[0001] 本发明涉及用于寡核苷酸合成的固相载体。更具体地,本发明涉及用于寡核苷酸合成的固相载体，其通过将可裂解连接物负载在下述的多孔树脂珠上来获得，所述珠包括单乙烯基单体单元和可交联的乙烯基单体单元，并结合有聚乙二醇单元，且在该珠表面具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团。

[0002] 采用亚磷酰胺(phosphoramidite)的固相合成方法被广泛地使用于寡核苷酸的化学合成。在该方法中,例如,首先，将待要合成的寡核苷酸的3'-端的核苷，经可裂解连接物例如琥珀酰基被预先负载在固相载体上，且将该载体放入反应柱并安装在寡核苷酸自动合成装置上。然后,根据寡核苷酸自动合成装置合成程序，例如下列方式，将合成用试剂送入反应柱中。(1)通过三氯乙酸/二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯等将核苷5'-OH基脱保护,(2)通过核苷亚磷酰胺(核苷单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑或等)/乙腈溶液，将亚磷酰胺(amidite)与5'-OH基团偶合反应,(3)通过乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等将未反应的5'-OH基封上，以及(4)通过碘/水/吡啶等将亚磷酸盐氧化。

[0003] 通过重复上述合成循环,来合成具有目的序列的寡核苷酸。通过氨、甲胺等将可裂解连接物水解,将最终合成的寡核苷酸从固相合成载体切出(见非专利文献1)。 [0004] 到目前为止无机颗粒例如CPG(Controlled Pore Glass)、硅胶等被用作在寡核苷酸合成中使用的固相载体,但是近年来，由于平价并且大量合成，能够增加单位重量的固相载体的寡核苷酸合成量的树脂珠开始被使用。这些树脂珠,可以例举例如高度交联且非溶胀的多孔聚苯乙烯珠(见专利文献1),低度交联且溶胀的多孔聚苯乙烯珠(见专利文献2)等。

[0005] 通常,合成的寡核苷酸链越长，存在导致合成能力（合成纯度以及合成数量）越低的问题。为了解决该问题，需要减少作为固相载体合成起点的核 苷连接物的负载量。例如，可以通过具有约200μmol/g核苷连接物负载量的市售的多孔树脂珠固相载体，高纯度地合成包含20个碱基的DNA寡核苷酸。然而，对于包含40个碱基的DNA寡核苷酸，该负载量需要为80μmol/g或更少。同样，当合成RNA寡核苷酸或修饰寡核苷酸时，因为包含大的保护基或修饰基的亚磷酰胺(amidite)被偶合，合成寡核苷酸采用较低核苷连接物负载量，以防止合成能力降低。

[0006] 然而,当使用多孔树脂珠作为寡核苷酸合成的固相载体来合成寡核苷酸并且核苷连接物负载量减少时，出人意料地，存在使合成能力变得比预想的更低的问题。 [0007] 引用文献

[0008] 专利文献：

[0009] 专利文献1:JP-A-H3-68593

[0010] 专利文献2:JP-A-2005-325272

[0011] 专利文献3:JP-A-2008-74979

[0012] 非专利文献：

[0013] 非专利文献1:Current Protocol in Nucleic Acid Chemistry(2000),UNIT3.6Synthesis of Unmodified Oligonucleotide。

[0014] 本发明解决的技术问题

[0015] 本发明目标在于提供用于高合成数量及高纯度合成寡核苷酸的固相载体。尤其,本发明目标在于提供采用低负载量连接物合成长链寡核苷酸、RNA寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的固相载体。

[0016] 解决问题的手段

[0017] 本发明的发明人对于上述问题进行了深入研究，并且发现通过将聚乙二醇单元结合到用作寡核苷酸合成固相载体的多孔树脂珠上，即使采用低负载量的连接物，可以以高合成能力(高合成纯度及合成数量)地合成长链寡核苷酸、RNA寡核苷酸或修饰的寡核苷酸，结果完成了本发明。

[0018] 因此,本发明概要如下：

[0019] (1)用于寡核苷酸合成的固相载体，其包括具有单乙烯基单体单元、可交联的乙烯基单体单元和聚乙二醇单元的多孔树脂珠和负载在其表面的可裂解连接物，该多孔树脂珠在其表面具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，该可裂解连接物具有羧基，其中该可裂解连接物的羧基通过脱水缩合反应被结合到该能够与羧基结合的基团上，并且该可裂解连接物的负载量相对于该多孔树脂珠的重量为1-80μmol/g。

