使用氨基吡唑鉴别和/或定量儿茶酚胺的质谱法 |
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| 申请号 | CN201480057828.9 | 申请日 | 2014-10-22 | 公开(公告)号 | CN105659078A | 公开(公告)日 | 2016-06-08 |
| 申请人 | DH科技发展私人贸易有限公司; | 发明人 | S·N·戴伊; S·普尔卡亚斯塔; | ||||
| 摘要 | 本 发明 描述一种用于质谱分析、检测和定量儿茶酚胺的方法。所述方法可包含使所述儿茶酚胺与4- 氨 基安替比林 试剂 反应并且检测和/或定量所述反应产生的加合物。所述方法也可以允许同时进行多次。还提供所述反应形成的化合物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种检测样品中一或多种儿茶酚胺的存在的方法，所述方法包含： |
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| 说明书全文 | 使用氨基吡唑鉴别和/或定量儿茶酚胺的质谱法[0001] 相关申请案 技术领域背景技术[0005] 儿茶酚胺是具有由具有两个羟基侧基的苯和一个侧链胺组成的儿茶酚核的分子。在人体中，最丰富的儿茶酚胺为肾上腺素(epinephrine/adrenaline)、去甲肾上腺素(norepinephrine/noradrenaline)和多巴胺。儿茶酚胺是水溶性的并且50％结合于血浆蛋白质，因此其在血流中循环。 [0006] 这些分子的精确分析和定量变得愈加重要。然而，仍需要改进这些化合物的质谱分析的标记，因为通过质谱法分析这些化合物通常有困难。举例来说，这些化合物中的许多不含可电离基团。因此，难以定量这些分子，在低浓度下尤其难以定量。 [0007] 需要一种克服这些前述困难来定量这些分析物的方法。 发明内容[0008] 在一些实施例中，提供检测样品中一或多种儿茶酚胺的存在的方法。在一些实施例中，所述方法包含a)使样品与4-氨基安替比林试剂或其重原子衍生物在足以与所述样品中存在的儿茶酚胺(如果存在)反应的条件下反应形成4-氨基安替比林-试剂-儿茶酚胺加合物，或其重原子衍生物；b)获得所述反应样品的质谱；以及c)分析所述质谱来判断样品是否含有4-氨基安替比林-试剂-儿茶酚胺加合物或其离子性片段。 [0009] 在一些实施例中，提供式I化合物或其重原子衍生物： [0010] [0011] 其中 [0012] R1为H或 [0013] y为1-6；以及 [0014] X为卤素。 [0015] 在一些实施例中，提供式II化合物或其重原子衍生物： [0016] [0017] 其中 [0018] R4为H或 [0019] R 5 为 [0020] z为1-6；以及 [0021] Q为卤素。 [0022] 在一些实施例中，提供式III化合物或其重原子衍生物： [0023] [0024] 其中 [0025] R6为 [0026] 在一些实施例中，提供制备式II化合物的方法 [0027] [0028] 所述方法包含使 与4-氨基安替比林试剂在足以产生式II化合物的条件下反应， [0029] 其中 [0030] R4为H或 [0031] R5为 [0032] z为1-6；以及 [0033] Q为卤素。 [0034] 在一些实施例中，提供试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒包含4-氨基安替比林试剂、一或多种分析物标准品、一或多种内标、一或多种样品制备套筒和板、生物学基质、溶剂、试管、HPLC柱以及一或多种液相色谱缓冲液。附图说明 [0035] 参考附图，将更完全地理解本发明的传授内容。