[0085] 图36根据实施方案说明使用透析方法制备负载尼罗红的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的步骤。

[0086] 图37说明表皮和角质层中尼罗红的量(n＝3)。使用被夹在垂直扩散池(PERMEGEARTM,Hellertown,PA)的两个室之间的皮片(dermatomed)的猪皮肤实施体外研究。
将100μL的5％v/v Tween-80溶液中的尼罗红(250ng)或水中的负载尼罗红的PEG-玉米醇溶蛋白胶束(250ng)添加至供应室。由PBS pH 7.4组成的接受室被维持在37℃并用磁力搅拌棒搅动。6小时后将皮肤移出并使用共聚焦激光扫描显微术(FLUOVIEW FV300TM,Olympus ix70,Olympus,Center Valley,PA)测量荧光像素。使用FLUOVIEWTM软件(Olympus,Center Valley,PA)分析光学切片(xyz)的角质层(0-15μm)和有活力的表皮(20-100μm)中的荧光强度。

[0087] 图38根据一个实施方案通过流程图说明使用透析方法制备负载视黄醇的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的一般步骤。在图38-39和43-46中，BHT指的是丁化羟基甲苯(2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚)。

[0088] 图39根据一个实施方案通过流程图说明使用膜方法制备负载视黄醇的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的一般步骤。

[0089] 图40从左至右说明游离的视黄醇和负载视黄醇的纳米胶束的水分散性。

[0090] 图41说明视黄醇从磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束的体外释放。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量视黄醇的浓度。每一个数据点是平均值±SD(n＝3)(平均值±SEM；n＝3)。

[0091] 图42从左至右说明游离的视黄醇、冷冻干燥的和视黄醇胶束。该图显示纯视黄醇的吸湿性和视黄醇胶束是未吸湿的自由流动粉末。

[0092] 图43说明当储存在正常的室内光线下时负载视黄醇纳米胶束的固态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇胶束存放在透明的玻璃小瓶中并暴露于室内光线一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量了不同时间点的剩余的视黄醇(平均值±SD；n＝3)。

[0093] 图44说明当储存在储存在不存在光时，负载视黄醇的纳米胶束的固态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇胶束存放在透明的玻璃小瓶中并储存在暗箱中一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量了不同时间点的剩余的视黄醇(平均值±SD；n＝3)。

[0094] 图45说明当储存在正常的光线下时，负载视黄醇的纳米胶束的液态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇胶束分散在磷酸盐缓冲液中(pH 7.4)并在室内光线中储存在透明的玻璃小瓶一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量了不同时间点的剩余的视黄醇(平均值±SD；n＝3)。

[0095] 图46说明当在暗箱避光储存时，负载视黄醇的纳米胶束的液态稳定性。将游离的视黄醇和视黄醇胶束分散在磷酸盐缓冲液中(pH 7.4)并在暗箱中储存在透明的玻璃小瓶一周。通过UV-可见光分光光度法在320nm处测量了不同时间点的剩余的视黄醇(平均值±SD；n＝3)。

[0096] 图47说明用游离的视黄醇和被包封在PEG-玉米醇溶蛋白胶束中的视黄醇处理后，在48小时结束时猪皮肤中和接受介质中的应用的视黄醇的百分数。切除的猪皮肤被夹在垂直扩散池的两个室之间。由磷酸盐缓冲液(pH 7.4)组成的接受介质维持在37℃并使用磁珠搅动。将游离的或被包封的视黄醇在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的分散体装载在供应室中。3
在研究结束时，通过使用H标记的视黄醇的放射化学方法测量皮肤和接受室中的视黄醇浓度。用0.1M氢氧化钠消化皮肤以确定视黄醇浓度(平均值±SD；n＝6)。

[0097] 图48说明用游离的视黄醇和包封视黄醇的胶束处理后，在48小时结束时猪皮肤中和接受介质中的应用的视黄醇的百分数。被切除的猪表皮(Epi)被放置在垂直扩散池的两个室之间。在第二组实验中，将角质层从猪表皮移出并随后物理放置(被荚在)猪表皮(Sand)上并被用于研究。将游离的视黄醇和视黄醇胶束应用在皮肤上并将研究进行48小时。由磷酸盐缓冲液(pH 7.4)组成的接受介质维持在37℃并使用磁珠搅动。将游离的或被包封的视黄醇在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的分散体装载在供应室中。在研究结束时，通过使用3H标记的视黄醇的放射化学方法测量皮肤和接受室中的视黄醇浓度。用0.1M氢氧化钠消化皮肤以确定视黄醇浓度(平均值±SD；n＝6)。

[0098] 图49说明储存在室温和49℃一个月时间段的具有铝箔覆盖的玻璃小瓶中的视黄醇胶束乳膏制剂的稳定性。定期将等分的制剂移出并使用HPLC分析视黄醇的含量。制剂保持稳定并在室温中没有显示任何显著的降解。每一个小瓶是平均值±SD；n＝3。

[0099] 图50说明游离的视黄醇(实心圆形)和视黄醇胶束(实心三角形)从pH 7.4的乳膏制剂中的体外释放。

[0100] 图51说明视黄醇乳膏制剂在人皮肤中的体外皮肤渗入。

[0101] 图52说明在应用游离的和被包封的视黄醇胶束乳膏制剂之后小鼠中经表皮水分丢失(TEWL)值。十二烷基硫酸钠(SLS)，已知的皮肤刺激剂，被用作阳性对照，且阴性对照组不经过任何处理。

[0102] 图53说明在SKH-1无毛的小鼠中处理6小时后，游离的和纳米粒子包封的视黄醇的体内局部生物利用率。

[0103] 图54说明制备负载尼罗红的酪蛋白胶束的步骤。

[0104] 图55说明用游离的尼罗红和被包封在酪蛋白胶束中的尼罗红处理6小时后不同的皮肤层中的荧光像素。使用了关于角质层(SC)0-20μm和关于表皮20-100μm的XZ光学切片用于定量荧光像素。

[0105] 发明详述

[0106] 疏水性植物蛋白玉米醇溶蛋白，属于谷醇溶蛋白家族并是水不溶性的。玉米醇溶蛋白已被研究作为用于药物、食品、和美容行业中的多种剂的缓释的聚合物(Shukla和Cheryan(2001),Ind Crops Prod 13:171-192)。玉米醇溶蛋白还被用于使涂层材料成膜和形成粒子系统诸如微米粒子或纳米粒子。聚乙二醇(PEG)是水溶性的、生物相容的、FDA批准的由多个乙二醇单元通过酯键连接组成的聚合物。

[0107] 申请人已发现多种两亲的蛋白缀合物能够自组装以形成稳定的、生物相容的、且生物可降解的胶束组装物，如图1中示意性说明的。胶束可在胶束核中具有或不具有货物分子的情况下被形成。还发现玉米醇溶蛋白如图2和3中描述的共价附着于聚乙二醇(PEG)。空白(未负载药物)或负载药物的PEG化的玉米醇溶蛋白在水环境中自组装以形成具有疏水性核和亲水性壳的纳米胶束(～100nm)。

[0108] 可使用其他疏水性蛋白替代玉米醇溶蛋白，例如，源自多种来源包括植物、动物和合成的来源的蛋白。相似地，其他水溶性聚合物诸如本文描述的聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、及其他，可缀合至疏水性蛋白以制备纳米胶束。多种水不溶性的疏水性分子(例如，治疗剂或“药物”)可被包封在纳米胶束的核内，且在胶束的冠(corona)处的亲水性聚合物链有助于将溶解药物在水环境中，诸如人体。另外，用抗衡离子中和的带电分子可被包封在本文描述的胶束的疏水性核内。可选地，当带电的官能团被引入疏水性核或亲水性壳时，带电分子可通过静力相互作用络合至核和/或壳。例如，阳离子聚合物诸如聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、和类似的，附着至胶束核和/或壳可被用于络合带负电荷的DNA或寡核苷酸。相似地，亲水性分子可被化学修饰(例如，成为前体药物或盐的形式)以提供用于在胶束的核中包封的疏水性实体(entity)。在实施方案中，蛋白上的总电荷可通过调节pH在谷醇溶蛋白的pI以上或以下(例如，玉米醇溶蛋白的pI在约5和9之间；麦醇溶蛋白的pI约6.8)被改变。

[0109] 定义：

[0110] 如本文所用的，叙述的术语具有以下的含义。本说明书中使用的所有其他术语和短语具有如本领域技术人员将理解的它们的通常含义。此通常含义可通过参考技术词典获得，诸如Hawley's Condensed Chemical Dictionary第14版,R.J.Lewis,John Wiley&Sons著,New York,N.Y.,2001。

[0111] 本说明书中涉及的“一个实施方案”、“实施方案”等，指示描述的实施方案可包括特定的方面、特征、结构、部分、或表征，但不是每个实施方案都必然包括那个方面、特征、结构、部分、或表征。此外，此类短语可以，但不必然，指的是涉及本说明书的其他部分的相同的实施方案。而且，当描述与实施方案有关的特定的方面、特征、结构、部分、或表征时，影响或连接此方面、特征、结构、部分、或表征与其他实施方案在本领域技术人员的知识内，无论是否明确被描述。

[0112] 术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有”、“包含(containing)”、“特征在于”和其语法上等同物，是包含的或开放式的术语，其不排除另外的、未列举的要素或方法步骤，但还包括更多限制性的术语“由…组成”和“基本上由…组成”。

[0113] 单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数所指除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提及“化合物”(例如，药物)包括多个此类化合物，所以化合物X包括多个化合物X。作为另外的实例，提及“胶束”可包括多个此胶束、且提及“分子”是提及多个分子、和其等同物。进一步注意的是权利要求可以被设计以排除任何任选的要素。正因如此，该申明意图用作使用与权利要求要素的列举有关的排外的术语诸如“单独地”、“仅仅”、和类似的或使用“否定(negative)”限制的前期基础。

[0114] 术语“和/或”意思是条目(item)的任一个、条目的任何组合、或所有与该术语相关的条目。短语“一个或多个”容易被本领域技术人员理解，特别是当在上下文中阅读它的用法。例如，苯基环的一个或多个取代基指的是一个至五个、或一个至四个，例如如果苯基环是双取代的。

[0115] 术语“约”可以指指定值的±5％、±10％、±20％、或±25％的变化。例如，一些实施方案中“约50％”可携带从45％至55％的变化。关于整数范围，术语“约”可包括大于和/或小于所列举的整数的一个或两个整数。除非本文另有说明，术语“约”意图包括临近所列举范围的在单个成分、组合物、或实施方案的功能方面等同的值，例如，重量百分数。另外，除非本文另有说明，所列举的范围(例如，重量百分数或碳基团)包括范围内每个特定值或恒等式(identity)。

[0116] 将被技术人员理解的是，所有的数字，包括表达成分的量、特性诸如分子量、反应条件等等的那些，是近似值并被理解为在一切情况下任选通过术语“约”被修饰。这些值可取决于旨在通过本领域技术人员利用本文描述的教导获得所需的特性而不同。同样被理解的是此类值固有包含必然由在它们的各自的测试测量结果中发现的标准差产生的可变性。

[0117] 将被本领域技术人员理解的是，用于任何和所有的目的，特别是根据提供的书面描述，本文所列举的所有范围还包含任何和所有的可能子范围和其子范围的组合，和组成范围的单个值，特别是整数值。所列举的范围(例如，重量百分数或碳基团)包括范围内的每一个特定值、整数、小数、或恒等式。任何所列出的范围能够容易被识别作为充分描述并使相同的范围能够分解为至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、或十等份。作为非限制性实例，本文讨论的每一个范围都可容易被分解为下部三分之一、中部三分之一和上部三分之一，等。

[0118] 还将被本领域技术人员理解的是，所有语言诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”、和类似的，包括所列举的数量且此类术语指的是能够如以上讨论的被随后分解为子范围的范围。以相同的方式，所有本文列举的比率还包括落入较宽的比率内的所有子比率。因此，所列举的自由基、取代基的特定的值，仅用于说明；它们不排除其他被定义的值或在自由基和取代基的被定义的范围内的其他值。

[0119] 本领域技术人员还将容易认识其中以共同的方式将成员集合在一起，诸如Markush组，本发明不仅包含所列出的作为整体的全部组，还单独包含该组的每一个成员和主要组的所有可能的亚组。另外，为了所有目的，本发明不仅包括主要组，还包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明因此设想所列举的组的任何一个或多个成员的明确排除。因此，限制性条款可适用于任何公开的类别或实施方案，据此任何一个或多个所列举的要素、物种、或实施方案可从此类别或实施方案中被排除，例如，如在明确否定限制中使用的。

[0120] 术语“玉米醇溶蛋白”指的是一类谷醇溶蛋白。谷醇溶蛋白在多种谷物诸如玉米、小麦、大麦、水稻、和高粱，及其他植物和动物中被发现。谷醇溶蛋白的其他实例包括麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。在本文描述的多个实施方案中，这些谷醇溶蛋白可更换为玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白由高比例的非极性氨基酸诸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺组成，并具有约22-27kDa的分子量(Shukla,Zein:the industrial protein from corn.Ind.Crops.Prod.13,171-92；2001)。玉米醇溶蛋白的典型的样品可具有约20％亮氨酸、10％脯氨酸、21-26％谷氨酰胺、5％天冬酰胺、和10％丙氨酸，因此其氨基酸组成的至少约61％是疏水性氨基酸。这些疏水性氨基酸使得蛋白是水不溶性的。玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批准的GRAS聚合物(Fed.Register(1985)50:8997-8999)。

