基于纳米颗粒的肿瘤靶向药物递送 |
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| 申请号 | CN201180052777.7 | 申请日 | 2011-09-02 | 公开(公告)号 | CN103179952B | 公开(公告)日 | 2015-06-03 |
| 申请人 | 斯克里普斯研究学院; | 发明人 | R.A.赖斯菲尔德; R.向; Y.罗; D.廖; Z.刘; T.陈; S.陈; D.卢; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供包含脂质体纳米颗粒的 水 性分散体的水性 肿瘤 靶向性脂质体纳米颗粒组合物。所述纳米颗粒优选包封抗癌化疗剂，可将其加至预形成的脂质体组合物或者可在脂质体形成期间掺入脂质体内。脂质体纳米颗粒包含与一种或更多种其它形成胶束或小泡的脂质材料混合的legumain靶向性脂质，所述组合物呈分散在水性载体中的纳米颗粒脂质体形式。优选的肿瘤靶向性脂质体纳米颗粒组合物包含(a) legumain靶向性脂质组分，(b)两性离子脂质组分；(c) 氨 基取代的脂质组分；(d)中性脂质组分；和(e)聚乙二醇-缀合的脂质组分。所述legumain靶向性脂质组分包含与legumain-结合部分共价连接的疏水脂质部分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种legumain靶向性脂质，其包含与legumain-结合部分共价结合的脂质组分，其中所述legumain-结合部分包含氮杂-ASN肽型legumain抑制剂。 |
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| 说明书全文 | 基于纳米颗粒的肿瘤靶向药物递送[0001] 相关申请的交叉引用 [0003] 政府支持 [0005] 背景 [0006] 配体靶向已成为纳米颗粒(NP)介导的药物递送的主要进展，实现高局部浓度和低全身暴露，减少药物毒性同时维持对靶细胞的最佳剂量递送。用抗体和归巢肽(homing peptide)对于这种策略建立观念的证据，所述抗体和归巢肽结合由肿瘤脉管系统过度表达的粘附受体(包括整联蛋白和HER-2)和肿瘤细胞上的叶酸细胞表面受体。与配体靶向有关的问题包括受体饱和、低受体-配体亲和力、有限的组织渗透和实体瘤的遗传异质性。Legumain是由多种肿瘤细胞过度表达的天冬酰胺酰基内肽酶。因此，legumain为将治疗剂引导至肿瘤细胞提供方便的靶标。本发明的组合物和方法解决与配体靶向有关的问题，同时为肿瘤特异性药物递送提供有效的方法。 [0007] 发明概述 [0008] 本发明提供水性肿瘤靶向性脂质体纳米颗粒组合物，其包含任选包封抗癌化疗剂的脂质体纳米颗粒的水性分散体。本发明的水性肿瘤靶向性脂质体纳米颗粒组合物包含legumain靶向性脂质，其与一种或更多种其它形成胶束或小泡的脂质材料混合，所述组合物呈纳米颗粒脂质体分散体形式，任选将抗癌化疗剂包封在脂质体纳米颗粒内。legumain靶向性脂质组分包含与legumain-结合部分共价连接的疏水脂质部分。可在纳米颗粒制备期间将抗癌化疗剂包封在脂质体纳米颗粒内，或者可预先形成纳米颗粒然后负载化疗剂。优选的水性肿瘤靶向性脂质体纳米颗粒组合物包含(a) legumain靶向性脂质组分，(b)两性离子脂质组分；(c)氨基取代的脂质组分；(d)中性脂质组分；和(e)作为纳米颗粒脂质体分散在水性载体(例如生理学上可耐受的缓冲剂，其可包括各种生理学上可接受的赋形剂和常用于药物制剂中的辅剂)中的聚乙二醇缀合的脂质组分。legumain靶向性脂质组分包含与legumain-结合部分共价连接的疏水脂质部分。legumain-结合部分可以是与legumain选择性形成稳定复合物或共价键的任何材料。 [0009] 优选的legumain靶向部分是legumain的氮杂-Asn迈克尔受体型(Michael acceptor-type)抑制剂。优选的legumain靶向性脂质组分包含与磷脂结合的氮杂-Asn迈克尔受体legumain抑制剂。例如，称为RR-11a的抑制剂可与合适的脂质结合，如显示于图1，(a)区。 [0010] 在一些优选实施方案中，legumain靶向性脂质组分包含与1,2-二酰基甘油-磷酸烷醇胺基，比如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)共价连接的legumain-结合部分。 [0011] 优选的两性离子脂质组分(b)包含1,2-二酰基甘油-磷酸胆碱化合物，比如1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。 [0012] 优选的氨基取代的脂质组分(c)包含1,2-二酰基甘油-磷酸烷醇胺化合物，比如DOPE。 [0013] 优选的中性脂质组分(d)包含胆固醇。 [0014] 优选的聚乙二醇-缀合的脂质组分(e)包含聚乙二醇-缀合的1,2-二酰基甘油-磷酸烷醇胺化合物比如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇]，其中化合物的聚乙二醇部分具有约2000个原子质量单位(amu)的平均分子量。 [0015] 在一个优选实施方案中，组分(a)、(b)、(c)、(d)和(e)以约1.1:6.7:6.7:2.2:1的(a):(b):(c):(d):(e)摩尔比存在于脂质体纳米颗粒中。 [0016] 优选脂质体纳米颗粒组合物包封抗癌化疗剂，例如多柔比星，1-[2-氰基-3-,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酰基]咪唑(也称为CDDO-Im)，或任何其它已知的抗癌化疗剂。 [0017] 本发明的组合物特别适合用于治疗表达legumain的肿瘤。本发明的方法方面包含给予需要癌症治疗的患者有效量的包封在本发明组合物的脂质体纳米颗粒内的抗癌化疗剂。 [0019] 图1说明legumain-靶向纳米颗粒(NP)的制备和鉴定。(a)区说明RR-11a缀合至1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。(b)区提供证明肿瘤缺氧的荧光显微镜图像(标度条, 100 μm)。(c)区提供特异性结合相对于抗体浓度的图，证明抗小鼠单克隆抗体(mAb)对细胞膜表达的legumain的亲和力，如通过Scatchard分析测定的。(d)区提供对于与CoCl2培养约24小时，然后将非靶向纳米颗粒(非靶向)或RR-11a-靶向纳米颗粒(靶向) NP加至细胞的鼠4T1和4TO7乳腺癌和CT26结肠癌细胞，罗丹明阳性细胞相对于时间的图(n = 3孔/组; 数据表示均值± s.e.m)。(e)区提供荧光显微镜图像，其显现用本发明的靶向(顶行)和非靶向(底行) NP处理的小鼠的肿瘤、肝、脾和肾细胞的NP分布，如通过罗丹明B荧光表示的(n = 2只小鼠/组; 标度条, 100 μm)。 [0020] 图2证明靶向legumain增强PEG-脂质体-包封的多柔比星的摄取和改善NP-介导的药物递送至原发性乳腺肿瘤。(a)区提供平均荧光强度(MFI)相对于时间的图，其中将4T1和4TO7细胞与CoCl2培养约24小时然后与负载多柔比星的靶向纳米颗粒组合物(本文称为RDZ-218)、负载多柔比星的非靶向NP (NP-Dox)或者游离多柔比星(游离Dox)培养指定的时间，接着通过流式细胞分析测定多柔比星的平均荧光强度(MFI) (对于每个时间点，n = 3孔/组; 数据表示均值± s.e.m)。(b)区提供显示药物摄取浓度的百分比条形图，该浓度通过比较RDZ-218、NP-Dox和游离Dox-处理的细胞的MFI与连续稀释的多柔比星的MFI而测定。