[0020] (2)根据(1)所述的用于寡核苷酸合成的固相载体，其中该单乙烯基单体单元包括苯乙烯单体单元。

[0021] (3)根据(1)或(2)所述的用于寡核苷酸合成的固相载体,其中该聚乙二醇单元的数均分子量为100-10000，并且其结合量相对于该多孔树脂珠的重量为0.001-1mmol/g。 [0022] (4)(1)-(3)中任一项所述的用于寡核苷酸合成的固相载体，其中该能够与羧基结合的基团包括羟基或氨基，并且被共价键合到该具有羧基的可裂解连接物上。 [0023] (5)一种合成寡核苷酸的方法，其包括使用(1)-(4)中任一项的用于寡核苷酸合成的固相载体，经可裂解的连接物连续地结合核苷或核苷酸来得到寡核苷酸。 [0024] 本发明的效果

[0025] 即使是当采用低负载量连接物合成长链寡核苷酸、RNA寡核苷酸等时，因为本发明的用于寡核苷酸合成的固相载体获得高合成数量及高合成纯度的寡核苷酸，采用本发明的多孔树脂珠比采用传统多孔树脂珠用作寡核苷酸合成的固相载体，能够更为有效地合成寡核苷酸。

[0026] 实施方式的描述

[0027] 本发明用于寡核苷酸合成固相载体的结构性单元之一的单乙烯基单体单元，没有特别限定，只要它是在分子中具有一个乙烯基的单体。其例子包括芳族乙烯基单体、（甲基）丙烯酸烷基酯、乙酸乙烯酯、（甲基）丙烯腈、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮等。 [0028] 芳族乙烯基单体的例子包括在分子中具有一个乙烯基的5或6元芳环， 作为环构成原子，除了碳，其任选地包含例如氮原子等的杂原子。该芳香环上任选地具有取代基，例如卤素原子（如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等）、具有1至10个碳原子的直链或支链烷氧基（如甲氧基、乙氧基等）、具有1至10个碳原子的直链或支链烷基（如甲基、乙基等）（所述烷基任选地被卤素原子、烷氧基等所取代）、具有2至10个碳原子的直链或支链酰氧基（如乙酰氧基等）、氨基、具有2至10个碳原子的直链或支链酰氨基（如乙酰氨基等）、氰基、硝基等。其特定例子包括苯乙烯类单体，例如苯乙烯、烷基苯乙烯（乙基苯乙烯、甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯、三甲基苯乙烯、丁基苯乙烯等）、卤代的苯乙烯（氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等）、卤代烷基苯乙烯（氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等）、氨基苯乙烯、氰基苯乙烯、甲氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯、硝基苯乙烯等。

[0029] 作为（甲基）丙烯酸烷基酯的例子，包括直链或支链的一元醇与丙烯酸或甲基丙烯酸得到的酯等，所述醇中烷基具有1至20个碳原子。所述醇任选地被卤原子、羟基、烷氧基、环氧基、苯基等所取代。它还包括由聚乙二醇、聚乙二醇单烷基醚（如聚乙二醇单甲基醚等）等，与丙烯酸或甲基丙烯酸得到的酯等。其具体例子包括丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸2-羟基乙基酯、丙烯酸甲氧基乙二醇酯、丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸甲氧基乙二醇酯、甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸三氟乙基酯、甲基丙烯酸八氟戊基酯等。该单乙烯基单体可以单独使用或不同种类混合使用。

[0030] 该单乙烯基单体优选苯乙烯类单体,或苯乙烯类单体与其它单乙烯基单体的混合物。

[0031] 本发明用于寡核苷酸合成固相载体的结构性单元之一的可交联的乙烯基单体，可以作为交联剂使用，且没有特别限定，只要它在分子中具有两个或更多，优选2或3个的乙烯基，并能够与上述单乙烯基单体形成交联网络结构。其例子包括二乙烯基苯、三乙烯基苯、三乙烯基环己烷、二（甲基）丙烯酸乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸二乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸三乙 二醇酯、二（甲基）丙烯酸与比上述更多聚乙二醇的酯、二（甲基）丙烯酸丙二醇酯、二（甲基）丙烯酸二丙二醇酯、二（甲基）丙烯酸三丙二醇酯、二（甲基）丙烯酸与比上述更多聚丙二醇的酯、二（甲基）丙烯酸丁二醇酯、二（甲基）丙烯酸己二醇酯、二（甲基）丙烯酸壬二醇酯等。

[0032] 该可交联的乙烯基单体可以单独使用或不同种类混合使用，该可交联的乙烯基单体尤其优选对二乙烯基苯、间二乙烯基苯或它们的混合物。

[0033] 本发明多孔树脂珠的可交联的乙烯基单体单元，相对于单位重量多孔树脂珠的量为100-5000μmol/g,优选300-3000μmol/g。当可交联的乙烯基单体单元少于100μmol/g时,获得的颗粒不能显示出足够的耐溶剂性、热稳定性或多孔性，并且当用作用于寡核苷酸合成的固相载体时，无法预期显示出所需的效果。相反地,当该单元超过5000μmol/g时,因为其在有机溶剂中可溶胀性将降低，使用该颗粒作为用于寡核苷酸合成的固相载体，所得到寡核苷酸的合成纯度和合成数量趋向于减少。

