유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물

유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물{Whitening composition containing lactobacillus lysate}

도 1은 본 발명에 따른 유산균 파쇄액의 제조 방법을 도식화한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 유산균 파쇄액이 멜라닌 종양 세포에서 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내는 그림이다(LF;락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ), EF;엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ), LC;루코노스톡 시트리움( Leuconostoc citreum ) , LL;락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ), LS;락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ), SM;스트렙코커스 뮤탄스( Streptococus mutans ), WC;와이셀라 시바리아( Weisella cibaria )).

도 3은 본 발명에 따른 유산균 파쇄액이 버섯 타이로시네이즈 활성 억제효과를 나타내는 그림이다.

도 4는 본 발명에 따른 유산균 파쇄액이 멜라닌 종양 세포에서의 타이로시네이즈 발현 저해 효과를 나타내는 그림이다.

도 5는 본 발명에 따른 유산균 파쇄액의 세포 안정성 시험 결과를 나타내는 그림이다.

본 발명은 유산균 파쇄액을 함유하는 기능성 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 피부 외용제, 화장료, 약제 및/또는 건강식품에 사용할 수 있다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 그러나, 나이가 들어감에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하며 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되고, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선에 자외선 함량이 증가하게 되고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 생기는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 멜라닌 침착에 의한 기미, 주근깨 등이 생성되며, 피부의 노화현상을 촉진하여 피부를 손상시키게 된다.

이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여, 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화 및 멜라닌의 침착을 효과적으로 억제하기 위한 노력이 시도되고 있다.

그 예로, 하이드로퀴논, 아스코르빅산, 코직산, 알부틴 및 다양한 추출물 등이 미백 화장료로 이용되고 있으나, 분해 되거나 착색되고, 효능 및 효과가 불분명한 문제가 빈번히 발생되고 있다. 특히 다양한 추출물 등은 안정성이 매우 낮아 쉽 게 분해되어 효능 및 효과가 불분명하고, 안전성 문제가 꾸준히 거론되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

한편, 효모나 곰팡이 박테리아와 같은 미생물을 화장품 산업에 사용하는 예도 증가되고 있다.

유산균은 인체 내에서 유익한 역할을 하는 세균으로서 탄수화물 같은 당을 발효시켜 유산(젖산)을 생성하는 균으로, 지금까지 400여종이 발견되었으며, 그 중 상품성이 있는 것은 18종으로 알려져 있다. 이들 유산균은 면역증강 특히, 위 장관 면역 증강의 생리활성을 가진다고 알려져 있어, 발효유제품의 소비량은 실로 어마어마하다. 특히, 최근 웰빙 트렌드에 따라, 먹어서 좋은 식품이 발랐을 때도 좋을 것이라는 사회적 분위기가 조성됨에 따라, 몸에 이로운 다양한 화장품 소재들이 개발되면서 유산균의 배양액이 피부의 보습, 각질층의 턴오버(turn over)속도 증가, 주름살 완화 등의 효과가 보고되어 있으나, 실제로 화장품을 사용하였을 때 전달받는 그 효과가 미미한 경우가 많았다.

또한, 종래에는 유산균을 발효 배양하여 생성되는 산물을 화장료 조성물에 포함시키거나(대한민국 등록특허 제0302505호), 버섯, 쌀, 과즙, 식물 추출물 등을 특정 속의 유산균으로 발효시켜 얻어진 발효액을 화장료에 배합하여 사용하는 경우 등(일본공개특허공보 제2004-097999호, 일본공개특허공보 제2005-298489호)이 있었다. 하지만 유산균의 발효액, 배양액이 아닌 유산균 자체의 파쇄액과 관련된 피부의 미백효과에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없었다.

이에, 본 발명자는 유산균을 배양한 뒤, 유산균에 의해 생성된 산물 뿐아니라 유산균 자체를 함께 파쇄하여 얻은 유산균 파쇄액(lysate)의 경우, α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)에 의해 유도된 흑화과정(melanogenesis)을 강하게 억제하여 멜라닌 생성을 저해시키고, 유도된 타이로시네이즈 발현을 강하게 저해하며, 버섯 타이로시네이즈(tyrosinase)의 활성을 저해시키는 효능을 강하게 보유하여 종래기술에서는 기대할 수 없었던 피부 미백효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유산균 파쇄액은 유산균을 배양하여 균체를 획득한 후, 파쇄과정을 통해 얻을 수 있는 물질을 말한다.

상기 유산균 파쇄액 제조시 유산균은 산소 존재 하에 배양된 것이 바람직하다.

