waters Micromass ZQ(+ve和–ve电喷雾)上进行的，然后进行分析用HPLC。当给出m/z时，通常仅报道了表示母体质量的离子，并且所引用的是质量离子为阳性或阴性质量离+ + +子:[M]，[M+H]，[M-H]-或[M+2H-BOC]。

[0225] 实施例和制备的标题和副标题化合物是用CambridgeSoft Corporation的IUPAC命名程序Struct=Name9.0.7命名的。

[0226] 高效液相色谱法(HPLC)是在装有十八烷基键合硅胶的反相柱上进行的。使用装备有UV检测器(λ=230nm)和梯度泵的HPLC设备。使用适于具体分析的固定相颗粒大小、柱尺寸、流动相(乙腈和水、用三氟乙酸调整的pH)、梯度时间表、流速和温度。使用适当的-1稀释剂以约0.5mg mL 的主要分析物浓度制备样品溶液。

[0227] 除非另有说明，起始物质是商购的。所有溶剂和商购试剂是实验室级的并且原样使用。所有操作是在环境温度即17-28℃的范围，并且在适当的情况下，是在惰性气体例如氮气的气氛中进行的。在使用前将起始物质用 分子筛(E)-丁-2-烯-1-醇干燥。

[0228] 分析用HPLC是用以下柱进行的：Waters XBridgeTM C83.5μm柱(用乙腈于0.1%三氟乙酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%醋酸铵水溶液或0.1%氨水中的梯度洗脱)；Waters TM TMXBridge C183.5μm柱(梯度为乙腈于0.1%氨水中)；Waters Symmetry C183.5μm柱TM
(梯度为乙腈于0.1%三氟乙酸水溶液中)；Waters Sunfire C83.5μm柱(梯度为乙腈于TM
0.1%三氟乙酸水溶液中)；Phenomenex Gemini C183μm柱(梯度为乙腈于0.1%三氟乙酸水溶液中)；Polaris Amide C183.5μM柱(梯度为甲醇于0.1%甲酸水溶液中)；或Ace Phenyl3.5μm柱(洗脱梯度为甲醇于0.1%甲酸水溶液中)。在Agilent 系统或等
同物上用二极管阵列测量所洗脱的峰的UV谱；

[0229] 手性分析用GC是用带有裂分/无裂分注射器的Agilent6890系列GC进行的，使用ChromPak Chiraldex CB柱(25mx0.25mm，具有0.25μm相厚度)或ChromPak Chiraldex CB柱(25mx0.32mm，具有0.25μm相厚度)。使用火焰电离检测器记录所洗脱峰的光谱。在GC-分析前通过乙酸酐或(N,O-二(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)对所有样品进行衍生化。

[0230] 手性分析HPLC是用AD-H Chiral Pak5μm柱进行的(用25%乙醇/异己烷洗脱)。在Agilent 系统或等同物上用二极管阵列测量所洗脱的峰的UV谱。

[0231] 水分析是通过Karl-Fischer滴定进行的。

[0232] X-射线粉末衍射分析(XRPD)是针对根据标准方法制备的样品进行的，所述标准方法为例如在以下文献中描述的那些方法：Giacovazzo,C.et al(1995),Fundamentals of Crystallography,Oxford University Press；Jenkins,R.and Snyder,R.L.(1996),Introduction to X-Ray Powder Diffractometry,John Wiley&Sons,New York；
Bunn,C.W.(1948),Chemical Crystallography,Clarendon Press,London；or Klug,H.P.&Alexander,L.E.(1974),X-ray Diffraction Procedures,John Wiley and Sons,New York。X-射线分析是用PANalytical X’Pert仪器以 构型或用PANalytical Cubix仪器以 构型在2°至40° 扫描范围内进行的，其中每0.02°增量100-秒暴露时
间。所述X射线是通过在45kV和40mA操作的铜制长-微细聚焦管生成的。铜X-射线的波长为 所述数据时在零背景固定器上收集的，其中将～2mg化合物放置在所述
固定器上。所述固定器是由单晶硅制造的，已经将其沿非-衍射面切割，然后在光学扁平磨光器上抛光。所述X-射线在该表面的入射被Bragg消光抵消。

[0233] 本领域已知的是，可获得X-射线粉末衍射图，所述X-射线粉末衍射图具有一种或多种测量误差(取决于测量条件(例如所使用的仪器、样品制备或机器))。具体地，通常已知的是，X-射线粉末衍射图中的强度可随测量条件和样品制备波动。例如，X-射线粉末衍射领域的技术人员会意识到，所述峰的相对强度可根据所述样品在试验时的取向和所使用的仪器的型号和设置而变化。技术人员还会意识到，反射的位置可受所述样品在衍射仪中所处的精确高度和所述衍射仪的零校准的影响。所述样品的表面平面性也可具有小的影响。因此，本领域技术人员会理解的是，本申请提供的衍射图数据不应被理解为是绝对的并且提供与本申请披露的那些粉末衍射图基本相同的粉末衍射图的任意结晶形式落入本申请的范围内。大体上，X-射线粉末衍射图中衍射角的测量误差通常为±0.2°2-θ。