[0034] 存在于该多孔树脂珠的表面的该“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团”，没有特别限定，只要它能通过脱水缩合反应与羧基成键。其优选包含羟基或氨基的基团,且其具体例子包括羟基、氨基、羟基-C1-20烷基例如羟甲基等、氨基-C1-20烷基例如氨甲基等等。

[0035] 能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团通过以下可以被引入到多孔树脂珠的表面上：

[0036] (1)将包含能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的乙烯基单体与上述单乙烯基单体和可交联的乙烯基单体共聚,或者

[0037] (2)将包含下述基团的乙烯基单体与上述单乙烯基单体和可交联的乙烯基单体共聚，然后将该共聚物进行如水解等反应，所述基团是可通过如水解等转变成能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团。其制备方法之后有详细描述。

[0038] 在本发明用于寡核苷酸合成的固相载体中,多孔树脂珠具有的聚乙二醇单元，没有特别限定，只要它具有聚乙二醇结构(-(CH2CH2O)n-，其中n为2或更多的整数)。该聚乙二醇单元和多孔树脂珠的结合方式没有特别限定,并包括酯键、醚键、酰胺键等。 [0039] 关于将聚乙二醇单元结合到用于本发明寡核苷酸合成的固相载体，可以举出将包含聚乙二醇单元的乙烯基单体，例如，丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、 丙烯酸苯氧基聚乙二醇酯、丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸苯氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯等共聚的方法。

[0040] 作为将聚乙二醇单元结合到用于本发明寡核苷酸合成的固相载体的其它方法，可以是先通过悬浮共聚等合成多孔树脂珠，然后可以引入聚乙二醇单元。例如,该结合可以通过将经氯甲基苯乙烯等共聚而引入氯甲基的多孔树脂珠与聚乙二醇低聚物反应来进行，上述聚乙二醇低聚物，例如，聚乙二醇、聚乙二醇单甲基醚、聚乙二醇单苯基醚等。或者，该结合可以通过将引入了官能团（例如羧基、氨基、羟基、缩水甘油基等）的多孔树脂珠与聚乙二醇、聚乙二醇双羧甲基醚、聚乙二醇二胺、聚乙二醇双3-氨基丙基、聚乙二醇缩水甘油醚等使用缩合剂等来进行。

[0041] 结合到本发明用于寡核苷酸合成固相载体的聚乙二醇单元的数均分子量为100-10000,优选150-5000,更优选200-3000,进一步优选200-2000。

[0042] 当该聚乙二醇单元的数均分子量低于这一范围,载体表面上的亲水化程度变低,且因此当该连接物的负载量低时，核苷酸的合成能力趋于减少。相反地,当其超出这一范围时,寡核苷酸的合成能力趋于变低,因为聚乙二醇单元不容易地结合到载体上或该聚乙二醇单元抑制寡核苷酸合成。

[0043] 该聚乙二醇单元的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱法(GPC)，使用高性能液相色谱仪来测量。另外,可以使用包含具有所需数均分子量的聚乙二醇单元市售的产品。 [0044] 当包含聚乙二醇单元的乙烯基单体被共聚时，该乙烯基单体本身的数均分子量可用作聚乙二醇单元的数均分子量。

[0045] 结合到本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的聚乙二醇单元的结合量，相对于该固相载体上多孔树脂珠的重量，为0.001-1mmol/g,优选0.005-0.7mmol/g,更优选0.01mmol/g-0.6mmol/g。

[0046] 当聚乙二醇单元的结合量低于这一范围时,载体表面的亲水化程度变低，且因此当该连接物的负载量低时,寡核苷酸的合成能力趋于减少。相反地,当其超出这一范围,寡核苷酸的合成能力趋于变低,因为该聚乙二醇单元抑制寡核苷酸合成。

[0047] 聚乙二醇单元的结合量，相对于多孔树脂珠的重量，可以通过调节包含聚乙二醇单元的乙烯基单体的量或者用于引入聚乙二醇单元的树脂珠上的官能团(氯甲基、羧基、氨基、羟基、缩水甘油基等)的量来设定。

[0048] 本发明用于寡核苷酸合成的固相载体不需要显示出严格的球形，仅需要具有至少为颗粒的形状。然而,本发明用于寡核苷酸合成的固相载体优选具有球形，因为固相合成反应柱的填充效率得到提高且其不容易损坏。

[0049] 但本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的中值粒径没有特别限定，其通过激光衍射散射法测量，优选1-1000μm,更优选10-500μm,进一步优选20-300μm。本发明的多孔树脂珠的中值粒径通过激光衍射散射法来测量。具体地,平均粒径使用50%v/v乙醇水溶液作为分散介质，通过激光衍射散射型粒度分布分析仪LA-950(Horiba,Ltd.制造)来测量并计算。

