알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수있는 젖산 박테리아 |
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申请号 | KR1020037003576 | 申请日 | 2001-09-21 | 公开(公告)号 | KR1020030034178A | 公开(公告)日 | 2003-05-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
申请人 | 소시에떼 데 프로듀이 네슬레 소시에떼아노님; | 发明人 | 제르몽쟈끄에두아르; 코르테시브레즈; 모에비아; 프릿슈로돌프; | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
摘要 | 본 발명은 알레르기 반응을 일으키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 신규한 종의 젖산 박테리아에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역허용원 펩티드를 포함하는 단백질을 발달시키는 젖산 박테리아 종의 발생 및 알레르기 반응을 일으키는 개인의 경향을 감소시키는 그 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 미생물 또는 그 활성 분획을 포함하는 음식 또는 약학 조성물에 관한 것이다. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
权利要求 | 폴리펩티드에 이종인 면역허용원 펩티드를 함유하는 폴리펩티드를, 펩티드가 위/십이지장 효소들에 의한 분해에 안정성 있고, 면역허용원 특성을 유지하며 폴리펩티드 표면에 표현되도록 발현하는 젖산 박테리아 그룹의 박테리아 종. 제 1 항에 있어서, 락토바실러스 또는 비피도박테리움에서 선택되는 박테리아 종. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드가 표면 단백질, 세포내 단백질 또는 박테리아에 의해 분비된 단백질에서 선택되는 박테리아 종. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역허용원 펩티드가 음식물에서 유래되는 박테리아 종. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액을 포함하는 음식 조성물. 제 5 항에 있어서, 우유, 요구르트, 굳은 우유, 치즈, 발효유, 우유기재 발효품, 아이스크림, 발효 시리얼 기재 산물, 우유 기재 파우더, 유아용 유동식 또는애완동물 음식으로 구성된 군으로부터 선택되는 음식 조성물. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 박테리아 종이 10 7 내지 10 11 cfu/투약 형 범위의 양으로 그 안에 함유되는 음식물. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액을 함유하는 약학 조성물. 제 8 항에 있어서, 박테리아 종이 10 10 내지 10 12 cfu/투약 형 범위의 양으로 그 안에 함유되는 약학 조성물. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 상청액의 알레르기 치료용 섭취성 담체 제조를 위한 용도. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 음식 또는 약학 조성물의 알레르기 치료용 섭취성 담체 제조를 위한 용도. 제 11 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 또는 비강 경로로 투여되는 용도. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 박테리아 종 또는 그 일부를 포함하는 백신. 제 13 항에 있어서, 용해된 박테리아의 세포막 분획을 이용하는 백신. |
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说明书全文 |
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분획 | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | F11 | F12 | F13 | F14 | F15 |
질량(g) | 52 | 13.9 | 11 | 11.8 | 2.57 | 1.94 | 4.37 | 13.1 | 5.01 | 6.53 | 1.05 | 3.46 | 1.9 | 2.67 | 28.8 |
농축펩티드 | - | T6T17T18 | T23 | T23 | - | T7T9 | T20T21T24 | T9T12T24 | T12T21 | T10T21 | T11 | T10 | T10T11 | T10T11 | - |
펩티드는 단리하고 서열 분석 하였다. 그 서열은 도 1 에 도시되어 있다.
Pecquet R, Bovetto L, Maynard F, Fritsche R 에 상세히 개시된 다른 실험들에서 다양한 펩티드가 면역허용원으로 입증되고, 보빈 B-락토글로블린의 트립신 가수분해에 의해 수득된 펩티드들이 생쥐에서 특이 경구 내성을 유도하였다(J. Allergy Clin Immunol, 105: 514-21, 2000; 본 명세서에 참고로 혼입됨).