[0234] 熔点是通过差式扫描量热法(DSC)用标准方法(例如在 ,G.W.H.etal(1996),Differential Scanning Calorimetry,Springer,Berlin中描述的那些 方法)确定的。通过如下方式研究试验样品对升高温度的量热响应：使用带有铝盘的TA Instruments Q2000温度差示扫描量热仪。样品重量在0.5至5mg之间变化。所述操作是在氮气流(50ml/min)中进行的，并且所研究的温度为25至300℃，温度的恒定增加速度为每分钟10℃。当提及熔点时，其是指所述熔化吸热的起始温度(onset temperature)。

[0235] 本领域技术人员理解的是，通过DSC测量的熔点可能会由于样品纯度、样品制备和测量条件(例如，加热速度)的变化而发生轻微变化。应理解的是，通过其它型号的仪器或通过使用不同于本申请之后描述的那些条件的条件可给出可选择的熔点读数。因此，本申请提及的熔点和吸热图不被认为是绝对值并且当解读DSC数据时要考虑所述测量误差。本领域技术人员会意识到，熔点可随样品纯度和所述样品的结晶程度而变化。即使是低水平的杂质也可影响所测量的熔点。因此，本申请披露的熔点可自本申请提及的值以±5℃变化，并且当提及具有“约”某熔点的物质时，其被理解为具有自所提及的值±5℃的值。应当理解的是，当提及本申请所披露的熔点时，其是指熔化吸热的起始温度。本领域技术人员可使用常规优化/校准来设置差示扫描量热器的仪器参数，从而使得能够采集与本文所提供的数据相当的数据。

[0236] 实施例1

[0237] N-(6-((2R,3S)-3,4-二 羟 基 丁-2- 基 氧 基)-2-(4- 氟 苄 基 硫 基) 嘧啶-4-基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺

[0238]

[0239] i)2-(4-氟苄基硫基)嘧啶-4,6-二醇

[0240] 在室温，将乙酸钠(113g)加至2-巯基嘧啶-4,6-二醇(80g)于水(900mL)中的悬浮液中。历时2小时滴加1-(溴甲基)-4-氟苯(105g)于乙腈(90mL)中的溶液。使反应混合物搅拌20分钟，然后过滤所述混悬液并用水(3x)和异己烷(3x)洗涤。将所述固体真空干燥2小时并与甲苯(3x)共沸，得到副标题产物(125g)，其为白色固体。1

[0241] H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ11.62(s,2H),7.57-7.36(m,2H),7.14(dd,J=6.0,14.8Hz,2H),5.18(s,1H),4.37(d,J=6.5Hz,2H)。

[0242] (ii)4,6-二氯-2-(4-氟苄基硫基)嘧啶

[0243] 将三氯氧化磷(92mL)加至步骤(i)的副标题产物(100g)和苄基三乙基氯化铵(9g)于二甲氧基乙烷(500mL)中的悬浮液中并回流加热10小时。将反应混合物小心倒在搅拌的冰-水上，在水(400mL)和乙酸乙酯(400mL)之间分配并回收有机物，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(洗脱梯度为1-40%二氯甲烷/异己烷)来纯化。将纯的馏分蒸干得到副标题产物(86g)，其为红色油状物。

[0244] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.46-7.34(m,2H),7.08-6.94(m,3H),4.34(s,2H).[0245] (iii)4-氯 -6-((R)-1-((S)-2,2-二 甲 基-1,3- 二 氧 戊 环-4- 基) 乙 氧基)-2-(4-氟苄基硫基)嘧啶

[0246] 将步骤(ii)的副标题产物(85.7g)和60%氢化钠(14.2g)悬浮在四氢呋喃(1000mL)中并在冰/水中冷却30分钟。历时20分钟滴加(R)-1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙醇(中间体A)于2-甲基四氢呋喃(53%w/v)(104mL)中的悬浮液并将反应混合物在0℃-室温搅拌20小时。使反应混合物在水(500mL)和乙酸乙酯(500mL)之间分配。将所述水溶液用乙酸乙酯(2x500mL)再萃取，干燥合并的有机物并真空蒸发。将粗制物通过快速硅胶色谱法(洗脱梯度为0-30%乙酸乙酯/异己烷)用Isolera LS来纯化。
将纯的馏分蒸干得到副标题产物(94g)，其为黄色油状物。

[0247] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.43-7.35(m,2H),7.04-6.95(m,2H),6.41(d,J=5.3Hz,1H),5.27-5.17(m,1H),4.33(s,2H),4.20-4.15(m,1H),4.07-4.02(m,1H),3.83-3.76(m,1H),1.39(dd,J=6.9,27.4Hz,6H),1.31(d,J=6.3Hz,3H).