일반적으로 유산균은 호기·혐기적 조건 모두에서 증식이 가능하나, 혐기적 조건하에서는 그 생육이 억제를 받게 되어 발효시, 균체의 생육에 영향을 받아 균체량이 감소되고 2차 대사산물의 생성이 저해된다. 비피도 박테리아의 경우에는, 혐기적 조건에서만 살 수 있는 것(strictly anaerobes)으로, 산소 조건하에서는 생육이 억제된다. 한편, 본 발명에서 사용된 유산균은 호기·혐기적 조건 모두에서 증식이 가능한 것(facultative anaerobes)이므로 산소 조건에서의 배양이, 혐기적 조건에서 배양하는 것보다 유리하다. 이에, 본 발명에서는 산소 존재 하에서의 배 양이 유리한 유산균을 이용하여, 산소 존재 하에서 배양한 것에 특징이 있다.

본 발명에서의 유산균은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 락토코커스( Lactococcus sp .), 스트렙토코커스( Streptococcus sp .), 와이셀라( Weisella sp. ), 락토바실러스( Lactobacillus sp .), 엔테로코커스( Enterococcus sp .) 및 루코노스톡( Leuconostoc sp. )속으로 구성된 군에서 선택된 유산균을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ), 루코노스톡 시트리움( Leuconostoc citreum ), 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ), 스트렙코커스 뮤탄스( Streptococus mutans ), 와이셀라 시바리아( Weisella cibaria )로부터 유산균을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 유산균 파쇄액은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량비(w/w%), 바람직하게는 0.001 내지 5 중량비(w/w%)로 포함될 수 있다.

본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물은 피부 미백 및 개선 효과를 위한 피부 외용제, 화장료, 약제 및/또는 건강식품에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 상기 유산균 파쇄액 이외 피부 미백 및 개선 효과에 유해한 효과를 끼치지 않는 한, 공지된 피부 미백 효과를 갖는 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 미백용 조성물에 대하여 피부누적 자극시험을 실시한 결과, 유산균 파쇄액은 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다(실시예 4, 도 5). 따라서 피부 외용제로의 사용이 적합하다. 상기 피부외용제의 제형은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 파우더(power), 젤(gel), 연고(ointment), 크림(cream), 액체(liquid), 에어로졸(aerosol) 등의 제형을 가진다.

또한, 본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물은 화장료로 사용할 수 있다. 상기 화장료로 사용시 본 발명에 따른 유산균 파쇄액 외에 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 임의로 선정하한 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증저점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH조절제, 향료 등이 첨가될 수 있다.

상기 유분으로는 미네랄오일, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 마카다미아 너트오일, 글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산, 선플라워씨드오일 등이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제로는 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드. 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등이 사용될 수 있다.

상기 보습제로는 글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등이 사용될 수 있다.

상기 고급 알코올로는 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등이 사용될 수 있다.

상기 증점제로는 산탄검, 카보머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등이 사용될 수 있다.

상기 킬레이트제로는 디소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 등이 사용될 수 있다.

상기 색소로는 청색1호, 적색40호, 황색4호, 황색 5호 등이 사용될 수 있다.

상기 지방산으로는 스테아릭애씨드, 미리스틱애씨드, 팔미틱애씨드, 이소스테아릭애씨드, 라우릭애씨드 등이 사용될 수 있다.

상기 산화방지제로는 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등이 사용될 수 있다.

상기 방부제로는 메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등이 사용될 수 있다.

상기 왁스로는 카나우바왁스, 칸데닐라왁스, 밀납, 경납 등이 사용될 수 있다.

상기 pH조절제로는 트리에탄올아민, 씨트릭애씨드 등이 사용될 수 있다.

상기 향료로는 천연향료, 조합향료 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물로 제조되는 화장료의 제형은 특별히 제한되는 바가 없으며, 예를 들면, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 조성물은 멜라닌합성을 저해하는 유산균 파쇄액을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 개선을 위한 약제로 사용될 수 있다.