(c)区提供比较死亡4T1和4TO7细胞的相对百分比的条形图，所述细胞用对照(无处理)、游离Dox、NP-Dox、游离RR-11a、NP-RR11a (无多柔比星)和RDZ-218处理，在处理后约24小时，所述相对百分比通过分析流式细胞术的前向和侧向散点图确定(显示相对于未处理细胞(对照)的数据; n = 3孔/组; 数据表示均值± s.e.m. *p<0.05, **p<0.005)。(d)区提供雌性BLAB/c小鼠的肿瘤(顶行)、肝(中间行)和心(底行)细胞的荧光显微镜图像，其中将4TO7细胞注入腹股沟的乳房脂肪垫；让肿瘤建立约5天(d)， 3 达到约500 mm的大小，然后将RDZ-218、NP-Dox或游离Dox i.v.注射(2次)给小鼠；最后一次注射后约24小时将小鼠处死，分离组织，立即通过荧光显微镜分析以检测多柔比星的分布；组织切片还用DAPI染色使细胞核显现(n = 2只小鼠/组; 标度条, 100 μm)。 [0021] 图3证明用RDZ-218治疗性处理4TO7荷瘤小鼠，对于以3天间隔5次i.v.注射RDZ-218、NP-Dox、游离多柔比星(游离Dox)、空RR-11a-缀合的NP (NP-RR-11a)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，导致完全阻遏原发性乳腺肿瘤生长且无毒性；数据点表示处理天数；n = 5只小鼠/组。(a)区提供肿瘤大小相对于时间的图(数据表示均值± s.e.m)。(b)区提供解剖之前获取的原发性肿瘤图像；图像是每组的代表。(c)区提供比较各处理组小鼠的原发性肿瘤的肿瘤湿重的条形图(数据表示均值± s.e.m; *p<0.05)。(d)区提供比较各处理组小鼠的TUNEL-阳性(凋亡)肿瘤细胞的条形图(n = 5个视野/切片; 数据表示均值± s.e.m; ***p<0.0005)。(e)区提供比较各处理组小鼠的体重改变的条形图(从处死时总体重减去原发性肿瘤重量并与肿瘤细胞攻击(challenge)之前的体重相比以确定体重的改变；数据表示均值± s.e.m；对照组与RDZ-218处理组相比，**p = 0.0029, ***p < 0.001)。 [0022] 图4图示说明在(a)区legumain半胱氨酸残基与氮杂-Asn迈克尔受体的迈克尔加成；在(b)区legumain Cys残基与氮杂-Asn-环氧化物的反应，和在(c)区legumain Cys残基与氮杂-Asn-卤代甲基酮的反应。 [0023] 图5. RR-11a-偶联的NP的物理化学表征。将负载CDDO-Im (A)、不负载CDDO-Im (B)的Legumain-靶向NP，或者负载CDDO-Im (C)或不负载CDDO-Im (D)的非-靶向NP，通过动态光散射和TEM (嵌入)分析以确定粒度分布(直径, nm)和ζ电位(mV)。标度条=100nm。 [0024] 图6. 通过蛋白质印迹分析得出，在鼠乳腺癌细胞和原发性肿瘤中包封的CDDO-Im抑制STAT-3磷酸化。(A)将4T1鼠乳腺癌细胞用各种浓度的IL-6 (10ng/mL)和CDDO-Im处理。(B)将4TO7鼠乳腺癌细胞用IL-6 (10ng/mL)联合游离CDDO-Im (游离CDDO)、空靶向NP (Leg-NP)、非靶向NP-包封的CDDO-Im (NP-CDDO)或靶向NP-包封的CDDO-Im (Leg-NP-CDDO)处理。(C)用8次i.v.注射PBS (1泳道)、Leg-NP (2泳道)或Leg-NP-CDDO (3泳道)处理小鼠，由此制备MMTV-Neu原发性肿瘤提取物。 [0025] 图7. 用Leg-NP-CDDO的治疗性处理抑制4TO7肿瘤的生长。(A)用5×103个4TO7肿瘤细胞攻击并用Leg-NP-CDDO或对照(PBS, 游离CDDO, NP-CDDO或Leg-NP)处理的小鼠的处理示意图(n=8只小鼠/组)。(B)每2天触摸检查肿瘤，计算肿瘤大小。数据表示均值± s.e.m。(C)在第19天测量肿瘤重量并与体重相比以确定肿瘤负荷百分比。数据表示均值± s.e.m。*p<0.05。 [0026] 图8. 用Leg-NP-CDDO治疗性处理MMTV-Neu原发性肿瘤延缓肿瘤生长。(A)用4 1×10个MMTV-Neu原发性肿瘤细胞攻击并用Leg-NP-CDDO或对照(PBS or Leg-NP)处理的小鼠的处理示意图(n=8只小鼠/组)。(B)每3天触摸检查肿瘤，计算肿瘤大小。数据表示均值± s.e.m. (C)在第46天测量肿瘤重量，用于计算肿瘤负荷百分比。数据表示均值± s.e.m, *p<0.05。 [0027] 图9. Leg-NP-CDDO调节体内肿瘤细胞因子和生长因子表达概况。自如图8A所述处理的小鼠分离MMTV-Neu原发性肿瘤，由此制备完整组织提取物。进行蛋白质印迹分析(左区)并相对于肌动蛋白(右图)量化以确定与生长因子和细胞因子相关的Th1 (A)和Th2 (B)的蛋白质表达。另外，还确定抗凋亡蛋白质的表达。数据表示3次独立实验的均值± s.e.m.。*p<0.05和**p<0.005。 [0028] 图10. 用Leg-NP-CDDO治疗性处理调节免疫细胞渗入原发性肿瘤内。按照图8A描述处理小鼠。(A-C)在肿瘤细胞攻击后46天，通过流式细胞术分析活的原发性肿瘤单细+胞悬液以检测活化的CD8 T细胞(A)、巨噬细胞(B)或树突状细胞(C)。数据表示均值± s.e.m。(D)用抗F4/80 (染红色)和NOS2 (染浅色)抗体通过免疫组化鉴定冷冻肿瘤切片中的M1巨噬细胞。用DAPI使细胞核染色(染深色)。标度条= 100µm。 [0029] 图11. Leg-NP-CDDO和pNeuTm联合疗法提高抗肿瘤免疫监视和预防乳腺癌复发。(A)肿瘤复发研究的治疗方案的示意图。将小鼠用MMTV-Neu原发性肿瘤细胞(第0天, 黑色虚线箭头)原位攻击，用Leg-NP-CDDO或对照NP (灰色实线箭头)处理，并用pNeuTm 3 或pVector (灰色虚线箭头)接种。在达到~500mm大小(黑色实线箭头)后手术切除原发性肿瘤。4周后，用MMTV-Neu原发性肿瘤细胞在对侧乳房脂肪垫再攻击小鼠(第53天, 黑色虚线箭头)。测量肿瘤尺寸，用于计算肿瘤大小(n=5只小鼠/组)。数据表示均值± 3 s.e.m。(B)当继发性肿瘤达到500mm体积时处死小鼠。在初始肿瘤细胞攻击后128天处死无肿瘤小鼠。将用PBS、Leg-NP或Leg-NP-CDDO处理的pNeuTm接种小鼠的脾细胞与被照射的MMTV-Neu原发性肿瘤细胞培养，通过流式细胞术分析。数据表示均值± s.e.m。 *p<0.05。(C)将Leg-NP-CDDO/pNeuTM处理小鼠的脾细胞与被照射的HEVc或MMTV-Neu原发性肿瘤细胞培养，通过流式细胞术分析。通过蛋白质印迹证实HER-2蛋白质表达。数据表示均值± s.e.m。***p<0.0005。 [0030] 优选实施方案的详述 [0031] 本发明涉及利用结合legumain (天冬酰胺酰基内肽酶)的靶向部分的新的NP靶向策略。本发明提供包含脂质体纳米颗粒的水性分散体的水性肿瘤靶向性脂质体纳米颗粒组合物。纳米颗粒优选包封抗癌化疗剂，可将所述抗癌化疗剂加至预形成的脂质体组合物或者可在脂质体形成期间掺入脂质体中。脂质体纳米颗粒包含与一种或更多种其它形成胶束或小泡的脂质材料混合的legumain靶向性脂质，所述组合物呈纳米颗粒脂质体分散体的形式，优选掺入聚乙二醇-缀合的脂质。优选的脂质体纳米颗粒组合物包含(a) legumain靶向性脂质组分，(b)两性离子脂质组分；(c)氨基取代的脂质组分；(d)中性脂质组分；和(e)聚乙二醇-缀合的脂质组分，例如PEG-脂质体组合物。legumain靶向性脂质组分包含与legumain-结合部分共价连接的疏水脂质部分。 [0032] legumain-结合部分可以是与legumain选择性形成稳定复合物或共价键的任何材料，例如legumain的不可逆性抑制剂，其通常包含对legumain具有亲和力的肽支架比如连接反应性官能团的Ala-Ala-Asn (或Ala-Ala-X，其中X是改性Asn比如氮杂-Asn残基)，例如氮杂-Asn-卤代甲基酮、氮杂-Asn环氧化物和氮杂-Asn迈克尔受体(包含如迈克尔受体的α,β-不饱和羰基部分)。此类氮杂-Asn部分与半胱氨酸残基在legumain活性位点反应以在抑制剂与legumain之间形成共价硫键(sulfide bond)，如显示于图4。 [0033] 优选的靶向部分由式(I)表示： [0034] [0035] 它是合成的氮杂-肽迈克尔受体型legumain抑制剂，包含两个连接改性氮杂-Asn部分的丙氨酸残基，该部分包括在legumain活性位点充当半胱氨酸残基的迈克尔受体的缺电子双键。式(I)表示氮杂-Asn迈克尔受体legumain抑制剂的反应部分，称为RR-11a： [0036] [0037] 其中RR-11a的琥珀酰亚胺基氧基已被磷脂置换。为方便起见，本文在提到legumain靶向性脂质材料时将式(I)结构称为RR-11a。 [0038] 优选的legumain靶向性脂质包含式(II)化合物： [0039] 。 [0040] legumain的细胞表面表达由缺氧应激(实体瘤的标志)驱动，并且与legumain靶向性部分比如RR-11a偶联的聚乙二醇(PEG)-包被脂质体显示高配体-受体亲和力、摄取和优良的肿瘤渗透。抗癌化疗剂，比如多柔比星，通过本发明的RR-11a-缀合的PEG-脂质体组合物递送，导致明显增强的肿瘤选择性、降低的药物敏感性和消除的全身药物毒性。 [0041] 本发明靶向性脂质体组合物的纳米颗粒(NP)载体部分优选包含膜脂比如小泡或其它膜性结构，例如能够包封抗癌化疗剂比如多柔比星的脂质体或胶束。优选的NP包含具有疏水脂质部分和亲水部分的材料，其经排列以使得当材料分散在水性系统中时将形成脂质体或胶束。图1，(a)区说明一种优选的膜脂材料(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺, DOPE)。术语“脂质”指能够形成双层或胶束以便脂质材料的疏水部分朝向双层而亲水部分朝向水相的任何脂肪酸衍生物。亲水特性源自存在磷酸盐、膦酸盐、羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐、巯基、氨基、硝基、羟基或其它类似基团，它们在本领域众所周知。疏水性可通过包含基团而赋予，所述基团包括但不限于至多20个碳原子的长链饱和和不饱和的脂族烃基和被一个或更多个芳基、杂芳基、环烷基和/或杂环基取代的此类基团。优选的脂质是磷酸甘油酯和鞘脂。磷酸甘油酯的代表性实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏含磷基团的化合物，比如鞘脂和鞘糖脂家族，也在指定为脂质的组群内。另外，上文所述两性脂质可与包括甘油三酯和甾醇在内的其它脂质混合。 [0042] legumain抑制剂/肿瘤靶向剂可在任何合适位置与脂质体纳米颗粒连接，例如在直链的末端或在其任何中间位置，只要连接不妨碍肿瘤靶向剂结合至肿瘤表达的legumain。肿瘤靶向剂还可包括，或者提供有任选二价桥连基以便于连接纳米颗粒(如果期望)。 [0043] 本发明的组合物可有益地包封任何抗癌化疗剂(例如抗肿瘤剂)用于靶向递送至表达legumain的肿瘤。此类化疗剂描述于例如Imai和Takaoka, Nat. Rev. Cancer6, 714-726 (2006)，其通过引用完全结合到本文中。此类化疗剂的非限制性实例包括：烷化剂(例如顺铂；卡铂；奥沙利铂；双氯乙基甲胺；环磷酰胺；苯丁酸氮芥；异环磷酰胺)； 嘌呤和嘧啶类似物和衍生物(例如5-氟脲嘧啶；氟尿苷；阿糖胞苷；巯基嘌呤；硫鸟嘌呤； 硫唑嘌呤；氟达拉滨；喷司他丁；克拉屈滨)；拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷；磷酸依托泊苷；替尼泊苷；安吖啶)；紫杉烷类(例如紫杉醇)；抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤；甲氧苄啶，乙胺嘧啶；培美曲塞)；血管生成抑制剂(如vitaxin；anecorvate，血管他丁；内皮他丁；角鲨胺；抗血管生成色氨酰-t-RNA合成酶片段，比如T2-TrpRS)；抗肿瘤单克隆抗体(例如贝伐单抗；tivozanib；凡德他尼(vandetanib)；伐他拉尼(vatalanib)；阿仑单抗；西妥昔单抗；吉姆单抗；替伊莫单抗(ibritumomab)；帕尼单抗(pantitumumab)；利妥昔单抗；托西莫单抗；曲妥单抗)；及其它抗肿瘤或化疗剂，比如细胞毒性抗生素(例如放线菌素；博来霉素；普卡霉素；丝裂霉素)；蒽环类抗生素(例如多柔比星；表柔比星；柔红霉素；戊柔比星；伊达比星)；三萜类Stat3抑制剂(例如熊果酸；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸酯；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸酰胺比如 1-[2-氰基-3-,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-酰基]咪唑(也称为CDDO-Im))； 等，及其生理学上可接受的盐和前药。 [0044] 在一些优选实施方案中，化疗剂是抗肿瘤剂，其为涉及肿瘤生长的受体或受体配体的激动剂或拮抗剂。 [0045] 靶向-脂质体/化疗剂复合物或包含所述复合物的组合物的剂量方案基于几种因素比如患者的年龄、体重、性别和医学病况类型，病况的严重度，给药途径和所用具体靶向分子的结合活性。剂量方案可根据上述因素变化。约0.01毫克至约1000毫克/公斤体重的剂量水平可用于治疗上述医学病况。优选的剂量水平在约0.01毫克至约100毫克/公斤体重范围。 [0046] 对于通过注射给药，将本发明实施方案的靶向-脂质体/化疗剂复合物或包含所述复合物的组合物用药学上可接受的载体比如水、盐水或水性葡萄糖溶液配制。对于注射，典型的日剂量为约0.01毫克至约100毫克/公斤体重，根据上述因素每天作为单剂量或作为多剂量注射。 [0047] 下列非限制性实施例进一步说明本发明的某些方面。 [0048] 实施例1：legumain-靶向性纳米颗粒的配制和表征。 [0049] 纳米颗粒组合物。RR-11a的合成已描述于文献。见例如Ekici, O.D.等, Aza-peptide Michael acceptors: a new class of inhibitors specific for caspases and other clan CD cysteine proteases (氮杂-肽迈克尔受体: 一类新的胱天蛋白酶及其它clan CD半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂). J Med Chem 47, 1889-1892 (2004)或者Ovat, A.等, Aza-peptidyl Michael acceptor and epoxide inhibitors--potent and selective inhibitors of Schistosoma mansoni and Ixodes ricinus legumains (asparaginyl endopeptidases) (氮杂-肽基迈克尔受体和环氧化物抑制剂-曼氏裂体吸虫和蓖子硬蜱legumains (天冬酰胺酰基内肽酶)的有效和选择性抑制剂). J Med Chem 52, 7192-7210 (2009)。