[0248] N-(6-((R)-1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙氧基)-2-(4-氟苄基-硫基)嘧啶-4-基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺

[0249] 氮气中，将步骤(iii)的副标题产物(94g)溶解于二噁烷(700mL)中的溶液用3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺(中间体B)(42.5g)、碳酸钾(65.1g),二环己基
(2',4',6'-三异丙基联苯-2-基)膦(11.2g)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(10.8g)处理。将所得混合物在100℃搅拌60分钟。将反应混合物用水(500mL)稀释并用乙酸乙酯(500mL)萃取。将有机物用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发得到粗制产物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(用30%乙酸乙酯/异己烷洗脱)来纯化。将纯的馏分蒸干得到副标题产物(98g)，其为红色油状物。

[0250] m/z[M+H]+=513(calc=512)(APCI)

[0251] N-(6-((2R,3S)-3,4-二 羟 基 丁-2- 基 氧 基)-2-(4- 氟 苄 基 硫 基) 嘧啶-4-基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺

[0252] 在0℃，将步骤(v)的副标题产物(98g)在二氯甲烷(200mL)中搅拌并加入三氟乙酸(200mL)。使反应混合物温热至室温并再搅拌18小时(形成所述醇的TFA酯)。真空除去挥发物并将残余物在甲醇(20mL)中稀释并用7M氨/甲醇(100mL)处理。将所述溶液搅拌20分钟，然后蒸干得到粗制产物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(洗脱梯度为50%-100%乙酸乙酯/异己烷)来纯化。蒸发醇的馏分得到标题化合物，其为白色固体，将其用乙腈结晶得到白色结晶固体(46.8g)。

[0253] m/z[M+H]+=473(calc=472)(APCI)

[0254] 1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ11.06(s,1H),7.49(dd,2H),7.13(t,2H),6.09(s,1H),5.28-5.18(m,1H),4.93(d,1H),4.65(t,1H),4.37(q,2H),3.97(t,2H),3.70-3.60(m,1H),3.58-3.49(m,2H),3.37(t,2H),2.59(td,1H),1.20(d,3H),1.09(d,3H)。

[0255] 实施例1的标题产物的晶体已通过XRPD来分析。结果显示在图1中并且XRPD-衍射图中的特征峰中的一些列在下面的表中(RI表示相对强度)。所述表已忽略了多个弱的和非常弱的峰。由于优选的取向效应，所忽略的弱峰中的一些可能变的较显著。

[0256]

[0257] 缩写

[0258] vs= 非常强；s= 强；m= 中等；w= 弱

[0259] 实施例1的标题产物的差式扫描量热分布显示在图2中。

[0260] 中间体A

[0261] (R)-1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙醇

[0262]

[0263] i)5,6-O-异亚丙基-L-抗坏血酸

[0264] 向L-抗 坏 血 酸 (65kg,369mol)、丙 酮(283kg) 和2,2- 二 甲 氧 基 丙 烷(46kg,443mol)的混合物中加入对-甲苯磺酸(1.1kg,5.5mol)。将温度调整至25±5℃。将所述浆液搅拌2小时，在此期间经常通过底部的阀门用氮气吹洗以防止物质在所述反应器的底物沉降。然后NMR分析(溶剂:D2O)显示98.5%的转化。

[0265] 加入庚烷(222kg)并将温度调整至5±5℃。将反应混合物搅拌至少30分钟，然后过滤。将所述反应器中的缩酮残余物用母液冲洗到滤饼上。将所述滤饼用庚烷(111kg)洗涤并在50℃干燥得到5,6-O-异亚丙基-L-抗坏血酸(73kg,336mol)，其为几乎白色的粉末。收率:91%。

[0266] 1H NMR(400MHz,d6-DMSO，含有马来酸和TFA)δ4.71(d,J=3.0Hz,1H),4.28(m,1H),4.11(dd,J=7.0,8.4Hz,1H),3.90(dd,J=6.3,8.4Hz,1H),1.27(s,6H)。

[0267] ii)(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-羟基乙酸甲酯

[0268] 将5,6-O-异亚丙基-L-抗坏血酸(58.8kg,272mol)加至用水(294kg)稀释的氢氧化钠溶液(27.5kg,50%,340mol)，并将所述温度调整至30±5℃。加入碳酸氢钠(57kg,680mol)并将所述混合物搅动15分钟，然后将所述温度升至40±5℃。在35-60℃，历时多于60分钟的时间向所述混合物中加入过氧化氢35%(55kg,562mol)。将反应混合物搅动两小时，然后NMR分析(溶剂:D2O)显示<1%残余的起始物质。