상기 약제는, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 파우더, 젤, 연고, 크림 등의 외용제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제재로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같 은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물이 약제로 사용할 때, 상기 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피를리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에티트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물을 약제로 사용할 때, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 약제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 약제 조성물은 공지된 피부 미백 및 개선 효과를 가지는 조성물을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물은 건강식품으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물을 첨가할 수 있는 건강식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

건강식품 중의 상기 피부 미백용 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중의 상기 피부 미백용 조성물의 양은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명에 따른 유산균 파쇄액을 함유하는 피부 미백용 조성물을 건강식품으로 사용할 때, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 ; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 ; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명 의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물을 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

[ 제조예 1] 유산균 파쇄액 제조방법

배양액을 제조하기 위해서 유산균 증식배지인 락토바실러스(Lactobacillus) MRS(Difco사) 액체배지를 15㎖ 유리시험관에 5㎖씩 담아 면전으로 막은 후, 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균된 배지에 MRS 한천배지에서 배양된 7종의 유산균, 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ), 루코노스톡 시트리움( Leuconostoc citreum ), 락토코커 스 락티스( Lactococcus lactis ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ), 스트렙코커스 뮤탄스( Streptococus mutans ), 와이셀라 시바리아( Weisella cibaria )을 콜로니 형태로 각각 접종하였다. 산소 존재 하에 30℃ 항온기에서 24시간 동안 배양한 액을 동일한 멸균 배지에 2%(v/v)를 접종한 뒤, 전 단계와 같은 조건으로 배양하였다. 최종적으로는 다량의 배양액을 얻기 위하여 100㎖ 삼각플라스크에 락토바실러스(Lactobacillus) MRS 액체배지를 50㎖ 담아 상기와 같은 조건으로 멸균하고 배지에 2%(v/v)으로 접종한 뒤, 산소 존재 하에 30℃항온기에서 48시간 배양하여 배양물을 획득하였다.

이의 유산균 생균수를 십진희석법으로 락토바실러스(Lactobacillus) MRS 한천배지에 도말하여 확인한 결과, 7종의 유산균이 2 ~ 4 X 10 ⁹ CFU/㎖이었으며 배양액 50㎖를 4℃에서 8,000rpm으로 30분간 원심분리하여 균체를 획득하였다.

멸균수로 2회 세척한 후. 멸균수 10㎖을 첨가하여 균체를 40% amplitude, pulse on 20sec, off 10sec, 15℃, 25분(Vibracell, SONICS)의 조건으로 파쇄하였다.

여기서 얻어진 파쇄물을 상기와 같은 방법으로 다시한번 원심분리하여 세포 침전물(cell debris)은 제거하고 상등액을 최종적인 유산균 파쇄물로 획득하였다.

이때, 세포 침전물을 이루는 성분은 소수성의 세포벽 성분들이 대부분이고, 상등액을 이루는 성분은 유산균 세포를 구성하는 성분으로, 펩티도글라이칸, 세포막성분, 세포내 단백질, 여러 종류의 세포내 효소 등이다.

[ 실시예 1] 멜라닌 종양세포에서 멜라닌 합성 저해 효과

본 발명의 유산균 파쇄액의 멜라닌 종양 세포에서 멜라닌 합성 저해 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 마우스 유래 악성 멜라닌 종양 세포주 B16F1 (KCLB 8007)를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신 (100 g/mL), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다. 수득된 멜라닌 종양 세포를 24웰 플레이트(well plate)에 1 X 10 ⁴ 세포/웰(cells/well)에 접종(seeding)하여 1일 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, 멜라닌 합성을 유도시키기 위하여, 알파-MSH (melanocyte stimulating hormone; 멜라노사이트 자극 호르몬)을 비처리군을 제외하고 50nM을 첨가하여 멜라닌 합성을 유도하였고, 동시에 7종의 유산균 파쇄액(락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ), 루코노스톡 시트리움( Leuconostoc citreum ), 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ), 스트렙코커스 뮤탄스( Streptococus mutans ), 와이셀라 시바리아( Weisella cibaria )을 각각 0.5% 및 코직산(양성대조군) 800uM를 가한 DMEM 배지를 첨가하여 3일간 배양하였다. 각 처리군에 의한 멜라닌 종양세포가 분비한 합성된 멜라닌 양을 육안으로 확인하고 그 변화를 디지털 카메라로 촬영하여 도 2에 나타내었다.

도 2의 사진은 멜라닌의 합성 정도에 따라 배지색이 갈색으로 진해지는 정도를 관찰한 것으로, 알파-MSH 단독처리군은 알파-MSH처리에 의해 멜라닌 합성이 크게 증가하여 비처리군에 비해 배지색이 진한 갈색이 되었고, 알파-MSH 동시처리 된 유산균 파쇄액 처리군의 배지색은 알파-MSH 단독처리군에 비교하였을 때, 비처리군과 유사한 정도로 옅음을 알 수 있었다. 결과적으로, 유산균 파쇄액은 알파-MSH에 의해 유도된 멜라닌 합성을 강력하게 저해하는 작용을 한다는 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 버섯 타이로시네이즈 활성 저해효과