所述图式打算说明而不是限制本发明的传授内容。 [0036] 图1示出了根据实例1产生的4-AAP-多巴胺加合物母离子的Q-1MS扫描。 [0037] 图2示出了根据实例1产生的4-AAP-多巴胺加合物子离子的MSMS扫描。 [0038] 参考例如以下图式，在下文中提供各种实施例的详细描述。应理解，所述图式仅是示范性的并且所有图式参考仅是出于说明的目的，并且并不打算以任何方式限制下文所述的实施例的范围。为方便起见，在整个图式中参考数字也可以重复(有或没有分支)来指示类似成分或特征。 具体实施方式[0039] 应了解，为了清楚起见，以下讨论将阐明申请人的传授内容的实施例的各种方面，但每当省略某些具体细节是适宜或恰当的时便省略某些具体细节。举例来说，在替代实施例中，相似或类似特征的论述可以略微简化。众所周知的想法或概念为简洁起见也可以不进行任何详细论述。技术人员将认识到，一些实施例可以不需要在每个实施方式中具体描述的细节中的某些，这些细节在本文中仅是为了提供实施例的透彻理解而加以阐述。类似地，将显而易知可以根据公共常识，在不脱离本发明的范围的情况下，对所述实施例稍作更改或改变。可以根据以下实例和各种实施例的描述进一步理解申请人的传授内容的各方面，不应将所述实例和实施例理解为以任何方式限制申请人的传授内容的范围。 [0040] 根据一些实施例，提供检测样品中一或多种儿茶酚胺的存在和/或其定量方法。检测和/或定量儿茶酚胺的实例包括(但不限于)表1中所示的那些。 [0041] [0042] [0043] 在一些实施例中，检测和/或定量的一或多种儿茶酚胺选自表1的群组。在一些实施例中，检测和/或定量的儿茶酚胺为肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺或其盐或水合物，或其任何组合。在一些实施例中，一或多种儿茶酚胺为肾上腺素、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、异肾上腺素、肾上腺酮盐酸盐、麻黄宁盐酸盐、2-(二甲氨基)-3',4'-二羟基-(8Cl)、2-(二甲氨基)-3',4'-二羟基乙酰苯、二羟西君、乙基喘息定、N-甲基肾上腺素、二羟基麻黄碱盐酸盐、丁基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、3,4-二羟基-苯丙氨酸、多巴胺或其盐或水合物，或其任何组合。 [0044] 在一些实施例中，所述方法包含a)使样品与4-氨基安替比林(4-AAP)试剂或其重原子衍生物在足以与所述样品中存在的儿茶酚胺(如果存在)反应的条件下反应形成4-氨基安替比林-试剂-儿茶酚胺加合物，或其重原子衍生物；b)获得所述反应样品的质谱；以及c)分析所述质谱来确定样品是否含有4-氨基安替比林-试剂-儿茶酚胺加合物或其离子性片段。质谱分析将指示是否存在加合物或其离子性片段。如果质谱中出现加合物或其片段，那么加合物或其离子性片段的存在指示样品中也存在儿茶酚胺。 [0045] 在一些实施例中，分析步骤包含检测与任何所述加合物和其一或多个片段有关的一或多个许多质量信号。质量信号的检测可以与任何标准质谱仪一起使用，例如(但不限于) 5500质谱仪。质谱仪可以使用直接输注模式。具体质谱仪和工作模式并不关键，因此机器和使用机器的变量可以视使用者偏好而修改。 [0046] 在一些实施例中，所述方法包含定量样品中的儿茶酚胺的量。可以例如通过比较质谱与标准品进行定量。标准品可以是内标或分析物标准品。举例来说，可使用重原子标记的分析物。重原子标记的分析物可以是重原子标记的儿茶酚胺，例如本文所述的儿茶酚胺。 [0047] 如本文所用，术语“重原子”指的是一或多个原子经较重原子取代的分子。举例来说，氢可经氘取代。