[0269] 将亚硫酸钠(4.2kg,33mol)加至反应器中，搅拌30分钟后的过氧化物试验为阴性的。

[0270] 在加入更多碳酸氢钠(34kg,408mol)后，将所述混合物加热至70±5℃并搅动至少一小时，随后的NMR分析(溶剂:D2O)显示，98.5%转化为下一中间体即
(2R)-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基](羟基)乙酸。

[0271] 减压除去约150L水，然后过滤出盐。将所述滤饼用水(30L)洗涤。

[0272] 将NMP(330kg)加至合并的母液/洗液中并将温度调整至30±5℃。加入碘甲烷(83kg,585mol)并将所述反应器封闭。将温度调整至55±5℃并使反应混合物反应至少120分钟，随后的NMR分析(溶剂:D2O)表明，有6%残余的羟基乙酸中间体。

[0273] 加入溶于水(147kg)中的亚硫酸钠(56kg,446mol)并将混合物搅动30分钟。将所述溶液在30±10℃历时10分钟用甲苯萃取，每次萃取使用406kg甲苯。通过减压和在最高70℃脱除溶剂来浓缩合并的有机相，直到残余的体积为约350L。将所述溶液冷却至低于30℃并转移到Millipore过滤器上的不锈钢桶上，得到(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-羟基乙酸甲酯的甲苯溶液(359kg,9.4%,177mol)。收率:65%。

[0274] 1H NMR与副标题产物的商购样品一致。

[0275] iii)(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-(甲苯磺酰基氧基)乙酸甲酯

[0276] 从(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-羟基乙酸甲酯的甲苯溶液(359kg,9.4%,177mol)开始，在最高温度70℃减压蒸馏掉甲苯直到浓缩停止。

[0277] 加入乙腈(153kg)并将温度调整至25±5℃。在25±5℃，加入三乙胺(41kg,405mol)、4-(二甲基氨基)吡啶(1.12kg,9.2mol)，然后历时约30分钟，加入对甲苯磺酰氯(52.5kg,276mol)的乙腈(146kg)溶液。将反应混合物再搅拌三小时后，NMR分析(溶剂:d6-DMSO)表明可接受的转化(94%)。

[0278] 加入MTBE(235kg)和水(326kg)并将两相系统搅动约3小时，之后HPLC分析显示对甲苯磺酰氯的水平为总峰面积的<0.1%。将温度调整至25±5℃，然后历时15分钟使其分离。提取水相并用更多MTBE(156kg)萃取，然后弃去。将2个有机相汇集到一起并用水(326kg)洗涤。然后将有机相用氯化钠(每份16kg)的水溶液(每份140kg)洗涤4次，每次在25±5℃保持5-10分钟。然后将有机相用水(每份185kg)洗涤两次，每次在25±5℃保持5-10分钟。随后的NMR分析(溶剂:d6-DMSO)表明<2%NMP(来自起始溶液的残余物)，以相对于磺酸酯中间体的摩尔计。

[0279] 加入活性炭(6.0kg)并将所述浆液在25±5℃搅动15分钟，然后在两平行袋状过滤器中过滤出所述炭。在袋状过滤器后使用0.6μm的柱状过滤器。将所述过滤器和管子用MTBE(27kg)冲洗。

[0280] 将所述母液和冲洗液合并且通过减压和在最高50℃的温度脱除溶剂来减小体积，直到浓缩停止。加入庚烷(106kg)并通过减压和在最高50℃的温度脱除溶剂再一次减小，直到浓缩停止，在所述反应器中余留约60L溶液。加入MTBE(185kg)，然后在将温度调整至25±5℃后加入庚烷(75kg)。将所述溶液历时不超过30分钟冷却至0-5℃并历时额外20分钟加入庚烷(150kg)。将所述浆液在0–5℃搅动一小时，然后过滤。将滤饼用MTBE(16kg)和庚烷(30kg)的混合洗涤。将所述湿产物加至真空盘架干燥器中并在35℃干燥(在不超过100mbar)得到(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-(甲苯磺酰基氧基)乙酸甲酯(51.3kg,154mol)，其为浅棕色粉末。收率:87%。

[0281] 1H NMR(400MHz,CDCL3)δ7.83(m,2H),7.35(m,2H),4.84(d,J=4.8Hz,1H),4.46(m,1H),4.04(dd,J=6.6,9.1Hz,1H),3.97(dd,J=5.2,9.1Hz,1H),3.70(s,3H),2.45(s,3H),1.3
0(s,3H),1.29(s,3H).

