발효유 성분을 갖는 가공 치즈 및 제조 방법

발효유 성분을 갖는 가공 치즈 및 제조 방법{Processed cheese with cultured dairy components and method of manufacturing}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 그의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 2012년 08월 22자로 출원된 미국 임시출원 제61/692,129호의 이익을 주장한다.

서열 목록의 제출

본 출원과 연관된 서열 목록은 EFS-Web을 통해 전자적 형태로 제출되고, 그에 의하여 그의 전체가 본 명세서에 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 "Sequence Listing 1410.131457"이다. 텍스트 파일의 크기는 46KB이고, 텍스트 파일은 2013년 08월 21일자로 생성되었다.

본 출원은 일반적으로 가공 치즈 조성물 및 제조 방법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 발효유 성분을 포함하는 가공 치즈 조성물에 관한 것이다.

슬라이스 및 덩어리 형태로 일반적으로 구입할 수 있는 가공 치즈는 가장 대중적으로 팔리는 치즈 제품 중 하나가 되었다. 가공 치즈 제품은 특히 어린이들에 인기가 있다. 가공 치즈는 통상적으로 가열, 갈기(grinding), 및/또는 예를 들면, 제안된 몇몇 종류인 체다 치즈(Cheddar cheese), 콜비 치즈(Colby cheese), 스위스 치즈(Swiss cheese), 브릭 치즈(Brick cheese), 문스터 치즈(Muenster cheese), 파스타 필라타 치즈(pasta filata cheese), 세척된 커드(washed curd), 및 과립 커드 치즈(granular curd cheese)와 같은 하나 또는 그 이상의 각종 우유-지방 함유 천연 치즈의 혼합에 의해 제조된다. 이후, 치즈를 저온 살균(pasteurize)하기 위해, 및 시트, 슬라이스, 또는 다른 원하는 형태로 형성될 수 있는 균질하고, 펌프로 퍼낼 수 있고, 부드러운 치즈 물질을 생산하기 위해 충분하게 증가된 온도에서 결과 치즈를 무지 분유(non-fat dry milk) 및 훼이 고형분(whey solid)과 같은 다른 유제품 및 디소듐 포스페이트(disodium phosphate)와 같은 유화염(emulsifying salts)과 혼합한다.

종종 가공 치즈와 같은 식품의 유통 기한을 연장하고 및/또는 이러한 식품의 미생물학적 안정성을 증가시키는 것이 바람직하다. 상기 시간의 양을 증가시킴으로써 음식은 안정하고, 처리자는 상한 식품에 의한 재고의 손실을 경감시킬 수 있다. 포장, 방부제, 및/또는 특정 저장 파라미터(예를 들면, 냉장)의 사용과 같은 기존의 방법은 부패를 늦추는데 사용되었다.

특히, 일부 예에 있어서, 리스테리아 모노사이토젠스( Listeria monocytogenes ) 및 C. 보툴리눔( C. botulinum )은 원유(raw milk), 치즈(특히 부드럽게 발효된(soft-ripened) 종류), 아이스 크림, 생채소, 발효된 날고기 소세지, 생 가금 및 요리된 가금, 날 고기(모든 종류), 및 날 생선 및 훈제된 생선과 같은 음식과 관련된다. 일부 에에 있어서, 이들 병원균의 성장 능력은 3℃만큼 낮은 온도에서 냉장된 음식 중 증식을 가능하게 한다.

또한, 가공 치즈와 같은 음식의 개선된 유통기한을 제공하는 것이 바람직한 반면, 또한, 천연 재료의 증가된 양을 포함하는 음식을 제공하고자 하는 증가된 요구가 있다. 이러한 관점에 있어서, 천연 재료만을 포함하거나, 그렇지 않으면 인공 물질이 제거된 음식을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 가공 치즈는 음식 안전성 및 유통기한을 개선하기 위해 소르브산과 같은 방부제를 종종 사용한다. 가공 치즈의 특성을 유지하고 및/또는 개선하면서, 천연 방부제 및/또는 항균제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.

요약

일 접근법에 있어서, 천연 항균제를 포함하는 가공 치즈가 여기서 제공된다. 이 접근법의 일 측면에 있어서, 가공 치즈는 약 10 내지 약 90 퍼센트 천연 치즈 또는 천연 치즈의 혼합물; 하나 또는 그 이상의 선택적 유화제; 약 8 내지 약 25 퍼센트 단백질; 및 약 10 내지 약 30 퍼센트 지방을 포함한다. 가공 치즈는 또한 가공 치즈 중 그의 단백질 및 지방 수준에서, 마우스를 이용한 독소 바이오어세이(bioassay)에 의해 결정된 C. 보툴리눔( C. botulinum )의 독소 형성을 86 ℉에서 약 9일 동안 방지하는데 효과적인 양의 니신(nisin)을 포함한다. 동시에, 가공 치즈는 또한 니신 및 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)를 포함하지 않는 가공 치즈에 비해 가공 치즈의 용해를 증가시키고 가공 치즈의 경도(firmness)를 증가시키기에 효과적인 양의 엑소폴리사카라이드를 포함한다. 일부 접근법에 있어서, 니신은 니신 A를 포함한다.

가공 치즈의 니신 및 엑소폴리사카라이드는 또한 가공 치즈 중 약 1 내지 약 20 퍼센트로 제공될 수 있는 발효유 성분의 형태의 가공 치즈에 포함될 수 있다. 발효유 성분 중 니신 및 엑소폴리사카라이드는 또한 액체유 배지 중 단일 세균 균주의 발효로부터 수득될 수 있고, 상기 세균 균주는 ATCC 의 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ) 균주의 동정된 특징을 모두 갖는 분리된 락토코커스 락티스 균주이다.

가공 치즈는 약 1 내지 약 100 ppm의 니신 및 약 100 내지 약 2,000 ppm의 엑소폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 상기 니신 및 엑소폴리사카라이드는 단일 세균 균주로부터 수득된 것일 수 있고, 상기 세균 균주는 ATCC 의 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ) 균주의 동정된 특징을 모두 갖는 분리된 락토코커스 락티스 균주이다.

세균 균주 ATCC 의 발효는 약 15 내지 약 48시간 동안 약 25 내지 약 35 ℃의 온도 및 약 5 내지 약 6의 pH에서 2X 내지 5X 농축 액체유 배지 중 수행될 수 있다. 농축 액체유 배지는 약 5 내지 약 36 퍼센트의 총 고형분, 약 1 내지 약 14 퍼센트의 단백질, 및 약 0 내지 약 16 퍼센트의 지방을 갖는 농축 우유일 수 있다.

일부 접근법에 있어서, 가공 치즈는 소르브산(soribic acid), 소르브산 칼륨(potassium sorbate), 아질산염(nitrite), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 인공 방부제가 없는 것이다.

일부 접근법에 있어서, 가공 치즈는 니신 A 및 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의성 있는 상동성을 갖는 니신 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자 및 서열번호 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의성 있는 상동성을 갖는 엑소폴리사카라이드 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 접근법에 있어서, 니신 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자 및 엑소폴리사카라이드 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자는 동일한 세균 균주로부터 유래한 것이고, 상기 세균 균주는 ATCC 의 락토코커스 락티스 균주의 동정된 특징을 모두 갖는 분리된 락토코커스 락티스 균주일 수 있다. 가공 치즈 제품에 포함된 세균 균주는 발효유 성분 또는 가공 치즈 제품을 제조하는 가공에 있어서 열 처리 단계에 의해 생존하지 못할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 천연 항균제를 갖는 가공 치즈를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 접근법에 있어서, 방법은 락토코커스 락티스 균주로 액체유 배지를 발효하여 니신 및 엑소폴리사카라이드를 포함하는 발효유 성분을 생산하는 단계를 포함한다. 이후 약 8 내지 약 25 퍼센트 단백질 및 약 10 내지 약 20 퍼센트 지방을 갖는 가공 치즈를 생산하기 위해 발효유 성분은 하나 또는 그 이상의 유화제 및 천연 치즈 또는 천연 치즈의 혼합물과 혼합된다. 방법은 가공 치즈 중 그의 단백질 및 지방 수준에서, 마우스를 이용한 독소 바이오어세이에 의해 결정된 C. 보툴리눔의 독소 형성을 86 ℉에서 약 9일 동안 방지하는데 효과적인 양의 니신을 갖는 가공 치즈를 생산하는데 효과적이다. 방법은 또한 니신 및 엑소폴리사카라이드 없는 가공 치즈에 비해 가공 치즈의 용해를 증가시키고 가공 치즈의 경도를 증가시키기에 효과적인 양의 엑소폴리사카라이드를 갖는 가공 치즈를 생산하는데 효과적이다. 일부 접근법에 있어서, 상기 니신은 니신 A를 포함한다.

다른 접근법에 있어서, 방법의 발효유 성분 중 니신 및 엑소폴리사카라이드는 액체유 배지 중 동일한 락토코커스 락티스 균주의 발효로부터 수득된다. 락토코커스 락티스 균주는 ATCC 의 락토코커스 락티스 균주의 동정된 특징을 모두 갖는 분리된 락토코커스 락티스 균주일 수 있다. 방법에서 사용되는 발효유 성분은 또한 약 1 내지 약 100 ppm의 니신 및 약 100 내지 약 2000 ppm의 엑소폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 가공 치즈는 약 1 내지 약 20 퍼센트의 발효유 성분을 포함할 수 있다.

방법은 약 15 내지 약 48시간 동안 약 25 내지 약 35 ℃의 온도 및 약 5 내지 약 6의 pH에서 2X 내지 5X 농축 액체유 배지 중 수행된 락토코커스 락티스 균주 ATCC 의 발효를 포함할 수 있다. 일부 접근법에 있어서, 농축 액체유 배지는 약 5 내지 약 36 퍼센트의 총 고형분, 약 1 내지 약 14 퍼센트의 단백질, 및 약 0 내지 약 16 퍼센트의 지방을 갖는 농축 우유이다.

다른 접근법에 있어서, 방법은 가공 치즈가 소르브산, 소르브산 칼륨, 아질산염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 인공 방부제가 없도록 효과적이다.

일부 접근법에 있어서, 방법의 발효유 성분은 니신 A 및 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의성 있는 상동성을 갖는 니신 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자 및 서열번호 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의성 있는 상동성을 갖는 엑소폴리사카라이드 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자를 갖는 세균 균주를 포함한다.

다른 접근법에 있어서, 니신 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자 및 엑소폴리사카라이드 생산 유전자군으로부터의 하나 이상의 유전자는 동일한 락토코커스 락티스 균주로부터 유래한 것이다.

상세한 설명

본 출원은 일반적으로 다른 측면 사이에서 천연 항균제 및 천연 품질개량체(texture modifying agent)를 포함하는 가공 치즈에 관한 것이다. 일 형태에 있어서, 천연 항균제는 천연 항균제 및/또는 적절한 발효 조건 하에서 천연 항균제를 생산할 수 있는 배양균을 포함하는 발효유 성분 또는 농축 발효유 성분을 통해 가공 치즈에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "발효유 성분(cultured dairy component)" 또는 "농축 발효유 성분(concentrated cultured dairy component)"은 일반적으로 일부 접근법에 있어서, 발효 항균제(cultured antimicrobial)를 포함하지 않는다고 상세하게 확인되지 않는 한 항균제를 생산하는데 효과적인 조건 하에서 선택된 항균제-생산 배양균으로의 농축 및 발효를 겪은 발효유 기질 또는 그의 파생물을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "천연 항균제(natural antimicrobial)"는 발효 공정 동안 생물체에 의해, 예를 들면, 세균 배양물에 의해 생산된 항균 활성을 갖는 성분을 의미한다.