12C碳可经13C碳取代。如果分子具有一个以上氢，那么一或多个或全部氢可经较重氢原子取代。如果分子具有一个以上碳，那么一或多个或全部碳可以经较重碳原子取代。 [0048] 可以用作标准品的重原子标记的分析物的实例包括(但不限于)： [0049] (多巴胺-1,1,2,2-d4盐酸盐)、 (肾上腺素(甲基-13C,d3)和 (去甲肾上腺素-2,5,6,α,β,β-d6)。这些是非限制性实例并且也可以使用其它重原子分析物。 [0050] 在一些实施例中，4-氨基安替比林试剂为式I化合物或其重原子衍生物： [0051] [0052] 其中 [0053] R1为H或 [0054] y为1-6；以及 [0055] X-为阴离子。 [0056] 如本文所用，当术语“其重原子衍生物”指的是化合物时，所述术语意思是化合物中的一或多个碳经13C碳取代。在一些实施例中，全部碳经取代。取代可用于促进样品中儿茶酚胺的分析、检测和/或定量。 [0057] 在一些实施例中，式I的重原子衍生物为式Ia、Ib或Ic的化合物。 [0058] [0059] 在式I、Ia、Ib或Ic的化合物的一些实施例中，R1为H。在一些实施例中，R1为[0060] 在式I、Ia、Ib或Ic的化合物的一些实施例中，X为Cl、F、I或Br。在一些实施例中，X为Br。 [0061] 在一些实施例中，所述方法产生式II的氨基安替比林-儿茶酚胺加合物化合物或其重原子衍生物： [0062] [0063] 其中 [0064] R4为H或 [0065] R5为 [0066] z为1-6；以及 [0067] Q为卤素。如本领域的技术人员显而易知，各种R5基团是可根据本文所述的方法检测和定量的不同示范性儿茶酚胺所专有的。侧链也可见于表1中。 [0068] 在一些实施例中，式II的重原子衍生物为式IIa或IIb的化合物。 [0069] [0070] 在 式 I I 、I I a 或 I I b 的 化 合 物 的 一 些 实 施 例 中 ，R 4 为在一些实施例中，R4为H。 [0071] 在式II、IIa或IIb的化合物的一些实施例中，z为3。 [0072] 在式II、IIa或IIb的化合物的一些实施例中，z为3。 [0073] 在式II、IIa或IIb的化合物的一些实施例中，Q为Cl、F、I或Br。在一些实施例中，Q为Br。 [0074] 在一些实施例中，所述方法产生氨基安替比林-儿茶酚胺加合物的离子性片段。在一些实施例中，检测离子性片段和/或用于定量样品中儿茶酚胺的量。在一些实施例中，离子性片段为式III化合物或其重原子衍生物： [0075] [0076] 其中R6 为如 本 领域的技术人员显而易知，各种R6基团是可根据本文所述的方法检测和定量的不同示范性儿茶酚胺所专有的。侧链也可见于表1中。 [0077] 在一些实施例中，如果存在儿茶酚胺，那么样品与4-氨基安替比林试剂在形成4-氨基安替比林-儿茶酚胺加合物的条件下反应。在一些实施例中，所述方法包含使样品与4-氨基安替比林试剂在碳酸氢铵(即缓冲液)和K2[Fe(CN)6](即氧化剂)存在下接触产生4-氨基安替比林-儿茶酚胺加合物。在一些实施例中，儿茶酚胺为盐酸盐形式。在一些实施例中，碳酸氢铵为缓冲液。在一些实施例中，缓冲液为约pH 8-9的pH。组分可以混合在一起并且反应5-30、5-20或5-15分钟。在一些实施例中，混合物反应至少或约5、10、15或20分钟。在一些实施例中，混合物反应少于20分钟。混合物在质谱仪上分析之前也可以经过滤。过滤器的实例为(但不限于)C18(500mg)滤筒。也可以使用其它缓冲液，例如(但不限于)磷酸盐缓冲液。缓冲液的pH范围可以是约8到约11。其它氧化剂的实例包括(但不限于)过氧化氢、硫酸铜或过硫酸钠。