[0121] 玉米醇溶蛋白可从玉米蛋白粉中被加工为粉末。纯的玉米醇溶蛋白是无气味的、无味的、水不溶性的、且可食用的、使得其成为用于加工食品和药品的重要成分的特性。用于分离、加工、和使用玉米醇溶蛋白的方法是本领域众所周知的。见例如，Lawton,Cereal Chem 2002,79(1):1-18，和WO 2009/137112(Perumal等人)，其通过引用并入本文。玉米醇溶蛋白的“等级”指的是玉米醇溶蛋白的多种类型或形式，包括通过多种方法衍生的白玉米醇溶蛋白和黄白玉米醇溶蛋白，诸如美国专利号5,254,673(Cook等人)中公开的，其内容通过引用并入本文。

[0122] 术语“PEG”或“聚乙二醇”指的是水溶性的、生物相容的、FDA批准的由多个乙二醇单元通过酯键连接组成的聚合物。PEG链或部分的分子量可从约1kDa至约220kDa而不同，例如，约1kDa至约15kDa，取决于链中乙二醇单元的数量。PEG部分可被表示为-(OCH2CH2)nOH或-(OCH2CH2)nOR基团，其中n为2至约1,000且R为烷基、芳香基、或芳烷基(arylalkyl)诸如甲基、乙基、叔丁基、苯基、或苄基。PEG部分可通过末端羟基附着至蛋白，例如，当用琥珀酸酯活化时。

[0123] 在多种实施方案中，PEG链的分子量可以约1kDa至约220kDa。在某些实施方案中，PEG基团可具有约1000至约20,000、约4,500至约20,000；约5,000至约18,000、约5,000至约12,000；或约4,000至约9,000的分子量。在其他实施方案中，PEG基团可具有约4,000、5,
000、6,000或约7,000的分子量。PEG基团还可在其末端用保护基团封端，诸如乙酰基基团或烷基基团，例如甲基或乙基基团。

[0124] 具有不同的末端基团的PEG异双官能团也可被用于PEG化。PEG异双官能团的实例包括HO2C-PEG-OH；HC(＝O)-PEG-SH，和类似的。除了线性PEG部分之外，包括PEG链的分支部分也可被用于谷醇溶蛋白的PEG化。能够缀合至玉米醇溶蛋白的多种PEG部分的实例被Roberts等人描述(Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)并在以下说明。

[0125] 基于PEG2三嗪的分支的PEG基团：

[0126]

[0127] 其中R-NH2的氨基是谷醇溶蛋白侧链上的或末端基的氨基。能够缀合至谷醇溶蛋白的其他PEG部分包括：

[0128] 1)分支的PEG(PEG2)；

[0129] 2)线性叉状PEG；和/或

[0130] 3)分支叉状PEG：

[0131]

[0132] 其中Y是具有碳分支部分的基团且X是谷醇溶蛋白的原子、至谷醇溶蛋白的接头、或谷醇溶蛋白的官能团。

[0133] 聚乙二醇部分或其他聚(烯化氧)可通过本领域众所周知的多种技术缀合至玉米醇溶蛋白(见例如，Francesco等人(2005),Drug Discov Today 10,1451-1458)。缀合物形成的一个实例包括将谷醇溶蛋白诸如玉米醇溶蛋白与活化的单烷基取代的PEG酯诸如甲氧基PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯反应以形成酯或酰胺连接，如以下方案A中阐述的。

[0134] 方案A.玉米醇溶蛋白(的谷氨酰胺侧链)的PEG化

[0135]

[0136] 如以上方案A中显示的，m-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯可通过酰胺键的形成缀合至谷醇溶蛋白诸如玉米醇溶蛋白中的谷氨酰胺残基(和/或天冬酰胺残基)的一个或多个末端胺基(Sessa等人，(2007)J Appl Poly Sci 105,2877-2883)。在其他实施方案中，精氨酸和组氨酸中的胺基可通过酰胺或氨基甲酸酯连接缀合至PEG。另外，N-末端氨基酸可被PEG化。本领域已知的多种PEG衍生物可被用于PEG化胺基，包括PEG羧酸、酯、碳酸盐、醛、和类似的。
天冬氨酸和谷氨酸中的羧酸、和玉米醇溶蛋白中的C-末端羧酸，还可使用具有胺、羟基、或本领域已知的用于连接羧酸至PEG基团的其他官能团的PEG缀合至PEG。还可使用例如吡啶硫、乙烯砜、马来酰亚胺、或碘乙酰胺功能化的PEG将玉米醇溶蛋白中的半胱氨酸的硫醇缀合至PEG。使用本领域众所周知的技术还可将玉米醇溶蛋白中的苏氨酸和丝氨酸PEG化。

[0137] 可使用酶获得玉米醇溶蛋白中位点特异性的PEG化。例如，可将转谷氨酰胺酶用于选择性PEG化谷氨酰胺中的侧链胺基，如以下方案B中显示的。通过使用乙酰基半乳糖胺转酶(acetylgalactosamine transferase)选择性糖基化丝氨酸或苏氨酸中的羟基及随后使用唾液酸转移酶缀合PEG-唾液酸可获得相似的选择性PEG化(Veronese等人(2005),Drug Discov Today 10,1451-1458)。

[0138] 方案B.酶的PEG化.

[0139]

[0140] 在多种实施方案中，其他烯化氧可被用于替代聚乙二醇，诸如每一个亚烷基中包含2至4个碳原子的烯化氧链。烷氧基-封端的聚(烯化氧)是适合的实例，诸如甲氧基-封端的聚(烯化氧)，且随后可用基团诸如琥珀酰亚胺酯活化游离的羟基端。在一些实施方案中，聚(烯化氧)链可具有从约2至约110的重复单元，且典型具有从约50至约110的重复单元。

[0141] 术语“生物相容的”意味着涉及到的聚合物或缀合物当被体内施用至受试对象时不会造成或引起显著的负作用。可能的负作用的实例包括，但不限于，严重发炎和/或过度或不良免疫应答、和毒性。玉米醇溶蛋白和聚乙二醇是生物相容的成分。

[0142] 术语“水醇溶剂”指的是包括水和醇系溶剂，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、或丁醇(包括1-丁醇、2-丁醇(仲丁醇(sec-butanol))、异丁醇、和叔丁醇)的溶剂系统。常见的水醇溶剂系统包括50％、70％、90％、和92％的乙醇在水中。

[0143] 术语“稳定”指的是其中核没有接触水的胶束的核(见例如，PEG-玉米醇溶蛋白的核-壳结构，实施例1)。

[0144] 术语“接触”指的是触碰、使接触、或引起直接或近距离的临近的行为，包括，例如，在溶液中、在反应混合物中，体外、或体内在细胞或分子水平，例如引起生理反应、化学反应、或物理改变。

[0145] 术语“施用(administered)”或“施用(administration)”当在胶束的治疗和诊断用途的上下文中使用时，指的是并包括为了例如递送治疗剂至靶向位点的目的引入所选择的胶束量进入体内或体外环境。

[0146] “有效量”指的是有效治疗疾病、障碍、和/或状况、或引起所列举的效果的量。例如，有效的量可以是有效减少被治疗的状况或症状的进展或严重程度的量。治疗上有效量的确定充分在本技术领域的技术人员的能力范围内。术语“有效量”意在包括例如，有效治疗或预防宿主中疾病或障碍，或治疗疾病或障碍的症状的本文描述的空白或负载药物的胶束的量。因此，“有效量”通常意味着提供期望效果的量。

[0147] 术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”可包括(i)防止疾病、病理或医疗状况形成(例如，预防(prophylaxis))；(ii)抑制疾病、病理或医疗状况或阻止其发展；(iii)减轻疾病、病理或医疗状况；和/或(iv)减少与疾病、病理或医疗状况相关的症状。因此。术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”可延伸至预防(prophylaxis)并可包括预防(prevent)、预防(prevention)、预防(preventing)、减少、停止或逆转被治疗的状况或症状的进展或严重程度。正因如此，术语“治疗”可包括医疗、治疗、和/或预防施用，视情况而定。

[0148] 术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”、和“抑制(inhibition)”指的是减慢、停止、或逆转疾病、感染、状况、或细胞组的生长或进展。与在不存在治疗或接触时发生的生长或进展相比，抑制可大于例如约20％、40％、60％、80％、90％、95％、或99％。

[0149] 术语“体内”意味着受试对象的身体内部，诸如患者的身体内部，并包括通过多种方式包括但不限于口的、颊的、静脉内的、肌内的、腹膜内的、肠胃外的、皮下的、局部的、眼睛的、肺部和鼻腔途径的施用的胶束施用。

[0150] 术语“体外”指的是受试对象或患者的身体外部的环境。术语“受试对象”或“患者”都指的是个体复杂的生物体，例如，人或非人动物。

[0151] 术语“治疗剂”和涉及治疗或医疗功能的相似的术语意味着所提及的小分子、大分子、蛋白、核酸、生长因子、激素、药物、其他物质、细胞、或其组合可有益影响受试对象中的疾病或状况的发生、进程、和/或一个或多个症状，并可与制造用于治疗疾病或其他状况的药剂中的胶束联合起来被使用。用于在本文描述的胶束中包封的适合的治疗剂包括疏水性治疗剂，例如，但不限于，姜黄素、阿霉素、和显像剂诸如尼罗红。

[0152] 疏水性剂：

[0153] 可采用另外适于本发明实行的几乎任何疏水性剂用于多种应用。本文描述的两亲的聚合物还可被用作增稠剂、润滑剂、洗涤剂、表面活性剂、和防污剂。两亲的聚合物可被用作染料、化妆品、色素和医药产品的乳化、分散或稳定剂。两亲的聚合物作为纺织品的染色中的乳化、分散或稳定剂和用于美容的包封染料可以是特别有用的。两亲的聚合物作为化妆品、药品、保健品、杀虫剂、纺织品、和香料的润滑剂和包封剂可以是有用的。

[0154] 因此，除了生物或药学上有活性的疏水剂，可被本文描述的两亲的聚合物包封的其他疏水性分子包括诊断剂、杀虫剂(insecticide)、杀虫剂(pesticide)、除草剂、防腐剂、食品添加剂、芳香剂、染料、诊断用辅助药(diagnostic acid)和类似的。可被本文描述的两亲的聚合物包封的疏水性分子的实例包括，但不限于：松香酸、醋葡醛内酯、二氢苊、苊香豆醇、乙酰六酰胺、乙酰汞辛酚、甘草次酸醋酸酯、乙酰毛地黄毒苷、二溴乙炔、二氯乙炔、乙酰水杨酸、土木香内酯、艾氏剂、铝糖醇钠、丙烯菊酯、烯丙雌醇、烯丙基硫醚、阿普唑仑、阿司匹林铝(乙酰水杨酸盐)、氨由醋胺、氨氯苯恶嗪、氨鲁米特、戊基氯、雄烯二醇、茴三硫、敌菌灵、地蒽酚、抗霉素A、除疟霉素、偶胂乙酸、积雪草皂苷、阿司咪唑、奥迪霉素、金硫乙酰苯胺、8-氮鸟嘌呤、偶氮苯；贝加因、秘鲁香脂、塔鲁香脂、燕麦灵、东菱克栓酶(baxtrobin)、苄达酸、地巴唑、苄氟噻嗪、苯菌灵、苄星青霉素、苯雌酚、苄替哌、苯醌、甲基苯异丙基苄胺、苄噻嗪、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、铋溴酚、治草醚、乐杀螨、菊精、红没药醇、比沙可啶、二(对氯苯氧基)甲烷、碘次五倍子酸铋、碱式棓酸铋、鞣酸铋、双酚A、硫双二氯酚、冰片基、溴代异戊酸(bromoisovalerate)、冰片基氯、异戊酸冰片酯、水杨酸冰片酯、大隆(brodifacoum)、溴鼠胺、二溴羟喹、丁苯羟酸、丁胺酯、正丁巴比妥、丁硫啶(buthiobate)、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯；碘硬脂酸钙、己醣酸钙、硬脂酸钙、卡泊酸、克菌丹、卡马西平、卡波氯醛、卡波硫磷、卡波醌、胡萝卜素、香芹酚、吐根酚碱、脑磷脂、大风子油酸、鹅胆酸、甲壳素、氯丹、三氯苯乙酸、杀螨醇、百菌清、三对甲氧苯氯乙烯、氯普噻吨、氯喹那多、卡波罗孟、西洛他唑、辛可尼丁、柠檬醛、克利贝特、氯法齐明、安妥明、氯氟苯脲(cloflucarban)、氯硝甘油、氯吡多(clopidol)、氯茚二酮、氯恶唑仑、香豆磷(coroxon)、皮质酮、氯杀鼠灵、蝇毒磷(coumaphos)、畜虫磷甲酚酯(coumithoate cresyl acetate)、鼠立死(crimidine)、育畜磷、福美铜氯、氰美马嗪、环扁桃酯、环拉氨酯、磁麻甙、cypernethril；氨苯砜、磷胺氮芥、嗅氰菊酷、醋酸脱氧皮质酮、去羟米松、右马拉胺(dextromoramide)、diacetazoto、氯亚磷、地百里砜、异氯硫磷、抑菌灵、二氯芬、二氯苯二磺胺、三氯杀螨醇、地快乐除草剂(dicryl)、双香豆素、双烯雌酚、己烯雌酚、双苯米唑、双氢可待因酮烯醇乙酸酯、双氢麦角胺、二氢吗啡、双氢速甾醇、二甲己烯雌酚、地美炔酮、敌杀磷、地芬南、N-(1,2-二苯基乙基)烟酰胺、地匹乙酯、二磺法胺、二噻农、去氧苯妥英、敌菌酮、多晶型磷灰石、克瘟散、大黄素、苯乙氨茴酸、抑草蓬、麦角异柯宁碱、丁四硝酯、红霉素硬脂酸酯、雌三醇、乙基罂粟碱、脱水羟基孕酮、双香豆乙酯、乙氢去甲奎宁、乙基薄荷烷甲酰胺、丁香油酚、尤普罗辛、依沙酰胺；非巴氨酯、苯丙酰胺酯、芬苯达唑、非尼戊醇、杀螟硫磷、非诺贝特、芬喹唑、倍硫磷、非普拉宗、菲律宾菌素、绵马酸(filixic acid)、夫洛非宁、氟阿尼酮、氟甲喹、氟可丁丁酯、氟甲睾酮、氟替尔、flutazolamn、烟曲霉素、5-糖基-5-异丙基巴比妥酸(5-furfury1-5-isopropylbarbituric acid)、镰孢真菌素、格拉非宁、胰高血糖素、苯乙哌啶酮、格列丁噻唑、灰黄霉素、愈创木酚碳酸酯、愈创木酚磷酸酯、哈西缩松、血卟啉、六氯酚、己烷雌酚、双辛氢啶、环己烯巴比妥、氢氯噻嗪、氢可酮、异丁普生、艾地苯醌、吲哚美辛、烟酸肌醇酯、碘苯扎酸、碘醋胺酸、胆影酸、碘美拉酸、碘泊酸盐、异美汀(isometheptene)、isonoxin、2-异戊酰茚满-1,3-二酮(2-isovalerylindane-1,3-dione)；交沙霉素、11-酮孕酮、月桂氮卓酮、3-O-月桂酰吡哆醇二乙酸酯(3-O-lauroylpyridoxol diacetate)、利多卡因、林丹(lindane)、亚麻酸、碘塞罗宁、光明霉素、代森锰锌、苦杏仁酸、异戊酯、氯苯咪吲哚、甲苯咪唑、美海屈林、甲铋喹、美拉胂醇、美法仑、甲萘醌、戊酸薄荷酯、美芬诺酮、美芬丁胺、美芬妥因、美普卡因、美他诺龙、炔雌醇甲醚、甲硫芬、甲麦角林、美沙拉妥、美雄醇、安眠酮、3-甲基胆蒽、哌醋甲酯、17-甲基睾酮、美替洛尔、苯哒吗啉、金硫乙酸钙、萘酞磷、萘哌地尔、萘、2-乳酸萘酯、2-(2-奈氧基)乙醇(2-(2-naphthyloxy)ethanol)、水杨酸萘酯、萘普生、烯丙新戊巴比妥、奈马克丁、氯硝柳胺、烟氯苯丁酯、尼可吗啡、硝呋喹酸、硝呋齐特、二胺硝吖啶、硝甲酚汞、诺加霉素、去甲西泮、诺乙雄龙、诺孕烯酮；奥他维林、欧夹竹桃甙、油酸、去甲羟基安定、奥沙唑仑、奥昔拉定、奥昔卡因、氧可酮、羟甲睾酮、双醋酚丁、郝青酰胺、对硫磷、匹莫林、季戊四醇四硝酸酯、戊基苯酚(pentylphenol)、奋乃静、芬卡米特、苯吡胺、2-苯-6-氯酚、苯基甲基巴比妥酸、苯妥英、伏杀磷、邻苯二甲酰磺胺噻唑、叶绿醌、哌嗪荒酸、哌法宁、吡酮洛芬(piketopfen)、哌普唑啉、吡扎地尔、普拉贝脲、普劳诺托、聚普瑞锌、泊利噻嗪、丙磺舒、孕酮、普美孕酮、丙泮尼地、克螨特、苯胺灵、普罗喹宗、丙硫异烟胺、乙嘧啶、嘧啶磷、恩波维铵；槲皮素、奎勃龙、喹禾灵、雷复尼特、瑞西那明、罗西维林、runnel、席夫碱(salen)、猩红、癣可宁、西玛津、西美曲特、索布佐生、蔬草灭(solan)、安体舒通、鲨烯、雄诺龙、硫糖铝、磺胺苯、磺胺胍诺、柳氮磺胺吡啶、亚砜、舒必利、琥保松、他布酮、特麦角脲、睾酮、四溴甲酚(tetrabromocresol)、粉防乙碱、氨硫尿、硫代秋水仙碱、硫辛酸、克杀螨、甲硫哒嗪、福美双、麝香异戊胺酯(thymyl N-isoamylcarbamate)、噻昔达唑、噻克索酮、生育酚、托西拉酯、托萘酯、三氯生、三氟醋铆酸、三苯乙醇；乌索酸、缬氨霉素、维拉帕米、长春花碱、维生素A、维生素D、维生素E、联苯丁酸、甲苯噻嗪、扎托洛芬、和玉米烯酮。