일 형태에 있어서, 발효유 성분은 항균제-생산 배양균으로 발효된 유 기질(dairy substrate)을 포함한다. 일부 접근법에 있어서, 유 기질은 우유 또는 농축 유 액체 또는 우유 기질, 예를 들면, 2 내지 5X 농축 우유 기질과 같은 유 액체(dairy liquid)이다. 일 측면에 있어서, 항균제-생산 배양균은 니신-생산 배양균이다. 일 특정 형태에 있어서, 배양균에 의해 생산된 니신은 니신 A이다. 일 접근법에 있어서, 가공 치즈는 여기서 약 1 내지 약 100 ppm의 니신, 다른 접근법에 있어서 약 1 내지 약 20 ppm의 니신, 다른 접근법에 있어서 약 5 내지 약 15 내지 ppm의 니신, 및 또 다른 접근법에 있어서 약 10 내지 15 ppm의 니신을 포함한다.

일부 접근법에 있어서, 발효유 성분은 또한 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide) (EPS)를 포함한다. 일 측면에 있어서, EPS는 니신을 생산하기 위한 동일한 조건 및 동일한 배지에서 우유 기질의 발효 동안 생산된다. 또 다른 측면에 있어서, EPS는 항균제-생산 배양균 및, 일부 접근법에 있어서 니신을 생산하기 위한 동일한 세균 균주로부터 생산된다. 이 관점에 있어서, 발효유 성분이 본 명세서의 가공 치즈에 사용될 때, 가공 치즈는 동일한 발효, 일부 접근법에 있어서, 동일한 세균 균주로부터 수득된 니신(예를 들면, 니신 A) 및 EPS를 포함한다. 상기 논의된 니신과 함께, 발효유는 약 0.1 내지 약 2 퍼센트의 엑소폴리사카라이드를 포함하고, 및 최종 가공 치즈는 니신 외에 약 100 내지 1000 ppm의 엑소폴리사카라이드를 포함하는 것으로 기대된다.

동일한 발효 및/또는 동일한 세균 균주로부터의 천연 항균제(예를 들면 니신) 및 엑소폴리사카라이드를 포함하는 본 명세서의 발효유 성분을 포함하는 가공 치즈는 인공 방부제 및/또는 기존 천연 항균제의 다른 종류를 제외하고는 동일한 제형을 갖는 가공 치즈와 비교하여 개선된 항균제 특성, 개선된 용해 수행능(melt performance), 및 더 단단한 질감(texture)을 갖는다는 것을 예측하지 못하게 찾아내었다. 동시에, 특유의 발효유 성분을 포함하는 본 명세서의 가공 치즈는 또한 천연 치즈의 경도와 유사한 경도를 나타낸다. 가공 치즈에 있어서, 동시에 증가된 용해 특성 및 증가된 경도 둘 모두가 얻어질 수 있다는 것은 예측되지 못했다. 일 접근법에 의해서, 가공 치즈는 여기서 약 1500 내지 약 2500 Pa의 경도(영 모듈러스(Young's modulus)를 나타내고, 동시에, 약 50,000 내지 약 70,000 Pa/초(second)의 점도(consistency)를 나타낸다. 다른 접근법에 있어서, 발효유 성분을 갖는 가공 치즈는 또한 발효유 성분 없이 또는 발효유 성분 대신 소르브산 또는 다른 인공 방부제를 제외하고는 동일한 가공 치즈에 대하여 약 20 내지 약 75%의 용해도 증가를 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 천연 치즈는 응유(curdling milk) 또는 레닛(rennet) (또는 레닛 대체물) 및 산성화(acidification)의 일부 조합을 사용한 다른 유 액체(dairy liquid)에 의해 만들어진 저온 살균되지 않은 치즈를 의미한다. 본 명세서에 기술된 가공 치즈에 사용되는 천연 치즈는 갓 만들어지거나 또는 숙성된 것일 수 있다.

하기 더 논의된 바와 같이, 일부 경우에 있어서, 더 낮은 수분 수준으로 조합된 가공 치즈 중 단백질 및 지방의 수준은 다양한 병원균이 니신 및 다른 천연 항균제의 상업적 형태에 의해 억제되는 것을 방지하고 및/또는 보호하는 경향이 있다고 생각되기 때문에, 기존 항균제는 고 수준의 단백질 및 지방을 갖는 가공 치즈의 맥락에 있어서 덜 효과적인 경향이 있다. 본 명세서의 발효유 성분의 천연 항균제는 기존 천연 항균제에 의해 발견되지 않은 수준에서 효과적으로 C. 보툴리눔 및 다른 병원균을 억제하는 것이 예측하지 못하게 발견되었다.

기존에는, 가공 치즈의 용해 수행능이 개선될 때, 이는 경도를 감소시키는 것으로 기대되었다. 즉, 기존에는 용해 및 경도 사이에 반비례한다고 기대되었다. 상기 언급된 바와 같이, 반면에, 발효유 성분이 사용될 때, 본 명세서의 가공 치즈는 동시에 용해 및 질감/경도의 개선을 달성한다. 이러한 동시의 용해 및 경도 이중 개선은 공지의 가공 치즈 적용에 있어서의 이들의 경향과 반대되는 경향이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 활성 단위(activity unit)("AU")는 항균제를 포함하는 발효유 성분 및 가공 치즈 중 천연 항균제의 생물학적 활성을 설명하는데 사용될 수 있다. 생물학적 활성은 또한 국제 단위(International Unit)("IU")로 표현될 수 있어 AU 및 IU가 호환적으로 사용될 수 있다는 것이 이해되어져야 한다. 일부 접근법에 있어서, 본 명세서의 발효유 성분 및 그에 의해 제조된 가공 치즈는 약 40 내지 약 400 IU/그람(gram), 다른 접근법에 있어서, 약 50 내지 약 200 IU/그람의 가공 치즈 중 니신 활성을 가질 수 있다.

하나 또는 그 이상의 상이한 천연 항균제가 가공 치즈에 포함될 수 있다. 일 형태에 있어서, 가공 치즈는 천연 항균제의 충분한 양을 함유하고 있어 가공 치즈는 소르브산, 및 소르브산칼륨 등과 같은 인공 방부제를 함유하지 않거나 또는 없다. 본 명세서에서 사용된 문구 "포함하지 않는다(does not contain)", "없다(is free of)", 또는 "실질적으로 없다(substantially free of)"는 약 0.5% 미만, 다른 접근법에 있어서, 약 0.1% 미만, 일부 경우에 있어서, 약 0.05% 미만, 및 다른 경우에 있어서, 없음을 의미한다. 일부 접근법에 있어서, 가공 치즈는 가공 치즈가 약 86℉에서 저장될 때, 적어도 약 9일 동안 독소 형성을 방지하는데 효과적인 천연 항균제의 양을 포함한다. 가공 치즈는 또한 약 1 내지 약 10 ℃에서의 저장 동안, 적어도 약 4주, 다른 측면에 있어서, 적어도 약 8주, 또 다른 측면에 있어서, 적어도 약 12주, 또 다른 측면에 있어서 적어도 약 16주, 또 다른 측면에 있어서, 적어도 약 20주, 또 다른 측면에 있어서, 적어도 약 24주, 및 여전히 또 다른 측면에 있어서 적어도 약 28주 동안 리스테리아 모노사이토젠스의 생장의 1 로그(log) 초과로 방지하는데 효과적인 양으로 발효유 성분을 포함한다.

천연 항균제는 락트산(lactic acid) 균의 항균제-생산 균주를 사용하는 발효에 의해 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "락트산 균(lactic acid bacteria)"은 일반적으로 락트산을 탄수화물 발효의 주요 대사 산물로 생성하는 그람-양성균을 의미한다. 락트산 균은 예를 들면, 락토코커스 락티스 또는, 대안적인 접근법에 있어서, 브레비박테리움 리넨스( Brevibacterium linens )의 항균제 생산 균주일 수 있다.

일부 측면에 있어서, 천연 항균제는 니신 및, 일부 접근법에 있어서 니신 A를 포함한다. 니신은 23 아미노산 잔기를 갖는 억제성 다환 펩타이드(polycyclic peptide)이다. 이는 흔하지 않은 아미노산인 란티오닌(lanthionine), 메틸란티오닌, 디하이드로알라닌(dehydroalanine), 및 디하이드로-아미노-부티르산(dehydro-amino-butyric acid)을 함유한다. 이들 아미노산은 번역후 변형(posttranslational modification)에 의해 합성된다. 이들 반응에 있어서, 리보좀 합성된(ribosomally synthesized) 57-머(mer)가 최종 펩타이드로 전환된다. 포화되지 않은 아미노산은 세린 및 트레오닌으로부터 유래한다.

니신은 우유를 포함하는 천연 기질 상에서 니신-생산 균을 배양함으로써 수득할 수 있다. 니신은 그람-양성 부패 및 병원성 세균을 억제함으로써 안전성과 사용 가능 기한을 확장하기 위해 음식 제품에 포함된다. 그의 고도로 선택적인 활성에 기인하여, 이것은 또한 그람-음성균, 효모 및 곰팡이의 분리를 위한 미생물학적 배지에서 선택적인 제제로서 사용될 수 있다. 니신을 포함하는 두 개의 상업적으로 구입 가능한 항균제는 니사플린(Nisaplin ^® ) 및 노바신(Novasin ^TM ) (둘 모두 Daniso A/S, 덴마크)이다. 전형적으로, 니사플린은 약 3.0 중량% 미만의 니신 및 NaCl, 단백질, 탄수화물 및 수분으로 구성된 나머지를 함유한다. 본 명세서에서 니신 성분을 언급할 때, 성분은 니신 뿐만 아니라 담체, 염, 단백질 탄수화물, 및 발효 공정으로부터 얻어진 대사 산물과 같은 다른 재료도 포함한다. 실시예에서 나타나고 및 하기에서 더 논의된 바와 같이, 상업적으로 구입 가능한 출처의 니신은 가공 치즈의 맥락에서 본 명세서의 발효유 성분과 같이 부패 및 병원성 세균의 억제 수준을 제공하지 않는다.

일 측면에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 발효유 성분은 니신 A를 포함하고 및/또는 니신-생산 배양균은 니신 A-생산 배양균을 포함한다. 니신 A는 약 3,351.5 Da의 분자량 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 다른 천연 항균제 또한 사용될 수 있다는 것이 이해되어져야 한다. 예를 들면, 니신 Z, 니신 Q, 니신 F, 및 니신 F를 포함하는 니신의 다른 형태를 포함할 수 있다. 클래스 I 박테리오신(bacteriocin), 클래스 II 박테리오신, 클래스 III 박테리오신, 및 클래스 IV 박테리오신과 같은 다른 박테리오신 또한 포함될 수 있다. 다른 천연 항균제는 예를 들면, 나타마이신(natamycin)(스트렙토마이세스 나탈렌시스( Streptomyces natalensis )에 의해 생산)과 같은 자연적으로 생산된 항진균제를 포함하고, 폴리리신(polylysine)(특정 스트렙토마이세스 종에 의해 생산) 또한 포함될 수 있다.

또한, 천연 항균제를 생산하는 세균 균주가 제공될 수 있다. 이러한 세균 균주는 예를 들면, 락토코커스 락티스 또는 브레비박테리움 리넨스의 니신-생산 균주와 같은 예를 들면, 락트산 균의 항균제-생산 균주를 포함한다.

일 형태에 있어서, 발효유 성분은 니신 성분을 포함하고, 및/또는 발효 배지의 중량에 대하여 약 30 내지 약 90 ppm의 범위의 니신 성분을 생산할 수 있는 배양균을 포함한다.

천연 항균제는 유 기질 중 적절한 발효 조건하에서 항균제-생산균을 배양함으로써 제공될 수 있다. 유 기질은 예를 들면, 우유, 크림, 훼이 또는 다른 유-함유 분말 또는 액체를 포함한다. 유 기질은 또한 칼슘 카보네이트와 같은 산 중화제가 있거나 없이 세균 생장을 위한 다른 영양분이 보충된 덱스트로오스, 옥수수 시럽 또는 다른 탄수화물을 포함한다.