[0050] 用悬浮聚合来制备用于寡核苷酸合成固相载体的多孔树脂珠的情况下，中值粒径取决于聚合开始前的搅拌条件情况，分散稳定剂的种类和浓度。从而,通过调节这些条件，可能调节该中值粒径到所需的范围。

[0051] 本发明的通过水银压入法来测量的用于寡核苷酸合成的固相载体的中值孔径，没有特别限定，其优选1-1000nm,更优选5-500nm,进一步优选10-300nm。

[0052] 本发明多孔树脂珠的中值孔径通过水银压入法来测定。具体地,0.2g的多孔树脂珠被放置在水银孔隙率计PoreMaster60-GT(QuantaChrome Co.制造)中,并且在水银接触角为140°以及水银表面张力为480dyn/cm的条件下，采用水银压入法进行测量。 [0053] 用悬浮聚合来制备用于寡核苷酸合成固相载体的多孔树脂珠的情况下，该中值孔径取决于聚合开始前的搅拌条件情况，致孔剂的种类和浓度。从而,通过调节这些条件，可能调节该中值孔径到所需的范围。

[0054] 本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的制备方法没有特别限定，其例子包括： [0055] (1)使用下述多孔树脂珠来制备的方法，所述珠是通过，将单乙烯基单体、可交联的乙烯基单体、包含能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的乙烯基单体、结合有聚乙二醇单元的单体，与致孔剂和聚合引发剂混合并溶解，并将该混合物在分散或溶解有分散稳定剂的水中悬浮共聚而制得的；

[0056] (2)使用下述多孔树脂珠来制备的方法，所述珠是通过，将单乙烯基单体、可交联的乙烯基单体、包含能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的乙烯基单体和包含官能团（氯甲基、羧基、氨基、羟基、缩水甘油基等)的乙烯基单体，与致孔剂和聚合引发剂混合并溶解，并将该混合物在分散或溶解 有分散稳定剂的水中悬浮共聚，合成了多孔树脂珠,然后通过与官能团反应而引入聚乙二醇单元而制得的；

[0057] (3)使用下述多孔树脂珠来制备的方法，所述珠是通过，将单乙烯基单体、可交联的乙烯基单体、包含通过例如水解等可转变成“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团”的基团的乙烯基单体、结合有聚乙二醇单元的单体，与致孔剂和聚合引发剂混合并溶解，以及将该混合物在分散或溶解有分散稳定剂的水中悬浮共聚等，合成了多孔树脂珠,然后通过例如水解等引入能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团而制得的；

[0058] (4)使用下述多孔树脂珠来制备的方法，所述珠是通过，将单乙烯基单体、可交联的乙烯基单体、包含通过例如水解等可变成“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团”的基团的乙烯基单体、和包含官能团（氯甲基、羧基、氨基、羟基、缩水甘油基等)的乙烯基单体，与致孔剂和聚合引发剂混合并溶解，并将该混合物在分散或溶解有分散稳定剂的水中悬浮共聚等，合成了多孔树脂珠,然后通过通过例如水解等引入能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并进一步通过与官能团等反应引入聚乙二醇单元而制得的。 [0059] 悬浮共聚中,加入的该可交联的乙烯基单体单元的量，相对于单体的总重量，优选0.1-5mmol/g,更优选0.3-3mmol/g。

[0060] 悬浮共聚中,加入的包含能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的该乙烯基单体的量,或包含通过例如水解等可变成能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的基团的乙烯基单体的量，相对于单体的总重量，优选0.001-1mmol/g,更优选0.005-0.5mmol/g。

[0061] 悬浮共聚通过在分散或溶解了分散稳定剂的水中，搅拌和乳化上述单体、致孔剂和聚合剂引发剂的混合溶解物来进行。

[0062] 本发明中,致孔剂指的是悬浮共聚系统中水以外的溶剂,且适宜使用烃和醇。具体地，作为烃，可以使用脂肪族饱和烃、脂肪族不饱和烃或芳族烃，其中的脂肪族烃类优选具有5至12个碳原子，且更优选正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、十一烷、十二烷等。另外，为了增加此情况下获得的树脂珠的多孔性，优选醇同时存在。作为醇，根据本发明可以举出例如脂族醇，其碳原子数优选为5至9。这样的醇，具体地，有2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、环己醇等。

[0063] 悬浮共聚中用作致孔剂的烃和醇的重量比可以根据烃和醇的具体组合 任选改变；并且因此可以增加得到固相合成载体的比表面积。优选烃和醇的混合比例为重量比1:9-6:4。