b) 면역허용원 펩티드 합성
하기 리스트와 같은 대조군 펩티드 T13 뿐만 아니라 상기 참고자료에 확인된β-락토글로블린(BLG) T6, T17 및 T6/T17의 3 개의 면역허용원 펩티드를 잉여 Cys 잔기 뿐만아니라 BLG 서열의 측면 잔기와 함께 화학적으로 합성하였다:
c) 동물 실험
다양한 펩티드의 면역허용원 특성의 평가를 위해, IFFA-Credo(L'Abresle France)로부터 수득된 암컷 Balb/c 생쥐가 사용되었다. 동물들은 모두 우유가 없는 음식을 공급하여 생장시켰다. 실험 초기에 동물들은 생후 3 주였다. 위관 영양법으로 천연 β-락토글로블린(체중 1g 당 5 mg), 다양한 양의 분해된 β-락토글로블린 및 다양한 양의 상기 a)에 따라 수득된 다른 펩티드를 공급하였다. 대조군 생쥐는 식염수를 섭취시켰다. 상기 음식으로 5 일 후, 모든 생쥐를 면역 시스템의 특이성을 평가하기 위해 비관련 항원으로서 β-락토글로블린 및 난백 알부민(등급 V, Sigma)로 면역접종하였다. 전신 감작 21 일 후에 지연된 형태의 과민증 측정 (DTH)을 면역 전후에서 왼쪽 뒷다리부의 두께를 비교함으로써 수행하였다. 면역 24 시간후에 동물의 다리부의 두께를 측정하였다(Δ두께(mm)로 표현). 그 후, 혈액을 모든 생쥐로부터 취하고, 비장을 취하여 그룹 처리에 따라 저장하였다. 각 그룹의 비장세포 특이 증식 분석을 수행하였다. 장 내용을 각각 수집하였다. 혈청 및 장 샘플을 각 분석 수행전까지 각각 -80 ℃ 에서 동결시켰다. 항-β-락토글로블린 IgE 및 항-난백 알부민 IgE 수준을 혈청 및 장 샘플 둘다에서 측정하였다.
d) IgE 항체 분석
혈청 및 장액을 희석한 후 ELISA를 사용하여 항-β-락토글로블린 및 항-난백 알부민 IgE 항체를 두번 분석하였다. 20 마리의 비 면역 생쥐의 저장된 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플의 희석도를 계산함으로써 역가를 측정하여, 음성 대조군의 흡광도의 두배를 얻어었다. 역가는 희석도의 역수의 log10으로 표현하였다.
e) 세포 배양
비장세포 용액을 PBS로 균질화하고 정제하였다. 세포를 β-락토글로블린 또는 식물적혈구응집소 A(phytohemagglutinin A)의 존재하에서 공 배양하였다. 삼중수소로 표지된 티미딘([ 3 H]-Thy(Amersham, Zuerich)을 배양 마지막 6 시간 동안 첨가하고, 플레이트를 수확하고 신틸레이션 카운팅으로 분석하였다. 자극 지표를 3회 배양에 의해, 혼입된 [ 3 H]-Thy의 평균 cpm으로 표현된 블랭크를 뺀 시험 및 대조군의 비로 계산하였다.
f) 합성 펩티드의 경구투여에 의해 유도된 내성
그 면역허용원성에 대해 합성 펩티드를 비경구 생쥐 모델에서 분석하였다. 하기의 결과가 얻어졌다:
IgE 역가(log)(시험군/대조군) | 비장 림포사이트 SI(시험군/대조군) | MLN 림포사이트 SI(시험군/대조군) | |
T6 | 3.24/3.39 | 0.53 | 0.29 |
T17 | 2.67/3.39 | 0.31 | 0.41 |
T6 / T17 | 3.40/3.39 | 0.92 | 0.81 |
T13 | 3.20/3.39 | 1.70 | 0.87 |
SI: 자극 지표MLN: 창자간막림프절 |
합성 펩티드 T17이 IgE 생산 및 T 세포 증식 둘다를 감소시켰으나, 펩티드 T6 은 단지 T 세포 반응만을 억제하였음을 알 수 있다. 반대로, 펩티드 T13(대조군 펩티드)는 BLG 에 경구 내성을 유도하지 않았다.
실시예 2
재조합 폴리펩티드의 구성
실시예 1 에서 면역허용원 특성이 존재함이 확인된 펩티드 T6 및 T17를 세포 표면 부착 프로테아제에 융합시켜 박테리아의 표면에 나타나게 하였다. 음성 대조군으로 β락토글로블린의 N-말단의 일부를 구성하는 펩티드 T13을 사용하였다.