일부 형태에 있어서, 우유는 원유 또는 적어도 약 2X 농축된 우유 제품, 다른 측면에 있어서 약 5X까지 농축된 우유 제품과 같은 농축 우유 제품의 형태일 수 있다. 전형적으로, 우유 베이스(milk base)는 약 3 퍼센트보다 큰 락토오스 및 질소원을 함유한다. 베이스는 수화된 분말로부터 생산될 수 있거나, 또는 탈지 우유, 2-퍼센트 우유, 전유 등과 같은 신선한 유 액체로부터 유래할 수 있다. 일 접근법에 의하여, 시작 유 기질(starting dairy substrate)은 약 5 내지 약 36 퍼센트의 총 고형분, 약 1 내지 약 14 퍼센트의 단백질 함량, 약 0 내지 약 16 퍼센트의 지방 함량, 및 약 64 내지 약 95 퍼센트의 수분 함량을 갖는 농축 우유를 포함한다.

발효유 성분이 가공 치즈의 생산에 사용될 때, 가공 치즈 제품 중 함유되기 이전에 발효유 성분으로부터 수분을 제거하는 것과 연관된 증가된 비용을 감소시키기 위해 유 기질 중 수분의 낮은 수준을 유지하는게 바람직하다는 것이 발견되었다. 또한, 발효유 성분의 특정 성분은 불안정할 수 있고, 수분 제거 공정 동안 분해되거나 또는 그렇지 않으면 손상될 수 있다. 예를 들면 발효유 성분의 EPS 성분은 상대적으로 불안정하고, 분무 건조 및 증발 등과 같은 수분 제거 기법에 의해 손상될 수 있다고 생각되어 진다. 그러나, 발효 항균제를 포함하는 발효유 성분은 특정 적용을 위해 원한다면, 액체 및/또는 분말과 같은 다양한 형태를 취할 수 있다.

적어도 일부 접근법에 있어서, 본 명세서에서 사용된 니신 A 및 엑소폴리사카라이드-생산 배양균은 락토코커스 락티스 아종 락티스 균주 329( Lactococcus lactis ss. lactis strain 329)이다. 2013년 08월 21일에 균주 329는 VA 20110 마나사스(Manassas), 10801 대학 빌딩(University Blvd.)에 위치한 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되고, 수탁 번호 를 부여받았다. 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정하에서 이루어졌다.

락토코커스 락티스 균주 329는 락트산 균의 다른 니신-생산 균주에 비해 특유의 유전적 및 파지(phage) 프로파일(profile)을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 유리하게, 균주 329는 또한 약 2X 내지 약 5X 우유를 포함하는 농축 유 기질 중 성장할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 소수의 배양균이 이러한 고도의 농축 우유 기질 중 성장할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 본 명세서에서 배양균은 약 2X 내지 약 5X 농축 발효 배지 중에서도 약 10시간 내에 적어도 약 10 ⁹ CFU/그람 성장하고, 약 18시간 내에 약 2000 IU 니신 A/그람 이상을 생산하기에 효과적이다. 균주 329는 하기 더 논의된 바와 같이, 다좌위 서열 타이핑(MLST), 파지 타이핑(phage typing), 및 리보타이핑(ribotyping)을 사용하여 특징지어졌다.

다좌위 서열 타이핑 ( MLST )

L. 락티스 아종 락티스 IL 1403 (taxid:272623), 또한, 니신-생산 균주의 공개적으로 사용가능한 게놈을 균주 329에 대한 IL 1403의 비교에 있어서 유전적 마커로 사용될 7 개의 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 선택을 위한 주형으로 사용하였다. 선택된 유전자는 하기 표 1에 상세하게 나타낸 바와 같이 염색체 상의 좌위(loci)의 범위를 포함한다. 각 7개의 유전자는 증폭되었고 시퀀싱되었다. 이후 서열은 정렬되었고, 참조로서 IL1403을 사용하여 비교되었다. 각 서열 변이는 개별 대립 유전자로 설명되고 나타낸다.

파지 타이핑( Phage Typing )

스팟 플레이트(spot plate)는 고 역가 파지 스탁(stock)의 파지 프로파일링을 위해 사용되었다. 파지는 동정되었고, 파지 타이핑의 결과는 도 11에 나타내었다.

리보타이핑( Riobtyping )

본 명세서에서 사용된 용어 "리보타이핑(ribotyping)"는 16S 및 23S rRNA를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 유전체 DNA 제한 단편(restriction fragment)의 핑거프린팅(fingerprinting)을 의미한다. 제한 효소로서 EcoRI를 사용하는 통상적인 리보타이핑 기법이 수행되었다. 결과는 도 12에 나타내었다. 리보타이핑은 락토코커스 락티스 균주 329가 공개적으로 사용 가능한 락토코커스 락티스 균주 ATCC 11454, 또한 니신-생산 균주와 실질적으로 상이하다는 것을 확인하였다.

DNA 서열 분석

락토코커스 락티스 균주 329는 도 13에 나타낸 바와 같이 엑소폴리사카라이드 및 니신 집합체 유전자의 특유의 조합을 갖는다. 락토코커스 락티스 균주 329는 하기 표 2의 니신 집합체 유전자 서열을 포함하고, 도 14의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 니신 A를 생산한다.

도 1의 방법을 참조로, 적어도 본 명세서에 기재된 발효 조건 하에서, 락토코커스 락티스 균주 329는 57-머(mer) 니신 A 전구체 펩타이드(니신 A 전구체는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는다)에 비해 고 수준의 34-머 니신 A를 생산한다는 것이 밝혀졌다. 니신 A는 니신 A 전구체의 번역후 변형(posttranslational modification)에 의해 생산된다. 적어도 일부 접근법에 있어서, 락토코커스 락티스 균주 329는 적어도 약 9:1, 또 다른 측면에 있어서 적어도 약 9.5:0.5의 비율로 니신 A 전구체에 상대적인 니신 A를 생산한다. 이와 대조적으로 다니스코(Danisco)의 니사플린(Nisaplin ^® )은 약 83 퍼센트 니신 A 및 17 퍼센트 니신 A 전구체를 포함한다.

상기 기재된 니신 A를 생산하는데 효과적인 동일한 발효 조건 하에서, 락토코커스 락티스 균주 329는 또한 예를 들면 도 1의 방법을 참조로 본 명세서에 기재된 발효 조건 하에서 엑소폴리사카라이드를 생산한다. 락토코커스 락티스 균주 329는 하기 표 3의 EPS 집합체 유전자를 포함한다:

적어도 일부 접근법에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 항균제-생산 세균 균주는 도 1을 참조하여 기재된 발효 조건 하에서 약 2000 IU/그람 이상의 니신 A 및 엑소폴리사카라이드를 생산할 수 있다.

본 명세서에서 제공된 서열 정보는 잘못 동정된 뉴클레오티드의 포함을 요구하기 위하여 좁게 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 서열은 세균 균주로부터 완전한 유전자를 분리하고 유전자에 대해 서열 오류를 확인하기 위한 추가적인 서열 분석을 수행하기 위하여 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상동성(homology)" 및 "동일성(identity)"는 호환적으로 사용된다. 두 개의 서열의 퍼센트 동일성 또는 상동성의 결정의 목적을 위하여, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산은 이후에 두 개의 서열의 상응하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 자리에서 비교된다. 예를 들면, 제1 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 제2 서열의 상응하는 자리에 위치할 때 제2 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산과 동일한 것으로 간주된다. 퍼센트 동일성은 자리의 총 수로 동일한 자리의 수를 나누고(즉, 겹치는 자리), 100을 곱하여 결정함으로써 계산된다.

기능적 핵산 등가물(equivalent)은 또한 본 명세서에서 고려된다. 예를 들면, 기능적 핵산 등가물은 침묵 돌연변이(silent mutation) 또는 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능을 바꾸지 않는 다른 돌연변이를 포함한다.

일 형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 항균제-생산 세균 균주는 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33과 유의적 상동성의 하나 또는 그 이상의 유전자를 갖고, 동일한 발효 조건하에서 니신 A 및 EPS를 생산할 수 있다. 본 명세서에서 정의된 용어 "유의적 상동성"은 적어도 70 퍼센트, 다른 측면에 있어서 적어도 75 퍼센트, 다른 측면에 있어서 적어도 80 퍼센트, 다른 측면에 있어서 적어도 85 퍼센트 동일성, 다른 측면에 있어서 적어도 90 퍼센트 동일성, 다른 측면에 있어서 적어도 95 퍼센트 동일성, 또 다른 측면에 있어서 적어도 99 퍼센트 동일성, 및 또 다른 측면에 있어서 완전한 동일성을 의미한다.

일부 접근법에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 항균제-생산 세균 균주는 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 두 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 3 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 4 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 5 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 6 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 7 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 8 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 9 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 10 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 11 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, � ��열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 12 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 13 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 14 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 15 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 16 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루� �진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 17 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 18 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 19 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 20 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 21 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상� ��성의 적어도 22 개의 유전자를 갖고, 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 23 개의 유전자를 갖고, 및 또 다른 측면에 있어서, 서열번호 9 내지 19 및 21 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 유의적 상동성의 적어도 24 개의 유전자를 갖는다.

효과적인 발효유 농축 및 가공 치즈를 생산하는 방법 및 도 1에 대한 제1 참조에 관한 더 상세한 설명으로 돌아오면, 가공 흐름도 (10)는 동일한 배양균으로부터 및 동일한 조건 하에서 항균제(예를 들면 니신 A) 및 EPS를 생산하는데 효과적인 발효유 물질 또는 발효유 농축물 (12)을 생산하는 하나의 방법을 설명하는 것을 제공하고, 그의 제품은 가공 치즈용에 효과적이다. 이 예시적 가공 (10)에 있어서, 액체 유 시작 물질 (14), 예를 들면, 유 액체 유사 전유가 사용될 수 있다. 다른 접근법에 있어서, 시작 유 액체는 우유 단백질 농축물(milk protein concentrate) 또는 훼이 물질(whey material)일 수 있다. 시작 물질 (14)은 약 5 내지 약 35% 총 고형분, 약 0 내지 약 16 퍼센트 지방, 약 1 내지 약 14 퍼센트 단백질, 약 64 내지 약 95 퍼센트 수분을 가질 수 있다. 다른 형태에 있어서, 시작 물질 (14)은 약 26 내지 약 30 퍼센트 총 고형분, 약 10 내지 약 15 퍼센트 지방, 약 8 내지 약 12 퍼센트 단백질, 약 70 내지 약 70 퍼센트 수분을 갖는 3.5X 농축된 전유이다.

다른 측면에 있어서, 시작 물질 (14)은 액체 유 우유(liquid dairy milk)의 한외여과(ultrafiltration)로부터 수득된 농축 유 액체(concentrated dairy liquid)이다. 농축 시작 물질은 총 고형분에 의해 결정된 2X 내지 5X 농축물로 농축될 수 있고, 다른 접근법에 있어서, 약 2X 내지 약 4X, 또 다른 접근법에 있어서, 약 3X 내지 3.5X 유 액체이다. 즉, 3X 농축물은 시작 유 액체와 비교하여 총 고형분의 수준이 3배이고, 5X 농축물은 시작 유 액체와 비교하여 총 고형분의 수준이 약 5배이다. 일 접근법에 있어서, 한외여과막은 적절한 농축 시작 물질을 달성하는데 사용될 수 있다. 하나의 적절한 막은 약 5 내지 약 20 KD의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는다. 농축의 다른 방법은 또한 특정 적용을 위한 필요에 따라 미세여과, 나노여과, 및 역삼투를 포함하여 사용될 수 있다.

하기에서 추가로 논의된 바와 같이, 본 명세서의 2X 내지 5X 우유와 같이 농축 우유의 발효는 전형적으로 기존의 항균제 배양균 및 발효에 대하여 문제를 나타낸다. 제품 내에서 사용되는 균주 329 및 본 명세서의 방법은 특이하게 농축 유 액체의 발효가 가능하고, 및 동시에 동일한 균주로부터 및 동일한 발효 조건 하에서 니신 및 EPS의 형성을 가능하게 한다. 본 명세서의 가공 치즈 재료의 발효 및 최종적인 생산에 대해 농축 우유를 사용함으로써, 가공 치즈 결과물 중 수분 함량이 더 잘 제어된다. 본 명세서의 농축유 성분은 동일한 재료 내에서 다중 기능 및 성분(즉, 예를 들면 니신 및 EPS)을 조합한다. 일부 접근법에 있어서, 이는 가공 치즈 제작 공정에 있어서 전체 수분 부하(moisture load)를 줄이고, 및 일부 경우에 있어서, 또한 가공 치즈 재료 라인(processed cheese ingredient line)을 단순화한다.