[0282] iv)(S)-2,2-二甲基-4-((R)-环氧乙烷-2-基)-1,3-二氧戊环

[0283] 将(R)-2-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-(甲苯磺酰基氧基)乙酸甲酯(76.1kg,221mol)溶解在甲醇(57kg)和二氯甲烷(208kg)中。

[0284] 将甲醇(14kg)、二氯甲烷(53kg)和起始物质溶液的三分之一(74mol)加至所述反应器中。将所述溶液的温度调整至10-15℃。然后，向所述反应器中分18份加入硼氢化钠(6.3kg,169mol)，保持温度在8-15℃。加入结束后，将所述混合物搅拌半小时。加入下三分之一起始物质溶液(74mol)和更多硼氢化钠(6.3kg,169mol)，然后用与先前相同的操作搅拌半小时。将该操作用最后三分之一的起始物质溶液(74mol)和更多硼氢化钠(6.3kg,169mol)再重复一次。然后的HPLC分析表明>99.9%转化为中间体(S)-4-甲基苯甲酸1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)-2-羟基乙基酯。

[0285] 向反应混合物中加入二氯甲烷(200kg)。在20-25℃历时60分钟加入甲醇钠的甲醇溶液(43kg,30%,239mol)。约半小时后，HPLC分析表明中间体醇消耗了99.7%。

[0286] 向所述反应混合物中加入乙酸钠(25kg)的水(230L)溶液。将所述混合物在20-25℃搅拌10-15分钟。分离15分钟后，移出下层有机相。将上层水相用二氯甲烷(376kg)萃取。移出下层有机相，与第一份有机相合并，并且弃去水相。

[0287] 向合并的有机相中加入水(359L)。在20-25℃搅拌10-15分钟并沉降15分钟，将下层有机相转移到装有硫酸钠(63kg)的反应器中。

[0288] 通过脱除溶剂将所述混合物的体积减至310L，然后过滤出硫酸钠。将滤饼用二氯甲烷(94kg)洗涤。将合并的液体充分混合，然后通过聚丙烯袋状过滤器排放到不锈钢圆筒中，得到(S)-2,2-二甲基-4-((R)-环氧乙烷-2-基)-1,3-二氧戊环的DCM溶液(467.5kg,6.2%,203mol)，其为澄清的黄色液体。收率:91%。

[0289] 可通过蒸发溶剂然后真空蒸馏小规模分离不含溶剂的样品。

[0290] 1H NMR(分离的样品,400MHz,d6-DMSO)δ4.01(dd,J=6.6,8.2Hz,1H),3.92(m,1H),3.72(dd,J=5.8,8.2Hz,1H),3.03(ddd,J=2.6,4.1,5.2Hz,1H),2.77(dd,J=4.1,5.0Hz,1H),2.58(dd,J=2.6,5.0Hz,1H),1.34(s,3H),1.27(s,3H)。

[0291] v)(R)-1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙醇

[0292] 在41-42℃，从(S)-2,2-二甲基-4-((R)-环氧乙烷-2-基)-1,3-二氧戊环的二氯甲烷溶液(465kg,6.2%,200mol)蒸馏出二氯甲烷并用THF(129kg)替换。在60℃继续蒸馏直到在所述反应器中达到固定的体积(235L)。在22℃向所述反应器中加入氢化铝锂(LAH)的THF溶液(26.4kg,10%,70mol)，并且随后在25℃搅拌约一小时后，GC分析表明起始物质消耗了>99.9%。

[0293] 通过加料漏斗加入数小份的水，调整速度以控制温度和起泡。加入总计2.6升水(1L/kg LAH)。以与就加入水所述相同的方式加入氢氧化钠溶液(2.6kg,15%,1L/kg LAH)。使用与前面所述相同的操作通过加料漏斗再次加入水(7.9L,3L/kg LAH)。

[0294] 过滤所述浆液并将滤饼用THF(36kg)洗涤。通过在最高85℃的温度脱除THF来浓缩滤液直到浓缩停止。向所述反应器中加入2-MeTHF(129kg)，然后脱除溶剂以达到溶液体积为约120L。KF分析表明<0.1%的水。将所述溶液通过柱状过滤器排到PE-衬里的圆筒中，得到(R)-1-((S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)乙醇溶液(103kg,27%,187mol)，其为澄清的浅黄色液体。收率:94%。

[0295] 可通过蒸发溶剂然后真空蒸馏小规模分离不含溶剂的样品。

[0296] 1H NMR(分离的样品,400MHz,d6-DMSO)δppm4.77(d,J=5.1Hz,1H),3.95(dd,J=8.0,6.2Hz,1H),3.76(dd,8.0,6.0Hz,1H),3.70(m,1H),3.46(m,1H),1.29(s,3H),1.25(s,3H),1.07(d,J=6.2Hz,3H).