[0064] 基于上述各单体的总重量，悬浮共聚时致孔剂的重量优选0.5-2.5倍,更优选0.8-2.2倍,进一步优选1.0-2.0倍。当该值大于或小于此时，得到多孔树脂珠的比表面积变小，并且使用树脂珠通过化学反应合成反应产物的量变小。

[0065] 根据本发明,实施悬浮共聚的方法本身可以通过采用惯用已知方法来实施。 [0066] 悬浮共聚中使用的分散稳定剂没有特别限定此,并且这儿可使用惯用已知的亲水性胶体保护剂（例如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉、羧甲基纤维素等）、微溶的粉末（例如碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硫酸安定、硫酸钙、膨润土等）等。尽管加入的分散介质的量没有特别限定,基于悬浮共聚体系的水的重量，优选0.01-10%重量比。当该值变小时,悬浮共聚的分散稳定性可会被破坏，并且可形成大量的凝聚物。当该值变大时,可形成大量的微小的珠。

[0067] 实施悬浮共聚所使用的聚合引发剂没有特别限定,并且可采与惯用已知的过氧化物（例如过氧化二苯甲酰、过氧化二月桂酰、过氧化二硬脂酰、1,1-二（叔丁基过氧基）-2-甲基环己烷、1,1-二（叔己基过氧基）-3,3,5-三甲基环己烷、1,1-二（叔己基过氧基）环己烷、1,1-二（叔丁基过氧基）-环己烷、二叔己基过氧化物、叔丁基枯基过氧化物、二叔丁基过氧化物、1,1,3,3-四甲基丁基过氧基-2-乙基己酸酯、叔己基过氧基-2-乙基己酸酯、叔丁基过氧基-2-乙基己酸酯、叔丁基过氧基异丙基单碳酸酯等），和偶氮化合物（例如2,2'-偶氮双异丁腈、2,2'-偶氮双-2-甲基丁腈、2,2'-偶氮双-2,4-二甲基戊腈等）。聚合引发剂的添加量没有特别限定，本领域技术人员可能选择适当的量。

[0068] 实施悬浮共聚的反应条件可以适当设置,例如,可以在60-90°C搅动30分钟-48小时。该搅动速度例如100rpm-1,000rpm,优选200rpm-800rpm。

[0069] 悬浮共聚得到的共聚物可以任选地进行洗涤、干燥、分级处理等。另外,可以在通过悬浮共聚等合成多孔树脂珠后,将能够通过脱水缩合反应结合羧基的基团和/或聚乙二醇单元引入。该引入方法如前所述。

[0070] 本发明用于寡核苷酸合成的固相载体在多孔树脂珠上负载有可裂解连接物。该可裂解连接物是作为寡核苷酸合成反应的起点的化合物,其在加温 及碱性等条件下裂解，以从用于寡核苷酸合成的固相载体上切出合成的寡核苷酸。

[0071] 本发明用于寡核苷酸合成固相载体的、具有羧基的可裂解连接物的例子，包括,但不限于式1所示的核苷琥珀酰基连接物。可以使用结合有各种修饰基的核苷连接物和不包含核苷的连接物例如普通的连接物(例如,USP5681945、USP6653468、WO2005/049621A、和US2005/0182241A中所述的连接物)。

[0072]式1琥珀酰基核苷连接物

[0073] 上式中,B1表示碱基,可以采用核酸碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶等），并且上述核酸碱基可以通过乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等的保护基来保护氨基。

[0074] 作为X,可以采用氢原子、羟基、卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子等)、具有1-20个碳原子的烷氧基(例如甲氧基等)、被叔丁基二甲基硅烷基等保护的羟基和其类似基团。

[0075] 本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的可裂解连接物负载量为1-80μmol/g,优选1-60μmol/g,更优选3-50μmol/g,进一步优选5-45μmol/g。当连接物负载量少于1μmol/g时,可合成寡核苷酸的量变得很小。当连接物负载量超过80μmol/g时,寡核苷酸的合成能力，与不含聚乙二醇单元的用于寡核苷酸合成的固相载体相比，没有显示出不同。

[0076] 用于寡核苷酸合成固相载体的可裂解连接物的负载量，可以合适地通过调节相对于多孔树脂珠的可裂解连接物使用量来设定。

[0077] 在用于本发明寡核苷酸合成的固相载体上负载可裂解连接物的方法没有特别限定。例如,可裂解连接物的羧基与多孔树脂珠的能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团,在缩合剂存在的条件下通过脱水缩合反应而共价键合 。

[0078] 为了将能够通过脱水缩合反应与羧基结合的该基团引入本发明用于寡核苷酸合成固相载体的多孔树脂珠，当为羟基的情况下，该方法可以为将包含羟基的乙烯基单体（例如丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、丙烯酸2-羟基丙酯、甲基丙烯酸2-羟基丙酯、丙烯酸4-羟基丁基酯、甲基丙烯酸4-羟基丁基酯、羟基苯乙烯等）共聚。当为氨基的情况下，该方法可以为将包含氨基的乙烯基单体（例如氨基苯乙烯、氨基甲基苯乙烯等），与单乙烯基单体和可交联的乙烯基单体共聚。