액체 유 또는 농축 액체 유 성분인 시작 물질 (14)은 이후에 저온 살균 (16)되고, 이후에 하나 또는 그 이상의 발효기 (18)에 들어간다. 저온 살균(Peasteurization)은 약 80 내지 90 ℉의 저온 살균된 시작 물질의 배출 온도(exit temperature)를 일으키는 약 20 내지 40 초 동안의 약 150 내지 약 190 ℉일 수 있다. 항균제 생산 배양균 (20), 예를 들면 락토코커스 락티스 균주 329는 소듐 히드록시드(sodium hydroxide) (예를 들면, 희석 5.5N 소듐 히드록시드)와 같은 염 용액(base solution) (22)과 함께 발효기 (18)에 첨가된다. 일 형태에 있어서, 항균제-생산 배양균 (20)의 약 2 X 10 ⁶ 내지 약 2 X 10 ⁸ CFU/ml를 배양기에 첨가한다. 일 구체예에 있어서, 배양균 (20)은 배양균의 형태로 해동된다. 일 접근법에 있어서, 발효 온도는 발효기 중 약 25 내지 약 35 ℃(일부 접근법에 있어서 약 28 내지 약 32 ℃, 및 다른 접근법에 있어서, 약 30 ℃) 및 약 5 내지 약 6의 pH(다른 접근법에 있어서, 약 5.4 내지 약 5.8, 및 또 다른 접근법에 있어서, 약 5.4 내지 약 5.6)로 유지된다. 배양균이 선택된 조건하에서 바람직한 수준으로 니신 및 EPS를 생산할 수 있다면 다른 온도 및 pH 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 일 접근법에 있어서, pH 범위는 약 5 내지 약 7이고, 온도 범위는 약 20 내지 약 40 ℃이다. 조성물은 조성물에 대한 상이한 풍미(flavor) 특징을 부여하기 위하여 다수의 상이한 시간 기간 동안 발효될 수 있다. 예를 들면, 일 접근법에 있어서, 조성물은 약 18 내지 약 22시간 동안 발효된다. 다른 형태에 있어서, 발효는 약 15 내지 약 48시간의 범위 동안 일어난다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 발효 시간을 다르게 함으로써, 발효유 성분의 풍미 및 결과로서 가공 치즈 풍미는 변형될 수 있다.

형성될 수 있는 작고/부드러운 커드로 전단하기 위해 조성물은 다음에 선택적 전단 장치(optional shear device) (24)로 보내진다. 일 접근법에 있어서, 전단 장치는 회전자/고정자(rotor/stator) 혼합기(예를 들면, 디스팍스(Dispax)) 또는 다른 회전자 전단 장치일 수 있다. 이 단계는 가공 중 사용되는 물질의 특성뿐만 아니라, 다른 가공 조건에 의존하여 선택적일 수 있다. 조성물은 이후에 선택적인 열 처리 단계 (26)가 최종적으로 수행된다. 일 형태에 있어서, 조성물은 대략적으로 약 60 내지 약 100 초 동안 약 150 ℉ 내지 약 160 ℉에서 열 처리 (26)된다. 다른 형태에 있어서, 조성물은 약 1000 CFU/ml 미만으로 CFU/ml을 감소시키기 위해 열 처리된다. 결과 조성물 (12)은 니신 및/또는 니신-생산 물질을 포함하고, 동시에, EPS 및/또는 EPS-생산 물질을 포함하는 발효유 성분 또는 발효유 농축물이다. 적어도 일부 접근법에 있어서, 이들 두 개의 성분은 유리하게 동일한 시작 세균 균주, 예를 들면 균주 329로부터 및 동일한 발효 조건하에서 생산된다. 조성물은 약 6 내지 약 40% 총 고형분을 갖는 액체의 형태일 수 있다. 일 형태에 있어서, 액체는 약 20 내지 약 30% 총 고형분을 갖고, 일부 접근법에 있어서 약 28.5% 총 고형분을 갖는다.

도 1a에 나타내 바와 같이 대안적인 방법 (200)에 있어서, 수화 분말 및/또는 액체 우유 (202)는 고온, 단기간 멸균(HTST), 또는 초-고온(UHT) 멸균 가공 단계와 같은 제1 가열 (202)될 수 있다. 다음에, 가열된 액체는 이후에 앞서서 논의된 방법에 관하여 기재된 바와 같이, 유사한 물질, 배양균, 및 조건으로 발효 (206)된다. 발효 후에, 물질은 선택적으로 전단 (208)되고, 이후에 농축 (210)된다. 이 접근법에 있어서, 농축은 막 여과, 증발, 또는 원심분리 일 수 있다. 농축 후에, 결과 농축물은 선택적으로 예를 들면, HTST 또는 UHT를 사용하여 다시 가열 (212) 될 수 있다.

발효유 성분을 제조하기 위한 또 다른 가공 (100)은 도 2에 설명되었다. 도 2 중 가공 (100)은 분유 단백질 농축물 및 분말 훼이와 같은 분말 시작 물질 (112)을 사용한다. 이 접근법에 있어서, 약 3 내지 약 10 퍼센트 분유 단백질 농축물, 약 2 내지 약 6 퍼센트 분말 훼이, 및 약 75 내지 약 95 퍼센트 물이 탱크(tank) 또는 발효기 (118)내에서 발효 배지(fermentation medium)를 형성하기 위해 혼합된다. 분말은 발효기 (118)에 첨가되기 전에 혼합 (114) 및 수화될 수 있다. 이들 시작 물질은 이후에 배양 용기 (118)에서 약 2 X 10 ⁶ CFU/ml 내지 약 2 X 10 ⁸ CFU/ml의 양의 항균제-생산 배양균 (120), 예를 들면, 락토코커스 락티스 균주 329와 혼합되고, 도 1에 기재된 방법과 유사하게 발효된다. 도 1의 방법과 유사하게, 가공 물 또는 염기, 예를 들면 희석 소듐 히드록시드는 탱크 (123)로부터 발효 용기 (118)에 첨가될 수 있다. 발효 후에, 조성물은 선택적으로 필요에 따라 가열되거나, 냉각될 수 있고, 이후에 최종 발효유 성분 (112)로 제조될 수 있다. 일부 접근법에 있어서, 가공은 특정 적용을 위한 필요에 따라 다양한 중간 가열(intermediate heating) 및 냉각 (132)를 포함할 수 있다. 이 관점에 있어서, 조성물 (112)은 농축 액체 형태로의 사용을 위해 하나 또는 그 이상의 저장 탱크(holding tank) (130) 또는 다른 저장 위치에 위치할 수 있다. 저장 탱크 온도는 약 30 내지 약 50 ℉일 수 있다. 일 구체예에 있어서(예를 들면, 액체 형태), 발효유 성분은 약 6 내지 약 11% 총 고형분, 및 다른 형태에 있어서 약 20% 총 고형분을 갖는다. 또한, 발효유 성분은 예를 들면 분무기(atomizer) (140)로 분무 건조될 수 있다. 일 접근법에 있어서, 분무기는 약 160 내지 약 180 ℉의 건조 온도 및 약 15 내지 약 25 psi의 압력 강하를 가질 수 있다.

발효유 성분은 다수의 형태를 취할 수 있다. 예를 들면 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 발효유 성분은 액체의 형태일 수 있다. 발효유 성분은 또한 예를 들면 도 2에 나타낸 바와 같이 분무 건조로부터의 분말의 형태를 취할 수 있다. 또한, 발효유 성분은 또한, 농축 형태, 예를 들면, 증발 및 여과 등에 의해 수득된 성분일 수 있다. 도 1 또는 2로부터의 방법의 결과 제품은 특정 적용에 따라 액체 또는 분무 건조된 것일 수 있다. 도 2는 분무 건조를 위한 예시적 단계를 제공하고, 이것은 이들 단계가 또한 도 1의 방법에 사용될 수 있다고 인식될 것이다. 만약 발효유 성분이 농축, 또는 분무 건조 등에 의한 추가적으로 가공된다면, 이 추가적인 가공은 실질적으로 니신 및/또는 EPS에 영향을 미치지 않는 방법으로 고려될 것이라는 것이 인식될 것이다.

동일한 세균 균주로부터 생산된 항균제 및 EPS를 갖는 도 1 및 도 2의 방법에 의해 생산된 발효유 성분은 이후에 가공 치즈 제조에 및/또는 제조를 위해 사용될 수 있다. 일 접근법에 있어서, 가공 치즈는 천연 치즈 또는 천연 치즈의 혼합물, 수분, 및 선택적인 부가적인 유 단백질 소스(예를 들면 우유 단백질 농축물, 훼이, 훼이 단백질 농축물, 및 한외여과된 우유 등) 및 발효유 성분과 함께 혼합함으로써 생산될 수 있다. 염화 나트륨은 풍미를 위해 첨가될 수 있다. 다른 선택적인 성분이 질감, 풍미, 영양, 및/또는 가격 속성(cost attribute)을 개선하기 위해 첨가될 수 있다. 이들은 훼이 유래 재료(예를 들면, 훼이 단백질 농축물), 무지분유(non-fat dry milk), 우유 단백질 농축물, 무수물 우유 지방(anhydrous milk fat), 검(gum), 녹말, 및 겔라틴 등을 포함하나, 그에 한정되는 것은 아니다. 재료는 함께 혼합되고, 이후에 저온 살균 온도로 가열된다. 선택적으로 전단은 가열 동안 또는 후에 적용될 수 있다.

훼이 단백질은 우유가 커들링(curdle)되고 걸러내진(strain) 후의 액체 잔여물인 훼이로부터 분리될 수 있는 구형 단백질(globular protein)의 집합을 의미한다. 훼이 단백질은 전형적으로 베타-락토글로불린(beta-lactoglobulin), 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 및 혈청 알부민 단백질의 혼합물이다. 일 구체예에 있어서, 훼이 단백질 농축물 (WPC)은 훼이 단백질 소스로 사용될 수 있다. WPC는 통상적인 농축 기법에 의해 훼이로부터 유래할 수 있다. 훼이 단백질 소스는 또한 락토오스, 비타민, 미네랄, 및 지방을 포함할 수 있다.

수분은 어떠한 방법, 예를 들면, 그에 한정되는 것은 아니지만, 레인지(cooker)에 증기 주입(예를 들면, 레이다운 쿠커(laydown cooker)), 요리로부터의 응축 증기의 혼합, 및/또는 물의 직접적인 첨가에 의해 혼합물에 첨가될 수 있다. 물론, 수분은 다양한 재료(예를 들면, 천연 치즈로부터의 수분)를 통하여 시스템에 들어갈 수 있다. 최종 치즈 제품의 전체 수분은 수분이 최종 제품에 어떻게 도입되었는지와는 독립하여 모든 수분을 포함한다. 유리하게, 본 명세서의 발효유 성분은 일부 형태에 있어서, 니신 및 EPS를 동시에 포함하는 농축유 성분이기 때문에, 가공 치즈의 수분 제어가 개선된다. 이를 위하여, 니신 및 다른 질감 변형 재료(texture modifying ingredient)는 개별적으로 첨가될 필요가 없기 때문에, 더 적은 물이 발효유 성분 재료를 통해서 가공 치즈에 첨가되는 경향이 있다.

통상의 기술자에 알려진 바와 같이, 재료는 치즈 제품의 원하는 결과에 따라 가공 치즈 중 다양한 양으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 감소된 나트륨 치즈 제품을 위하여, 치즈 제조자는 치즈 혼합물에 소량의 염을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 가공 치즈는 또한 발효유 성분의 형태 및 조성물 및 가공 치즈의 원하는 형태에 따라 발효유 성분의 양의 범위를 포함할 수 있다.