[0155] 具有适于本发明使用的生物活性的一类特定的疏水性分子是细胞间调节因子和介质诸如干扰素、生长因子、激素、和类似的，包括它们相应的受体。本文描述的两亲的缀合物预期对于干扰素的有效施用是特别有效的，干扰素的有效施用已证明是有问题的因为干扰素的水不溶性。本文描述的胶束制剂的局部剂型因为通过两亲的聚合物胶束包封疏水性物质可呈现经皮递送的出乎意料的加速比率。因此，聚合物包封的具有生物或医药活性的疏水性物质可被制备作为局部剂型诸如洗剂、凝胶、药膏、乳膏、镇痛软膏、软膏和类似的。这些组合物可以以水溶液的形式，或以水包油或油包水乳液的形式。这些组合物可被制备用于通过多种途径施用至患者，包括通过注射施用、肺部施用、和通过口服或经鼻途径的施用。包括本文描述的胶束的这些制剂可以是另外的传统制剂，任选包含众所周知的添加剂、并可使用领域公认的技术制备。

[0156] 溶解技术：

[0157] 已使用许多方法溶解疏水性药物用于改善它们至患者的递送。现有的溶解技术的综述在以下表A中阐述。该表仅显示在市场产品中和在临床开发中使用的溶解技术的代表性列表。

[0158] 表A.不同的溶解技术.

[0159]

[0160] a.Lipinski(2002),Am.Pharm.Rev.5:82-85；Neervannan(2006),Expert Opin Drug Metab Toxicol2:715-731.

[0161] b.Miller等人(2006),J Pharm Sci,96:1691-1707；Redenti等人(2000),J Pharm Sci 89:1-8；Redenti等人(2001),J Pharm Sci 90:979-986.

[0162] c.Yalkowsky等人(1998),J Pharm Sci 87:787-796；Portmann和Simmons(1995),J Pharm Biomed Analysis 13,1189-1193；Johnson等人(2003),J Pharm Sci 92:1574-1581

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[0164] e.Pasut和Veronese(2009),Adv Drug Deliv Rev,61,1177-1188；Greenwald等人(2000),Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 17,101-161；Veronese等人(2005),Drug Discov Today 10,1451-1458.

[0165] PEG缀合物在临床开发中或用作抗癌剂的综述：

[0166] 研磨活性剂(药物)提供一些优势，包括可测量性、低的批可变性、和处理大量药物的高的灵活性。研磨活性剂的劣势是该过程可能只适用于晶体药物，可能需要列出空间位阻/离子稳定剂的GRAS、可能发生Ostwald成熟、且延长的研磨可引起非晶形组合物的形成，导致不稳定性。

[0167] 改性的环糊精，诸如β-环糊精，是GRAS和FDA批准的赋形剂。然而，环糊精要求客体分子的结构和腔大小之间严格的相关性。如果相应的结合常数太高，环糊精还可显著改变ADME参数。活性剂的盐可被用于提供改善的水溶解性并可在某些情况下被用于有利地改变药代动力学特征。盐还可增加用于加工的药物的熔点。然而，盐的形成需要合适的离子化基团，且活性剂的盐可能被FDA认为是新的药物并需要单独的批准。盐还可导致与盐酸盐的常见的离子效应，并具有形成水合物和多晶型物的趋势、和/或改变药代动力学。

[0168] 表面活性剂和/或聚合物胶束在稀释时具有较少的沉淀的倾向，不想要的副作用被最小化，并已被发现是有用的药物递送系统。然而，许多胶束系统具有与它们的组分表面活性剂相关的不同量的毒性，负载能力可能是不够的，且溶解能力可能太低。因为它们的表面活性，表面活性剂分子还具有渗入并破坏生物膜的潜力并可能是溶血的。

[0169] 胶束的临界胶束浓度(CMC)决定了它们在体内施用之后的结构稳定性，且聚合物胶束具有比表面活性剂胶束更高的结构稳定性。然而，在文献中报道的大部分聚合物胶束是通过冗长的且复杂的合成过程从个体单体单元制备的合成嵌段共聚物。

[0170] 小分子药物的PEG化可能被药物中的官能团数量限制。小分子药物的PEG化还可造成构象限制并可影响药物的结合和治疗活性。此外，因为被限制的PEG的缀合(即，每个药物分子一个PEG)和聚合物药物-缀合物的被限制的负载，高度疏水性药物的水溶解性的增加充其量是适度的。因此，需要改善的药物递送系统以克服目前使用的药物递送技术的许多劣势。

[0171] 胶束和其应用：

[0172] 本发明涉及使用疏水性水不溶性蛋白和水溶性聚合物制备胶束的方法。例如，合成的聚合物聚乙二醇(PEG)可共价缀合至疏水性水不溶性植物蛋白玉米醇溶蛋白。当以约0.025g/L的CMC分散在水中时，两亲的PEG化的玉米醇溶蛋白可自发形成自组装的具有疏水性核和亲水性壳的胶束。胶束的直径可以是，例如，约10nm至约450nm、约10nm至约300nm、约
75nm至约450nm、约75nm至约300nm、约10nm至约200nm、或约80nm至约200nm。

[0173] 发现纳米胶束仅在用约3kDa或更大的聚乙二醇共价修饰玉米醇溶蛋白之后才形成。发现约5kDa的PEG部分当缀合至玉米醇溶蛋白时特别适于胶束形成。

[0174] 因为玉米醇溶蛋白是高分子量蛋白(约22-27kDa)，PEG化的玉米醇溶蛋白形成比大部分其他已知的聚合物胶束更稳定的胶束。用于胶束形成要求的浓度称为临界胶束浓度(CMC)。在用水或血清稀释时，CMC决定胶束的稳定性。就这一点而言，CMC越低，胶束稳定性越高。例如，十二烷基硫酸钠具有约2.304g/L的CMC。PEG化的玉米醇溶蛋白的CMC，在一些实施方案中为0.025±0.0095g/L，其比商业可得的从聚环氧乙烷和聚环氧丙烷聚合物制备的嵌段共聚物胶束的CMC值低，后者CMC值取决于
聚合物的分子量在0.3和190g/L之间变化。

[0175] PEG-玉米醇溶蛋白胶束可与其他表面活性剂或聚合物结合以形成混合的胶束系统，例如，以加强包封或稳定性，或提供另外的或不同的功能性。可被用于形成混合的胶束的表面活性剂可包括非离子表面活性剂诸如BRIJ 35、BRIJ 58P、TRITON X-100、TRITON X-114、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 80、SPAN 80、和类似的，或阴离子表面活性剂诸如胆盐、十二烷基硫酸钠，或阳离子表面活性剂诸如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)，和类似的。

[0176] PEG-谷醇溶蛋白接枝共聚物或嵌段共聚物可被用于形成与包括以下的其他聚合物混合的胶束：PLURONICS(聚环氧丙烷-嵌段-聚环氧乙烷)、聚乳酸-嵌段-PEG、聚己酸内酯-嵌段-PEG、PEG-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)、PEG-嵌段-聚(2-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)-嵌段-聚(-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)、PEG-嵌段-聚氨基酸、聚天冬氨酸-嵌段-PEG、PEG-嵌段-聚环氧丙烷-嵌段-聚环氧乙烷、聚乳酸-嵌段-聚环氧乙烷-嵌段-聚环氧丙烷、聚乙烯吡咯烷酮-嵌段-聚乳酸-嵌段-聚乙烯吡咯烷酮、聚(3-苄基天冬氨酸)-接枝-PEG、壳聚糖-接枝-聚己酸内酯-接枝-PEG、和类似的。

[0177] 相似地，脂类诸如磷脂、磷脂酰乙醇胺、PEG-二酰基脂和类似的也可被用于形成与玉米醇溶蛋白-PEG缀合物混合的胶束。天然的聚合物诸如酪蛋白也可被结合以形成与PEG-玉米醇溶蛋白混合的胶束。以上描述的表面活性剂、脂类、天然的和合成的聚合物仅是代表性的实例并可改变胶束中的表面活性剂、聚合物或脂类的组成以形成不同的与PEG-玉米醇溶蛋白混合的胶束。

[0178] 可溶性差的化合物进入PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的包封可通过将两种组分共溶解在水醇溶剂中，诸如90％v/v乙醇、随后孵育足以允许将疏水性化合物(“货物分子”)分配进入疏水性玉米醇溶蛋白核中的时间量(例如，过夜)获得。孵育之后，可通过蒸发将水醇溶剂去除以形成薄膜。可在缓冲液中重构膜以恢复负载药物的胶束。

[0179] 可溶性差的化合物进入两亲的PEG-玉米醇溶蛋白的包封还可通过将两种组分共溶解在水醇溶剂(例如，90％v/v乙醇)中、随后孵育以允许疏水性化合物分配进入疏水性玉米醇溶蛋白核中获得。孵育之后，可通过例如针对水的广泛的透析去除水醇溶剂。乙醇的完全去除导致负载药物的胶束的形成。

[0180] 可选地，冷冻干燥方法也可被用于制备PEG-玉米醇溶蛋白胶束。可溶性差的化合物和PEG-玉米醇溶蛋白可溶解在水/叔丁醇溶剂混合物中并随后通过冷冻干燥去除溶剂。当冷冻干燥产物在水媒介物(vehicle)或缓冲液中重构时，胶束自发形成。

[0181] PEG化的谷醇溶蛋白胶束具有许多重要的应用。例如，它们可被用于增强药学上和相关行业的感兴趣的疏水性化合物的溶解性，诸如具有从约1至6.5(辛醇/水)或更大的范围的Log P的那些疏水性化合物。在一些实施方案中，可使用本文描述的胶束获得约60％至约95％的包封率。本文描述的胶束可提供被包封的货物分子在体外或体内环境中的缓释持续直至约一周、或直至约两周。