세포 표면 부착 프로테아제(상기)는 락토바실러스 불가리쿠스의 단백질로서 그 서열은 Gilbert 등 J. Bacteriol, 178, 3059-3065에 공개되었다. 이 단백질은 효소의 세포 방출을 위한 33 아미노산의 리더 펩티드(전-지역), 이어서 절단시 효소의 단백질 분해 활성의 활성화를 위한 일련의 154 아미노산(후-지역) 그리고 활성 부위를 위한 700 - 800 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로하는 2000 아미노산 단백질이다. 후 지역(약 1000 아미노산)이 절단의 특이성과 생성된 펩티드의 세포내 수송 및 세포벽에 고정되는데 역할을 한다는 것이 제안되어왔다. 이 프로테아제는 세포벽 펩티도글리칸 구조에 특이 공유결합하는 말단의 200 아미노산의 그 카르복실 말단으로 세포벽에 고정된다.
이 프로테아제 유전자를 하기 두 프라이머를 사용하여 그 프로모터와 1차 증폭하였다:
5'-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3'
(BamHI 자리를 지니는 유전자의 프로모터 상류)
5'-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3'
(XbaI 자리를 지니는 유전자의 rho-독립 터미네이터 하류)
증폭 산물을 BamHI 및 XbaI로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단한 젖산 박테리아 벡터 pNZ124로 클로닝하고 전기영동으로 플라스미드 없는 (베타-갈락토시다아제 및 프로테아제 음성) 락토코쿠스 락티스 내로 도입하였다.
클로닝된 프로테아제의 활성사이트 지역을 목적 펩티드/폴리펩티드 서열로 교체하였다. 이를 달성하기 위해, 클로닝된 프로테아제를 리더 펩티드의 절단부위 서열의 50 bq 하류에 위치한 NheI 및 하류로 추가 800 bp에 위치한 PvuI으로 절단하였다. 목적 펩티드(10 아미노산 이하)를 코딩하는 DNA 서열을 두개 올리고뉴클레오티드로서 두 제한 효소 부위 사이에 삽입하였다. 이는 잡종되었을 때 그 말단에 두 제한효소 자리를 만들도록 고안된 것이다. 올리고뉴클레오티드의 고안은 프로테아제 유전자에의 결합시 재조합 단백질의 리딩 프레임이 개방되어 유지되는 것을 고려하였다.
보다 큰 폴리펩티드의 삽입은 두 제한효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 DNA 증폭으로 달성되었다. 증폭산물을 그 제한효소로 절단하였다. 두 경우에서, DNA 절편을 프로테아제 유전자와 연결하고, 락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 존소니 에 전기영동으로 도입하였다.
펩티드 T6 및 T17를 각각 포함하는 재조합 플라스미드 구성을 부다페스트 조약에 따라 2000 년 9 월 22 일자에 Institute Pasteur 에 기탁하였고, 기탁증 no. CNCM I-2563 및 CNCM I-2564를 각각 수령하였다.
실시예 3
락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 존소니 의 형질전환
형질전환 목적을 위해, 락토코쿠스 락티스 종(MG1363, 플라스미드 없음) 및 락토바실러스 존소니 종 La1(액세스 번호 CNCM I-1225로 Institute Pasteur에서 구할 수 있음)를 GasPak 혐기성 시스템에서 37 ℃ 에서 MRS 배양액에서 밤동안 성장시켰다. 이 배양액의 부분 표본을 0.5 M 수크로오스를 함유하는 또다른 배양액(MRS)을 접종하는데 사용하였다. 2 % 에서 200 ml MRS + 0.5 M 수크로오스로의 추가적 재 접종후 배양액을 0.6의 OD 595 까지 성장시켰다. 세포를 4 ℃ 에서 5000 rpm으로 10 분동안 원심분리하여 수집하고, 펠릿을 1/2 부피의 1 M 수크로오스 및 2.5 mM CaCl 2 를 함유하는 용액으로 한번, 그리고 1/4 부피의 1 M 수크로오스 및 2.5 mM CaCl 2 를 함유하는 용액으로 한번 세척하고, 원심분리후 수득된 펠릿을 1 M 수크로오스, 3.5ml의 2.5 mM CaCl 2 + 0.459 ml 87 % 글리세롤(10 % 최종농도)의 용액에 재현탁하였다. 세포를 형질전환에 바로 사용하거나 또는 -80 ℃에서 냉동하였다.