使所有磷脂(Avanti Polar Lipids)都溶于氯仿中。为了实现靶向，如下使氮杂-肽的羧酸端改性：将该基团用1-(3-二薄荷基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活，接着与N-羟基琥珀酰亚胺反应以制备NHS-酯。RR-11a由WuXi AppTec Co. Ltd合成。如下产生RR-11a-缀合的NP：首先使RR-11a与1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)以约1:1的摩尔比在三乙胺(TEA)的存在下在环境室温(RT)反应约24小时。然后，将所得化合物与1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DOPC)、DOPE、胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DOPE-PEG)以约1.1:6.7:6.7:2.2:1的摩尔比合并，如前文关于另一种脂质体系统的描述。见：Hood, J.D.等, Tumor regression by targeting gene delivery to the neovasculature (通过基因靶向递送至新血管系统使肿瘤消退). Science 296,2404-2407 (2002)。在ZETASIZER NANO®光散射分析仪(Malvern)上通过动态光散射确定大小分布。 [0050] 将多柔比星负载入纳米颗粒内。如下将多柔比星负载入NP内。简言之，使脂质薄膜在约1 ml无菌磷酸铵缓冲液(300 mM, pH 7.4)中再水化，搅拌最少约1小时，接着声处理以制备SUV。在NAP-10柱(GE Healthcare)上通过凝胶过滤层析用PBS (pH 7.4)更换外部的磷酸铵缓冲液。然后加入多柔比星在水中的10 mM溶液，将混合物在室温孵育过夜。最后，用PBS (pH 7.4)缓冲液作为洗脱液，用NAP-10柱通过凝胶过滤层析纯化掺入多柔比星的脂质体。将负载多柔比星的RR-11a-缀合的脂质体NP组合物命名为RDZ-218。 [0051] 如下实现RR-11a与DOPE的缀合：首先通过用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活氮杂-肽的羧酸端使其改性，接着与N-羟基琥珀酰亚胺反应以制备NHS酯并与DOPE的氨基在氯仿中偶联，使用三乙胺作为催化剂；见图1，(a)区。通过用Glut-1抗体染色并用荧光素-缀合的第二抗体显现来检测肿瘤缺氧。通过DAPI染色使细胞核显现。标度条，100 μm；见图1，(b)区。通过Scatchard分析确定抗小鼠legumain mAb对细胞膜表的达legumain的亲和力；见图1，(c)区。计算对照和CoCl2处理细胞的平均Kd，分别为约1.107±0.232 nM和约1.208±0.107 nM。计算对照和CoCl2处理的细胞的结合位点数，分别为约46,760和约117,800个位点/细胞。在具有红色荧光的DOPE-罗丹明B脂质的存在下配制NP。将鼠4T1和4TO7乳腺癌和CT26结肠癌细胞与约100 µM CoCl2- +培养约24小时，随后将RR-11a (非靶向)或RR-11a (靶向) NP加至细胞内；见图1, (d)区。在指示的时间后，除去NP，立即用荧光显微镜使细胞显像，并且将罗丹明B-阳性细胞百分比定量；n = 3孔/组。数据表示均值± s.e.m。将具有确立的原位4T1乳腺肿瘤的雌性BALB/c小鼠用非靶向或靶向NP注射1次。约24小时后处死小鼠，立即用荧光显微镜分析器官以使NP的分布显像，如通过罗丹明B荧光指示；n = 2只小鼠/组；标度条，100 μm； 见图1，(e)区。 [0052] 实施例2：靶向Legumain增强PEG-脂质体-包封的多柔比星的摄取和改善NP-介导的至原发性乳腺肿瘤的药物递送。 [0053] 动物和细胞系。雌性BALB/c小鼠购自Scripps研究所啮齿动物培育机构(The Scripps Research Institute Rodent Breeding Facility)。所有动物实验都按照NIH关于实验动物的护理和使用(Care and Use of Laboratory animals)的指南进行，经过Scripps研究所动物护理委员会(The Scripps Research Institute Animal Care Committee)批准。4T1和4TO7鼠乳腺癌细胞系由Suzanne Ostrand-Rosenberg (University of Maryland, College Park, Maryland, USA)提供。CT26鼠结肠癌细胞购自ATCC。 [0054] 结合研究和Scatchard分析。将抗小鼠legumain抗体(约40 μg) (R&D Systems)在冰上在用约100 μg IODO-GEN®试剂(Pierce Chemical Co.)包被的聚苯乙烯管中与125 约0.5 mCi I (Amersham)孵育约30分钟(m)。在PD-10柱(GE Healthcare)上通过凝 125 5 胶过滤除去未掺入的 I。将4T1细胞(5×10)与或不与100 μM CoCl2培养约24小时 125 (h)，接着与约14 nM连续稀释的约4 μC I-标记抗体孵育约2小时。用含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS将细胞洗涤3次，在a-闪烁计数器中确定结合的放射性标记的量。对应的每分钟计数(CPM)用于用PRISM®软件(GraphPad)进行Scatchard绘图分析，用于计算legumain结合位点的数目。 [0055] 体外纳米颗粒摄取。将肿瘤细胞以约0.3×106个细胞/孔接种在6孔板中。在添加NP之前约24小时，将细胞用100 μM氯化钴处理以刺激缺氧。将RR-11a-缀合的或无RR-11a的NP (无或负载0.2 nM多柔比星(Sigma))加至细胞，孵育约15和30分钟或者约1、2、3、4和6小时，然后将这些细胞用PBS洗涤，用10%福尔马林锌(Fisher Scientific)固定，立即通过荧光显微镜分析以使多柔比星摄取显影。为了通过流式细胞术分析，除去NP后使细胞经受胰蛋白酶作用，再悬浮于FACS缓冲液中，立即分析平均荧光强度。 [0056] 生物分布测定。对荷有大小约500 mm3的4TO7原位肿瘤的小鼠i.v.注射单剂量-用罗丹明B标记的RR-11a-缀合的NP (RR-11a+)或无RR-11a的NP (RR-11a)。或者对小鼠以约48小时间隔注射3次RDZ-218、NP-Dox、游离Dox或PBS。最终处理后约24小时，将动物处死，收集脾、肾、肺、肝、心和肿瘤，冷冻在OCT化合物(Tissue-Tek)中，立即切片，通过荧光显微镜成像。 [0057] 统计学分析。用PRISM®软件(GraphPad)通过双尾学生t检验确定实验组与对照之间差异结果的统计学显著性。如果P<0.05则将结果视为具有显著性。 [0058] 用磷酸盐梯度将多柔比星负载入RR-11a+ NP内以产生RDZ-218。还将多柔比星负-载入RR-11a NP (NP-Dox)内作为对照。如图2, (a)区说明，将4T1和4TO7细胞与CoCl2培养约24小时，然后与RDZ-218、NP-Dox或游离Dox孵育指示的时间，接着通过流式细胞术分析以确定多柔比星的平均荧光强度(MFI)；对于各时间点n = 3孔/组。数据表示均值± s.e.m。通过比较RDZ-218、NP-Dox和游离Dox-处理的细胞的MFI与连续稀释的多柔比星的MFI确定药物摄取浓度的百分比；见图2，(b)区。