可以使用任何适合氧化剂，只要如果样品中存在儿茶酚胺，那么所述氧化剂可以促进4-氨基安替比林试剂与儿茶酚胺的反应。 [0078] 如本文所用，术语“样品”指的是可含有或不含有儿茶酚胺的样品。在一些实施例中，已知样品含有儿茶酚胺。在一些实施例中，预期样品含有儿茶酚胺。“样品”也可以称为“测试样品”。 [0079] 根据一些实施例，提供式I化合物或其重原子衍生物： [0080] [0081] 其中 [0082] R1为H或 [0083] y为1-6；以及 [0084] X为卤素。 [0085] 在一些实施例中，式I的重原子衍生物为式Ia、Ib或Ic的化合物。 [0086] [0087] 在 式 I 、I a 、I b 或 I c 的 化 合 物 的 一 些 实 施 例 中 ，R 1 为在一些实施例中，R1为H。 [0088] 在式I、Ia、Ib或Ic的化合物的一些实施例中，y为3。 [0089] 在式I、Ia、Ib或Ic的化合物的一些实施例中，X为Cl、I、F或Br。在一些实施例中，X为Br。 [0090] 根据一些实施例，提供式II化合物或其重原子衍生物： [0091] [0092] 其中 [0093] R4为H或 [0094] R5为 [0095] z为1-6；以及 [0096] Q为卤素。 [0097] 在一些实施例中，式II的重原子衍生物为式IIa或IIb的化合物 [0098] [0099] 在 式 I I 、I Ia 或 II b或 I c 的 化 合 物 的 一 些 实 施 例 中 ，R 4 为在一些实施例中，R4是H。 [0100] 在式II、IIa或IIb或Ic的化合物的一些实施例中，z为3。在一些实施例中，Q为F、I、Cl或Br。在一些实施例中，Q为Br。 [0101] 根据一些实施例，提供式III化合物或其重原子衍生物： [0102] [0103] 其中 [0104] R6为在一些实施例中，重原子衍生物为式IIIa 化合物 [0105] [0106] 在一些实施例中，提供制备式II化合物的方法 [0107] [0108] 其中 [0109] R4为H或 [0110] R5为 [0111] z为1-6；以及 [0112] Q为卤素。 [0113] 在一些实施例中，所述方法包含使 与4-氨基安替比林在足以制造式II化合物的条件下反应，其中 [0114] R4为H或 [0115] R5为 [0116] z为1-6；以及 [0117] Q为卤素。 [0118] 在一些实施例中，所述方法包含使 (即儿茶酚胺)与4-氨基安替比林试剂在缓冲液和氧化剂存在下反应产生式II化合物。在一些实施例中，缓冲液为约8到约11的pH。在一些实施例中，缓冲液为碳酸氢铵缓冲液。在一些实施例中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一些实施例中，氧化剂为K2[Fe(CN)6]。在一些实施例中，氧化剂为过氧化氢、硫酸铜或过硫酸钠。如本文所述，特定缓冲液和氧化剂并专用的，只要其使儿茶酚胺和4-氨基安替比林试剂彼此反应形成式II化合物。 [0119] 在一些实施例中，4-氨基安替比林试剂为式I化合物或其重原子衍生物： [0120] [0121] 其中 [0122] R1为H或 [0123] y为1-6；以及 [0124] X为卤素。 [0125] 根据一些实施例，还提供试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含4-氨基安替比林试剂，例如(但不限于)本文所述的那些、一或多种分析物标准品、一或多种内标、一或多种样品制备套筒和板、生物学基质、溶剂、试管、HPLC柱以及一或多种液相色谱缓冲液。在一些实施例中，4-氨基安替比林试剂为式I化合物或其重原子衍生物： [0126] [0127] 其中 [0128] R1为H或 [0129] Y为1-6；以及 [0130] X为卤素。 [0131] 根据多个实施例，试剂盒可包含缓冲液、一或多个色谱柱以及适用于进行所述方法或分析法的任选地其它试剂和/或组分。在一些实施例中，试剂盒可以包含例如均质分析以使得使用者仅需要添加样品。在一些实施例中，试剂盒可以包含校准或标准化试剂或标准品。试剂盒中也可以包括可以或应该用于进行分析的关于仪器设定的信息。在一些实施例中，试剂盒内包括关于样品制备、操作条件、体积量、温度设定等的信息。试剂盒还可以包装于含有一或多个试剂容器和适当说明书的气封容器中。试剂盒中可以包括电子媒体，在所述电子媒体上储存有关于一或多种分析、测量值、跃迁对、操作说明书、用于进行操作的软件、其组合等的电子信息。根据多个实施例，可以提供一种用于合成4-氨基安替比林试剂和其中间体的方法。在一些实施例中，试剂盒可以包含至少一种包含已知浓度的已知儿茶酚胺分析物的标准品。根据一些实施例，试剂盒可包含用于标记、定量和检测儿茶酚胺分析物的说明书。 [0132] 如本文所述，所述方法可进一步包含提供包含已知儿茶酚胺的标准品。内标可用于在同一质谱分析法中检测和定量儿茶酚胺的量。举例来说，可使用两种不同标记的内标和试剂来根据本文所述的方法标记样品。“标记”样品指的是形成加合物。也就是说，儿茶酚胺(如果存在)用4-氨基安替比林试剂标记。标记后，可以通过例如LC/MS/MS混合和分析样品来获得两个不同样品中存在的分析物的定量信息。这一方法的非限制性实例如下： [0133] ■样品1+内标1→样品制备→用试剂1标记 [0134] ■样品2+内标2→样品制备→用试剂2标记 [0135] ■混合上述反应反应物并且分析。这是同时进行两次的实例，它也可以延伸到任何其它同时进行多次的型式。 [0136] 举例来说，如果样品含有多巴胺，那么内标1可以是： 多巴胺-1,1,2,2-d4盐酸盐，并且内标2可以是： [0137] 多巴胺13C6。第一4-氨基安替比林试剂(试剂1)可以是并且第二4-氨基安替比林试剂(试剂2)可以是 通过使用 不同内标和不同试剂允许样品的混合物判断不同样品中是否存在儿茶酚胺，以及同时定量和检测相同或不同样品的能力。这提供同时分析许多样品的出人意料的优势，并且因此提高产出量。 [0138] 在一些实施例中，可获得儿茶酚胺分析物的相对浓度。在其它实施例中，可以通过使用已知浓度的标准品来获得儿茶酚胺分析物的绝对定量。 [0139] 根据多个实施例，一种用于相对定量一或多种儿茶酚胺分析物的方法可包含标记一或多种分析物，随后使用质谱法分析。根据一些实施例，可以定量一或多种儿茶酚胺分析物和/或其盐或水合物。如本文所述，标记可以是4-氨基安替比林试剂或其重原子衍生物。可以根据本文所述的反应条件进行标记。 [0140] 应理解可以通过与上文针对相对定量所述相同的方式来进行儿茶酚胺分析物的绝对定量，其中标准物具有已知浓度的儿茶酚胺分析物。另外，当儿茶酚胺分析物和/或儿茶酚胺分析物的盐或水合物是上文所述的那些时，应理解可使用任何儿茶酚胺分析物。 [0141] 根据多个实施例，在分析之前可以通过多种方法富集含有一或多种儿茶酚胺的样品。富集方法可以取决于样品类型，例如血液(新鲜的或干缩的)、血浆、血清、尿液或唾液。示范性富集方法可以包含(但不限于)蛋白质沉淀、液-液萃取、固-液萃取、亲和捕捉/释放、抗体介导的富集和超滤。可以使用其它富集方法或两种或两种以上富集方法的组合。样品可以是适于分析的任何类型的样品，例如(但不限于)血液(新鲜或干缩)、血浆、血清、尿液或唾液。 [0142] 在一些实施例中，分析儿茶酚胺分析物可以包含例如通过质谱仪中的高能碰撞产生报告子离子，并且利用报告子离子的强度或峰面积进行定量。举例来说，上文所示的加合物可以在高能碰撞(MSMS)期间发生中性丢失，留下作为报告子离子的带电分析物质，并且报告子离子随后可以进行MS3分析。