예를 들면, 및 일 형태에 있어서, 가공 치즈는 약 10 내지 90% 천연 치즈를 포함할 수 있다. 다른 형태에 따라서, 가공 치즈는 약 30 내지 약 60% 천연 치즈를 포함할 수 있다. 또 다른 형태에 있어서, 본 명세서에서 가공 치즈는 약 35 내지 약 55% 천연치즈를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 천연 치즈는 일반적으로 커들링된 우유 및 레닛, 레닛 대체물, 산성화, 및 그들의 조합 중 하나로부터 수득된 저온 살균되지 않은 치즈로부터 제공되는 치즈를 의미한다.

가공 치즈는 또한 특정 적용을 위한 필요에 따라 다양한 소스로부터의 다수의 유 재료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 및 일 형태에 있어서, 가공 치즈는 우유 단백질 농축물 약 0 내지 약 50%(다른 접근법에 있어서, 약 10 내지 약 25%), 훼이 단백질 농축물 약 0 내지 약 25%(다른 접근법에 있어서, 약 1 내지 약 10%), 훼이 약 0 내지 약 30%(다른 접근법에 있어서, 약 1 내지 약 10%), 및 우유 지방/크림 약 0 내지 약 30%(다른 접근법에 있어서, 약 1 내지 약 15%) 등을 포함할 수 있다. 가공 치즈는 또한 소듐 시트레이트(sodium citrate), 및 디소듐 포스페이트(disodium phosphate) 등과 같은 유화제(emulsifier)를 약 0 내지 약 5%(다른 접근법에 있어서, 약 1 내지 약 3%)의 양으로 포함할 수 있다. 가공 치즈는 또한 염, 향료(flavoring), 강화제(fortification), 및 착색제(colorant) 등을 원하는 색, 풍미 등을 제공하기 위해 포함할 수 있다. 가공 치즈는 또한 원하는 최종 제품 수분을 제공하기 위해, 재료로부터 첨가된 물 및/또는 수분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비타민 및 다른 미네랄은 필요에 따라 가공 치즈를 강화하기 위하여, 일 접근법에 의해, 약 0 내지 약 3 퍼센트의 비타민 A, 비타민 D 및/또는 칼슘 분말(예를 들면 트리칼슘 포스페이트)로 첨가될 수 있다. 다른 적용에 있어서, 염은 또한 필요에 따라 첨가될 수 있다. 일부 접근법에 있어서, 약 0 내지 약 5 퍼센트 염이 첨가될 수 있다.

또한, 전통적인 방부제 대신에 가공 치즈는 본 명세서의 발효유 성분을 포함할 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법을 통해 제조된다. 일 형태에 있어서, 가공 치즈는 약 1 내지 약 20% 발효유 성분을 포함할 수 있다. 다른 형태에 있어서, 가공 치즈는 약 4 내지 10% 발효유 성분을 포함할 수 있다. 일부 접근법에 있어서, 본 명세서의 발효유 성분은 니신 함량에 상대적인 니신 등가물(니신 활성 비율)에 비하여 더 높은 총 항균제 활성을 제공한다. 예를 들면, 및 일부 접근법에 있어서, 본 명세서에 기재된 발효유 성분의 양을 사용하는 발효유 성분 및 가공 치즈는 약 0.3 이하의 비율의 니신 활성을 나타낸다.

발효유 성분은 인공 방부제에 대한 대체물로서 사용될 수 있고 및/또는 또한 전체 가공 치즈 조성물을 위해 부분적으로 보충하거나 또는 다른 성분을 대체하는데 사용될 수 있다는 것이 유의되어야 한다. 예를 들면 발효유 성분의 형태에 따라서, 발효유 성분은 조성물, 예를 들면 우유 지방, 카세인, 및 훼이 중 다른 유 물질의 부분을 보충하거나 또는 그렇지않으면 대체하는데 사용될 수 있다. 즉, 다른 유 물질의 비율은 발효유 성분의 사용의 결과에 따라 변형될 수 있다. 가공 치즈가 본 명세서의 발효유 성분을 포함할 때, 치즈는 소르브산, 아질산염(nitrite) 등과 같은 전통적인 방부제가 실질적으로 없을 수 있다. 일 접근법에 의하여, 실질적으로 없음은 일반적으로 약 0.5 퍼센트 미만, 다른 접근법에 있어서, 약 0.1% 미만, 다른 접근법에 있어서, 전혀 존재하지 않는 것을 의미할 수 있다.

일 형태에 있어서, 가공 치즈는 약 40% 천연 치즈, 35% 다른 유 물질(diary material), 약 8% 발효유 성분, 약 12% 물 및 나머지 염, 향료(flavoring), 착색제(colors), 비타민, 및 미네랄 등을 포함한다. 가공 치즈는 요리 동안 및 대안적으로 치즈 혼합 단계 동안 발효유 성분의 첨가로 일반적으로 이해되어지는 바와 같이 제조될 수 있다. 일 형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 치즈 제품은 치즈 딥(dip), 치즈 스프레드(spread), 치즈 블록(block), 치즈 슬라이스(slice), 또는 세절된 치즈(shredded cheese) 등 중의 어떠한 것일 수 있다. 일부 접근법에 있어서, 본 명세서의 가공 치즈의 다양한 형태는 약 10 내지 약 90% 천연 치즈, 약 0 내지 약 50% 우유 단백질 농축물, 약 0 내지 약 30% 우유 지방 또는 크림, 약 40 내지 약 60% 물, 약 1 내지 약 20% 발효유 성분, 약 0 내지 약 30% 훼이, 및 약 0 내지 약 25% 훼이 단백질 농축물을 상기 기재된 다양한 선택적인 향료, 염, 및 유화제와 조합하여 포함할 수 있다.

다른 형태에 있어서, 가공 치즈는 약 10 내지 약 30% 총 지방(다른 접근법에 있어서, 약 20 내지 약 30% 지방), 약 8 내지 약 25% 총 단백질(다른 접근법에 있어서, 약 15 내지 약 25% 총 단백질), 및 약 40 내지 약 60% 총 수분(다른 접근법에 있어서, 약 40 내지 약 50% 수분)을 포함한다.

개선된 용해 프로파일 및 증가된 경도를 동시에 달성하기 때문에, 본 명세서의 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈는 예측하지 못한 질감의 이익을 나타낼 뿐만 아니라, 본 명세서의 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈는 또한 약 10 내지 약 30% 지방 및 약 8 내지 약 25% 단백질을 갖는 가공 치즈와 같은 고 단백질 및 고 지방 제품의 맥락에 있어서, 개선된 항균제 특정을 나타낸다. 기존의 상업적인 형태의 니신은 일반적으로 액체 배지 또는 브로스(broth)에서 C. 보툴리눔을 억제하는 것으로 이해되어지는 반면, 이러한 기존의 형태의 니신이 가공 치즈와 같은 고-단백질 및 고-지방 음식 시스템에서 사용될 때, 니신은 C. 보툴리눔 및 다른 병원균을 억제하는데 덜 효과적이었다. 이론에 제한되고자 하는 것은 아니지만, 일부 경우에 있어서, 본 명세서에 기재된 가공 치즈의 고 단백질, 고 지방 및 낮은 수분 수준은 전통적인 니신 및 전통적인 천연 항균제를 덜 효과적이게 만드는 C. 보툴리눔 및 다른 병원균을 보호하고 및/또는 캡슐화하는 경향이 있는 것으로 생각되어 진다. 본 명세서에서의 항균 배양균, 특히, 균주 329로부터 수득된 니신은 고 지방 및 고 단백질 가공 치즈의 맥락에 있어서, 하기 실시예 1에 일반적으로 나타난 바와 같이 다른 형태의 니신에 비해 훨씬 더 C. 보툴리눔 및 다른 음식 유래 병원균, 예를 들면, 리스테리아 모노사이토젠스를 억제하는데 효과적이다. 일부 접근법에 있어서, 가공 치즈 중 발효유 성분은 본 명세서에 기재된 고 단백질 및 고 지방 수준에서 가공 치즈 중 마우스의 통상적인 독소 바이오어세이에 의해 결정된 적어도 C. 보툴리눔으로부터의 독소 형성을 약 86 ℉에서 약 9 내지 약 10일 동안 방지하는데 효과적인 니신의 양을 제공한다. 일 접근법에 있어서, 바이오독소 어세이는 본 명세서에 그의 전체가 참조로서 포함된 Haim M. Solomon et al., Bacteriological Analytical Manual, Chapter 17, Clostridium botulinum , January 2001, available at http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070879.htm , 와 일치하게 수행될 수 있다.

본 명세서의 발효유 성분은 고 단백질 및 고 지방 가공 치즈의 맥락에 있어서 C. 보툴리눔 및 다른 병원균을 억제할 뿐만 아니라, 발효유 성분은 이러한 억제성 효과를 기존에 밝혀진 가능성보다 낮은 활성 수준 및/또는 낮은 용량 수준에서 달성한다.

다른 접근법에 있어서, 본 명세서의 발효유 성분 또는 본 명세서의 가공에 의해 제조된 발효유 성분의 액체 형태는 최종 가공 치즈에 있어서 고 수준의 니신 활성을 보유하고, 이는 가공 치즈에서 사용될 때, 기존의 상업적 형태의 니신을 사용하여서는 달성할 수 없는 것이다. 일 접근법에 의해서, 본 명세서에 기재된 발효유 재료 및 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 발효유 재료는 가공 치즈에 포함되기 전의 재료의 활성에 비해 약 50 내지 약 90 퍼센트 활성, 및 다른 접근법에 있어서 약 60 내지 약 75 퍼센트 활성을 보유하기에 효과적이다.

일부 접근법에 있어서, 발효유 성분은 발효 전 또는 후에 한외여과된 유 액체를 사용하여 제조된다. 이러한 접근법에 있어서, 발효유 성분은 락토오스 및 다른 유 미네랄의 감소된 수준을 갖는다. 예를 들면, 및 일부 접근법에 있어서, 발효유 성분 및 발효유 성분을 사용하는 가공 치즈는 약 0.1 퍼센트 미만의 락토오스 및 산(acid)으로서 약 15 퍼센트 미만의 락테이트를 가질 수 있다. 다른 접근법에 있어서, 발효유 성분 및 발효유 성분을 사용하는 가공 치즈는 또한 약 600 mg/100 그람 미만의 칼슘을 가질 수 있다.

조성물, 방법, 및 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 조성물의 유리한 점 및 구체예는 다음의 실시예에 의해 추가적으로 설명된다; 그러나, 이들 실시예에 기재된 특정 조건, 가공 계획, 물질, 및 그의 양 및 다른 조건 및 상세한 설명들은 이 방법을 과도하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서의 모든 퍼센트 및 비율은 다르게 표시되지 않는 한 중량에 의한 것이다.