通过分析流式细胞术的前向和侧向+ 散点图确定用RDZ-218、NP-Dox、游离Dox、游离RR-11a或空RR-11a NP (NP-RR-11a)处理后约24小时死亡4T1和4TO7细胞的相对百分比；见图2，(c)区。显示相对于未处理细胞(对照)的数据；n = 3孔/组。数据表示均值± s.e.m。*p<0.05, **p<0.005。将4TO7 3 细胞注入雌性BALB/c小鼠的腹股沟乳房脂肪垫。让肿瘤建立约5天，达到约500 mm大小，随后将RDZ-218、NP-Dox或游离Dox i.v.注射(2次)给小鼠。最后一次注射后约24小时处死小鼠，将组织分离，立即用荧光显微镜分析以检测多柔比星的分布；见图2，(d)区。组织切片还用DAPI染色以使细胞核显现；n = 2只小鼠/组；标度条，100 µm。 [0059] 实施例3：用RDZ-218治疗性处理小鼠导致完全阻遏原发性乳腺肿瘤生长且无毒性。 [0060] 在雌性BALB/c小鼠的胸部乳房脂肪垫注射约1×105个4TO7细胞。在肿瘤细胞攻击后约7天，以3天间隔将RDZ-218、NP-Dox、游离Dox (全都为约1 mg/kg Dox)或盐水i.v.注射(5次)给小鼠。每次处理当天都用测微计测量肿瘤尺寸并用于计算肿瘤大小。最终处理后约24小时处死小鼠。确定体重和肿瘤重量两者，对组织进行组织学分析。根据制造商的方案进行TUNEL (Promega)染色。 [0061] 对雌性BALB/c小鼠原位注射4TO7肿瘤细胞，让肿瘤建立约7天，然后处理。以3+天间隔将RDZ-218、NP-Dox、游离多柔比星(游离Dox)、空RR-11a NP (NP-RR-11a)或盐水(PBS) i.v.注射(5次)给小鼠。数据点表示处理天数；n = 5只小鼠/组。在每次处理当天，用测微计测量肿瘤尺寸，用于计算肿瘤大小；见图3，(a)区。数据表示均值± s.e.m。 在第5次注射后约1天处死小鼠，采集原发性肿瘤的图像，然后解剖；见图3，(b)区。图像是每组的代表。还测量原发性肿瘤的湿重；见图3，(c)区。数据表示均值± s.e.m；*p<0.05。 将肿瘤切片用TUNEL染色以使凋亡肿瘤细胞显影并对凋亡肿瘤细胞百分比进行量化；n = 5个视野/切片；见图3, (d)区。数据表示均值± s.e.m；***p<0.0005。从处死时总体重减去原发性肿瘤重量并与肿瘤细胞攻击之前的体重比较以确定体重改变；见图3，(e)区。 数据表示均值± s.e.m。将对照组与RDZ-218处理组比较，**p = 0.0029, ***p < 0.001。 [0062] 实施例4：毒性评估。 [0063] 以约24小时间隔将游离多柔比星、NP-Dox或RDZ-218 i.v.注射(连续5次)给3 荷有大小约500 mm的原位4TO7肿瘤的雌性BALB/c小鼠。所有组的多柔比星剂量都是5 mg/kg。 [0064] RDZ-218显示无体内毒性，与现有技术的游离和PEG-脂质体-包封的多柔比星相对。用4TO7乳腺肿瘤细胞原位注射雌性BALB/c小鼠。让肿瘤建立，在处理之前达到约5003 + mm大小。将游离多柔比星(游离Dox)、天然(NP-dox)或RR-11a PEG-脂质体-包封的多柔比星(RDZ-218) i.v.注射(5次)给小鼠。所有各组都给予约5 mg/kg在200 μl PBS中的多柔比星；n = 5只小鼠/组。结果显示于表1；分数表示每次处理后总数5中存活小鼠的数目。 [0065] 表1. 在处理的小鼠中RDZ-218的毒性研究 [0066] [0067] 讨论 [0068] 本发明证明通过使PEG-脂质体NP缀合至legumain的小分子(451 M.W.)抑制剂RR-11a (来自一类氮杂-Asn迈克尔受体抑制剂)实现配体靶向；见图1，(a)区。将RR-11a设计为具有clan CD特异性序列，因此对clan CD蛋白酶比如legumain具有高度特异性，其以纳摩尔范围(IC50 = 31-55 nM)的IC50值不可逆地抑制。重要的是，RR-11a与包括胱天蛋白酶、梭菌蛋白酶或牙龈蛋白酶K在内的其它相关蛋白酶不相互作用，并且对体内蛋白酶切割具有抗性。RR-11a抑制legumain的机制涉及催化性半胱氨酸残基对迈克尔受体双键在C2的亲核攻击，形成不可逆地抑制这种天冬酰胺酰基内肽酶的共价键；见图4, (a)区。在使用本发明的组合物时，使RR-11a偶联的NP共价结合至legumain导致整个脂质体复合物附着于受体从而不可逆地内化。提出的这种机制得到NMR研究支持，并且是相关的，因为高结合亲和力将改善NP靶向。RR-11a与NP的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)组分的偶联通过与三乙胺(TEA)的反应实现，细节如描述于Material and +Methods；见图1，(a)区。通过动态光散射分析RR-11a偶联的PEG-脂质体(RR-11a)或天- 然PEG-脂质体(RR-11a) NP分别显示约150和110 nm的均匀大小分布(数据未显示)。 [0069] Legumain为肿瘤靶向提供优良的操作(handle)，因为它在物种之间高度保守，且在人与小鼠legumain蛋白之间具有约83%同源性，并且在大部分人实体瘤中过度表达。因此，蛋白质印迹分析在多种鼠癌细胞系和鼠原发性乳腺肿瘤中证实legumain蛋白表达，由此证实先前的报道。虽然细胞内legumain遍在表达，但在细胞表面上的legumain表达在响应于微环境诱导的细胞应激比如血清饥饿时出现。重要的是，legumain的细胞表面表达通过缺氧应激(实体瘤的标志)而增强，其存在于我们的原位小鼠乳腺癌模型中，如通过Glut-1 (一种已建立的缺氧诱导型蛋白)的肿瘤表达确定；见图1，(b)区。另外，多种鼠癌细胞系的体外免疫组化分析表明缺氧应激诱导legumain的细胞表面表达(数据未显示)。 [0070] 配体靶向的效率部分取决于靶受体的丰富度，并且通过其在靶细胞上的过度表达(相对于正常细胞)而最大化。因此，配体靶向的限制是靶细胞表面受体的数量，这决定125 可在肿瘤位点特异性结合的靶向化合物的分子数。因此，我们用 I-标记的抗-legumain抗体通过结合研究和Scatchard绘图分析量化每个肿瘤细胞的legumain结合位点数。我们计算在正常氧张力下，legumain结合位点数为约46,760，而在缺氧条件下数量增加至约 117,800位点/细胞；见图1，(c)区。缺氧诱导肿瘤细胞表面legumain结合位点数目增加约3倍的事实在生物学上是相关的，因为缺氧是实体瘤微环境的标志，所以使得靶向系统不依赖于肿瘤的任何单一遗传特性。因此，本文所述靶向策略应当不受限于通常在实体瘤中观察到的遗传异质性。 [0071] 为了评估RR-11a偶联增强PEG-脂质体NP被肿瘤细胞体外摄取的程度，将经受缺氧应激的鼠乳腺癌(4T1和4TO7)和结肠癌(CT26)细胞在不同时间点与用荧光染料罗丹明+ -B标记的RR-11a或RR-11a NP孵育。荧光显微镜分析显示在所有测试时间点在所有三种- + 细胞系，与RR-11a NP相比，RR-11a NP的摄取明显增强；见图1, (d)区。通过将这些相 3 同颗粒i.v.注入荷有大小约500 mm的原位4T1乳腺肿瘤的雌性BALB/c小鼠来确定体内- 靶向的效率。这些动物肿瘤和组织的荧光显微术显示当与RR-11a NP相比时，归巢至原发+ 性肿瘤的RR-11a NP明显增加，并且包括肝、脾和肾在内的网状内皮系统(RES)器官的非+ 特异性积累减少；见图1，(e)区。意外的是，在肝脏观察到RR-11a NP积累明显增加是显著的，因为这种RES器官已被鉴定为非靶向PEG-脂质体NP的主要吸收池(sink)，这可导致肝毒性。总之，这些令人惊奇的数据表明RR-11a与PEG-脂质体NP的偶联增强其在缺氧应激下被肿瘤细胞摄取和有效增加NP归巢至原发性肿瘤同时减少在RES器官的积累。 [0072] 有效的配体介导的NP药物递送的重要因素不仅是它们携带最佳有效负载至期望靶细胞的能力，而且是递送之后有效释放这种有效负载的能力。为了精密评估这些参数，将通常用于治疗乳腺癌的化疗药物多柔比星经由磷酸铵梯度负载入NP内，如前文描述。然后将在缺氧应激下的鼠乳腺肿瘤细胞(4T1和4TO7)在不同时间点与游离多柔比星(游离- +Dox)或多柔比星-负载的RR-11a (NP-Dox)或RR-11a (RDZ-218) NP孵育，并且立即通过流式细胞术分析以量化被细胞内化的多柔比星的平均荧光强度(MFI)。当与用NP-Dox处理的细胞比较时，RDZ-218处理的细胞显示增强的多柔比星摄取；见图2，(a)区。令人惊奇的是，用RDZ-218处理不仅导致随着时间推移比NP-Dox更迅速的药物摄取，而且增加至多约16倍的摄取程度，且RDZ-218摄取的速率类似于游离Dox摄取的速率；见图2，(a)区。 通过比较用连续稀释的游离多柔比星处理的细胞而产生的MFI与用NP包封的多柔比星处理的细胞而产生的MFI，我们惊奇地观察到在处理约4小时内接近100% RDZ-218 NP被细胞摄取；见图2，(b)区。另外，与游离Dox比较，RDZ-218的立即和迅速摄取表明配体-受体-介导的内化，并且当与非靶向NP-Dox比较时为优良的。 [0073] 接着，通过比较处理后约24小时死亡肿瘤细胞的百分比，用流式细胞术体外确定RDZ-218的多柔比星生物活性；见图2，(c)区。用RDZ-218处理的细胞显示与对照或NP-Dox处理的细胞比较，死亡细胞的百分比增加3至15倍。有趣的是，RDZ-218的这种细胞毒性+作用优于游离Dox。重要的是，在用游离RR-11a或空RR-11a NP处理的细胞中未观察到细胞毒性作用，表明用RDZ-218观察到细胞毒性增强是因为NP-介导的多柔比星摄取增加，而不是因为RR-11a对肿瘤细胞的任何legumain抑制作用。总而言之，这些结果证明RDZ-218增强将生物学上有效的药物有效负载递送至体外肿瘤细胞。 [0074] 配体-靶向的NP递送的主要治疗目的是将因NP在RES器官的非特异性积累而发生的不期望的全身药物毒性减至最小，同时仍然能够将生物学上有效剂量的药物递送至靶细胞。但是，将NP用于药物递送的一个问题是NP比药物分子相对大，因此与小分子质量药物或抗体比较将较不可能渗透血管壁而进入肿瘤细胞。因此，为了测试RDZ-218将药物有效负载有效和特异性递送至治疗环境的靶组织的能力，以约48小时间隔将RDZ-218、3 NP-Dox或游离Dox i.v.注射(2次)给具有已建立的大小约500 mm乳腺肿瘤的小鼠。最后一次注射后约24小时显微镜分析肿瘤显示在RDZ-218处理的动物的肿瘤中强烈和广泛散布的多柔比星荧光；见图2，(d)区。相比之下，在用NP-Dox或游离Dox处理的小鼠的肿瘤中多柔比星荧光明显减少或呈点状；见图2，(d)区。令人惊奇的是，当分别与NP-Dox和游离Dox处理的小鼠比较时，只有用RDZ-218处理的小鼠显示肝脏和心脏内多柔比星荧光明显减少；见图2，(d)区。多柔比星在心脏的积累减少特别重要，因为心脏毒性是多柔比+ 星疗法的剂量限制因素。这些结果清楚地表明RDZ-218具有渗透肿瘤的能力，并且RR-11a NP可实现将药物有效负载特异性递送至体内实体瘤，同时减少药物在周围器官比如肝脏和心脏的非特异性积累。 [0075] 通过以3天间隔对已建立乳腺肿瘤的小鼠i.v.注射(5次) RDZ-218、NP-Dox、空+ +RR-11a NP (NP-RR-11a)、游离Dox或盐水，评估RR-11a NP将多柔比星有效负载递送至小鼠的治疗功效。用测微计测定肿瘤大小显示与盐水处理的动物比较，单独RDZ-218处理基本消除肿瘤生长，但对照组只延缓肿瘤生长；见图3，(a)区。肿瘤细胞攻击后3周，大体检查用RDZ-218处理的小鼠的原发性肿瘤显示只有初步的肿瘤结节，而对照小鼠具有大小约 3 500 mm或更大的大肿瘤块；见图3；(b)区。与对照相比，用RDZ-218处理导致肿瘤重量下降约8至12倍；见图3；(c)区。一致地，RDZ-218处理的小鼠的肿瘤切片的TUNEL免疫组化分析显示凋亡细胞的百分比增加9至35倍(当与对照动物的肿瘤比较时)；见图3，(d)区。意想不到的是，用RDZ-218处理的小鼠在研究过程中未显示任何体重损失，表明毒性减少；见图3，(3)区。 [0076] 为了证实RDZ-218这种减少的毒性，在荷瘤小鼠中进行毒性研究：通过在约5天的过程内，对所有各组以约5 mg/kg多柔比星每天给予单剂量的游离Dox、NP-Dox或RDZ-218 (表1)。在第5天最后处理后只有RDZ-218处理组的所有动物都存活。相比之下，以约5 mg/kg给予的游离Dox致死，并且该组的所有测试动物都是在首次处理后立即死亡。比较起来，非靶向NP-Dox处理组在所有5次处理完成后只有1只动物存活，且在第2次和第3次处理后在5只动物中有4只观察到致死毒性。这些意想不到的结果证实PEG-脂质体的RR-11a-介导的配体靶向减少多柔比星在非靶器官中的非特异性积累，从而消除致死的全身毒性。 [0077] 实施例5：Legumain靶向性NP包封的CDDO-Im。 [0078] 通过利用CDDO-Im的物理特性，即其疏水性和与胆固醇的化学类似性，将CDDO-Im掺入NP，以确保在脂质薄膜再水化时CDDO-Im自发掺入脂质双层内。将0.6摩尔比的CDDO-Im加入摩尔比分别为6.7:6.7:2.2:1:1.1的DOPE:DOPC:胆固醇:DOPE-PEG:DOPE-RR11a内，导致有效负载CDDO-Im。通过UV光谱术分析游离CDDO-Im和包封的CDDO-Im(在NP破裂而释放后)表明约45微摩尔/L CDDO-Im的负载浓度，这比有效Stat3抑制需要的100 nmol/L剂量更浓(约450倍)。通过动态光散射和TEM分析NP显示约100 nm的最佳平均NP直径和接近0的ζ电位(见图5 A-D)。 [0079] 实施例6：包封的CDDO-Im的体内评估。 [0080] 材料。已验证的4TO7/4T1鼠乳腺癌细胞由Suzanne Ostrand-Rosenberg (University of Maryland, College Park, MD)提供，保持在补充10% FBS、1% HEPES、1%碳酸氢钠和1%丙酮酸钠的RPMI-1640培养基(Gibco, Carlsbad, CA, USA)中。通过在Balb/c小鼠中体内生长/转移，通过IL-6和S100A8/A9表达，并且具有6-硫鸟嘌呤抗性，验证细胞系。用MycoALERT (2008, Lonza, Basel, Switzerland)针对支原体测试细胞，为阴性。MMTV-Neu原发性肿瘤由Michael Karin (University of California, San Diego, CA, USA)提供，通过连续传代保持在同源FVB/NJ小鼠中。简言之，将MMTV-Neu原发性肿瘤切碎，在无菌条件下用3型胶原酶(Worthington, Lakewood, NJ, USA)在补充2.5% FBS和6 10mM Hepes的RPMI-1640培养基中消化。使1×10个细胞再悬浮于PBS中，并注入同源雌 3 性FVB/NJ小鼠的乳房脂肪垫。一旦原发性肿瘤达到约500mm的大小则重复该程序一次。 [0081] 蛋白质印迹。如前文描述制备蛋白质提取物。用下列抗体探测蛋白质印迹：兔-抗-磷酸-STAT-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)，山羊-抗-β-肌动蛋白、IL-6和IL-10，兔-抗-磷酸-STAT-1、STAT-3、IL-2、Bcl-xL、Bcl-2和TGF-β，大鼠-抗-IL-12b、GM-CSF和IFN-γ，和小鼠-抗-IL-15 (所有均来自Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)和抗-ERBB2 (Abcam, Cambridge, MA, USA)。