在一些实施例中，加合物可以在高能碰撞时产生标签片段，并且标签片段可以随后进行MS3分析。标签片段的实例显示为式III化合物。 [0143] 如本文所述，标准品和样品的分析物可混合在一起并且进行分析来测定样品中分析物的浓度。分析可以包含分离混合物形成经分离的分析物，并且分析经分离的分析物。可以使用的分离方法包括气相色谱法、液相色谱法、其它色谱法、电泳法、电渗法、质量差示分离法等。在示范性实施例中，液相色谱用于分离混合物中的不同分析物并且因此形成经分离的分析物。 [0144] 在一些实施例中，可以在反相柱上进行色谱分离并且可以对从管柱洗脱的峰进行后续分析。在一些实施例中，后续分析可以包含质谱或更具体地说，母离子-子离子跃迁监测(PDITM)。通过比较来自PDITM的结果，可以确定样品中的儿茶酚胺分析物的浓度(如在下文中更详细地描述)。关于PDITM和其用途的更多细节可见于公开的申请案US2006/0183238A1中，其以全文引用的方式并入本文中。 [0145] 可以根据本发明传授内容的多个实施例使用的不同液相色谱和质谱法、系统和软件包括2009年5月31日提交的美国临时专利申请案第61/182,748号和2006年8月17日公开的美国专利申请案第US 2006/0183238A1号中描述的那些。这些参照案都以引用的方式并入本文中。 [0146] 可以根据以下实例进一步理解本发明传授内容的各方面，所述实例不应该理解为以任何方式限制本发明传授内容的范围。 [0147] 实例 [0148] 实例1： [0149] 向多巴胺盐酸盐(1mg/mL)和4-氨基安替比林(4-AAP，1mg/mL)于100mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8-9)中的0.5mL溶液中添加K2[Fe(CN)6]溶液(0.1mL，水中0.25mg/mL)并且混合。因此产生的紫色溶液经C18(500mg)滤筒过滤并且通过MS/MS分析。反应根据以下流程制造以下加合物： [0150] [0151] 全部化学物质都购买自西格玛阿尔德里奇(Sigma Aldrich)。反应涉及在环境温度下向碳酸氢铵缓冲的多巴胺溶液中添加4-AAP和K2[Fe(CN)6]水溶液并且涡旋5分钟，此时形成紫色4-AAP-Dopa加合物。通过C18·滤筒去盐后，使用直接输注模式在 5500质谱仪中分析产物的母离子和子离子。 [0152] 在m/z 353.1(MH+)下观测到母离子并且在分段后，在m/z＝150.5、159.5、187.5、202.8(密集)、204.7(密集)、324.9以及336.0下观测到子离子。所有这些跃迁都可用于MRM监测。识别出一个结构特异性片段(观测到质量＝204.7) [0153] [0154] 图1和图2示出了识别物质的光谱。 [0155] 本文所用的章节标题仅用于组织目的并且不应理解为以任何方式限制所述标的物。 [0156] 虽然结合多个实施例来描述本申请人的传授内容，但并不打算将申请人的传授内容限制于此类实施例。与其相反，本领域技术人员应了解，申请人的传授内容涵盖多种替代方案、修改和等效物。 [0157] 虽然上文的描述提供了多种实施例的实例和具体细节，但应了解，所述实施例的一些特征和/或功能允许在不脱离所述实施例的范围的情况下加以修改。上文的描述打算说明本发明，其范围仅由在此随附的权利要求书的语言进行限制。从本说明书和本文所公开的本发明传授内容的实践来考虑，本发明传授内容的其它实施例对本领域的技术人员来说将为显而易知的。打算将本说明书和实例仅视为示范性的。 |
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