[0297] 可选择地，可如下所述制备中间体A[(R)-1-[(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙醇]:

[0298] 方法A:

[0299] 将40g(1R)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸1-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基]酯(117.5mmol)溶解在7相对体积(280mL)的甲醇中。向该溶液中加入20g47%w/w氢氧化钠水溶液(2当量,235mmol)并将所述溶液加热至50℃。所述反应通常在1-2小时内结束，减压蒸发所述反应混合物。加入2-甲基-四氢呋喃(160mL,4相对体积)并再次减压蒸发混合物以除去痕量的甲醇。加入更多的2-甲基-四氢呋喃(200mL,5相对体积)并将所得悬浮液在环境温度搅拌20分钟，然后过滤。将滤饼用72mL(1.8vol)2-甲基四氢呋喃洗涤。再次减压浓缩澄清的滤液得到所述醇，其为无色油状物。

[0300] 收率:13.4g(78%)

[0301] 方法B:

[0302] 将20g(1R)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸1-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基]-酯(58.76mmol)溶解在10相对体积(200mL)的2-甲基四氢呋喃中。向所述澄清的溶液中加入4.24mL甲基-三丁基氯化铵(75%水溶液,11.75mmol)，然后加入
9.89g(58.76mmol)50%氢氧化钾水溶液。将所得混合物在50℃搅动并且通常在20小时内结束(<1%残余的起始物质)。过滤所述悬浮液并将澄清的滤液通过真空蒸馏进一步干燥至约100mL体积。过滤混合物，在顶部加入100mL2-甲基四氢呋喃并再次浓缩至20mL总体积。将所得澄清溶液用先前用于冲洗所述容器的30mL2-甲基四氢呋喃稀释。

[0303] 收率:含有7.9g(92%th)(R)-1-[(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙醇的50mL2-甲基四氢呋喃溶液。

[0304] 可通过蒸发溶剂然后真空蒸馏小规模分离不含溶剂的样品。

[0305] 1H NMR(分离的样品,400MHz,d6-DMSO)δppm4.77(d,J=5.1Hz,1H),3.95(dd,J=8.0,6.2Hz,1H),3.76(dd,8.0,6.0Hz,1H),3.70(m,1H),3.46(m,1H),1.29(s,3H),1.25(s,3H),1.07(d,J=6.2Hz,3H)。

[0306] 如下所述制备(1R)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸1-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基]-酯:

[0307] 3,4,5-三甲氧基苯甲酸[(1R,2S)-2,3,-二羟基-1-甲基-丙基]酯

[0308]

[0309] 由于所述产物的收率和对映异构过量很大程度上依赖于溶剂和反应物中残余水的水平，因此所述反应需要干燥剂(通常为 (埃)分子筛)的帮助。溶剂和反应物中的总的水含量以E-巴豆醇计不超过0.038摩尔当量。

[0310] 在约20℃，使E-巴豆醇(20kg@100%w/w,277mol)历时约80分钟以恒定速度通过装有 (埃)分子筛颗粒(8kg)的柱，流入到干燥的收集瓶中。保持约32分钟后，将所述柱用加压的氮气历时约31分钟吹洗澄清。以干燥的E-巴豆醇形式回收E-巴豆醇加料量的约85%。

[0311] 在约-8℃，向干燥的E-巴豆醇(20kg@100%w/w,277mol)、L-(+)-二异丙基酒石酸酯(11.7kg,50mol)和甲苯(167kg)的溶液中加入异丙氧基钛(11.8kg,42mol)和甲苯(33kg)。将所述批次搅动约30分钟，然后历时至少4小时加入氢过氧化枯烯(87%w/w,58.2kg,333mol)和甲苯(78kg)。将所述批次搅动约2小时，然后加入3,4,5-三甲氧基苯甲酸(2.9kg,13.9mol)。然后在约30℃历时约1小时将所述批次加至异丙氧基钛(7.9kg,28mol)、3,4,5-三甲氧基苯甲酸(47.1kg,222mol)和甲苯(152kg)的浆液中，然后加入甲苯(17kg)线性洗液。然后历时约2小时加入异丙氧基钛(23.7kg,83mol)和甲苯(40kg)，接着将所述批次搅动约3小时。将所述批次冷却，然后加入有亚磷酸三甲酯(17.2kg,139mol)和甲苯(35kg)。然后将所述批次温热至约30℃，接着用盐酸水溶液(10%w/w,84kg，然后63kg)洗涤两次，随后用水(3x60kg)洗涤三次。然后将合并的水相用2-甲基四氢呋喃(344kg)洗涤。合并有机相，然后用水(60kg)洗涤，接着真空蒸馏至约
260±40L的批次体积。