[0079] 当包含能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的乙烯基单体为苯乙烯单体时,能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，优选存在于相对于乙烯基的对位。然而,也可以是邻位或间位。

[0080] 能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团,其包含于本发明用于寡核苷酸合成的固相载体中，其是先通过悬浮共聚等合成多孔树脂珠后，该多孔树脂珠具有通过例如水解等可变成“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团”的基团,然后通过水解等变成为“能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团”。

[0081] “通过例如水解等可变成能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的基团”的例子包括具有2-10个碳原子的直链、支链或环状酰氧基（例如乙酰氧基、苯甲酰氧基等），具有2-10个碳原子的直链、支链或环状酰氨基（例如乙酰氨基、苯甲酰氨基等），其中酰基具有2-10个碳原子的直链、支链或环状酰氧基-C1-20烷基（例如乙酰氧甲基等），其中酰基具有2-10个碳原子的直链、支链或环状酰氨基-C1-20烷基（例如乙酰氨基甲基等），卤代-C1-20烷基（例如氯甲基等等）。

[0082] 在如此的制备过程中，包含可转变为本发明的“能够通过脱水缩合反应与羧基结合基团”的基团的单乙烯基单体的例子，包括酰氨基苯乙烯（例如乙酰氨基苯乙烯等）、酰氧基苯乙烯（例如乙酰氧基苯乙烯、乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基苯乙烯等）、卤代烷基苯乙烯（例如氯甲基苯乙烯等）。

[0083] 当包含可转变为能够通过脱水缩合反应与羧基结合基团的基团的单乙烯基单体为苯乙烯单体时,可转变为能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团的酰氧基、酰氨基、卤烷基等,优选存在于相对于乙烯基的对位。然而,也可以是邻位或间位。

[0084] 通过悬浮共聚等合成多孔树脂珠中的酰氧基和酰氨基，可以通过通常水解，例如,与无机碱（例如氢氧化钠等）在含水醇类（乙醇水溶液、甲醇水溶液）中的反应，转变为能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团,具体地如羟基和氨基。另外,卤代烷基可以通过邻苯二甲酰亚胺与肼、氨、氢氧化钠等的反应，转换为能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团,具体地如氨基烷基或羟基烷基。

[0085] 脱水缩合反应可以在对反应惰性的溶剂中进行。只要反应能进行，该溶剂没有特别限定,可以为卤化烃溶剂（例如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿等），芳族烃溶剂（例如苯、甲苯、二甲苯等），脂族烃类溶剂（例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等），腈溶剂（例如乙腈等）。其中优选乙腈。

[0086] 缩合剂的例子包括二环己基碳二亚胺（DCC），二异丙基碳二亚胺（DIC），N-乙基-N'-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺或其盐酸盐（EDC.HC1），（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷鏻六氟磷酸盐（PyBop），O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N',N'-四甲基脲 四氟硼酸盐（TBTU），1-[双（二甲基氨基）亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑 -3-氧化物六氟磷酸盐（HCTU），O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N',N'-四甲基脲 六氟磷酸盐（HBTU）等。其中，HBTU，HCTU或二环己基碳二亚胺（DCC）是优选的。

[0087] 只要反应能进行，反应温度没有特别限定,优选-10°C至50°C。反应时间为30分钟至70小时。

[0088] 在脱水缩合反应后,优选对未反应的能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团进行封端。封端可以通过惯用已知的方法进行。例如,优选对未反应的能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团进行乙酰化。乙酰化反应不限于,例如,优选将包含醋酸酐的溶液与包含碱性催化剂的溶液(例如,1-甲基咪唑、吡啶、二甲基氨基吡啶等)一同加入至固相载体上。

[0089] 通过上述反应，可以获得本发明用于寡核苷酸合成的固相载体。

[0090] 惯用已知的方法可以应用于使用本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的寡核苷酸合成中。

[0091] 例如,将核苷连接物负载在了用于寡核苷酸合成的固相载体的情况下,核苷亚磷酰胺一个接一个键合，以从核苷的5'-端提供预定的碱基序列。

[0092] 合成反应可以通过自动合成装置进行。例如,通过顺次地将5’-OH脱 保护剂溶液、核苷亚磷酰胺溶液、亚磷酰胺(amidite)活化剂溶液、氧化剂溶液、封端剂溶液、作为洗涤溶液的乙腈等，加入填充了用于寡核苷酸合成固相载体的反应柱，并重复该反应。最后,通过采用碱溶液等水解来切断可裂解连接物部分，可以得到所需的寡核苷酸。 [0093] 使用本发明用于寡核苷酸合成的固相载体的寡核苷酸合成，采用降低的可裂解连接物负载量(1-80μmol/g)，对于合成不少于20个碱基的长链的寡核苷酸、DNA或RNA尤其有用。