도 1은 농축유 액체(concentrated dairy liquid)로부터 생산된 예시적 발효유 성분의 생산을 설명하는 가공 흐름도를 나타내는 도면이다;
도 1a는 대안적인 가공 흐름도를 나타내는 도면이다;
도 2는 분유 재료로부터 생산된 예시적 발효유 성분의 생산의 제2 형태를 설명하는 가공 흐름도를 나타내는 도면이다;
도 3은 발효유 성분 존재 및 부존재에서 가공 치즈에 대한 기호 프로파일(taste profile)을 설명하는 도면이다;
도 4A 내지 D는 발효유 성분 존재 및 부존재에서 다양한 가공 치즈에 대한 용해 비교(melt comparison)를 보여주는 사진이다;
도 5A 내지 C는 발효유 성분 존재 및 부존재에서 다양한 가공 치즈에 대한 용해 비교(melt comparison)를 보여주는 사진이다;
도 6은 발효유 성분이 없는 대조군과 비교하여 8 퍼센트 발효유 성분을 갖는 가공 치즈에 대한 경도 측정을 보여주는 그래프이다;
도 7은 발효유 성분이 없는 대조군과 비교하여 8 퍼센트 발효유 성분을 갖는 가공 치즈에 대한 점도(consistency) 측정을 보여주는 그래프이다;
도 8은 발효유 성분이 없는 대조군과 비교하여 8 퍼센트 발효유 성분을 갖는 가공 치즈에 대한 경도 측정을 보여주는 그래프이다;
도 9는 발효유 성분이 없는 대조군과 비교하여 8 퍼센트 발효유 성분을 갖는 가공 치즈에 대한 점도(consistency) 측정을 보여주는 그래프이다;
도 10은 니신-생산 균주의 상대적인 다좌위 서열 타이핑(Multi Locus Sequence Typing) (MLST) 분석의 결과를 보여주는 도표이다;
도 11은 니신-생산 균주의 파지 타이핑 분석(phage typing analysis)의 결과를 보여주는 도표이다;
도 12는 다양한 락토코커스 락티스 균주의 리보프린터 분석(Riboprinter analysis)의 결과를 포함하는 도면이다.
도 13은 다양한 락트산 균(lactic acid bacteria)의 EPS-관련된 유전자를 비교하는 도표이다;
도 14는 니신 A의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다; 및
도 15(A)는 L. 락티스 균주 329의 접종 및 발효 전에 EPS의 부존재를 보여주는 주사 공초점 현미경 이미지(scanning confocal microscopy image)를 나타내는 도면이고, 도 15(B)는 L. 락티스 균주 329로의 발효 후에 EPS의 존재를 보여주는 주사 공초점 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.

다음의 실시예는 상기 기재된 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈 슬라이스 및 방부제로서 소르브산을 사용하는 대신에 발효유 성분 없는 가공 치즈의 시료의 대조군의 수행능을 설명한다. 시료는 일반적으로 방부제 및/또는 발효유 성분(표시된 곳), 향료, 착색제, 비타민, 및 미네랄 등의 다양한 양과 함께 약 46 퍼센트 수분, 약 23 퍼센트 지방, 약 1.2 퍼센트 염, 및 약 18 퍼센트 단백질을 갖는 가공 치즈 슬라이스로 제조하였다.

실시예 1

가공 치즈 슬라이스는 균주 329로부터 본 명세서에 기재된 바와 같이 28% 고형분을 갖는 액체 발효유 성분을 사용하여 제조하였고, 발효 분무 건조 훼이로 제조된 가공 치즈 슬라이스와 비교하였다. 발효 분무-건조 훼이는 필수적으로 지방이 없고 소량의 단백질을 갖는 약 96% 고형분을 갖는 분말의 형태였다. 둘 모두 상업적인 발효 분무-건조 훼이 및 도 1의 가공 및 균주 329를 사용에 따라 제조된 액체 발효유 성분을 가공 치즈에 사용하였다. 하기 표 4는 균주 329로부터의 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈가 상업적으로 사용 가능한 항균제 물질과 비교하여 유의적으로 높은 항균 활성을 보유한다는 것을 설명한다. 이러한 활성 보유 효과는 가공 치즈 중 발효유 성분의 6% 및 8% 적재(loading)에 대하여 나타났다. 이 관점에 있어서, 발효유 성분은 상업적으로 구매가능한 항균제에 비해 더 높은 항균 활성을 보유하기 때문에, 항균 활성은 더 오래 지속되고 및 그렇지 않으면 동일한 효능에 대하여 더 낮은 용량을 요구할 수 있다.

또 다른 비교를 분말로부터 제조되고 약 20% 총 고형분을 갖는 도 2의 방법에 따른 액체 물과 조합된 액체 발효유 성분을 제조하는 것에 대하여 수행하였다. 이 비교에 있어서, 상업적으로 구매 가능한 니신 소스(니사플린, 다니스코) 및 분무 건조 발효 훼이 분말은 각각 가공 치즈 중 포함시켰고 본 명세서의 발효유 성분으로 제조된 유사한 가공 치즈와 비교하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 명세서와 일치하게 균주 329로부터 제조된 발효유 성분의 8%를 가공 치즈에 사용하였을 때, 약 10일 후에 독소(C. 보툴리눔)가 검출되지 않은 반면에, 상업적으로 사용 가능한 항균제(니사플린 또는 분문 건조 발효 훼이)로 제조된 유사한 가공 치즈는 약 7일째 및 10일째에 나타난 독소를 가졌다. 독소 유발 연구(toxin challenge study)는 실리커 라보라토리(Silliker Laboratory)가 수행하였다. 원하는 경우, 독소 유발 연구에 대한 다른 전통적인 방법론 또한 사용할 수 있다.

실시예 2

풍미 비교는 도 3에 나타낸 바와 같이 가공 치즈 슬라이스 시료에 대해 수행하였다. 가공 치료 시료를 방부제로서 약 0.2 퍼센트 소르브산으로 제조하거나("대조군"으로 식별), 또는 소브르산 없이 및 본 명세서에 따라 제조된 약 8% 발효유 성분 및 균주 329를 활용하여 제조하였고("변수(variable) 8"로 식별), 훈련된 감각 패널(trained sensory panel)이 맛을 느끼고 평가하였다. 도 8(훈련된 패널의 입 안에서의 맛 인식을 요약하였다)에 나타낸 바와 같이, 본 명세서의 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈는 일반적으로 방부제로서 소르브산으로 제조된 가공 치즈와 동일한 맛 인식 프로파일을 가졌다. 그러므로, 풍미 인지 측면으로부터 방부제로서 소르브산을 발효유 성분으로 대체하는 것이 허용가능하다고 예측된다.

실시예 3

본 출원의 균주 329로부터 수득된 발효유 성분이 있거나 없이 제조된 가공 치즈 슬라이스의 용해 프로파일을 비교하기 위해 다수의 가공 치즈 시료를 제조하였다. 시료는 약 2 내지 약 8% 발효유 성분을 포함하였고, 발효유 성분이 없는 대조군 시료와 비교하였다. 치즈의 지방, 수분, 단백질 및 pH는 모든 시험 시료 사이에 상대적으로 변함 없이 유지되었다(약 43 내지 약 44 퍼센트 수분 및 약 5.7 pH). 발효유 성분이 없는 대조군 시료는 방부제로서 0.18% 소르브산을 포함하였고, 또는 일부 경우에 있어서, 소브르산의 부족으로 인한 용해를 배제하기 위하여 소르브산을 제거하였다. 이 실시예에 있어서, 발효유 성분으로 제조된 시료는 용해 직경(melt diameter)이 증가하였다. 다른 것들은 그렇지 않았다. 이것은 하기 표 6, 7, 및 8에서 데이터로 나타내었다.

각 시험 시료는 서로 위에 쌓은 가공 치즈의 3개의 원형 슬라이스를 포함하였다. 시료를 이중 냄비(double boiler)에 두었고, 약 4분 동안 배지 열(medium heat) 상에서 끓는 물로 가열하였다. 도 4A 내지 D 및 5A 내지 C에 나타낸 바와 같이, 발효유 성분으로 제조된 시료는 용해될 때 본 명세서의 발효유 성분이 없는 대조군 시료와 비교하여 증가된 표면적을 가졌다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, 대조군 치즈의 용해 직경은 약 1.125 인치인데 반해 약 6 퍼센트의 발효유 성분을 갖는 본 발명의 시료의 용해 직경은 약 1.6 및 약 1.45 인치였다. 이들 도면에 있어서, 대조군 시료는 "C"로 표시하였고, 본 발명의 시료는 균주 329로 제조된 약 2 퍼센트, 약 4 퍼센트, 약 6 퍼센터 또는 약 8 퍼센트 발효유 성분을 갖는 본 발명의 가공 치즈 디스크(disk)를 나타내는 I2, I4, I6 또는 I8로 표시하였다.

표면적 측정은 시료의 용해 프로파일을 측정하여 완료하였다. 하기 표 6, 7, 및 8은 도 4A 내지 D 및 5A 내지 C에 나타낸 것과 상응하는 시료의 일부에 대해 이미지J 소프트웨어(ImageJ software)(공개된 도메인, 자바-기반 이미지 처리 프로그램, 국립 보건원)를 사용하여 측정된 표면적을 설명한다. 표에 나타낸 바와 같이, 가공 치즈 중 4%, 6%, 및 8%에서 본 출원의 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈 시료는 모두 발효유 성분이 없는 대조군에 비해 용해 즉시 증가된 표면적을 나타내었다. 일반적으로 소비자는 발효유 성분을 갖는 시료에서 나타난 바와 같이 증가된 용해 수행능(melt performance)을 갖는 가공 치즈를 선호한다.

상기 데이터에 기초하여, 본 명세서의 발효유 성분을 포함하는 시료는 발효유 성분이 없는 대조군 시료와 비교하여 더 광범위한 디스크 용해(disc melt) 결과를 나타내었다.

실시예 4

도 6 내지 9는 균주 329를 사용하여 본 출원의 방법에 의해 제조된 발효유 성분 및 발효유 성분 없이(대조군) 제조된 가공 치즈 사이의 경도(firmness) 및 점도(consistency) 비교를 설명한다. 이 실시예에 있어서, 고형분, 단백질, 지방 및 수분은 모든 시험된 시료에 대하여 상대적으로 변함없이 유지되었다. 발효유 성분이 없는 시료는 방부제로서 0.18% 소르브산을 포함하였고, 또는 일부 경우에 있어서, 소브르산의 부족으로 인한 경도를 배제하기 위하여 소르브산을 포함하지 않았다. 이 실시예에 있어서, 발효유 성분을 갖는 시료만이 경도 및 점도가 증가하였다.

도 6 및 8에 나타낸 바와 같이, 발효유 성분을 갖는 가공 치즈는 발효유 성분이 없이 제조된 대조군 시료와 비교하여 증가된 경도(즉, 영 모듈러스)를 나타내었다. 일반적으로 이 증가된 경도는 소비자에게 더욱 천연 치즈 조성물임을 시사한다. 인장 계수(tensile modulus)로도 또한 알려진 영 모듈러스(Young's modulus)는 물질의 단단함의 측정법이다. 가공 치즈의 맥락에 있어서, 영 모듈러스는 치즈 슬라이스의 초기 접촉(initial touch)의 측정이다. 이 실시예의 맥락에 있어서, 초기 접촉은 치즈가 손가락 또는 손으로 접촉되었을 때 치즈가 제공하는 저항을 의미한다. 이것은 경도의 인식의 또 다른 측정법이다. 영 모듈러스는 알려진 중량을 적용하였을 때 치즈의 스탁을 관통하는데 필요한 힘의 양을 측정하는 질감 분석 기계(텍스쳐 테크놀로지 주식회사(Texture Technologies Corp)를 사용하여 조직감 측정 시험(texture profile analysis) (MTPA)을 사용하여 측정하였다. 이 시험을 위하여 약 10 개의 21 그램 슬라이스의 치즈를 서로 쌓았다. 일반적으로 영 모듈러스는 물질 중 인장력(tensile stress)을 인장 변형률(tensile strain)로 나눔으로써 계산하였고, 초기 훅킨 영역(initial Hookean region)에서 스트레인(strain) (변형(deformation))에 대한 스트레스(stress) (부하(load))의 비율로 나타낸다. 이것은 전형적으로 외부 부하에 대하에 반응하여 시료가 얼마나 단단하거나 견고한지를 나타낸다. 또한, 더 높은 점도 값을 갖는 제품은 더 큰 씹는 감각 인식(chewy sensory perception)을 제공한다.