[0182] 胶束的CMC、大小和包封率还可通过改变PEG化的程度、被使用的PEG部分的分子量(m.w.)、和在制备胶束中使用的药物与聚合物的比率而不同。例如，通过使用较高分子量的PEG可降低CMC。相似地，通过优化PEG-玉米醇溶蛋白缀合物中的PEG链的数量可减少CMC。药物与PEG-玉米醇溶蛋白的较低的比率还可导致较小的尺寸的胶束。另一方面，药物/PEG-玉米醇溶蛋白比率的增加可增加胶束中的包封率和负载率。交联玉米醇溶蛋白疏水性核或PEG壳也可增加负载率。交联还可被用于货物分子从胶束的进一步缓释。另外，靶向配体的表面缀合可被用于专门靶向胶束至机体内特定组织，例如，癌组织。

[0183] 当制备胶束时，可通过溶解感兴趣的抗癌剂与被溶解的PEG化的玉米醇溶蛋白制备负载抗癌药物的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束。这些负载药物的胶束可显著改善抗癌药物的细胞摄入并比游离药物更有效。抗癌药物的细胞摄入可通过使用HPLC分析测量细胞内药物浓度确定。见图30和31和它们的描述。通过测量抗药性人癌细胞的细胞活性和确定杀死50％该细胞所需的浓度(即，确定IC50值)可评价与游离药物相比的负载药物的胶束的效力。
负载药物的胶束具有比游离药物显著较低的IC50。见，例如，图17、28、和29，和它们的描述。

[0184] 还出人意料地发现被包封在PEG化的玉米醇溶蛋白胶束中的抗癌药物针对抗药性癌症是有效的。该发现通过使用作为P-糖蛋白外排泵的底物的荧光标记钙黄绿素乙酰氧基甲基酯(钙黄绿素AM)分析抗药性人癌细胞被发现。在一些癌症中过量表达P-gp外排泵导致药物抗性。胶束能够抑制P-gp外排泵并增加通过荧光光谱测定法测量的钙黄绿素的细胞内浓度。见图32和它的描述。因此，PEG-玉米醇溶蛋白胶束可抑制P-gp外排泵并增强抗药性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和恶性胶质瘤的抗药性种类(strain)中抗癌药物的细胞摄入。胶束核中疏水性化合物的包封还针对来自环境因素的降解稳定了不稳定化合物，如通过测量储存在室温光下的游离药物溶液或负载药物的胶束分散体在不同时间段(例如，直至12小时)的药物浓度确定的。通过UV-可见光分光光度计测量药物浓度。

[0185] 另外，PEG化的玉米醇溶蛋白胶束还可被用于形成疏水性药物的水溶解/水分散制剂。因为胶束尺寸较小(例如，直径约100nm至约300nm)，它们可被用于例如疏水性药物的IV施用。它们还可被用于通过肠胃外的、口的、颊的、经皮的、眼睛的和其他的药物施用途径改善水不溶性药物的生物利用度。负载冷冻干燥的药物(水不溶性药物)的胶束在注射之前用水可容易被稀释。负载冷冻干燥的药物的胶束可随后被并入胶囊或其他适合的制剂基质(matrix)中。胶束施用之后可形成胃肠肠液，导致水不溶性药物的增强的溶解性和吸收。此外，PEG化的玉米醇溶蛋白胶束是生物相容的并是生物可降解的，因此增加它们在人中的安全特性。

[0186] 在本发明的一个方面中，可采用胶束作为治疗和/或诊断胶束制剂，例如，包含抗癌剂的胶束。此类胶束可提供活性剂的靶向递送和时序控释，其通常是治疗剂诸如小分子药物、核酸、蛋白、疫苗、受体、激素、细胞、抗体、化学或其他剂或物质。除了描述的治疗方法之外，本发明提供了用于生产具有诊断剂诸如染料、显像剂、探针和类似物的胶束的方法。

[0187] 可对谷醇溶蛋白-聚合物缀合物作出进一步修饰以用于特定应用，诸如将靶向配体附着在亲水性壳上用于靶向递送至肿瘤。例如，叶酸、抗体、和类似的可被附着至PEG壳用于过量表达用于特定靶向配体的受体的靶向癌细胞。

[0188] 使用本文描述的方法形成的玉米醇溶蛋白胶束可具有其他用途，特别是身体外部。例如，负载药物的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束可被用作心血管的和其他生物医学装置的涂层材料。尽管本文描述的是关于药物递送，但胶束还可被用于食品、奶制品和美容行业的感兴趣的分子的包封和缓释。除了人用药物，兽用药物也可被包封在胶束中。PEG化的玉米醇溶蛋白胶束还可被用于保护分子免于通过诸如水解作用、氧化作用、光降解、和其他降解反应的降解。这种利用可包括药学、食品、奶制品、农业、保健品和美容行业的感兴趣的分子。

[0189] 式I的变化：

[0190] 式I-V可被进一步修改以提供另外的实施方案。在列举玉米醇溶蛋白作为实例的任何实施方案中，另外类型的谷醇溶蛋白可取代玉米醇溶蛋白以提供单独的实施方案。例如，除了玉米醇溶蛋白(Z)和PEG之外，其他疏水性(X)或亲水性聚合物(Y)也可缀合至任何式I-V以形成接枝共聚物或ABC类型的多嵌段共聚物，其中A、B和C是不同的单体单元的聚合物嵌段部分。这些变化的实例包括式VI-IX：

[0191] Z-b-PEG-b-X(VI)

[0192] Z-b-PEG-b-Y(VII)

[0193] PEG-b-Z-b-Y(VIII)

[0194] PEG-b-Z-b-X(IX)

[0195] 其中X是疏水性聚合物部分、Y是亲水性聚合物部分、且Z和PEG如式I所定义的。

[0196] 通式I的亲水性聚合物PEG可被其他亲水性聚合物(Y)取代，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸(PAA)、聚唾液酸(PSA)、多糖诸如右旋糖苷、和类似的。相似地，疏水性聚合物(X)可缀合至谷醇溶蛋白(例如，玉米醇溶蛋白)。此疏水性聚合物(X)可包括，例如，聚己酸内酯、聚乳酸-乙醇酸、聚环氧丙烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、精胺、聚赖氨酸、或聚丙烯酸酯诸如聚甲基丙烯酸酯、聚二甲氨基乙基丙烯酸酯(polydimethylamino ethyl acrylate)、和类似的。脂肪酸也可缀合至谷醇溶蛋白以形成疏水性核。此类脂肪酸的实例包括，例如，硬脂酸、棕榈酸、磷脂酰乙醇胺、和油酸。

[0197] 可针对谷醇溶蛋白疏水性核和/或亲水性PEG壳作出其他和/或另外的修饰。这些修饰可包括缀合刺激响应元件诸如聚甲基丙烯酸羟乙酯至核，以制备pH敏感的胶束，或聚(N-异丙基丙烯酰胺)以制备热敏胶束。另外，谷醇溶蛋白疏水性核或亲水性壳可被交联(例如，使用交联剂诸如戊二醛、京尼平、或柠檬酸、和类似的)以控制药物释放并增加药物包封和负载率。

[0198] 胶束的药物制剂：

[0199] 本文描述的胶束可被用于制备治疗的药物组合物。胶束还可以以水分散体或作为冷冻干燥的胶束的干粉形式被添加至组合物。本文描述的胶束可被配制为药物组合物并以多种形式施用至哺乳动物宿主，诸如人患者。形式可特定适应于所选择的施用途径，例如，口的或肠胃外的施用，通过静脉内的、肌内的、局部或皮下的途径。

[0200] 本文描述的胶束可与药学上可接受的媒介物诸如惰性稀释剂或可吸收可食用的载体结合被全身性施用。关于口服施用，胶束分散体可被封闭在硬或软壳明胶胶囊中，或冷冻干燥的胶束可被压缩为片剂，或直接掺入患者的/受试对象的饮食的食物中。胶束分散体或冷冻干燥的胶束还可与一种或多种赋形剂结合并以可摄取的片剂、口含片剂、糖剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、圆片(wafers)、和类似的形式使用。此类组合物和制剂典型包含至少0.1wt％的活性治疗剂或诊断剂。组合物和制剂中的剂的重量百分数可以不同并还可方便地是从给出的单位剂型的重量的约2％至约60％。此类包含胶束的治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是此可获得的有效的剂量水平。

[0201] 片剂、糖剂、丸剂、胶囊、和类似的还可包含下面的一种或多种：黏合剂诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸氢钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸和类似的；和润滑剂诸如硬脂酸镁。可添加甜味剂诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或增香剂诸如薄荷油、冬青油、或樱桃香精(cherry flavoring)。当单位剂型是胶囊时，除了以上类型的材料之外，它可包含液态载体、诸如植物油或聚乙二醇。多种其他的材料可作为包衣存在或另外修改固体单位剂型的物理形态。例如，片剂、丸剂、或胶囊可涂有明胶、蜡、虫胶或糖和类似的。糖浆或酏剂可包含胶束，除了蔗糖或果糖作为甜味剂之外，甲基和丙基对羟基苯甲酸酯作为防腐剂，染料和调味诸如樱桃或橙味。制备单位剂型中使用的任何物质应该是药学上可接受的并所采用的量是本质上无毒的。另外，胶束分散体或冷冻干燥的胶束可被并入另外的缓释制品和装置。

[0202] 胶束分散体可被静脉内、皮下、肌内、瘤内、瘤周施用，或通过输注或注射。胶束分散体可被制备在水中，任选与缓冲液混合，或在其他药学上可接受的溶剂中、或其混合物。在储存和使用的常规条件下，制剂可包含防腐剂以预防微生物的生长。

[0203] 适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液、分散体、或包含适于无菌可注射或可输注(infusible)的溶液或分散体的临时制备的胶束的无菌粉末。最终剂型应该在制造和储存条件是无菌的、液体的并稳定的。液态载体或媒介物可以是液态分散介质包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇、和类似的)、植物油、无毒甘油基酯、和其适合的混合物。微生物作用的预防可通过多种抗细菌和抗真菌剂引起，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、和类似的。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如，糖、缓冲液、或氯化钠。注射的组合物的延长吸收可通过延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和/或明胶引起。

[0204] 无菌注射溶液可通过将胶束以所需的量并入具有按照所需要的以上列举的多种其他成分的合适的溶剂中、随后过滤灭菌制备。在无菌粉末用于制备无菌注射溶液的情况下，制备的方法可包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生胶束加任何另外的所需的存在于先前无菌过滤的溶液中的成分的粉末。

[0205] 关于局部给药，通常将胶束作为例如与皮肤病学上可接受的载体结合的组合物或制剂施用至皮肤将是理想的，皮肤病学上可接受的载体可以是固体、液体、凝胶、乳膏、软膏、或膏剂。有用的固体载体包括精细分割的固体诸如滑石、黏土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝、和类似的。有用的液体载体包括水、或水-乙醇/乙二醇/二甲基亚砜(DMSO)共混物、其中胶束可以以有效的水平分散，任选在无毒表面活性剂的帮助下。可添加佐剂诸如增香剂和另外的抗菌剂以优化所给出的用途的特性。可从用于浸透绷带和其他敷料剂的吸水垫应用液体组合物，或使用泵型或烟雾剂喷射器喷在受影响区。

[0206] 增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、被改性的纤维素、或被改性的矿物质也可与液态载体一起被采用以形成容易被涂开的糊剂、凝胶、软膏、肥皂、和类似的，用于直接应用至使用者的皮肤。

[0207] 用于递送活性剂(例如，负载剂的胶束)至皮肤的皮肤用组合物的实例是本领域已知的；例如，见美国专利号4,608,392(Jacquet等人)、4,992,478(Geria)、4,559,157(Smith等人)、和4,820,508(Wortzman)，通过引用以其整体并入本文。此类皮肤用组合物可与本文描述的胶束制剂结合被使用。

[0208] 本文描述的负载药物的胶束的有用的剂量可通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性确定。用于推测小鼠、和其他动物中的有效剂量至人的方法是领域已知的；例如，见美国专利号4,938,949(Borch等人)，通过引用以其整体并入本文。在治疗中使用所需的负载到胶束中的化合物、或活性盐、前体药物、或其衍生物的量将不仅根据所选择的特定的化合物或盐而且根据施用途径、被治疗的状况的本质、和患者年纪及状况而不同，并将最终听凭监护医生或临床医生的决定。

[0209] 负载治疗剂的胶束可以以单位剂型方便施用，例如，每单位剂型包含5至1000mg/m2、方便地10至750mg/m2、最方便地，50至500mg/m2的活性成分。所需的剂量可方便以单次剂量或作为以适当的时间间隔施用的分开的剂量存在，例如，作为每天两次、三次、四次或多次的子剂量。子剂量本身例如，可进一步被分开为不连续的松散的间隔施用的数量。

[0210] 本文描述的负载药物的胶束可以是有效的抗肿瘤剂并与非胶束包封的抗肿瘤剂相比具有较高的效力和/或减少的毒性。本发明提供了治疗哺乳动物中的癌症的治疗方法，其包括将本文描述的组合物的有效量施用至患有癌症的哺乳动物。哺乳动物包括灵长类动物、人、啮齿动物、犬、猫(feline)、牛(bovine)、绵羊(ovine)、马(equine)、猪(swine)、牛(bovine)和类似的。癌症指的是任何不同类型的恶性新生物，例如，结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和白血病，并通常特征为不期望的细胞增殖，例如，无节制的增长、缺少分化、局部组织入侵、和转移。

[0211] 本发明的化合物治疗癌症的能力可通过使用本领域众所周知的分析确定。例如，治疗方案的设计、毒性评价、数据分析、杀死的肿瘤细胞的定量、和使用移植瘤筛选的生物学意义是已知的。