[0094] 本发明更多的细节参考如下实施例,但其不应被理解为限制性的。

[0095] 实施例1

[0096] 多孔树脂珠的制备

[0097] 将配有冷凝器、搅拌器和氮气导入管的500ml可拆式烧瓶设置在恒定温度的水浴中，然后将聚乙烯醇（2.6克，KURARAY制备）和蒸馏水（260克）装入其中，并以300rpm速度搅拌至聚乙烯醇溶解。添加将苯乙烯（23.7克，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制备)、对乙酰氧基苯乙烯（3.2克，Aldrich制备）、二乙烯基苯（21.5克，含量为55％，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制备）、聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（5.4克，Sigma-Aldrich制备，平均Mn300）、2-乙基己醇（60.3克，Wako Pure Chemical Industries Ltd.制备）、异辛烷（25.9克，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制备）和过氧化苯甲酰（1.1克，25％水，NOF corporation制备）混合溶解后的该溶液。室温下在氮气流中搅拌混合物(50rpm)，然后加热至80℃进行悬浮共聚10小时。

[0098] 将聚合产物使用蒸馏水和丙酮(Wako Pure Chemical Industries制备)洗涤并过滤，被分散在丙酮中至总体积约1L。该分散液静置，直到即使分散液倾斜沉淀物也不松动，然后弃去上清液丙酮。再次将丙酮加入到沉淀物中至总体积为约1升，重复静置和排出丙酮的操作。通过过滤该分散液并且在减压条件下干燥，得到由苯乙烯-二乙烯基苯-对乙酰氧基苯乙烯-聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯共聚物形成的多孔树脂珠。

[0099] 然后，在配有冷凝器、搅拌器和氮气导入管的500ml可拆式烧瓶中，装入由该共聚物形成的上述多孔树脂珠（20克）、乙醇（80克）、蒸馏水（50克）和氢氧化钠（2克），并且75℃下使该混合物反应同时搅拌18小时。 用盐酸中和该分散体溶液，采用蒸馏水和丙酮过滤洗涤，并且在减压下干燥得到由苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯-聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯共聚物形成的多孔树脂珠。

[0100] 在多孔树脂珠上负载DMT-dT-3'-琥珀酸酯

[0101] 按表1（实施例1）的配比，将多孔树脂珠、DMT-dT-3'-琥珀酸酯（Beijing OM Chemicals制备）、O-（苯并三唑-1-基）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU，Novabiochem制备）、N,N,二异丙基乙胺（DIPEA，Aldrich制备）与乙腈（Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制备）混合，并且将该混合物在室温下搅拌反应12小时，采用乙腈洗涤并过滤，在减压条件下干燥。

[0102] 将多孔树脂珠与封端A（112.5mL,20％醋酸酐/80％乙腈）、封端B（12.5ml，20％N-甲基咪唑/30％吡啶/50％乙腈）、4-二甲基氨基吡啶（63mg，Aldrich制备）和乙腈（12.5ml）混合，并且该混合物在室温下搅拌反应12小时，用乙腈洗涤过滤，并且在减压条件下干燥来得到负载有DMT-dT-3'-琥珀酸酯的多孔树脂珠。DMT-dT-3’-琥珀酸酯的负载量是使用对甲苯磺酸/乙腈溶液对脱保护了的DMT基团的吸光度（412nm）通过测量来确定。
得到的多孔树脂珠DMT-dT-3’-琥珀酸酯的负载量为7.2μmol/g。

[0103] 21mer RNA寡核苷酸的合成评估

[0104] 上述得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠被填充在合成柱中使合成规模为1μmol，安装在ABI3400DNA/RNA合成装置（Applied Biosystems制造）上，并且在核苷亚磷酰胺浓度为0.1M且DMT-off的条件下，合成了具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸。合成后将柱干燥，使RNA从多孔树脂珠上切出并将碱基氨基脱保护。多孔树脂珠通过过滤器过滤分离，由滤液的紫外吸收(260nm)测量法来测定RNA寡核苷酸的OD产量（相应于RNA寡核苷酸的合成量）。然后，干燥滤液，将得到的RNA寡核苷酸的2'-羟基进行脱保护，并将滤液装入HPLC测量仪（Waters制备）来测定全长％（具有目标序列的长度的RNA寡核苷酸的比例）。其结果如表2所示。

[0105] 对比例1

[0106] 按实施例1的相同方式，不同的是聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（0克 ），苯乙烯（47.0克），对乙酰氧基苯乙烯（4.7克），二乙烯基苯（8.3克，含量为55％），2-乙基己醇（55.4克）和异辛烷（23.7克）作为用于聚合的组分，获得由苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯共聚物形成的多孔树脂珠。