[0312] 将温度调整至约35℃，然后历时至少30分钟加入己烷(65kg)。然后向所述批次引晶，接着搅动至少1小时，然后历时至少3小时冷却至约0℃。[晶种可通过以下方法制备：移出一部分溶液至单独容器中并将其冷却至超饱和的温度或低于该温度。可过滤析出的固体并直接送回到主要批次中以发挥晶种的作用，然后控制结晶。]

[0313] 历时至少2小时加入额外庚烷(325kg)，将所述浆液再老化至少1小时，然后过滤分离固体。将所述固体用己烷(2x130kg)洗涤，然后干燥至恒重。收率:57%(以100%w/w计)。强度=93%w/w[还含有3,4,5-三甲氧基苯甲酸(TMBA)]。

[0314] 1H NMR[500MHz,CDCl3，以 2,3,5,6- 四 氯 硝 基 苯 (TCNB)作 为 内 标 ]；δ7.71(s,TCNB),7.33(s,残余的TMBA),7.26(s,2H),7.24(s,CDCl3),5.13(m,1H),3.89(m,
9H),3.73(m,2H),3.63(1H,m),1.44(d,J=6.6Hz,2H)。

[0315] 对映体过量:通常为97%。

[0316] (1R)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸1-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基-酯

[0317]

[0318] 在约30℃，向3,4,5-三甲氧基苯甲酸[(1R,2S)-2,3,-二羟基-1-甲基-丙基]酯(43.8kg@100%w/w,146mol,约97%对映体过量)于2-甲基四氢呋喃(226kg)中
的溶液中加入对甲苯磺酸(0.6kg,3mol)。然后历时约40分钟加入2,2-二甲氧基丙烷(38.0kg,365mol)。将所述批次搅动约2.5小时，然后加入碳酸氢钾水溶液(7%w/w,167kg)。
将温度调整至约60℃，然后过滤所述批次装至静置的容器中，从而除去残余物的钛种类物质。除去下层的水相，然后将所述批次用水(131kg)洗涤，接着真空蒸馏至约130±20L的体积。加入异辛烷(212kg)并将所述溶液进一步真空蒸馏至约240±20L的体积。在60℃，向所述批次引晶，然后搅拌至少1小时，接着历时至少8小时冷却至约5℃。[晶种可通过以下方法制备：移出一部分溶液至单独容器中并将其冷却至超饱和的温度或低于该温度。可过滤析出的固体并直接送回到主要批次中以发挥晶种的作用，然后控制结晶。]。将所述批次老化至少2小时，然后过滤分离所述固体。将所述固体在约-5℃用己烷(85kg)洗涤，然后干燥至恒重。收率:84%at100%w/w.强度=100%w/w。

[0319] 1H NMR[400MHz,CDCl3,with2,3,5,6-四氯硝基苯(TCNB)]；δ7.71(s,TCNB),7.28(s,2H),7.24(s,CDCl3),5.15(m,1H),4.20(m,1H),4.10(m,1H),3.92(m,1H),3.88(s,9H),1.36(m,9H)。

[0320] 对映体过量:通常>99%ee(可根据起始 3,4,5-三甲氧基苯甲酸[(1R,2S)-2,3,-二羟基-1-甲基-丙基]酯的对映异构体过量和分离的(1R)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸1-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基]乙基-酯的所期望的对映异构体过量来调整分离温度。

[0321] 中间体B

[0322] 3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺

[0323]

[0324] i)3-甲基氮杂环丁烷-1-基磺酰基氨基甲酸苄酯

[0325] 将乙酸异丙酯(300mL)加至1000ml3-颈烧瓶中并冷却至-10～-5℃。在-5～10℃，历时60分钟先后加入异氰酸磺酰氯(Sulfurisocyanatidic chloride)(44.5mL)和苯基甲醇(50.5mL)/乙酸异丙酯(60mL)。使所述混合物在-5～10℃反应并通过HPLC监测直到苄基醇的含量为<2%(在0℃1小时后)。将乙腈(300mL)、3-甲基氮杂环丁烷盐酸盐(50g)(中间体C，商购的或如下所述制备)和三乙胺(162mL)的混合物在2000mL3-颈烧瓶中搅拌，在<-5℃和历时90分钟，向其中滴加中间体苄基氯磺酰基氨基甲酸苄酯于乙酸异丙酯(360mL)中的溶液。使所述混合物温热至室温，过夜。将所述反应用乙酸淬灭并将pH调整至4～5。分离所述混合物，将所述水相用乙酸异丙酯(500ml)洗涤，然后分离。
合并有机相并用10%盐水(2x120ml)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并将滤饼用乙酸异丙酯(30ml)洗涤，得到副标题产物(145g)，其为红色油状物。