전기 영동을 위해 40 ㎕ 세포를 10 - 100 ng DNA( < 5 ㎕ 부피)와 혼합하여빙냉 0.2 cm 전기영동 큐베트에 이전시켰다. 빙냉 0.2 cm 전기영동 큐베트중 200 Ω, 25 ㎌, 2.5 ㎸에서의 펄스가 사용되었다. 큐베트에 1 ml의 MRS + 20mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 를 첨가하고, 현탁액을 적당한 온도( 락토코쿠스 락티스 는 30℃ 및 락토바실러스 존소니 는 37 ℃에서) 2 - 3 시간 동안 배양하였다. ts 플라스미드(pG+host9)를 사용할때 배양 온도는 30 ℃이다. 10 ㎕ 및 100 ㎕ 부분 표본을 각각 플라스미드 DNA의 형질전환에 적절한 항생제를 함유하는 MRS 아가 플레이트에 평판배양하고, 100 ㎕ 및 500 ㎕ 각각을 연결 믹스와 함께 형질전환 하였다. 플레이트를 상기와 동일한 온도에서 24 - 48 시간동안 혐기적으로 배양하였다.
선택 배지로서 에리트로마이신(2.5 ㎍/ml) 을 갖는 MRS 또는 카나마이신(5 ㎍/ml)을 갖는 MRS를 사용하였다.
실시예 4
면역허용원 BLG 펩티드에 대한 쥐 항혈청 및 모노클로날 항체의 발생
BLG 펩티드 T6, T17, T6/T17 및 T13(실시예 1 참조)를 말레이미드 활성화된 KLH에 연결하고 Titermax 보조제와 함께 사용하여 젖산 단백질 없는 음식으로 기른 쥐를 면역하였다. 최초 면역후 2 주 간격으로 115 일까지 채취한 혈액 샘플이 BLG 펩티드에 특이 항체를 함유하는 것이 ELISA에 의해 보여졌다.
또한 항 T6 및 항 T13 항혈청을 BLG의 천연(ELISA) 또는 변성 (SDS-PAGE + Western blot) 형과 반응시켰다. 항 T6 및 항 T17이 특이적으로 재조합 L.라틱스 의 표면에 발현된 BLG 펩티드를 인식함이 보여졌다. 그 결과는 표 I에 나타내어진다.
항-BLG 펩티드 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 비장을 면역된 쥐에서 회수하였다. 비장 세포를 표준 기술에 따라 골수종 세포와 융합하였고, 1 회 선별에서 이미 항 T6 또는 항 T7 항체중 어느 하나를 생산하는 세포 집단을 확인하였다. 웰당 1개 단일 세포의 존재를 보장하는 세포 선별기를 사용하여 이들 세포의 클로닝을 성취하였다.
실시예 5
항체에 의한 면역허용원 펩티드의 검출
항체에 의해 접근가능하고 인지되는 방식으로 젖산 박테리아가 면역허용원펩티드를 발현하는지 아닌지를 확인하기위해, 재조합 유전자를 함유하는 박테리아를 50 ml 배양액에 생장시키고, 세포를 원심분리로 수집하였다. 그후 세포를 50 ml TBS로 2 회 세척하고, 6ml TBS에 현탁하였다. 현탁액 75 ㎕를 웰에 넣고(하프 웰 편평 바닥 ELISA 플레이트), 플레이트를 뚜껑없이 37 ℃ 에서 24 시간 동안 방치하여 웰을 건조시켰다. 플레이트를 비결합 박테리아가 씻겨나갈 때까지 TBS/PBS로 3 회 세척하고, 그 후 웰을 TBS 카세인(1.5g/l)로 2 시간동안 37 ℃ 에서 블러킹 처리하였다. 웰에 특이 펩티드에 관한 항체를 함유하는 쥐 항혈청을 첨가하였다. 웰을 RT에서 0.2 % Tween 20을 함유하는 TBS-카세인 중 희석액을 사용하여 밤동안 배양하였다. 그 후, 웰을 TBS로 3 회 세척하고, 발달 항체(HRP-접합 염소 항-쥐 IgG)를 웰에 첨가하고, 0.2 % Tween 20을 함유하는 TBS-카세인 용액에서 희석하여 37 ℃ 에서 배양하였다. 웰을 TBS로 3 회 세척하고, OPD/H 2 O 2 로 발색시키고 490 nm 에서 측정하였다.