본 발명의 유산균 파쇄액의 버섯 타이로시네이즈 활성 저해 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 버섯 타이로시네이즈 (Sigma; T3824)를 10mM Sodium phosphate buffer (SPB)에 10ug/ml농도로 녹여 준비하였다. 또한, L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma; D9628-5G)를 10mM SPB에 10mM농도로 녹여 준비하였다. 1.5ml 에펜도르프 튜브에 10mM SPB를 100ul씩 첨가하고, 코직산 200uM과 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis )의 유산균 파쇄액 0.5~16%까지 2배수 농도로 시료를 첨가하였다. 그 다음, 10ug/ml 버섯 타이로시네이즈를 각 튜브에 80ul씩 첨가한 후 10mM L-DOPA를 20ul씩 각 튜브에 첨가하고 부드럽게 섞이도록 흔들어주었다. 96웰 플레이트를 준비해 튜브 내 반응액 90ul씩을 각 웰에 첨가하여 색이 변했을 때, 475nm 흡광도를 측정하여 결과를 나타내었다.

도 3은 버섯 타이로시네이즈 활성이 락토코거스 락티스의 유산균 파쇄액에 의해 저해된 정도를 색 변화에 따른 흡광도 변화를 확인한 것으로, 유산균 파쇄액이 유의적인 버섯 타이로시네이즈 활성 저해효능을 가진다는 것을 확인하였다.

[ 실시예 3] 타이로시네이즈 발현 저해효과

본 발명의 유산균 파쇄액의 타이로시네이즈 발현 저해 효과를 알아보기 위하 여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 마우스 유래 악성 멜라닌 종양 세포주 B16F1 (KCLB 8007)를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신 (100 g/mL; Hyclone), 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Hyclone) 배지에 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다. 수득된 멜라닌 종양 세포를 6웰 플레이트(well plate)에 1 X 10 ⁵ 세포/웰(cells/well)에 접종(seeding)하여 1일 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, 멜라닌 합성을 유도시키기 위하여, 알파-MSH (melanocyte stimulating hormone; 멜라노사이트 자극 호르몬)을 비처리군을 제외하고 50nM을 첨가하여 멜라닌 합성을 유도하였고, 동시에 7종의 유산균 파쇄액(락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ), 루코노스톡 시트리움( Leuconostoc citreum ), 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ), 락토바실러스 사케이( Lactobacillus sakei ), 스트렙코커스 뮤탄스( Streptococus mutans ), 와이셀라 시바리아( Weisella cibaria )을 각각 0.5%, 1% 가한 DMEM 배지를 첨가하여 1일간 배양하였다. 각 처리군의 세포를 수거한 후, SDS cell lysis buffer (2%SDS첨가)로 세포를 용해시켜 용해물(lysates)을 획득하고, Brad-ford 법으로 총 단백질양을 정량하여 각 처리군의 총 단백질양을 보정하여, 웨스턴 시료를 제조하였다. 준비한 시료는 10% SDS-PAGE에서 크기에 따라 단백질이 분리되었고, 이 후 PVDF 막(membrane)으로 옮겨진 단백질은 항-타이로시네이즈 항체를 1차 항체로 사용하여 엑스레이 필름에서 가시화 되었다.

도 4는 알파-MSH에 의해 유도된 타이로시네이즈 발현이 유산균 파쇄액에 의해 저해된 정도를 웨스턴 블라팅으로 확인한 것으로, 유산균 파쇄액이 타이로시네이즈 발현을 강력히 저해한다는 것을 확인하였다.

[ 실시예 4] 유산균 파쇄액의 세포 안전성 시험

본 발명의 유산균 파쇄액의 세포 안정성 여부를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 마우스 유래 악성 멜라닌 종양 세포주 B16F1 (KCLB 8007)를 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신 (100 g/mL; Hyclone), 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Hyclone) 배지에 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다. 수득된 멜라닌 종양 세포를 96웰 플레이트(well plate)에 1 X 10 ⁴ 세포/웰(cells/well)에 접종(seeding)하여 1일 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, 유산균 파쇄액을 각각 0.1%, 0.5% 첨가한 DMEM 배지를 첨가하여 1일간 배양하였다. 각 처리군에 1mg/ml농도로 1xPBS에 녹여진 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Sigma) 용액을 50ul씩 첨가한 후 세포배양기에서 2시간 배양하였다. 그 후 담겨져 있는 MTT 용액을 제거하고 100ul의 DMSO를 각각 첨가하여 형성된 포마즌 결정(formazan crystal)을 녹이고, microplatereader 기계를 이용하여 570nm에서의 흡광도를 측정하여 값을 나타내었다.