[0212] 以下的实施例意在阐述本发明的以上部分并不应被解释为使它的范围变窄。本领域技术人员将容易认识实施例表明了其中可实行本发明的许多其他方式。应该理解的是可作出许多变化和修改同时保持在本发明的范围内。实施例

[0213] 实施例1.PEG化的玉米醇溶蛋白和胶束制剂的制备

[0214] 按照本文描述的制备了具有在约80nm和约200nm之间的尺寸范围分布的PEG化的玉米醇溶蛋白纳米胶束。图2和3阐述根据多种实施方案的PEG-玉米醇溶蛋白的逐步制备。通过添加0.1g的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(分子量1000、2000、或5000Da)至5mL的
90％乙醇中的0.1g的白玉米醇溶蛋白制备PEG化的玉米醇溶蛋白。将以特定比率(1:1,w/w)的混合物在37℃孵育三个小时(以50rpm搅动)。3小时后，添加1mL甘氨酸水溶液(1M)以猝灭任何过量的PEG酯。随后添加5mL的柠檬酸盐缓冲液pH 7.4以沉淀PEG化的玉米醇溶蛋白。随后于室温(～23℃)在磁力搅拌器(100rpm)中针对去离子水直接透析(分子量截留＝～10,
000Da)PEG化的玉米醇溶蛋白的沉淀的分散体24小时以去除游离的PEG、甘氨酸、和乙醇。将产生的产物冷冻至-80℃，随后在-47℃以60mTorr的真空冷冻干燥12至14小时。

[0215] 将m-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(5kDa)用于与玉米醇溶蛋白中的氨基形成酰胺键。使用FTIR确认缀合物。分别在1650和1500-1540cm-1处观察到玉米醇溶蛋白的酰胺I和II蛋白峰。在1740cm-1处观察到PEG的NHS酯峰，其在与玉米醇溶蛋白缀合之后消失(图4)。而且，缀合物通过尺寸排阻色谱(SEC)被表征。如在图4中可以看出的，PEG-玉米醇溶蛋白缀合物在7分钟时被洗脱且玉米醇溶蛋白在23分钟时被洗脱。另一方面，PEG在29分钟时被洗脱。

[0216] 对缀合玉米醇溶蛋白的不同分子量PEG观察到的PEG化效率在以下表1中显示，其中使用三硝基苯磺酸(TNBS)测定确定效率百分数。发现玉米醇溶蛋白中的表面氨基参与PEG化。将TNBS测定用于在PEG化之前和之后评价玉米醇溶蛋白中的游离氨基。用纯的玉米醇溶蛋白和PEG化的玉米醇溶蛋白的递增浓度对在440nm波长处的吸光度产生标准曲线。使用以下式计算PEG化效率：

[0217] ％PEG化效率＝[a-b/a]×100

[0218] 其中a＝未PEG化的玉米醇溶蛋白的浓度对吸光度的斜率，且b＝PEG化的玉米醇溶蛋白的浓度对吸光度的斜率。用于构建标准曲线的玉米醇溶蛋白的浓度范围为0.357mg/mL至12mg/mL，且相关系数为0.9994。

[0219] 表1.玉米醇溶蛋白的PEG化效率.

[0220]样品 PEG分子量(Da) PEG化效率(％)
1 1000 74±7
2 2000 60±4
3 5000 52±6

[0221] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)。

[0222] 使用PEG>3000Da形成较小尺寸的PEG-玉米醇溶蛋白胶束，如通过表2中显示的数据说明的。PEG化的玉米醇溶蛋白在水环境中自组装以形成具有疏水性核和亲水性壳的纳米胶束(～100nm)，如在图1中示意性说明的。

[0223] 表2.胶束形成所需的PEG分子量.

[0224]样品 PEG分子量(Da) 粒径(nm) PDI
1 1000 970±125 0.69±0.12
2 2000 902±107 0.65±0.08
3 5000 95±1.7 0.21±0.02

[0225] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)。

[0226] PEG-玉米醇溶蛋白的核-壳结构：在二甲基亚砜(DMSO)中，1H NMR谐振峰对应于玉米醇溶蛋白和PEG 5000Da的疏水性和亲水性部分并在NMR谱中清楚地观察到(图5)：PEG亚甲基谐振为3.56ppm且蛋白/酰胺谐振为3.36ppm。相比之下，在D2O中只检测到PEG谐振峰且没有观察到玉米醇溶蛋白峰。该结果确认了PEG-玉米醇溶蛋白胶束的核-壳结构。因为玉米醇溶蛋白不溶于水，在氘化水(D2O)没有观察到玉米醇溶蛋白的蛋白峰。然而，在D2O中观察到PEG峰因为PEG是水溶性的。关于PEG-玉米醇溶蛋白胶束，由PEG嵌段组成的壳在D2O很好地溶剂化并因此显示清楚的NMR谱峰，尽管因为缺少溶剂和胶束核内的溶剂化，组成胶束的核的玉米醇溶蛋白的谐振峰没有观察到。然而，DMSO溶解并分解胶束并因此能够溶剂化PEG和蛋白，允许对应于待被记录的分子的两个部分的峰(图5)。

[0227] 用于胶束形成要求的浓度称为临界胶束浓度(CMC)。当用水稀释时，CMC值决定胶束的稳定性。PEG化的玉米醇溶蛋白的CMC为0.025±0.0095g/L，其使用芘作为探针被确定(图7)。因为玉米醇溶蛋白分子量相对高，它们形成比其他聚合物胶束更稳定的胶束(见，例如，图6)，如通过玉米醇溶蛋白胶束的较低的CMC值所指示的。图6说明在339nm和334nm的激发波长(发射波长为390nm)时芘的吸光度(0.6ILIM)的比率对PEG化的玉米醇溶蛋白对数浓度(g/L)的绘图。因为PEG化的玉米醇溶蛋白的浓度是增加的，芘在CMC(即，形成胶束的浓度)处的吸光度的强度具有显著改变。

[0228] 在用缓冲液稀释的时候胶束的粒径没有显著改变，显示胶束的稳定性(图6)。如由在小鼠中皮下施用之后不存在任何玉米醇溶蛋白的特异性抗体所确定的，所制备的PEG-玉米醇溶蛋白胶束不是免疫原性的(图8)。在PEG-玉米醇溶蛋白胶束中负载不同的疏水性化合物的粒径和包封率的总结在以下表3中显示。

[0229] 表3.不同的化合物的PEG-玉米醇溶蛋白胶束包封数据.

[0230]样品 化合物 Log P M.W.(Da) 粒径(nm) PDI 包封率(％)
1 姜黄素 2.5 368.3 124±4.1 0.25±0.03 95±4
2 阿霉素 1.20 543.5 153±3 0.18±0.06 92±6
3 尼罗红 5 318.3 165±7 0.21±0.08 77±11

[0231] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0232] 实施例2.包封阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束

[0233] 阿霉素是用于治疗，除了其他癌症以外，乳腺癌和卵巢癌的广泛使用的抗癌药物。然而，阿霉素的临床使用被严重的副作用限制，诸如骨髓抑制和慢性心脏毒性，其可导致充血性心力衰竭(Hortobagyi(1997),Drugs 54Suppl 4:1-7)。阿霉素的另外的限制是抗化疗的形成(Gottesman等人(2002),Nat Rev Cancer 2:48-58)。阿霉素具有543.5的分子量(m.w.)、1.2的Log P，几乎不溶于水，并溶于甲醇、乙醇和DMSO。

[0234]

[0235] 与低分子量的表面活性剂胶束相比，聚合物胶束通常是更稳定的，具有低的临界胶束浓度(CMC)和较低的解离，允许所负载的阿霉素保留较长的时间段，并最终，获得药物在靶向位点的较高的积累。此选择性被动靶向的能力是因为增强的渗透性和保留效果，源于肿瘤组织中渗漏的血管和淋巴引流的缺少(Maeda等人(2000),J Control Release 65:271-284)。

[0236] 水不溶性的阿霉素基从它的盐酸盐中被提取。将阿霉素盐酸盐(0.012g)溶解在100mL的去离子水(0.22μm过滤)中，并磁力搅动10分钟以允许阿霉素的完全溶解。10溶液的pH为7.2。添加三乙胺(0.2mL)之后通过磁力搅动30分钟以允许均一的混合。产生的溶液的pH为12。将100mL的氯仿添加至该水溶液中并磁力搅动15分钟。在分液漏斗中剧烈摇动产生的乳液，并回收氯仿层。重复该过程三次以完全回收基。合并氯仿层部分并在减压下浓缩至干燥(在旋转蒸发器上)。将干燥的残余物重新溶解在氯仿中并用氯化钠的饱和水溶液冲洗。将氯仿层分开进入圆底烧瓶中并在旋转蒸发器上完全浓缩至干燥。将圆底烧瓶中的阿霉素基于37℃保持在烘箱(在黑暗条件下)中48小时以允许完全干燥。将产物储存在4℃直到被使用。

[0237] 图20和21说明分别使用膜和透析方法逐步制备负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束。在膜和透析方法中，都将0.1g的PEG-玉米醇溶蛋白和0.001g的阿霉素溶解在20mL的90％乙醇中。将混合物在37℃孵育过夜(磁力搅拌棒，以50rpm搅动)以允许阿霉素分配进入疏水性玉米醇溶蛋白核中。过夜孵育之后，在减压条件下通过旋转蒸发将水醇溶剂完全去除以形成薄膜。将负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的干燥的膜在柠檬酸盐缓冲液pH 
7.4中重构并声处理5分钟以形成均匀悬浮液。随后在磁力搅拌器中针对水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物。

[0238] 关于透析方法，过夜孵育后，于室温下在磁力搅拌器(100rpm)中针对水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小时以去除任何残留的物质。随后将产生的产物冷冻至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷冻干燥12至14小时(图21)。将冷冻干燥的产物储存在4℃冷藏条件下的干燥器中。以下的表4说明分别使用膜方法和透析方法制备的负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的不同的表征。

[0239] 表4.

[0240]

[0241] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0242] 使用具有由三氟乙酸(0.1％v/v)和5％v/v～3min、80％v/v～11min和5％v/v～22分钟的乙腈组成的流动相、使用荧光检测器(505nm作为激发且550nm作为发射波长)以1mL/min的流速的梯度HPLC定量游离的阿霉素、被包封的阿霉素的量、在体外释放研究中释放的量、和细胞摄入的量。

[0243]

[0244] 图22和23分别显示负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的透射电子显微术(TEM)和原子力显微术(AFM)图像。

[0245] 阿霉素几乎不溶于水(15ng/mL)。然而，当被并入PEG化的玉米醇溶蛋白胶束中时，溶解性增加了约1000倍(10μg/mL)。图24分别说明磷酸盐缓冲液pH 7.4、90％乙醇中的阿霉素、和PBS pH7.4中负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的UV-可见光光谱。负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度高于溶解在90％(v/v)乙醇中的阿霉素的吸光度，其显示负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的增强的水溶解性(1000倍增加)。

[0246] 图25分别显示磷酸盐缓冲液pH 7.4、90％乙醇中的阿霉素、和PBS 7.4中负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的荧光光谱。因为阿霉素的增强的溶解性，在PEG化的玉米醇溶蛋白胶束捕获之后PBS pH 7.4中的阿霉素荧光显著增加(约50倍)。负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的差示扫描量热法(DSC)热分析图在图26中显示。不存在阿霉素的熔融峰显示阿霉素被包封进入胶束的核内部。在图27中说明阿霉素从PEG-玉米醇溶蛋白胶束的体外释放。阿霉素的释放持续约24小时。PEG化的玉米醇溶蛋白胶束因此是用于阿霉素的有前景的载体。

[0247] 针对阿霉素敏感的人乳腺癌细胞(MCF-7)和阿霉素抗性的人卵巢癌细胞(NCl/ADR/RES)、和阿霉素敏感的人乳腺癌细胞系(MCF-7)体外检测根据本文描述制备的负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的治疗活性。图28说明MCF-7细胞中的阿霉素(溶解在90％乙醇中)和PEG-玉米醇溶蛋白胶束的体外细胞毒性曲线。将以2000每孔的接种密度的细胞暴露于7.8nM至500nM的浓度的阿霉素溶液和阿霉素胶束。24小时后，去除各自的药物处理。用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次并用新鲜的培养基替换。每48小时替换培养基。
第5天时，使用MTT分析执行细胞毒性分析。

[0248] 阿霉素胶束的IC50值是纯的阿霉素处理的IC50值的一半。图29说明NCl/ADR-RES细胞系中的阿霉素基(溶解在90％v/v乙醇中)和PEG-玉米醇溶蛋白胶束的体外细胞毒性曲线。将以2000细胞每孔的接种密度的细胞暴露于31.25nM至1000nM的浓度的阿霉素基和阿霉素胶束。24小时后，去除各自的药物处理。用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次并用新鲜的培养基替换。每48小时替换培养基。第5天时，使用MTT分析执行细胞毒性分析。阿霉素胶束的IC50值是游离的阿霉素处理的IC50值4倍低。在人乳腺癌细胞系中的负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的体外细胞毒性分析的结果显示负载在PEG化的玉米醇溶蛋白胶束中的阿霉素具有比游离的阿霉素溶液显著更高的有效效价。效价的差异可能是因为与负载阿霉素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束相比，游离药物的细胞摄入动力学的差异。

[0249] 游离阿霉素通过由浓度梯度决定的被动扩散被吸收，而负载阿霉素的胶束通过主动的内吞作用过程被吸收。图30说明温度对NCl/ADR-RES细胞系中负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的细胞摄入的影响。将细胞在4℃预培养2小时。2小时后，用PBS pH 7.4冲洗细胞两次并用胶束处理(对应于5μg/mL的阿霉素的量)。两小时后，去除处理，用冰冷的PBS pH7.4冲洗细胞两次，并使用HPLC分析评价在不同时间间隔时的细胞裂解物中阿霉素含量的量。