또한, 도 7 및 9는 MTPA 시험 동안 힘이 적용되는 동안에 치즈의 유동(flow) 동안의 경도를 통해 가공 치즈 시료의 점도를 설명한다. 도 7 및 9에 나타낸 바와 같이, 발효유 성분을 갖는 가공 치즈는 발효유 성분이 없는 시료와 비교하여 유동 동안 증가된 점도를 나타낸다. 일반적으로 유동 동안 증가된 경도는 또한 소비자에게 더욱 천연 치즈 조성물임을 시사한다. 본 명세서에서 사용된 점도는 일반적으로 유동 동안의 경도 또는 유동에 대한 저항에 관한 것이다. 가공 치즈의 맥락에 있어서, 점도 값이 높을 수록, 이후에, 치즈는 입 안에서 더 느린 속도의 분해를 나타내고, 이것은 일반적으로 소비자에게 바람직한 특징으로 인식된다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 명세서의 발효유 성분으로 제조된 및 균주 329로 제조된 가공 치즈 조성물은 적어도 등가물을 제공할 수 있고, 만약 개선되지 않는다면, 항균제 특성 및 방부제 기능성을 제공할 수 있다. 또한, 이들 발효유 성분으로 제조된 가공 치즈는 가공 치즈의 개선된 용해 및 증가된 경도를 동시에 나타낸다는 것이 예측하지 못하게 발견되었다. 일반적으로 기존에는 치즈 용해가 증가될 때, 경도는 감소한다고 기대되었다. 균주 329에 의한 발효유 성분에서 생성된 물질은 예측하기 못하게 치즈의 둘 모두의 특성을 동시에 개선하는데 도움을 준다고 생각되어 진다.

실시예 5

3X 우유(pH 5.46)를 발효유 성분의 발효를 위한 액체 배지로서 사용하였다. 3X 우유의 시료는 L. 락티스 균주 329로의 접종 전에 취하였다. 발효유 성분은 약 21 시간 발효를 갖는 도 1의 가공에 따라 제조하였다. 추가적인 시료는 발효 후에 취하였다(pH 5.46). 엑소폴리사카라이드가 발효 동안 생산되는지 여부를 결정하기 위해 시료는 이후에 α-만노피라노실(mannopyranosyl) 및 α-글루코피라노실(glucopyranosyl) 잔기와 선택적으로 결합하는 콘카발린 A(Concavalin A)의 알렉사 플루어 488 컨쥬게이트(Alexor Fluor®488 conjugate)를 사용하여 착색(stain)하였다. 콘A 알렉사 플루어 488(ConA Alexa Flour 488)를 pH 6.8에서 0.1 M 포스페이트 버퍼에서 용해하였고, 훼이 막투과액(whey permeate)으로 pH 6으로 희석하였다. 착색 용액(staining solution)의 점적(drop)을 밀폐된 유리 슬라이드 상에서 시료에 적용하였고, 25 ℃에서 30분 동안 두었다. 이후에 슬라이드를 유리 커버슬립(coverslip)으로 덮었고, 495 nm(여기(excitation)) 및 519 nm(이미션(emission))의 20X 대물렌즈(objective)를 갖는 레이카 SP5(Leica SP5) 공초점 주사 레이져 현미경(CSLM)으로 관찰하였다. 도 15A 및 도 15B(기준자(scale bar) 25 ㎛)에 나타낸 바와 같이, 엑소폴리사카라이드(EPS)가 발효 시료에서 관찰되었으나, 균주 329로의 접종 전에 3X 우유 시작 물질에서는 관찰되지 않았다. EPS는 큰 응집된 덩어리로 관찰되었다.

앞선 기재에 나타낸 바와 같은 내용 및 동반된 도면은 설명의 방법으로서만 제공될 뿐 그에 제한하는 것은 아니다. 특정 구체예가 보여지고 기재되었으나, 출원인의 기여의 더 넓은 관점에서 벗어남이 없이 통상의 당업자가 변화 및 변형을 할 수 있다는 것은 명백하다. 추구된 보호의 사실상의 범위는 선행 기술에 기반한 적절한 관점에서 생각할 때, 다음의 청구항에서 정의된 것으로 의도된다.

American Type Culture Collection (국외)