用ImageJ软件量化蛋白质带强度并标准化至β-肌动蛋白。 [0082] 体内肿瘤研究。将4TO7 (5×103)细胞或MMTV-Neu (1×104)原发性肿瘤细胞分13 别原位注入雌性BALB/c或FVB/NJ小鼠。i.v.给予在200µl PBS中的NP (约1.36×10 2 个颗粒)，用数字测微计测量肿瘤尺寸。用式[(a×b)/2]计算肿瘤体积，其中‘a’是两个垂直直径中较大者。关于复发研究，通过手术切除原发性肿瘤，并且在对侧乳房脂肪垫再次原位攻击小鼠。用由pNeuTm (由Wei-Zen Wei, Karmanos Cancer Center, Detroit, MI, 8 USA提供)或空载体转导的减毒鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimuirum) (1×10 CFU/只小鼠)通过管饲法以1周间隔口服接种小鼠3次。 [0083] 流式细胞术。将脾细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞分离，并且与抗小鼠CD8、CD25、6 CD14、CD11c、CD11b、CD80、CD45、F4/80的荧光素-缀合抗体(0.25µg抗体/10个细胞在 100µl体积中) (Biolegend, San Diego, CA USA)和/或粒酶B (Granzyme B) (0.125µg 6 6 抗体/10个细胞在100µl体积中) (eBioscience, San Diego, CA, USA)孵育(1×10 个细胞/管)。将数据收集在数字LSR-II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)上，用FlowJo软件(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)分析。 [0084] 免疫组化。将固定在丙酮中的肿瘤切片用下列第一抗体染色：大鼠抗-小鼠F4/80 (1:50稀释液, AbD Serotec, Raleigh, NC, USA)和兔抗-小鼠Nos2 (1:50稀释液, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)，并且分别用下列第二抗体检测：山羊抗-大鼠IgG Alexa Fluor 568或山羊抗-兔IgG Alexa Fluor 488 (两者都是1:200稀释液, Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)。关于染色对照，将组织切片仅用第二抗体孵育。细胞核用DAPI-二乳酸化物(dilactate) (Sigma, St. Louis, MO, USA)染色。 [0085] CDDO-Im抑制鼠乳腺癌细胞中STAT-3活化。通过将4T1肿瘤细胞与IL-6孵育并增加游离CDDO-Im的浓度来评估CDDO-Im抑制鼠乳腺癌细胞中IL-6诱导STAT-3活化的能力。蛋白质印迹分析表明CDDO-Im以100nM-1μM浓度阻断STAT-3磷酸化和阻遏总STAT-3蛋白的表达(图6A)。通过将IL-6刺激的4TO7肿瘤细胞与空的靶向NP (Leg-NP)、非-靶向(NP-CDDO)或负载CDDO-Im的靶向(Leg-NP-CDDO) NP，或者游离CDDO-Im孵育，证实包封的CDDO-Im抑制STAT-3活化的能力。蛋白质印迹分析显示包封的CDDO-Im阻断STAT-3磷酸化以及游离CDDO-Im (图6B)。重要的是，用Leg-NP处理的细胞不显示STAT-3磷酸化的抑制，从而证明抑制只是因为CDDO-Im而并非NP的任何非特异性作用(图6B)。 [0086] 最后，测试在治疗环境下Leg-NP将CDDO-Im有效负载递送至MMTV-Neu原发性肿瘤的能力。为此，用盐水(PBS)、Leg-NP或Leg-NP-CDDO以3天间隔i.v.注射(8次)荷有原位乳腺肿瘤的小鼠。在最后一次注射后1天获得的MMTV-Neu原发性肿瘤蛋白提取物的蛋白质印迹分析显示Leg-NP-CDDO有效地抑制原发性肿瘤中的STAT-3磷酸化(图6C)。总之，这些数据证明CDDO-Im抑制鼠乳腺癌细胞中的STAT-3磷酸化。另外，该研究证明成功地将CDDO-Im包封入脂质体NP内用于靶向递送至TME和有效地治疗性抑制体内STAT-3磷酸化。 [0087] Leg-NP-CDDO阻遏鼠乳腺肿瘤的生长。为了评估Leg-NP-CDDO的体内作用，用约3 5×10个4TO7肿瘤细胞原位攻击BALB/c小鼠，4天后，通过8次i.v.注射Leg-NP-CDDO或对照对其进行处理(图7A)。与对照相比，Leg-NP-CDDO明显阻遏原发性肿瘤生长(图7B)。 重要的是，与Leg-NP-CDDO相比，用游离CDDO-Im或包封在非靶向颗粒中的CDDO-Im的处理在阻遏肿瘤生长方面的有效性明显较低。另外，与未处理的对照相比，用Leg-NP-CDDO处理的小鼠显示肿瘤负荷明显下降(图7C)。 [0088] 但是，与原发性肿瘤细胞相比，已经长期离体培养的已建立的肿瘤细胞系比如4TO7，可能获得可影响其治疗反应的基因和表型改变。因此，为了精确评估Leg-NP-CDDO的功效，对具有从MMTV-Neu原发性细胞衍生的原位肿瘤的小鼠进行处理：8次i.v.注射Leg-NP-CDDO、Leg-NP或PBS (图8A)。计算肿瘤体积揭示用Leg-NP-CDDO处理的小鼠的肿瘤大小比对照只显示最低限度的减小(图8B)，尽管肿瘤负荷明显减小(图8C)。因此，与从4TO7细胞系衍生的肿瘤相比，Leg-NP-CDDO在阻遏原发性肿瘤细胞体内生长方面的有效性明显较差。 [0089] Leg-NP-CDDO调节原发性肿瘤中细胞因子和生长因子表达。STAT-3信号传导通过调节TME中肿瘤细胞及其它细胞(包括巨噬细胞)的细胞因子和生长因子表达，而介导肿瘤相关的体内免疫抑制。因此，为了评估Leg-NP-CDDO对这些因子表达水平的作用，将来源于小鼠原发性肿瘤的全部细胞提取物用Leg-NP-CDDO、Leg-NP或PBS处理。蛋白质印迹分析显示，与对照相比，用Leg-NP-CDDO处理的小鼠中pSTAT-1 (715倍)、IL-15 (37倍)、IL-12b (9倍)、IFN-γ24倍)和GM-CSF (6倍)蛋白质表达明显上调(图9A)。相反，在Leg-NP-CDDO处理的小鼠的原发性肿瘤中IL-6、IL-10和TGF-β的蛋白质表达显示2至5倍的下降(图9B)。Leg-NP-CDDO处理还下调抗凋亡蛋白Bcl-XL (8倍)和Bcl-2 (1.4倍)的表达(图9C)。有趣的是，这些结果表明Leg-NP-CDDO疗法导致TME的Th1细胞因子极化。 [0090] 在Leg-NP-CDDO处理的小鼠的原发性肿瘤中抗原递呈细胞和CD8+ T细胞增加。由肿瘤募集的免疫细胞取决于它们从TME接受Th1或Th2极化信号而分泌不同的细胞因子和生长因子。因此，在细胞因子表达中观察到的Th1转变表明在肿瘤中免疫细胞环境的改变可能也明显。为了评估这种假设，将来源于小鼠的原发性肿瘤的活的单细胞悬液用+ Leg-NP-CDDO、Leg-NP或PBS处理，并通过流式细胞术分析以检测活化的CD8 T细胞、DC和+ + 巨噬细胞(图10 A-C)。与PBS对照相比，用NP-Leg-CDDO处理的小鼠显示CD8/CD25 T细+ + 胞增加4.6倍(图10A)。另外，Leg-NP-CDDO处理的小鼠揭示在巨噬细胞(CD45/F4/80) + + + + (图10B)和DC (CD14/CD11c和CD80 /CD11b) (图10C)中分别增加5.6和2倍。 [0091] 巨噬细胞取决于其活化和极化方式对免疫功能和肿瘤生长具有非常不同的作用。“经典活化的”M1巨噬细胞通常显示与抗肿瘤免疫反应相关的NOS2高表达。相比之下，“交替活化的”M2巨噬细胞不表达NOS2，通常与免疫抑制和促肿瘤(pro-tumor)反应相关。因此，研究Leg-NP-CDDO处理的小鼠的原发性肿瘤中巨噬细胞是对应于M1还是M2。为此，肿瘤+ + 的免疫组化和荧光显微术分析揭示来源于Leg-NP-CDDO处理的小鼠的肿瘤中F4/80/Nos2- + 阳性细胞明显增加(图10D)，而对照肿瘤显示主要为NOS2的加强的F4/80 染色(图10D)。 这些发现表明肿瘤浸润巨噬细胞的M1极化是Leg-NP-CDDO处理的结果。 [0092] 联合疗法改善Her-2 DNA疫苗的抗肿瘤作用。本发现表明用Leg-NP-CDDO的处理阻断TME-介导的免疫抑制。而且，基于细胞因子表达概况和免疫效应细胞浸润，免疫TME4 显得被充分引发(primed)用于抗肿瘤反应。将FVB/NJ小鼠用约1×10个MMTV-Neu原发性肿瘤细胞原位攻击，并用Leg-NP-CDDO和抗HER-2胞外域的DNA疫苗(pNeuTM) (FIG. 11A)的组合处理。或者，亦用空的靶向NP (Leg-NP)或对照疫苗(pVector)处理小鼠。在 3 4 达到500mm体积后通过手术切除原发性肿瘤，恢复4周后，在对侧脂肪垫用约1×10 个MMTV-Neu原发性肿瘤细胞再攻击小鼠用于实验性复发。与对照相比，在用Leg-NP-CDDO/pNeuTm联合疗法处理的小鼠中肿瘤复发被明显阻遏，并导致40% (2/5)小鼠完全肿瘤排斥(图11A)。相比之下，接种pNeuTm疫苗或仅用Leg-NP-CDDO处理并不防止肿瘤复发。这些结果表明联合疗法介导的针对肿瘤复发的防护是因为Leg-NP-CDDO，其中Th1引发免疫TME，从而改善pNeuTm疫苗接种后的抗肿瘤免疫反应。 [0093] 将pNeuTm疫苗接种的小鼠的脾细胞，联合Leg-NP-CDDO、Leg-NP或PBS，与被照射的MMTV-Neu原发性肿瘤细胞培养，并通过流式细胞术测量其CTL反应。结果显示用+ +Leg-NP-CDDO处理的pNeuTM疫苗接种小鼠的CD8/粒酶B脾细胞百分比比对照增加2.3倍(图11B)。另外，为了评估CTL反应的这种提高是否为肿瘤细胞特异性的，将Leg-NP-CDDO/高 pNeuTm处理小鼠的脾细胞与HER-2 MMTV-Neu肿瘤细胞培养时的CTL反应相对于与HER-2低 HEVc小鼠内皮细胞培养时的CTL反应比较(图11C)。这些脾细胞的流式细胞术分析揭高 + + 低 示响应于HER-2 细胞的CD8/粒酶B细胞百分比增加4倍(相对于HER-2 细胞) (图 11C)，从而证明用联合疗法处理的小鼠的免疫反应的确为肿瘤抗原特异性的。 [0094] 讨论 [0095] 在Leg-NP-CDDO处理的小鼠的肿瘤中CD8+ T细胞增加与IL-15 (有效的T细胞化+学吸引剂)表达的明显增加相关。重要的是，IL-15刺激体外幼稚人和记忆CD8 T细胞的Th1 T细胞分化和增殖。显然，这些发现符合如下观察：在TME中增加的IL-15表达与改善+ 的CD8 T细胞功能相关是用Leg-NP-CDDO抑制STAT-3的结果。 [0096] 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是实体瘤中最常见的免疫细胞。TAM通过细胞因子释放介导促肿瘤炎症，促使炎性细胞(24)进一步募集。一致地，这里我们发现在原发性肿瘤中IL-10和TGF-β (据报道两者都可诱导TAM的促癌M2表型)的蛋白表达下降。相比之下，由IFN-γ活化的巨噬细胞具备肿瘤破坏相关的表型。这些M1巨噬细胞部分特征在于NOS-2+的表达。有趣的是，观察到，在用Leg-NP-CDDO处理的小鼠的原发性肿瘤中NOS-2巨噬细胞的浸润增加，这对应于原发性肿瘤中GM-CSF的表达增加。重要的是，显示GM-CSF诱导增强的专职抗原递呈细胞(包括DC和巨噬细胞)的募集。 [0097] 本结果证明用Leg-NP-CDDO联合HER-2 DNA疫苗(pNeuTm)靶向操控免疫TME基+本上预防了小鼠肿瘤模型中乳腺癌复发。联合疗法还明显改善CD8 T细胞的抗肿瘤CTL反应，当与单独接受单一疗法的小鼠相比时。另外，用联合疗法处理的小鼠显示特异性针对原- 发性肿瘤细胞而并非HER-2内皮细胞的CTL反应增强，从而证明肿瘤抗原特异性的免疫反+ 应。重要的是，联合疗法延缓用HER-2原发性肿瘤细胞再攻击后的肿瘤生长，防止40%小鼠复发。这些结果清楚地证明免疫TME的治疗性操控可改善癌症免疫疗法的功效。 [0098] 总而言之，本文所述结果与几项I/II期临床试验的发现一致，显示单一细胞因子疗法的效果有限，这强烈强调需要多种细胞因子的联合疗法和特异性靶向。重要地，本文的发现代表新的靶向治疗方法以操控TME中免疫细胞因子和生长因子的主要组成成分(major repertoire)。重要的是，通过特异性靶向免疫操控TME中的Th1/Th2转变，可防止许多免疫刺激性细胞因子的严重的全身毒性，同时利用它们的免疫促进作用。通过改善癌症疫苗疗法的抗肿瘤作用和预防癌症复发，Leg-NP-CDDO代表可最终改善癌症免疫疗法的功效以增加癌症患者的寿命和健康的潜在有用的治疗化合物。 [0099] 总之，已开发能够将药物有效负载非常有效地递送至体内实体瘤的新的legumain-靶向性PEG-脂质体NP。与RR-11a偶联明显增强缺氧应激(实体瘤的标志)下肿瘤细胞对NP的摄取，因为肿瘤细胞表面上legumain结合位点的数量明显增加。这种现+象，结合RR-11a对legumain的高度结合亲和力，便于在治疗环境中药物负载的RR-11a NP特异性归巢至实体瘤，减少在肝脏和心脏的非特异性积累，从而消除不期望的药物毒性。重+ 要的是，通过RR-11a NP递送药物不仅消除致死剂量的多柔比星的毒性，还增加肿瘤对低剂量多柔比星的敏感度，从而减少实现有效的抗肿瘤反应需要的药物量。 [0100] 肿瘤微环境(TME)介导免疫抑制，导致肿瘤细胞逃避免疫监视和癌症疫苗失效。免疫抑制由STAT-3转录因子介导，这加强在肿瘤和免疫细胞中的信号传导。因为免疫抑制仍旧是癌症疫苗功效的主要抑制剂，我们在本研究中检验将合成的STAT-3抑制剂治疗+ 性靶向递送至TME，联合HER-2 DNA疫苗，是否可改善针对HER-2乳腺癌的免疫监视和预防其复发。本发明包封CDDO-Im有效负载的配体-靶向性纳米颗粒(NP)能够特异性递送至TME，这证明在原发性肿瘤中有效地治疗性抑制STAT-3活化。此外，用这些NP处理导致引发免疫TME，特征在于增加的IFN-γ、pSTAT-1、GM-CSF、IL-2、IL-15和IL-12b以及减少+ 的TGF-β、IL-6和IL-10蛋白质表达。另外，观察到活化的CD8 T细胞、M1巨噬细胞和树突状细胞对肿瘤的浸润明显增加。这些改变与原位4TO7乳腺肿瘤的生长延缓相关，当联合+ HER-2 DNA疫苗时，预防免疫活性小鼠中HER-2原发性肿瘤复发。此外，在从用这种联合疗法处理的小鼠分离的脾细胞中抗肿瘤T细胞反应增强。总之，这些数据证明通过改善针对肿瘤特异性抗原的免疫监视有效防护癌症复发。 [0101] 本发明的肿瘤靶向性NP具有重要的临床应用，因为用于包封多柔比星和CDDO-Im+的RR-11a NP还可用于包封其它药物化合物，包括药物组合比如多柔比星和紫杉烷类，这将实际上消除它们的药代动力学差异。这项技术推进目前药物递送和化疗的状态，提供减少抗肿瘤作用所需生物学最佳药物剂量的方式，同时消除不期望的全身毒性，这可明显改善癌症患者的健康和生活质量。 |
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