[0250] 细胞摄入在低温时显著降低预示着PEG-玉米醇溶蛋白胶束的细胞摄入是主动的内吞作用过程。图31说明NCl/ADR-RES细胞系中负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束和溶液的细胞摄入动力学(5μg/mL的阿霉素或负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束(5000细胞/孔))。与普通的阿霉素溶液相比，在所有的时间点都观察到阿霉素胶束的较高的细胞摄入。此外，阿霉素胶束的内吞摄入克服了抗癌细胞中的药物外排泵，因此增加了药物效价。

[0251] 图32说明了NCl/ADR-RES细胞中PLURONIC F68处理(1mg/mL)、和空白PEG玉米醇溶蛋白胶束(0.050mg/mL)对P-gp活性(钙黄绿素AM测定)的影响。钙黄绿素AM是非荧光的并容易扩散进入细胞。钙黄绿素AM而非钙黄绿素，是P-gp的底物。在P-gp抑制剂存在时，钙黄绿素AM进入细胞并通过细胞内酯酶转变为钙黄绿素。荧光随着增加的细胞内钙黄绿素浓度而增加。从图32中说明的数据明显看出，对空白的PEG-玉米醇溶蛋白胶束观察到显著的P-gp抑制。还可附着靶向配体以促进负载药物的PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束体内递送至靶向位点。

[0252] 图33显示同种异体移植小鼠的肿瘤模型中的负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的体内生物分布。雌性裸鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)被用于该研究。将JC小鼠乳腺癌细胞(1x107细胞)重悬在PBS中并皮下注射。当肿瘤体积达到～150至200mm3时，动物接受阿霉素溶液和负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束(3mg/kg)的静脉注射。3小时后，处死小鼠并收集器官(肝、心脏、肺、脾、脑和肿瘤)并使用组织均质器在2mL的去离子水中匀质化。添加100ng的柔红霉素(内标)之后，冷冻干燥组织匀浆。

[0253] 称重并于室温在黑暗中使用振动器用5mL的甲醇/氯仿混合物(65:35)提取干燥的组织持续5小时。将提取物于4℃在13,000rpm离心10分钟。在氮气条件下蒸发上清液并在甲醇/乙腈(50:50)中重构。使用利用荧光检测器(激发波长505nm且发射波长550nm)的反相HPLC法(27(乙腈)：73(20mM磷酸氢钾(一元的)缓冲液(pH：2.5))定量器官中阿霉素的量。将器官中的阿霉素的量表示为量(ng)每mg干燥的器官。

[0254] 如在图30中可以观察到的，在肿瘤中发现了较高的药物积累而肿瘤中没有游离的阿霉素溶液的药物积累。与游离的阿霉素溶液样品相比，使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白胶束的心脏和肾组织中的药物浓度显著较低。阿霉素化疗被心脏和肾毒性限制。这些结果说明负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的增强的肿瘤积累和减少的毒性。

[0255] 通过测量同种异体移植乳腺肿瘤小鼠模型中的肿瘤体积的改变研究阿霉素PEG玉米醇溶蛋白胶束的效力。雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)被用于该研究。将JC小鼠乳腺肿瘤细胞(1x107细胞)重悬在PBS中并皮下注射。当肿瘤体积3
达到～150至200mm 时，动物接受两次剂量的静脉的阿霉素溶液或负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束(3mg/kg，在第0和第7天)。使用Vernier Caliper测量肿瘤体积。

[0256] 图34显示在不同处理后肿瘤体积的增加。如图34中可以看出的，使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白胶束的肿瘤体积的增加显著较低。使用阿霉素PEG-玉米醇溶蛋白胶束处理的小鼠同样比其他处理组活的更久(图35)。结果说明负载阿霉素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的增强的效力。

[0257] 实施例3.包封姜黄素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束

[0258] 姜黄素是印度香料姜黄的主要的姜黄素类化合物，其中姜黄是姜科(Zingiberaceae，姜科)成员。两种其他的姜黄素类化合物为脱甲氧基姜黄素和双-脱甲氧基姜黄素(bis-desmethoxycurcumin)。姜黄素可以以至少两种互变异构形式存在，其中烯醇式在固相和溶液中是更能量稳定的。姜黄素具有368.4的分子量(m.w.)、2.5的Log P，几乎不溶于水，并溶于甲醇。

[0259]

[0260]

[0261] 临床试验正研究姜黄素对多种疾病包括多发性骨髓瘤、胰腺癌、骨髓增生异常综合征、结肠癌、牛皮癣、和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)的影响。体外和动物研究显示姜黄素具有抗肿瘤、抗氧化、抗关节炎、抗-淀粉样蛋白、抗-局部缺血、和抗-炎的特性，和其他生物活性(Aggarwal等人，Adv Exp Med Biol 2007,595:1-75)。图9和10分别说明使用膜水化和透析方法逐步制备负载姜黄素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束。在膜水化和透析方法中，都将0.1g的PEG-玉米醇溶蛋白和0.002g的姜黄素溶解在20mL的90％乙醇中。将混合物在37℃孵育过夜(以50rpm搅动)以允许姜黄素分配进入疏水性玉米醇溶蛋白核中。随后使用旋转蒸发装置完全去除水醇溶剂以形成膜。在柠檬酸盐缓冲液pH 7.4中重构负载姜黄素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的干燥的膜并声处理5分钟以形成均匀悬浮液。随后于室温在搅动(100rpm)下针对水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小时以去除游离的姜黄素。

[0262] 在透析方法中，过夜孵育后，于室温下在磁力搅拌器(以100rpm)中针对水透析(分子量截留＝～10,000Da)混合物24小时以去除游离的姜黄素。随后将产生的产物冷冻至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷冻干燥12至14小时。将冷冻干燥的产物于4℃储存在干燥器中。

[0263] 以下的表5和6分别说明使用薄膜方法和透析方法制备的负载姜黄素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的不同的表征。

[0264] 表5.

[0265]样品 姜黄素(％w/w) 粒径(nm) PDI 包封率(％)
1 0.25 166±10 0.4±0.1 92±3.5
2 0.5 139±2 0.43±0.05 76±11
3 1 176±9 0.4±0.12 47±17
4 2 185±13 0.52±0.06 38±4

[0266] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0267] 表6.

[0268]样品 姜黄素(％w/w) 粒径(nm) PDI 包封率(％)
1 1 124±4.1 0.25±0.03 95±4
2 1.25 127±2.6 031±0.01 94±7
3 1.66 148±7 0.34±0.09 87±15
4 2.5 152±2.5 0.35±0.03 74±09
5 5 154±1 0.45±0.04 60±13
6 4 175±1.7 0.38±0.03 63±11

[0269] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0270] 使用C18色谱柱通过RP-HPLC测定游离的姜黄素和被包封的姜黄素的浓度。流动相由60％乙腈和40％柠檬酸缓冲液(使用50％(w/w)氢氧化钠溶液被调节到pH 3.0的1％(w/v)柠檬酸溶液)组成。流速为1.0mL/min且检测波长为420nm。

[0271]

[0272] 图11和12显示负载姜黄素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的透射电子显微术(TEM)和原子力显微术(AFM)图像。姜黄素是几乎不溶于水的(11ng/mL)(B.Aggarwal等人(2007),Adv Exp Med Biol 595:1-75)。然而，当并入PEG化的玉米醇溶蛋白胶束中时，溶解性增加了约2000倍(20μg/mL)。图13是10％甲醇中的姜黄素和PBS pH 7.4中负载姜黄素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的UV-可见光光谱。从光谱明显看出负载姜黄素的PEG-玉米醇溶蛋白的吸光度与溶解在10％(v/v)甲醇中的姜黄素的吸光度是相似的。因此PEG-玉米醇溶蛋白显著增强了姜黄素的水溶解性约2000倍。图14是10％甲醇中的姜黄素和PBS pH 7.4中负载姜黄素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的荧光光谱。姜黄素的发射光谱的Xmax从540nm至525nm的位移显示姜黄素被捕获在胶束中。此外，由于姜黄素增强的水溶解性，捕获在PEG化的玉米醇溶蛋白胶束中之后水中的姜黄素荧光显著增强(约4倍)。核中的包封稳定了姜黄素抗来自环境因素，诸如水解作用和光降解的降解。

[0273] 以下的表7说明负载姜黄素的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束在光和pH变化存在时的稳定性。与普通的溶液相比(半衰期4分钟)(磷酸盐缓冲液pH 7.4)，当被包封在PEG-玉米醇溶蛋白胶束中时姜黄素的稳定性被改善(半衰期31.8分钟)。磷酸盐缓冲液pH 5中稳定性显著增强(半衰期＝6.9分钟，与胶束t1/2＝366分钟相比)。

[0274] 表7.

[0275]

[0276]

[0277] *10％v/v甲醇被用于溶解姜黄素。

[0278] 图15显示负载姜黄素的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的差示扫描量热法(DSC)热分析图。姜黄素的熔融峰的不存在显示姜黄素被包封进入胶束的核内。图16呈现姜黄素从PEG-玉米醇溶蛋白胶束的体外释放。姜黄素的释放持续约24小时。姜黄素是已知具有抗癌和抗炎活性，然而姜黄素的递送被其差的水溶解性所限制。PEG化的玉米醇溶蛋白胶束可以是用于姜黄素的适合的载体。图17说明药物抗性的人卵巢癌细胞(NCl/ADR-RES细胞)中的姜黄素(溶解在10％DMSO中)和姜黄素胶束(在PBS 7.4中)的体外细胞毒性。用7.8nM至500nM的姜黄素处理细胞(2000细胞/孔)4天。第五天时，使用MTT分析执行细胞毒性分析。负载姜黄素的胶束比纯的姜黄素更有效(3倍多)。

[0279] 游离的姜黄素和被包封的姜黄素的体外皮肤渗入。如从图18中可以看出的，姜黄素的皮肤渗入增强了5-20倍。不像游离的姜黄素，姜黄素胶束的皮肤渗入随着处理时间而增加。被应用的剂量的显著的量(5-20％)渗入皮肤并甚至发现姜黄素随着较长的处理时间穿过并到达受体相。

[0280] 如从图19中可以看出的，姜黄素胶束主要定位至毛囊(c)。从“b”也可明显看出，其中从表面至皮肤内100μm深处的条痕中观察到荧光。PEG-玉米醇溶蛋白胶束的定位对治疗囊泡疾病诸如痤疮、脱发、皮脂溢性湿疹、毛囊炎和一些皮肤癌特别有用。图19(d)显示角质层(0-15μm)中和有活力的表皮(20-100μm)中的荧光像素。包封在胶束中的姜黄素显著增加了姜黄素的皮肤渗入，每一个值为平均值±SD(n＝4)。将被切除的猪皮肤夹在垂直扩散池的两个室之间。由磷酸盐缓冲液(pH 7.4具有20％乙醇)组成的接受介质维持在37℃并使用磁珠搅动。将游离或被包封的姜黄素应用在皮肤上6小时。在研究结束时，冲洗皮肤并在共聚焦荧光显微镜下观察。使用IMAGEJ软件定量荧光像素。

[0281] 实施例4.包封尼罗红的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束

[0282] 尼罗红被用作典型的疏水性染料(Sheihet等人(2008),Int.J.Pharm.350：312-319)以研究PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束作为皮肤递送媒介物的应用。

[0283]

[0284] 尼罗红具有318.4的分子量、Log P:5、和203-205℃的熔点。它几乎不溶于水，但溶于甲醇、乙醇、和DMSO。

[0285] 图36说明根据一个实施方案使用透析方法逐步制备负载尼罗红的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束。将PEG-玉米醇溶蛋白(0.1g)和0.5mg的尼罗红溶解在20ml的90％的乙醇中。将混合物在37℃孵育过夜(以50rpm搅动)以允许尼罗红分配进入疏水性玉米醇溶蛋白核中。随后于室温针对水(100rpm搅动)透析(分子量截留10,000Da)混合物24小时以去除任何残留的物质。随后将产生的产物冷冻至-80℃之后在-47℃以60mTorr的真空冷冻干燥12至14小时。将冷冻干燥的产物于4℃储存在干燥器中。以下在表9中显示负载尼罗红的PEG-玉米醇溶蛋白胶束的表征。

[0286] 表9.