PTA-120552

20130821

SEQUENCE LISTING <110> Kraft Foods Group Brands LLC <120> PROCESSED CHEESE WITH CULTURED DAIRY COMPONENTS <130> 1410-131457 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Dehydrobutyrine (beta-methyldehydroalanine) <220> <221> THIOETH <222> (3)..(7) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Dehydroalanine <220> <221> THIOETH <222> (8)..(11) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Amino butyric acid <220> <221> THIOETH <222> (13)..(19) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Amino butyric acid <220> <221> THIOETH <222> (23)..(26) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Amino butyric acid <220> <221> THIOETH <222> (25)..(28) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Amino butyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Dehydroalanine <400> 1 Ile Xaa Ala Ile Xaa Leu Ala Xaa Pro Gly Ala Lys Xaa Gly Ala Leu 1 5 10 15 Met Gly Ala Asn Met Lys Xaa Ala Xaa Ala His Ala Ser Ile His Val 20 25 30 Xaa Lys <210> 2 <211> 1086 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 2 atgaaacaga aacataaatt agcgcttggt gcgtcaattg ttgctttggc aagtcttggt 60 gggattaaag cacaagctgc atctgttcaa gaaattatta acgctgcggt accagtggca 120 aatgactacg gactttatcc atcagtaatg attgcccaag ggattttaga atcaagtggt 180 ggacaaagtg ccttagcaag caattataat aatatttttg gagttaaata cacttctggt 240 acacctgttt atctaccaac acaagagtat ttgaatggaa caatgacaaa tgttgttgaa 300 cccttccaag cttatagctc agtttatgac gcatgtgttg cccaagctaa aatgttacgt 360 gcttcatcat attattctgg ggcttggcgt gaaaatacaa gttcttactt agatgcgaca 420 gcttggcttg aaggacgtta tgccacggat ccaacttatg cttctaaatt gaatagcgtg 480 atttctgaac ttggtttaag tgtttatgac caaggaggag aaatatcagg aggaactgct 540 gttacaacta gttcatcagc ctcaacaaat tcagctggca catacaaagt acaagagggt 600 gattcattat cagcaatcgc tgctcaatat ggtacaactg ttgatgcact tgtgtcagca 660 aatagtttag aaaatgcgaa cgatattcat gtaggagaag ttttgcaagt tgctggtgct 720 agcacaacta caacaagtac caatacaact tccaatgtat cgtcaagttc tacttat acc 780 gtcaaatcag gagatagttt atattcgatt gcggaacaat atggaatgac tgtttcatca 840 ctgatgtcag ccaatggaat ttatgatgtt aattcaatgc ttcaagtagg acaagtattg 900 caagtaactg taagtactag tgcaacaact tcaaacacaa cgacttcaaa cagttataca 960 attcaaaatg gtgacagcat ttattcaatt gccacagcaa atggtatgac agctgaccaa 1020 ttagcagccc tcaatggatt tggaattaat gacatgattc atccaggaca aacaattaga 1080 atctaa 1086 <210> 3 <211> 1011 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 3 atggtagtta aagttggtat taacggtttc ggtcgtatcg gtcgtcttgc tttccgtcgt 60 attcaaaatg ttgaaggtgt tgaagttgtt gcaatcaacg acttgacaga tccagcaatg 120 cttgctcact tgcttaaata cgatacaact caaggtcgtt ttgatggtaa agttgaagtt 180 aaagatggtg gttttgaagt taacggtaaa ttcgttaaag ttactgctga atctaaccca 240 gctaacatca actgggctga agttggtgca gaaatcgttc ttgaagcaac tggtttcttc 300 gcaactaaag aaaaagctga acaacacttg cacgctaacg gtgctaaaaa agttgttatc 360 actgcacctg gtggatctga tgttaaaaca atcgttttca acactaacca cgaagtactt 420 gatggaactg aaacagtaat ttcagctggt tcatgtacaa ctaactgtct tgctccaatg 480 gctgata ctt tgaacaaaca attcggtatc aaagttggta caatgactac agttcacggt 540 tacactggtg accaaatgac tcttgatggc ccacaccgtg gtggagactt ccgtcgcgca 600 cgtgctgcag ctgaaaacat cgtacctaac tcaacaggtg ctgctaaagc tatcggtctt 660 gtattgccag aacttcaagg taaacttcaa ggacatgctc aacgtgtacc agttccaact 720 ggttcattga ctgaacttgt tactatcctt aacaaagaag ttacagttga cgaaatcaac 780 gcagctatga aagctgcttc aaatgaatca tttggttaca acgaagacca aatcgtttca 840 tctgatatcg ttggtatctc aaactcttca ctctttgatg ctactcaaac tgaagttact 900 tcagctgatg gagctcaact tgttaaaact gtatcttggt acgataacga aatgtcatac 960 acttcaaacc ttgttcgtac acttgcatac ttcgctaaaa tcgctaaata a 1011 <210> 4 <211> 1419 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 4 atggttgttg gtgcacaagc aacagaagtt gatttggttg ttattggttc aggccctggt 60 ggttatgttg cagccatccg tgcggctgaa cttggtaaaa aagttacaat tattgaaaaa 120 gataatgttg gtggggtttg tttaaatatt ggttgtatcc catcaaaagc attgattaat 180 attggtcatc attaccaaga atctttggag gaagaaaaag gagaaaatcc ttttggtctt 240 tctgtcggaa atgttaaatt aaactgggaa tctgcccaaa aatggaaaca agataaagtt 300 gtcaaccagt tgacaggtgg tgttaaaatg ctacttaaaa aacacaaagt tgacgtgatt 360 caaggaactg cagaatttat tgataacaat acaataaatg ttgaacaaga agatgggttc 420 caacttttgc aatttaatga tgtgattatc tcaactggtt cacgtcctat cgaaattcct 480 tctttcccat ttggtggtcg cattattgac tctactggtg ctttgtcact tccagaagtt 540 cctaaacatt tgattattgt tgggggagga gttattggtt ctgagcttgg tggagcatac 600 cgtatgctcg gttctaagat tacaattgtt gaaggtttgg accacatttt aaacgggttt 660 gataaagaaa tgtctgatat cattgctaat cgcgttaaat ctgctggttc tgaaatcttt 720 acttcagcaa tggctaaatc agctactcaa actgataaag atgtaacttt gacttttgag 780 gttgacggaa aagaacaaac ggtgactggt gattacttac tcgtttctgt tggacgtcgt 840 ccaaatactg atttaatcgg cttgaacaac actgatgtta aattgactga ccgtggtttg 900 attgaagttg acgattctta tgcaactaat gttcctcaca tttatgcaat cggtgatgtg 960 gttcctggtc caatgctcgc tcacaaagct tctttccaag ctaaagttgc tgctgctgcg 1020 attgctggag ctgaggacga cgtggactta cacgttgctt tgcctgctgt agcttataca 1080 acaactgaat tagcaacagt tggagaaacg cctgaatcag ttaaagaccg taaagat gtt 1140 aaaatttcta agttcccatt tgctgcaaat ggccgtgcca tttcaatgaa tgatacgact 1200 ggtttcttac gtttgattac tgaaactaaa gaaggggcct taatcggtgc tcaaatcgtt 1260 ggccctggtg catctgactt gatttctggt ttatcactag cgattgaaaa tggattgact 1320 tctaaagaca tttcattgac tatccaacct cacccaacac ttggtgaagc gattatggat 1380 acagctgaat tggctgatgg cttaccaatt cacgtttaa 1419 <210> 5 <211> 1311 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 5 atgacagtaa catcagattt cacacaaaaa ctctacgaaa attttgcaga aaatacaaaa 60 ttgcgtgcgg tggaaaatgc cgtgactaaa aatggtttgc tttcatcact cgaagtccgt 120 ggttcacatg cagcaaattt gcctgagttt tcaattgact tgacaaaaga ccctgtaacg 180 aatcaaaaac aatctggtcg ttgctggatg tttgctgctt tgaacacttt ccgtcataaa 240 tttatcaatg aatttaaaac agaggatttt gagttttcac aagcttacac tttcttctgg 300 gataaatatg aaaaatcaaa ctggttcatg gaacaaatta ttggtgatat tgaaatggac 360 gatcgtcgtt tgaaattcct tttacaaaca ccacaacaag atggcggcca atgggatatg 420 atggttgcaa tttttgaaaa atatggaatt gttcccaaag ctgtttatcc tgaatcacaa 480 gcttcaagta gctcacgtga attgaatcaa tactt gaata aactactccg tcaagatgct 540 gaaattttgc gttatacaat tgagcaaggt ggagatgttg aagcagttaa agaagaactt 600 ttgcaagaag tctttaattt ccttgcggta actttaggtt tgccaccaca aaattttgaa 660 tttgctttcc gtaataaaga taatgaatac aaaaaatttg ttggtagtcc aaaagaattt 720 tacaatgaat atgttggaat tgatttgaat aattatgtgt cagtaatcaa tgctccaact 780 gctgacaaac cttataataa gagctacaca gttgagtttc ttggaaatgt tgtcggtggt 840 aaagaagtga aacatttgaa tgttgaaatg gaccgcttta aaaaattggc cattgcccaa 900 atgcaagctg gtgaaacagt ttggtttggt tgtgacgtgg gtcaagaatc aaatcgttca 960 gcaggacttt tgacaatgga ttcttatgat ttcaaatctt cattggatat tgaatttact 1020 caaagcaaag caggacgtct tgactatggt gagtcgttga tgacgcatgc catggtttta 1080 gcgggtgttg atttagatgc tgacggaaat tcaactaaat ggaaagttga aaattcatgg 1140 ggtaaagatg cgggtcaaaa aggatatttt gttgcctctg atgaatggat ggatgaatat 1200 acttatcaaa ttgttgtccg taaagacctt ttaactgaag aagaattggc tgcttacgaa 1260 gagaaacctc aagtacttct accatgggac ccaatgggtg ctttagctta a 1311 <210> 6 <211> 648 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 6 atgaaaaata aaattttaga cctgagggca tattttattg ctggcccaca agattttcca 60 aaactttcaa ttgatgatgc aatcgataaa atttctgtaa tcataaaaag tggagtaacg 120 gtttatcaat ttcgtgataa gggaacaatt tataaaaata aaaatcaacg attagaagta 180 gcaaaaagac tacaagaagt agctcagaaa gcggctgttt cttttattgt gaatgatgat 240 gttgaattag cgcgtgaatt gtcagctgac gggattcatg tcggacaaga cgatgattct 300 gtcagtaaaa ttcgtgagct gattggccaa gaaatgtggg taggactttc tgtcagtaat 360 gatatggaat tagaaagcgc tcaaaagagt ggggctgact atttgggaat tggtccaatt 420 tatccaacaa atagcaagtc cgacgcagca gaaccaattg gggttgacca tttaagaaaa 480 atgcttgagc ataatcaatt accaactgtt ggaattggtg gaattactga aaattcactg 540 acagagcttt caaaaattgg tctgggtgga gttgcggtaa tttctttgct gacagaatcc 600 gaaaattaca aaaatatggt tcaaaaaatt aagcaaaata ttagatga 648 <210> 7 <211> 1623 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 7 atgaaacaac cactttataa tacaggagtt ttatttaaga ctttaataaa aagggattgg 60 tttaagttag ttttctggat tttaggaatg cttgcttttg ctgcttcagg ggcagggaaa 120 atggaagttg cctcgaatcc ggcgacggct agtactcttt atacaatgtt tgtcaaaaat 180 ccagcaatgg tcggattatt tggaccaact ccaataaata atccaactaa ttatagtctg 240 gggccgattt ttggtcaaac catgacttta attacggggc tgactttcgc tatcatttcg 300 attatttatg ttgttaatcg aagcagaaaa gaagaagatg atgggattac agaacttttt 360 cggtcttact ctattggaaa attggcaaat acgactgctt tagtcatgga acttttgctc 420 ttaaatttaa taatggctgt cttattagct ctttcaatag aggtccaaaa cgtggctggc 480 ttgaatcatt tagaaagtaa ttttctattt gctttcacaa caagcgctca gggtttcctt 540 tggggaatgt ttgctttact tttcggtcaa attttctctg aagcaagtac aactaaaggg 600 atgacatttg gtttactggg tttgttatat attgttcgaa tgctaacaga tgtaacaaat 660 ctttccatag gttggttcaa tcctctgtct tggtcttatc tagcttttcc atatgttaaa 720 ggtcatgaaa attggttagc tgtctttttg acttttctct tagcttttct aattttagga 780 atatcctata ttctagagct taaaagagat gtgggagtgg ggtattttcc cgaaagaaag 840 gcgcgacttc atgggaaaaa gggacatttc ggatttcctg gtctcgtttt gaatcttgaa 900 aaaaagatga ttatcggttg gcttttggca agttttgttc tgggcttagt ttatggttca 960 atgtttggac aaatggacca atttatttca agtaataaaa ccgttaagga gctttttg tt 1020 gggaatgaaa cggcagcgag tgcgattaga ggaaacttca tggtcactct gttttcgata 1080 ttgtcaatct taatcgcagc gtttggtgta attttactga caaaaatggt gagcgaggaa 1140 agaaaaaatc gtctggaagc tctttatgct ttaccacttt cacgactaaa agtgtattcc 1200 acttatttac tgatagctat tctgtcagta attttagctc agtttttagc gctttttgga 1260 atatttattg aacagttggg taataaaaat gctttgagct tcttagaaat tatgaaatct 1320 ggcatgattt ggcttgttgc tgtcatattt gttttagcaa tacttagtct gttacttggg 1380 cttgtgcctc gtttggcaga attaatttgg gtatatcttg ctttcttact ttttatgact 1440 tatcttggaa aattattatc tttgccaaaa tggcttgaaa atttaagcat ttataactat 1500 attcctaaat tgccagttga gaaaatgaat cttcctaccg ttttattcat attaatttta 1560 tctgtcttct tagttttact tggctttgga gcttatagaa gacgcgattt aatcacgggg 1620 taa 1623 <210> 8 <211> 1116 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 8 atggctttaa cagcaggtat cgttggttta ccaaacgttg gtaaatcaac tctttttaat 60 gcaattacaa aagcaggcgc agaagctgca aactatcctt ttgcaacaat tgacccaaat 120 gttgggatgg tagaagtacc ggatgaacgt ttaaacaagt taacagagtt gattaaacct 180 aa gaaaactg ttccgacaac ttttgaattt acagatattg ctgggattgt taaaggggct 240 tcacgcggag aaggtctagg aaataaattt cttgccaata ttcgtgaagt agatgccatc 300 attcacgttg ttcgagcttt tgatgatgaa aatgtaatgc gtgaaaataa tcgtgaagat 360 gcttttattg atccaatggc agacattgaa acaattaatc ttgaattaat tttggccgat 420 ttagaatcag tcaataaacg ttatgcgcgt gttgaaaaag ttgctcgtac ggcaaaagat 480 aaagatgcgg tcgcagaatt taatgttttg aaaaagctca aaccggtact tgaagatggt 540 aaatcagcac gaacaattga ctttgacgaa gatgaaataa aggttcttaa aagcttgttc 600 ttattgacaa gtaaaccagt tctttatgta gctaatgttt cagaagatga agtaggcgaa 660 cctgataata tcgaatacgt gaaacaaatt cgtgagtttg cggcgactga aaatgctgaa 720 gttgctgtga tttctgctcg tgttgaagaa gaaatctcag agttggaaga tgatgaaaaa 780 gcagaatttt tggaagcaat tggcttaaaa gaatctggtg ttgatatgtt gactcgtgca 840 gcttaccacc ttcttggact tgccacttac tttactgctg gtgaaaaaga agtccgtgct 900 tggaccttca agcgtggaat gaaagctcca caaatggcag gaattattca tacagacttt 960 gaaaaaggct ttatccgcgc agtaactatg tcttatgatg atttgcttaa atacggttca 1020 gaaaaagctg ttcgtgaagc cggtcgcttg cgtgaagaag gaaaagaata tgttggtcaa 1080 gatggcgaca ttatggaatt ccgtttcaac gtgtaa 1116 <210> 9 <211> 411 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 9 atggatcgtt atactaaaaa agtcattgct tgggatttag gaaagcgaat gactctagaa 60 ttagtgcaaa ggactttgaa taaggcaatg gaatcacaaa attatccaga agctgtgatg 120 cttcattctg accaaggaag tcagtatacg agtcatgagt atgaagagac aataaaaaac 180 tctggaatga ctcactcctt cagtcgtaag ggctatcctt atcataatgc cagtcttgaa 240 tcttggcatg gacatttaaa aagagagtgg gtgtatcaat ttaaatataa gaactttgaa 300 gaagcctatc agagtatttt ctggtacatc gaagcctttt ataattcaaa acgaatccat 360 caaagtttag ggtatcttac gcctaatcaa tttgaaaaag aaatcactta a 411 <210> 10 <211> 645 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 10 atgataagaa gtgaatgtct caaattaaaa aatagcttag ggttttattt agtttttctc 60 tttactttat tagagctttt aacggttcct atttatttag cttttggaag aagtcatgtt 120 tcaatgactg atttatcgct catgattttt ttgttttttc cgttactggt tacaattttg 180 tctattctaa tctttgaaca ggagagtctg gccaatcgtt tccaagaaat aaatgtaaat 240 aaaaaaagta gcagaatttg gttatcaaag ctaatagtag tggatttcct tttgttcttt 300 ccatcagcaa tgatctggat aattacggga gtttcacagg cagtagggca acaaggaatg 360 atgatcgcaa cagctagctg gttgatggca atttttctta atcattttca tcttttattg 420 acctttataa tcaatcgagg agggagcatg attatcgcga ttattgaaat attactcatt 480 atttttgcca gtaataaagt tttattagca gcttattggt gtcccattgc tttacctgtt 540 aattttatga taactgggcg gtgtgcttat ctgatagctg ccgtagggtg gattgtttta 600 tccacaataa ttcttgtagc attatctaaa aaaaagatta gataa 645 <210> 11 <211> 729 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 11 atgaaaagaa taatagcatc agaagcaata aaattaaaaa aatcaggaac tcttagattg 60 gtattaatta tcccttttgt gactctattt atagcatttc ttatgggtgg aatacagatt 120 tttagtgttt tttcaattta ttggtgggaa actggttttt tattcctttt gatgagtttg 180 ctttttcttt atgatataaa atcagaggag caagctggaa attttcaaaa tgtgaaatgg 240 aaaaagctga gttggaaaat tcatttggcc aaaatgttgt tgatttggct aagaggtata 300 ctagcgagca tagtcttgat tattttgctt tatttggttg cttttgtgtt tcaaggtatt 360 gtagtggtgg attttatgaa agtaagtgtg gcattgattg ctatattact agcagcttct 420 tggaatttac cctttatata cttgattttc aagtggatta atacttacgt attgttagct 480 gcgaatacct tgatttgttt aattgttgcc ccttttgttg cacaaactcc agtatggttc 540 ttgctaccat acacttatca ctataaagtt acagaaagtt tgttaaatat caaaccatca 600 ggagatttgt taacagggaa gataaatttc agtatttggg aagttttatt accatttgga 660 ctttccatag ttgtaacgat aggagtttcg tatttactta aaggagtgat agaacatgat 720 aagaagtga 729 <210> 12 <211> 678 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 12 atgcaggtaa aaattcaaaa tctttctaaa acatataaag aaaagcaggt gctacaagat 60 atcagttttg atattaaatc tggaacagtc tgtggtttat taggagttaa cggtgcagga 120 aaatcaactt tgatgaaaat tttgtttggt ttaatttctg cagatactgg aaaaattttt 180 tttgatggac aagaaaagac aaataatcaa cttggagcct taatcgaggc tccagcaata 240 tatatgaatt tatctgcttt cgataatctt aaaactaagg ctttgctttt tggaatttca 300 gataagagaa ttcatgaaac tctagaagtg attggtttgg cagaaacagg aaagaaaaga 360 gcaggaaaat tctctttagg gatgaaacaa cgtttgggaa ttggtatggc tattcttaca 420 gaacctcaat ttttaattct tgatgaacct actaatggtt tggatcctga tggtattgcg 480 gagttgttaa 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