[0326] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.43(s,1H),7.57(m,5H),5.18(s,2H),4.08-3.96(m,2H),3.60-3.50(m,2H),2.67-2.54(m,1H),1.22-1.11(d,3H)。

[0327] ii)3-甲基氮杂环丁烷-1-磺酰胺

[0328] 将分装到2个反应器中的步骤(i)的副标题产物(132g)加入到搅拌的10%Pd/C(4.94g)于乙醇(1000mL)中的溶液中。将所述混合物在3.00巴氢化约16小时。蒸发溶剂得到粗制产物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(用30%乙酸乙酯/二氯甲烷(污染有KMnO4)洗脱)来纯化。将纯的馏分蒸干得到标题产物(60.3g)，其为白色固体。

[0329] 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.82(s,2H),3.75(t,J=8.0Hz,2H),3.36-3.24(m,2H),2.59-2.46(m,1H),1.13(d,J=6.8Hz,3H).

[0330] 中间体C

[0331] 3-甲基氮杂环丁烷盐酸盐

[0332]

[0333] i)3-羟基氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯

[0334] 氮气中，将氮杂环丁烷-3-醇(14.7g)溶解在THF(170mL)和水(85mL)中的溶液用碳酸钾(37.1g)处理。将所述混合物在室温搅拌30分装，然后冷却至0℃，在0℃历时30分装滴加氯甲酸苄酯(20.0mL)。将所得混合物在20℃搅拌60小时。将反应混合物用水(150mL)稀释并用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机物用硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到粗制产物，其为无色油状物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(用50%乙酸乙酯/异己烷至100%乙酸乙酯洗脱)来纯化。将纯的馏分蒸干得到副标题产物(19.40g,69.8%)，其为无色油状物。

[0335] 1H NMR(500MHz,CDCL3)δ7.41-7.28(m,5H),5.09(s,2H),4.70-4.54(m,1H),4.23(dd,J=6.7,9.9Hz,2H),3.89(dd,J=4.4,10.0Hz,2H),2.34(d,J=6.1Hz,1H)。

[0336] ii)3-氧代氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯

[0337] 在0℃(轻微放热升至5C)，历时15分钟将步骤(i)的副标题产物(17.9g)于DMSO(100mL)中的溶液滴加至吡啶·三氧化硫(44.7g)和三乙胺(39.3mL)于DMSO(200ml)中的溶液。5分钟后将所述混合物温热至室温并搅拌16小时。将所述混合物倒在冰/水中并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机物用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空浓缩得到粗制产物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(用100%二氯甲烷洗脱)来纯化。将纯的馏分蒸干得到副标题产物(17.9g)，其为浅黄色油状物。

[0338] 1H NMR(500MHz,CDCL3)δ7.40-7.31(m,5H),5.17(s,2H),4.78(s,4H).

[0339] iii)3-亚甲基氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯

[0340] 将甲基三苯基鏻溴化物(93g)和叔丁醇钾(29.3g)于乙醚(700mL)中的悬浮液在室温搅拌20分钟并在氮气中在35℃加热1小时。在35℃，历时1小时将所述亮黄色混合物用步骤(ii)的副标题产物(17.9g)/乙醚(200mL)逐滴处理(形成橙色悬浮液)。将所得混合物在35℃搅拌12小时。冷却混合物，用硅藻土垫过滤并用乙醚洗涤。将所述滤液用水(300mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发得到粗制产物。将粗制产物通过快速硅胶色谱法(用10%乙酸乙酯/异己烷至50%乙酸乙酯/异己烷(污染有KMnO4)洗脱)来纯化。将纯的馏分蒸干得到副标题产物(14.1)，其为无色油状物。

[0341] 1H NMR(400MHz,CDCL3)δ7.39-7.28(m,5H),5.12(s,2H),5.01(m,2H),4.57(t,4H)。

[0342] iv)3-甲基氮杂环丁烷盐酸盐

[0343] 氢气中，将步骤(iii)的副标题产物(14.1g)溶解在乙醇(100mL)中的溶液用10%Pd/C(JM型，87L)(1.48g)处理。将所得混合物在20℃和在4.50巴氢气压力搅拌40小时。所述Cbz保护基仍是连接的，因此换成氢氧化钯于炭上(2g)/乙醇(100mL)。将所述混合物在4.50巴再氢化24小时。用硅藻土垫过滤所述混合物并将滤液在冰浴中冷却至0℃。
滴加4M HCl/二噁烷(26.0mL)，蒸干溶液得到标题产物(7.46g)，其为浅棕色油状物。

[0344] 1H NMR(400MHz,CDCL3)δ9.24(s,2H),3.95(ddd,J=7.4,9.8,11.4Hz,2H),3.55-3.45(m,2H),2.85(dt,J=6.7,14.2Hz,1H),1.16(d,3H)。