락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 존소니 두종 모두 면역허용원 펩티드가 항체에 의해 인식되었음을 시사하는 양성 반응을 나타냄이 관찰될 수 있었다.
실시예 6
L. 불가리쿠스 prtB 단백분해효소의 아미노산 잔기 472 - 659 에 관한 토끼 항혈청의 제조
아미노산 잔기 472 - 659(아미노산 번호 1 은 개시 메티오닌임)를 코딩하는 prtB 타겟 서열(bp 1414 - 1977)은 주형으로서 pMD114 및 하기 서열
5'-GCGGATCCGGCTTGGGCGGTGCAGATG-3'(5'-BamHI 자리 포함)
의 상류 프라이머(prtB 5'-1414) 및 하기 서열
5'-CGCAAGCTTGTGCGAAGTGTTCATGGC-3'(5'-HindIII 자리 포함)
의 하류 프라이머(prtB 3'-1977)을 사용하여 증폭되었다.
Taq DNA 중합효소(Perkin-Elmer)를 사용하여 95 ℃ 에서 30 초 동안 변성 단계, 56 ℃ 에서 30 초 동안 프라이머 결합 단계 그리고 72 ℃ 에서 45 초동안 신장하는 단계로 구성된 3 사이클, 그 후 60 ℃ 에서 결합단계를 갖는 27 사이클로 특이 PCR 산물을 수득하였다.
탈염, 프라이머 및 dNTP의 제거(고순도 PCR 산물 정제 키트, Roche) 후, 샘플을 BamHI 및 HindIII로 소화하고, 그 후 아가로스 겔 전기영동하여, 목적 DNA 밴드를 겔로부터 회수하였다(EZNA 겔 추출 키트, Peqlab).
정제된 증폭 산물을 pQE-9 E.coli 발현 벡터 (Qiagen)의 BamHI 및 HindIII 부위 사이의 6-히스티딘 택을 코딩하는 서열 하류에 연결하였다.
E.coli 종 M15[pREP4]를 상기 벡터로 형질전환하고 이종 단백질의 발현을 배양액의 1mM IPTG-매개 유도로 얻었다.
1 리터 배양액의 세포를 펠릿화하고 변성 조건(8M 요소)하에서 용해시켰다. 맑은 용해질을 원심분리로 수득하고 Ni 2+ -NTA 아가로스 비드(Qiagen)에 로딩하고, pH 8.0 에서 평형을 맞추고, 6-히스티딘 표지 단백질을 결합하게 하였다. pH 6.3 에서의 세척단계 후, 재조합 단백질을 pH 4.5에서 용출시켰다.
상기 물질을 100 mM 트리스-Cl(pH 7.5)로 중화하고, 비신콘산(bicinchoninic acid) 단백질 분석(Pierce)으로 정량하고, 그 농도를 동일한 버퍼를 사용하여1mg/ml로 조절하였다.
항원을 완전한 Freund 보조제 중에 유화하고, 다중 진피주사로 두마리 토끼에 투여하였다. 주사는 0, 14, 28 및 56 일에 수행하였다. 최후 채혈은 80 일에 수행하였다.
놀랍게도 강한 항혈청 반응성이 세포표면상 L. 불가리쿠스 prtB 단백분해효소를 발현하는 재조합 Lc 에서 ELISA으로, 그리고 단백분해 효소의 분비형을 발현하는 재조합 Lc의 배양 상청액에서 면역블로팅으로 확인되었다.
본 발명은 특정 서열 및 가능하게는 면역허용원 펩티드의 배치가 유지되고, 안정성이 보존되고, 따라서 개인의 면역시스템에 의해 인지되고 가공될 수 있는 면역허용원 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 신규한 젖산 박테리아 종을 제공하며 이로써 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있다.