[0287]典型化合物 粒径(nm) PDI 包封率(％)
尼罗红 165±7 0.21±0.08 77±11

[0288] 结果表示为一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0289] 尼罗红是被用于研究皮肤渗入的典型的亲脂性染料。制备的负载尼罗红的PEG-玉米醇溶蛋白胶束具有165nm的平均粒径和低的多分散指数(0.21)。PEG-玉米醇溶蛋白胶束提供了好的包封率(77％)。图37说明PEG-玉米醇溶蛋白胶束增加疏水性化合物的皮肤渗入和皮肤保留的能力。数据还说明了PEG-玉米醇溶蛋白胶束作为用于治疗剂和美容剂的皮肤递送媒介物的应用。

[0290] 使用皮片的猪皮肤研究表皮和角质层(n＝3)中发现的尼罗红的量。从南达科塔州立大学(South Dakota State University)的动物归类科学系(the Department of Animal and Range Sciences)的屠宰场获得猪耳朵。在屠宰后直接收集耳朵并在自来水下冲洗。用理发推子去除背面的毛。使用手术刀和镊子从底层软骨切下皮肤。使用钝手术刀小心去除粘附在真皮侧的脂肪并观察皮肤任何可见的损伤。

[0291] 使用B型电子取皮机(PadgettTM Instruments,St.Louis,MO)将皮肤皮片至300μm厚。将被皮片的猪皮肤夹在Franz扩散池(PermeGearTM,Hellertown,PA)中的供应和接受室之间。用6mL的磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)填充接受室并使用磁力搅拌棒搅动。将接受介质保持在37℃。将供应室装载100μL的5％v/v TWEEN-80溶液中的尼罗红(250ng)和水中的尼罗红胶束(等同于250ng的尼罗红)。6小时后，用PBS冲洗皮肤样品并放置在显微镜用载玻片上用于通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)分析。

[0292] 使用CLSM(Fluoview FV300TM,Olympus ix70,Olympus,Center Valley,PA)检查具有角质层(SC)朝上的皮肤。使用氩激光以488nm的激发波长激发尼罗红。使用PLAN-NEOFLUAR 40/0.85物镜观察图像。以5μm/扫描的步长从表面(z＝0μm)至100μm扫描皮肤的xyz共聚焦图像。用相同的光学孔径、镜头和扫描速度获得所有图像。

[0293] 空白的皮肤没有显示任何的自发荧光。每一张代表性的图像都选自三至四个皮肤样品且每一个皮肤中扫描三至四个不同的区域。使用FluoviewTM软件(Olympus,Center Valley,PA)分析光学切片(xyz)。通过整合总的像素定量共聚焦图像中的荧光强度分布。分析了每一个皮肤的至少三至四个区域。单独计算SC(0-15μm)和有活力的表皮(VE,20-100μm)中的像素。与游离的尼罗红溶液相比，用尼罗红胶束处理皮肤显示皮肤渗入进入角质层和有活力的表皮中的显著增加(图37)。该数据显示PEG-玉米醇溶蛋白胶束可被用于递送治疗剂或美容剂至角质层或有活力的表皮以有效治疗多种皮肤状况。

[0294] 实施例5.另外的缀合物和胶束实施方案

[0295] 还可制备本文描述的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的变化形式(Variation)。例如，其他疏水性谷醇溶蛋白，诸如麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白可替代玉米醇溶蛋白被用作用于胶束形成的PEG化的蛋白。因此，可制备PEG化的麦醇溶蛋白胶束、PEG化的大麦醇溶蛋白胶束、和PEG化的高粱醇溶蛋白胶束并与本文描述的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束类似被使用。

[0296] 另外，可通过用另外的水溶性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、聚唾液酸(PSA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸(PAA)、多糖诸如葡聚糖和类似的水溶性聚合物取代PEG化的谷醇溶蛋白聚合物的PEG部分制备其他两亲的蛋白缀合物。这些水溶性的聚合物可缀合至任何疏水性谷醇溶蛋白，诸如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，以形成自组装进入胶束的两亲的蛋白缀合物。当胶束在存在被溶解的治疗剂时形成时，可从这些不同的两亲的蛋白缀合物制备负载药物的胶束并可如描述用于PEG化的玉米醇溶蛋白胶束那样被使用。

[0297] 类似地，疏水性聚合物可缀合至谷醇溶蛋白。此类聚合物可包括，例如，聚己酸内酯、聚乳酸-乙醇酸、聚环氧丙烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、精胺、聚赖氨酸、或聚丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯、聚二甲氨基乙基丙烯酸酯(polydimethylamino ethyl acrylate)、和类似的)。脂肪酸也可缀合至谷醇溶蛋白以形成疏水性核。此类脂肪酸的实例可包括硬脂酸、棕榈酸、磷脂酰乙醇胺、或油酸。这些聚合物和/或脂肪酸可缀合至任何疏水性谷醇溶蛋白，诸如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，以形成自组装进入胶束的蛋白缀合物。当胶束在存在被溶解的治疗剂时形成时，可从这些不同的蛋白缀合物制备负载药物的胶束并可如描述用于PEG化的玉米醇溶蛋白胶束那样被使用。

[0298] 可针对谷醇溶蛋白疏水性核或亲水性壳，诸如PEG壳，作出其他或另外的修饰。这些可包括缀合刺激响应元件诸如聚甲基丙烯酸羟乙酯至核，以制备pH敏感的胶束，或聚(N-异丙基丙烯酰胺)以制备热敏胶束。另外，谷醇溶蛋白疏水性核或亲水性壳可被交联，例如，使用交联剂诸如戊二醛、京尼平、柠檬酸、和类似的，以控制药物释放并增加药物包封产量和效率。

[0299] 实施例6.用于局部递送类视黄醇的谷醇溶蛋白胶束

[0300] 已开发了用于局部递送视黄醇穿过皮肤用于治疗多种皮肤状况的新的纳米载体。视黄醇(维生素A)和其衍生物(类视黄醇)参与机体内的多种生物学功能包括表皮细胞生长和分化、视力、免疫调节和抗炎效果(Summer,J Nutr 138:1835-1839,2008)。特别地，视黄醇和其衍生物被广泛用于治疗多种皮肤状况包括痤疮、牛皮癣、角质化障碍、皮肤色素减退、和皮肤恶性肿瘤(皮肤癌和黑色素瘤)、及用于创伤愈合和光老化(Orfanos等人,Drug 
53:358-388,1997)。视黄醇还被用于美容制剂中以减少皱纹和治疗脂肪团(Orfanos等人，Drug 53:358-388,1997)。然而，视黄醇用于美容和皮肤应用的用途被其差的理化特性和潜在的皮肤刺激可能性严重限制(Melo等人，J Control Release 138:32-39,2009；Kim等人，Toxicol Lett 146:65-73,2003)。

[0301]

[0302] 视黄醇是亲脂性分子(Log P 6.20)，具有差的水溶解性和有限的皮肤渗透性。此外，在光和水分存在时是高度不稳定的(见美国专利号5,851,538(Froix等人))，通过引用整体并入本文。视黄醇的局部应用造成表现为轻度红斑和角质层剥离的严重的局部刺激，在用户中导致不顺从(Kim等人，Toxicol Lett 146:65-73,2003)。申请人通过将视黄醇包封在用于局部应用的基于新的蛋白的胶束中已成功解决视黄醇的递送问题。

[0303] 新的纳米载体已从玉米蛋白玉米醇溶蛋白中被开发出，如本文描述的。一个纳米载体包括缀合聚乙二醇(PEG)至玉米醇溶蛋白。PEG化的玉米醇溶蛋白形成自组装的具有疏水性核和亲水性壳的纳米胶束。玉米醇溶蛋白显示对皮肤角蛋白的疏水性(Deo等人，Langmuir 19:5083-5088,2003)并因此是用于皮肤应用的有前景的载体。因为玉米醇溶蛋白是疏水性的，它可被用于包封疏水性类视黄醇进入纳米粒子内(见，例如，WO 2009/137112，其通过引用整体并入本文)、或本文描述的胶束可被用于包封疏水性类视黄醇以提供类视黄醇的可去除水的制剂。

[0304] 申请人已经制备了负载视黄醇的纳米胶束的尺寸范围为180-220nm，具有79-91％的包封率。在胶束中包封视黄醇导致水溶性制剂。

[0305] PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束显著增强了视黄醇抗水分和光诱导的降解的固态和液态稳定性。视黄醇从PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束的释放持续直至2天。

[0306] 与游离的视黄醇水分散体相比，PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束增强了视黄醇的皮肤渗入。此外，PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束可被用于保持视黄醇在皮肤层中用于美容和皮肤病应用。纳米载体的一个独特的方面是纳米胶束解决视黄醇的局部递送的多个市场挑战的能力。这些挑战包括提供1)视黄醇的水溶性的和水可分散的制剂，2)增强的视黄醇抗光和水分诱导的降解的稳定性，3)视黄醇的自由流动、无色的且不吸湿的粉末，4)视黄醇的缓释制剂，5)视黄醇的较高的皮肤渗入和较高的皮肤保留，和6)视黄醇的无刺激性制剂。

[0307] 玉米醇溶蛋白是生物可降解的US-FDA批准的具有与皮肤角蛋白相似的表征的蛋白聚合物并因此是皮肤相容的纳米载体。PEG是US-FDA批准的水溶性聚合物。PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束因此提供用于视黄醇的水洗型的局部制剂(water washable topical formulation)。两亲的PEG-玉米醇溶蛋白胶束用作用于运输疏水性药物诸如视黄醇穿过皮肤中交替的疏水性和亲水性环境的载体。

[0308] 在纳米胶束中包封后视黄醇的水溶解性显著增加。视黄醇从玉米醇溶蛋白纳米胶束中的释放可以是持续的，导致较低的剂量和减少的应用频率。在玉米醇溶蛋白纳米胶束中包封视黄醇显著增加了视黄醇制剂的储存期。PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束增加了视黄醇在固体和半固体制剂中的流动性和分散性。因为视黄醇是吸湿的粘性粉末，在纳米胶束中包封视黄醇能够克服与视黄醇相关的困难的处理和加工问题。

[0309] PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束可增强视黄醇在皮肤层中的皮肤渗入和保留以用于美容和皮肤病应用。玉米醇溶蛋白纳米胶束可增强视黄醇在皮肤层中的皮肤渗入和保留以用于美容和皮肤病应用。在纳米胶束中包封视黄醇掩盖了视黄醇的黄色。这改善了视黄醇制剂的美学诉求并预防了黄色染色。冷冻干燥的PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束可容易被并入多种局部制剂基质，诸如凝胶、乳膏、洗剂和软膏。

[0310] 用切除的猪皮肤实施皮肤渗入研究，其与人皮肤在许多重要的方面是相似的(Simon和Maibach,Skin Pharmacol Appl Physiol 13:229-234,2000)。小鼠中的体内研究进一步说明纳米胶束克服视黄醇的皮肤刺激的能力。使用纳米胶束替代现有的商业制剂的优势包括：

[0311] 1.增溶。视黄醇是水不溶性疏水性化合物。在PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束中包封视黄醇是水溶性的/可分散的。因此纳米胶束可被用于形成水洗型视黄醇制剂用于局部应用。通常水洗型制剂优选用于美容和皮肤病应用。

[0312] 2.稳定。视黄醇在存在水分和光时是高度不稳定的。这限制了视黄醇制剂的储存期和在应用过程中制剂的效力。在PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束中包封视黄醇可显著增强视黄醇制剂的稳定性和储存期。

[0313] 3.缓释。视黄醇从PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束中的释放可以是持续的。释放可持续从2天至一周。这减少了应用视黄醇的剂量和频率。

[0314] 4.皮肤渗入和保留。视黄醇具有差的皮肤渗入的特性。纳米胶束导致增强的视黄醇的皮肤渗入。取决于应用，使用纳米胶束可将视黄醇保留在皮肤层中用于多种皮肤病/美容应用。

[0315] 5.药用化妆品应用。负载视黄醇的胶束可被用于美容应用诸如抗衰老、抗皱纹、和脂肪团的治疗。

[0316] 6.皮肤病应用。负载视黄醇的纳米胶束可被用于多种皮肤病状况诸如牛皮癣、痤疮、创伤治愈和皮肤恶性肿瘤，诸如皮肤癌和黑色素瘤。

[0317] 7.有效和安全的制剂。使用负载视黄醇的纳米胶束导致更有效的治疗。此外，纳米胶束中包封视黄醇显著减少了由视黄醇造成的皮肤刺激。视黄醇的皮肤刺激是视黄醇不符合美容和皮肤病应用的主要问题。

[0318] 8.用于包封其他类视黄醇的平台技术。多种类视黄醇包括视黄醇、视黄酸、和它们的衍生物，可被包封在谷醇溶蛋白纳米胶束中用于美容和皮肤病应用。适于包封的多种类视黄醇的实例包括，但不限于，视黄醇、视黄酸(诸如13-反式-视黄酸(维甲酸)、13-顺式-视黄酸(异维甲酸)、9-顺式-视黄酸(阿利维A酸))、视黄醛、阿维A酯、阿维A、视黄醇棕榈酸酯、和类胡萝卜素诸如胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、和玉米黄质。

[0319] 9.组合治疗。视黄醇纳米胶束可与其他药物一起被并入其他产品中，诸如防晒、抗牛皮癣、抗痤疮和抗癌产品。因为视黄醇被包封，将预防与其他剂的互作。其他剂诸如抗氧化剂、自由基清除剂、抗炎剂也可与视黄醇一起被包封在纳米胶束中。

[0320] 负载视黄醇的PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束。

[0321] 视黄醇(C20I-1300；286.45g/mol)具有61-63℃的熔点、3100单位/mg的活性、和6.2的Log P。视黄醇几乎不溶于水，溶于或部分溶于乙醇、并与氯仿、乙醚和汽油(petroleum spirit)是可混溶的。

[0322] 视黄醇是用于多种皮肤状况包括光老化、痤疮、创伤愈合、黄褐斑牛皮癣、皮肤癌、黑色素瘤和其他皮肤状况的药用化妆品/治疗剂(Orfanos等人,Drug 53:358-388,1997)。视黄醇具有差的水溶解性和差的光稳定性(Melo等人，J Control Release 138:32-39,
2009；美国专利号5,851,538(Froix等人)通过引用整体并入本文)。另外，其还造成皮肤刺激(Kim等人，Toxicol Lett 146:65-73,2003)。申请人已开发出新的基于玉米醇溶蛋白的视黄醇的纳米粒子的局部制剂。因为玉米醇溶蛋白与皮肤角蛋白具有相似的特征，它被用作检测用于局部制剂中的赋形剂的皮肤刺激的模式蛋白(玉米醇溶蛋白测试)。由于其与皮肤角蛋白的相似性，玉米醇溶蛋白纳米载体是用于视黄醇的极佳的递送媒介物。另外，PEG是在皮肤制剂中被广泛使用的物质。因此，疏水性玉米醇溶蛋白和亲水性PEG在PEG-玉米醇溶蛋白胶束中的结合是能够运载分子经皮肤中交替的疏水性和亲水性区域穿过皮肤的两亲的载体。

[0323] 该实施例说明负载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米胶束的制备和表征，与视黄醇本身相比，使用PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束改善了视黄醇的溶解性、通过在PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束中包封改善了视黄醇的稳定性、视黄醇从玉米醇溶蛋白胶束的缓释、玉米醇溶蛋白纳米胶束增强视黄醇的皮肤渗入和皮肤保留的能力、和视黄醇胶束制剂无皮肤刺激或降低的皮肤刺激。