[0107] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（对比例1）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到得到的多孔树脂珠上。所得的多孔树脂珠上DMT-dT-3’-琥珀酸酯的负载量为11μmol/g。

[0108] 按实施例1的相同方式,合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0109] 实施例2

[0110] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（实施例2）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到实施例1中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3’-琥珀酸酯的量为45μmol/g。上述得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠被填充在合成柱中使合成规模为1μmol，安装在ABI3400DNA/RNA合成装置（Applied Biosystems制造）上。

[0111] 并且在核苷亚磷酰胺浓度为0.1M且DMT-on的条件下，合成了具有40mer混合序列的DNA寡核苷酸。合成后将柱干燥，使DNA寡核苷酸从多孔树脂珠上切出并将碱基氨基脱保护。

[0112] 多孔树脂珠通过过滤器过滤分离，由滤液的紫外吸收（260nm）测量法来测定DNA寡核苷酸的OD产量（相应于DNA寡核苷酸的合成数量）。然后，将滤液装入HPLC测量仪（Waters制备）来测定全长％（具有目标序列的长度的DNA寡核苷酸的比例）。其结果如表2所示。

[0113] 对比例2

[0114] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（对比例2）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到对比例1中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3-琥珀酸酯的量为42μmol/g。

[0115] 按实施例2的相同方式，合成具有40mer混合序列的DNA寡核苷酸,并测定DNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0116] 对比例3

[0117] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（对比例3）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到实施例1中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3-琥珀酸酯的量为108μmol/g.

[0118] 按实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0119] 对比例4

[0120] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（对比例4）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到对比例1中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3-琥珀酸酯的量为96μmol/g.

[0121] 按实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0122] 实施例3

[0123] 按实施例1的相同方式，不同的是使用苯乙烯（46.9克，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制备）、对乙酰氧基苯乙烯（3.7克，Aldrich制备）、二乙烯基苯（7.3克，55％含量，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制备）、聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（3.0克，Sigma-Aldrich制备，平均Mn950）、2-乙基己醇（55.4克，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制备）、异辛烷（23.7克，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制备）和过氧化苯甲酰（1.2克，25％水，NOF corporation制备）作为用于聚合的组分，得到由苯乙烯-二乙烯基苯-对羟基苯乙烯-聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯共聚物形成的多孔树脂珠。

[0124] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（实施例3）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到得到的多孔树脂珠上。所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3’-琥珀酸酯的负载量为55μmol/g。

[0125] 将上述得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠填充在合成柱中使合成规模为1μmol，安装在ABI3400DNA/RNA合成装置（Applied Biosystems制造）上，并且在核苷亚磷酰胺浓度为0.1M且DMT-on的条件下，合成具有20mer混合序列的DNA寡核苷酸。合成后将柱干燥，使DNA寡核苷酸从多孔树脂珠上切出并将碱基氨基脱保护。多孔树脂珠通过过滤器 过滤分离，通过滤液的紫外吸收（260nm）测量法来测定DNA寡核苷酸的OD产量（相应于DNA寡核苷酸的合成数量）。然后，将滤液装入HPLC测量仪（Waters制备）来测定全长％（具有目标序列的长度的DNA寡核苷酸的比例）。其结果如表2所示。 [0126] 对比例5

[0127] 使用对比例2得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠，并且按实施例3的相同方式，合成具有20mer混合序列的DNA寡核苷酸,并测定DNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0128] 实施例4

[0129] 使用实施例3得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠，并且按实施例2的相同方式，合成具有40mer混合序列的DNA寡核苷酸,并测定DNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0130] 实施例5

[0131] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（实施例5）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到实施例3中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3-琥珀酸酯的量为7.1μmol/g.

[0132] 按实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0133] 对比例6

[0134] 按实施例1的相同方式，不同的是使用表1（对比例6）的组分,将DMT-dT-3’-琥珀酸酯负载到对比例1中得到的多孔树脂珠上。负载到所得多孔树脂珠上的DMT-dT-3-琥珀酸酯的量为5.4μmol/g.

[0135] 按实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0136] 实施例6

[0137] 使用实施例3得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠，并且按 实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0138] 对比例7

[0139] 使用对比例2得到的负载有DMT-dT-3’-琥珀酸酯的多孔树脂珠，并且按实施例1的相同方式，合成具有21mer混合序列的RNA寡核苷酸,并测定RNA寡核苷酸的OD产量和全长%。其结果如表2所示。

[0140] 表1.组成以及DMT-dT-3’-琥珀酸酯的负载量

[0141]

[0142] 表2.寡核苷酸的合成量（OD产量）和合成纯度（全长%）

[0143]