도 5는 유산균 파쇄액이 세포에 사용하기에 안전한지를 MTT 어세이로 확인한 것으로, 비처리군에서 나타난 세포 생존도와 각 유산균 처리군에서 나타난 세포 생 존도가 모두 약 100%로, 유산균 처리에 의한 세포손상이 없는 것으로 나타났다. 상기 실험에 의해, 유산균 파쇄액이 세포에 안전한 물질임을 알 수 있었다.

[ 제조예 1] 유산균 파쇄액을 포함하는 화장료

A. 유산균 파쇄액을 함유한 크림

유산균 파쇄액을 함유한 영양 크림의 제조예는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민, 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 유산균 파쇄액과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

B. 유산균 파쇄액을 함유한 화장수

a) 유연 화장수

유산균 파쇄액을 함유한 유연 화장수의 제조예는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 유산균 파쇄액, 유성성분, 유화제, 방부제, 향을 실온에서 용해시킨 후, 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

b) 수렴 화장수

유산균 파쇄액을 함유한 수렴 화장수의 제조예는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 유산균 파쇄액, 유상성분, 유화제, 방부제, 향에 에탄올을 가하여 실온에서 용해시켜 알코올상을 제조한 다음 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

C. 로션

유산균 파쇄액을 함유한 로션의 제조예는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민, 부틸렌 글라이콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 친수성 증점제인 산탄검 2% 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량%가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후, 유산균 파쇄액, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다.

D. 겔

유산균 파쇄액을 함유한 겔의 제조예는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.

E. 에센스

유산균 파쇄액을 함유한 에센스의 제조예는 하기 표 6에 나타낸 바와 같다. 정제수에 점증제를 천천히 교반하면서 가하여 균일하게 분산시켰다. 수상 성분들을 혼합하여 수상을 제조하였다. 유화제, 피부 유연제, 향, 방부제에 에탄올을 가하여 용해시켰다. 수상에 알코올상을 교반하면서 가하고 알칼리제를 첨가하였다. 최종적으로 유산균 파쇄액과 색소를 첨가하였다.

[비교 제조예 1] 정제수를 함유한 크림

유산균 파쇄액을 첨가하지 않고 정제수로 대체한 것을 제외하고는 상기 제조예 1-A와 동일한 방법 및 제형으로 크림을 제조하였다.

[ 제조예 2] 유산균 파쇄액을 함유한 건강식품의 제조예

유산균 파쇄액을 함유한 건강식품 조성물은 다음 각각의 제제예와 같은 조성으로 통상의 액제 제조방법으로 제조하였다. 최종 부피는 각 액제에 100 ml이다. 본 제제예는 액제 뿐만 아니라 정제, 산제, 과립제 등으로 통상의 제조방법으로 제조가 가능하다.

[ 제조예 3] 유산균 파쇄액 함유 약제의 제조

본 발명의 유산균 파쇄액은 일일 0.1 내지 1000mg의 용량을 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제나 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적인 방법으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있는 약학적 제제로 제제화하여 의약품으로 사용될 수 있다. 다음에 제제실시예로서 제제의 제조예를 예시한다.

제제실시예 A : 정제의 제조

유산균 파쇄액 5mg

유당 20mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 50mg의 정제로 타정한다.

제제실시예 B : 캅셀제의 제조

유산균 파쇄액 5mg

유당 20mg

전분 19mg

탈크 1mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 50mg의 젤라틴 캅셀에 충진한다.

제제실시예 C : 주사제의 제조

유산균 파쇄액 5mg

용해보조제 적량

주사용멸균증류수 적량

상기의 성분을 통상이 주사제의 제조방법에 따라서 2ml의 앰플에 충진하고 밀봉한 다음 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 D : 시럽제의 제조

유산균 파쇄액 5mg

틘 80 적량

설탕 5g

이성화당 5g

정제수 적량

전체 50ml

상기의 성분을 정제수에 넣고 잘 교반한 다음 50ml의 유리병에 충진하고 멸균하여 시럽제를 제조한다.

제제실시예 E : 연고제의 제조

유산균 파쇄액 5mg

디에탄올아민 1.5g

폴리비닐피롤리돈 5g

프로필렌글리콜 30g

증류수를 가하여 전체 100ml로 함

상기의 성분을 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 유산균 파쇄액을 포함하는 조성물은 멜라닌 합성을 저해하는바, 피부 미백 또는 개선 효과가 있어 새로운 화장료, 약제 및 건강식품으로 이용될 수 있다.