[0324] 1.负载视黄醇的纳米胶束的制备。将PEG-玉米醇溶蛋白、视黄醇和BHT溶解在90％乙醇中并于37℃孵育过夜。随后，将分散体针对去离子水透析以去除游离的视黄醇。随后冷3
冻干燥负载视黄醇的胶束。放射性标记的(H)视黄醇与‘冷’视黄醇一起被用于该研究。取决于PEG-玉米醇溶蛋白/药物比率和BHT浓度，纳米胶束的尺寸约180-220nm且包封率为79至91％。不存在BHT时，包封率<35％。表6(10)-1分别提供了使用透析方法(例如，见图38)和薄膜方法(例如，见图39)制备的负载视黄醇的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的表征的数据。

[0325] 表10-1：分别使用透析方法和薄膜方法制备的负载视黄醇的PEG化的玉米醇溶蛋白胶束的表征。

[0326]

[0327] 结果表示一式三份样品(平均值±SD)；PDI＝多分散指数。

[0328] 2.视黄醇在水溶液中增加的溶解性/分散性。游离的视黄醇不可分散于水中并在试图分散该剂之后沉淀在小瓶的底部(图40)。在另一方面，负载视黄醇的PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束容易分散在水中。在纳米胶束中包封之后显著增强了视黄醇在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的溶解性。10μg/mL的盐酸盐缓冲液(pH 7.4)中的视黄醇(等量视黄醇)视黄醇胶束样品显示堪比于10μg/mL的20％甲醇中的游离视黄醇的UV吸光度(320nm)。在10μg/mL的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的视黄醇分散体中观察到非常低的吸光度。

[0329] 3.视黄醇从PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束中的释放。在磷酸盐缓冲液盐水(PBS；pH 7.4)中实施视黄醇从纳米胶束中的释放研究。使用UV分光光度计在320nm处分析视黄醇的浓度，并一式三份实施释放研究。视黄醇从纳米胶束的释放持续直至48小时，如在图41中显示的。

[0330] 4.负载视黄醇的玉米醇溶蛋白纳米胶束的稳定性。视黄醇是黄色颜色的粉末。它在环境条件下是吸湿的并快速变成粘性的。被包封的视黄醇是无色的并自由流动，且是远远较少吸湿的(图42)。在图42中显示的视黄醇样品是亮黄色且纳米胶束制剂是白色，说明包封掩盖了视黄醇的亮黄色颜色。纳米胶束制剂还导致比纯的视黄醇更自由流动的粉末。

[0331] 持续一周时间段研究了环境条件下和黑暗中的视黄醇纳米胶束制剂的稳定性。持续一周还研究了视黄醇和负载视黄醇的纳米胶束(冷冻干燥的粉末)的固态稳定性。关于液态稳定性，将游离的视黄醇或负载视黄醇的纳米胶束分散在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中并持续一周使用UV光谱学方法(于320nm)测量视黄醇的浓度。发现视黄醇遵循一级动力学并测定了半衰期。获得以下的结果，如表10-3和10-4及图43、44、45、和46中显示的。

[0332] PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束保护视黄醇抗光降解和水分引起的降解。与游离的视黄醇相比，固态和液态中的被包封的视黄醇显示增强的稳定性。包含BHT作为抗氧化剂进一步增强了被包封的视黄醇的稳定性。最终，通过纳米胶束中的包封显著增强了视黄醇的储存期。

[0333] 表10-3：游离和被包封的视黄醇的固态稳定性.

[0334]物质 光(t1/2以小时计) 黑暗(t1/2以小时计)
视黄醇固体 52.75 63
视黄醇胶束 86.63 112
具有BHT的视黄醇胶束 173.25 1155

[0335] 表10-4：游离和被包封的视黄醇在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的液态稳定性.[0336]物质 光(t1/2以小时计) 黑暗(t1/2以小时计)
视黄醇 16.11 20.83
视黄醇+BHT 35.25 43.42
视黄醇胶束 37 94.88
具有BHT的视黄醇胶束 99 219.5

[0337] 5.视黄醇和被包封的视黄醇的皮肤渗入。使用Franz扩散池用被切除的猪耳朵皮肤研究视黄醇和被包封的视黄醇的皮肤渗入。放射性标记的(3H)视黄醇与‘冷’视黄醇一起被用于该研究。使用放射化学分析评价48小时结束时皮肤匀浆和接受介质中的视黄醇的量。重复实验6次(±SD)。如在图47中可以看出的，被包封的视黄醇导致皮肤中视黄醇的较大的保留。胶束导致约5倍增加的视黄醇的皮肤保留。游离的视黄醇和视黄醇胶束的“皮肤中的视黄醇与受体”的比率分别为3和6.5。结果显示胶束增加了视黄醇的整体皮肤渗入和保留。

[0338] 为了说明视黄醇的囊泡靶向性，使用了皮肤三明治模型。在三明治皮肤中(见图48)，囊泡途径被夹在表皮上的角质层阻断。与传统的皮肤表皮渗入研究相比，三明治皮肤模型中游离的视黄醇和胶束包封的视黄醇被运转进入接受室的视黄醇的量都是减少的。然而，从胶束运转视黄醇的显著减少显示大部分视黄醇胶束是穿过毛囊被运转的。考虑到视黄醇治疗痤疮的用途(痤疮主要起源于毛囊)，视黄醇胶束将具有靶向视黄醇至毛囊中的疾病部位的优势。

[0339] 总之，PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束显著增加了视黄醇的水溶解性和分散性。在纳米胶束中包封视黄醇导致自由流动的无色粉末，不像游离的视黄醇，游离的视黄醇是黄色、粘性且吸湿的粉末。玉米醇溶蛋白纳米胶束有效维持视黄醇的释放。通过在玉米醇溶蛋白纳米胶束中的包封显著增强了视黄醇的光稳定性和水解稳定性，其通过添加BHT作为抗氧化剂进一步被增强，且PEG-玉米醇溶蛋白纳米胶束导致视黄醇的更高的皮肤保留。纳米胶束还可减少视黄醇的皮肤刺激。

[0340] 视黄醇胶束的乳膏制剂的制备。为了说明用于递送的皮肤制剂的商业发展的可行性，将商业膏基(MEDCO Labs)用于并入游离的视黄醇或被包封在玉米醇溶蛋白胶束中的视黄醇。膏基包含硬脂醇(14％，鲸蜡酯(cetyl ester)为(3.5％)、单硬脂酸甘油酯(2％)、聚氧乙烯硬脂醚(3％)、山梨醇(10％)、棕榈酸异丙酯(2％)、对羟基苯甲酸甲酯(0.16％)、对羟基苯甲酸丙酯(0.4％)和纯化水(65％)。称重等同于0.1％的视黄醇并转移至表面皿并通过几何稀释使用玻璃棒均匀混合。可使用其他制剂，包括但不限于，油-水乳膏、油包水乳3
膏、软膏、凝胶、和类似的。将0.05μCi的 H-视黄醇掺入混合物中并在乳膏中彻底混合。最终，将制备的乳膏制剂转移至玻璃小瓶并存储直到使用。

[0341] 表11：视黄醇乳膏制剂

[0342]

[0343]

[0344] 持续一个月的时间段测量了视黄醇胶束乳膏制剂的稳定性(见图49)。如图中显示的，制剂保持稳定并没有在室温中显示任何降解。

[0345] 视黄醇从乳膏制剂中的体外释放。约40mg的膏基和胶束乳膏被放置在垂直扩散池透析膜中(MWCO～8,000-10,000Da)用于释放研究，接受介质由pH 7.4的缓冲液组成。从接受介质中收集样品并使用3H视黄醇通过放射化学方法分析。每一个数据点代表平均值±SD(n＝3)。如从图50中可以看出的，与胶束乳膏相比，更多的视黄醇从普通乳膏中释放。

[0346] 体外皮肤渗入。将被切除的人皮肤夹在垂直扩散池的两个室之间。由磷酸盐缓冲液(pH 7.4)组成的接受介质维持在37℃并使用磁珠搅动。将游离的视黄醇或被包封在胶束中的视黄醇乳膏制剂装载在供应室中。制剂被应用6小时并随后去除制剂并继续渗入研究48小时。在研究结束时，使用3H标记的视黄醇通过放射化学方法测量皮肤和接受室中的视黄醇浓度。用0.1M氢氧化钠消化皮肤以确定视黄醇浓度。如从图51中可以看出的，对于普通的乳膏，接受室中比皮肤中存在更多的视黄醇。相比之下，胶束乳膏显示相反的，其中在皮肤中比接受室中发现更多的视黄醇。

[0347] 视黄醇和被包封的视黄醇乳膏制剂的皮肤刺激。可使用如表12中列出的处理组在SKH-1无毛小鼠中体内检测标准的制剂对被包封的制剂的皮肤刺激。

[0348] 表12：皮肤刺激研究的处理组.

[0349]组 处理
组1 对照(无处理)
组2 视黄醇乳膏
组3 空白PEG-玉米醇溶蛋白胶束乳膏
组4 视黄醇纳米胶束乳膏
组5 十二烷基硫酸钠乳膏(阳性对照)

[0350] 将视黄醇乳膏制剂(0.5g的0.1％w/v视黄醇当量)每天施用至SKH-1无毛小鼠的背部持续五(5)天。在应用制剂之前，使用TEWA计(Delfin)每天测量经表皮水分丢失(TEWL)值。TEWL的增加是皮肤刺激的衡量并如图52中可以看出的，被包封在胶束中的视黄醇没有显示皮肤刺激并堪比阴性对照(即，无处理)。另一方面游离的视黄醇乳膏显示皮肤刺激。十二烷基硫酸钠(SLS)，已知的皮肤刺激剂，被用作阳性对照。

[0351] 体内局部生物利用度。将乳膏制剂施用在异氟烷麻醉下的小鼠的背部皮肤上。安乐处死动物之后，使用SCOTCH TAPE胶带剥离皮肤以去除角质层。通过放射化学分析使用3H视黄醇确定皮肤(角质层和表皮/真皮)和血液中的视黄醇的量。如图53中可以看出的，胶束包封的视黄醇保留在皮肤中，没有全身性吸收进入血液。值为平均值±SD(n＝3)。

[0352] 实施例7.酪蛋白胶束

[0353] 酪蛋白是在合适条件下可以形成胶束的牛奶蛋白。尽管一些研究已经描述了酪蛋白胶束作为递送载体的用途，酪蛋白胶束没有被用作用于皮肤应用的递送剂。酪蛋白可与PEG-玉米醇溶蛋白胶束结合形成新的混合的胶束。

[0354] 制备负载视黄醇的β-酪蛋白胶束的一般步骤如下。可将β酪蛋白(20mg)和视黄醇(0.1mg于600μL的乙醇中)溶解在10mL的0.1M的PBS pH 7.0中。在约37℃将混合物孵育过夜，之后于～100℃在100mTorr真空下冷冻干燥(例如，持续约24小时)。可将产生的胶束粉末储存在于约2-8℃的干燥器中持续延长的时间段。以下的表13说明负载视黄醇的β-酪蛋白胶束的多种表征。关于负载视黄醇的β-酪蛋白胶束的制备，视黄醇的浓度可从约0.005至约0.05％w/w的范围。β-酪蛋白浓度从约0.15-0.25％w/v的范围。

[0355] 表13.负载视黄醇的β-酪蛋白胶束的表征.

[0356]样品号 视黄醇(％w/w) BHT(％w/w) 粒径(nm) PDI 包封率(％)
1 0.005 -- 207.4 0.656 9.74
2 0.015 -- 109.1 0.616 10.28
3 0.005 0.005 76.9 0.626 10.25
4 0.015 0.015 68.9 0.510 11.06

[0357] 酪蛋白还可被用于制备包含尼罗红的胶束(见，图54)。表14提供此类胶束的表征。

[0358] 表14.

[0359]样品名称 粒径(nm) PI 包封率(％)
尼罗红-酪蛋白胶束 245±15nm 0.38±0.41 78±5％

[0360] 如在图55中看出的，在酪蛋白胶束中包封尼罗红显著增强了尼罗红的皮肤渗入。将被切除的猪皮肤夹在垂直扩散池的两个室之间。由磷酸盐缓冲液(pH 7.4)组成的接受介质被维持在37℃并使用磁珠搅动。将游离的或被包封的尼罗红应用在皮肤上6小时。在研究结束时，冲洗皮肤并在共聚焦荧光显微镜下观察。使用IMAGEJ软件定量SC(0-15μm)和有活力的表皮(20-100μm)中的荧光。每一个值为平均值±SD(n＝4)。在p<0.05时差异显著。

[0361] 实施例8药物剂型

[0362] 以下的制剂说明可被用于本文描述的胶束制剂的治疗或美容施用的代表性的药物剂型，其可以是水分散体或冷冻干燥的粉末(在下文中被称为‘组合物X’)：

[0363]

[0364]

[0365] 可通过药学领域众所周知的常规程序制备这些制剂。将被领会的是以上药物组合物可根据众所周知的制药技术而变化以适应活性成分‘组合物X’的不同的量和类型。气雾剂制剂(vi)可与标准的、计量剂量气雾剂分配器联合起来使用。另外，特定的成分和比例是为了说明性的目的。根据所需的感兴趣的剂型的期望特性，可将成分换为适合的等同物并可改变比例。

[0366] 尽管以上参考公开的实施方案和实施例描述了特定的实施方案，此类实施方案仅是说明性的并不限制本发明的范围。根据本领域的普通技术可作出改变和修改而在根据所附权利要求中所定义的其广泛的方面不偏离本发明。

[0367] 所有的出版物、专利、和专利文件通过引用并入本文，就好像通过引用个别并入。已参考多个特定的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应当理解的是可作出许多变化和修改同时保持在本发明的精神和范围内。尽管参考以上的实施例描述了本发明，将被理解的是修改和变化被包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅被所附的权利要求所限制。