新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法

本発明は、ラクトコッカス（Lactococcus）に属する新規乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳に関する。
本願は、２００７年２月１３日に出願された特願２００７−０３２６４６号に基づいて優先権を主張し、その内容をここに援用する。

ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌（以下、「ビフィズス菌」という）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つである。 ビフィズス菌は、腸内細菌のバランスを回復する整腸作用や、免疫増強作用、発ガン抑制作用等を有することが知られている。 このため、近年、生活者の健康志向の高まりと共に、ビフィズス菌発酵乳等の、生きているビフィズス菌を含む食品への需要が高まっている。

ビフィズス菌は、乳性培地における増殖性が悪い。 このため、発酵乳中に一定量の、例えば１×１０ ^７ ＣＦＵ／ｍＬのビフィズス菌を含有させるために、通常、様々な生育促進物質を添加することが行われている。 しかし、該生育促進物質は一般的に高価であり、かつ、風味が損なわれるおそれもある。 また、ビフィズス菌は、酸性条件下での保存が難しく、死滅し易い。 このため、発酵乳製品等が流通する過程で、発酵乳製品中の生きているビフィズス菌量は加速度的に減少してしまう。
そこで、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善することにより、生きているビフィズス菌を多く含有する発酵乳を製造し得るばかりではなく、生きているビフィズス菌が、製造直後と同様に、消費者が摂食する時点においても豊富に含有されている発酵乳を製造し得ることが期待できる。

ビフィズス菌以外の乳酸菌と混合発酵をさせることにより、該生育促進物質等を添加することなく、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善する種々の方法が開示されている。 発酵乳製造におけるビフィズス菌の生育性を改善させる方法については、例えば、（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）およびビフィズス菌を含有することを特徴とするヨーグルト及びその製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

その他、発酵乳のビフィズス菌の保存生残性を改善させる方法については、例えば、（２）乳を主成分とする培地で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、並びにダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスを混合培養することを特徴とするビフィズス菌発酵乳の製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。

特許第３３６４４９１号公報

特許第３０６８４８４号公報

しかしながら、上記（１）の方法では、ビフィズス菌の生育が促進され、発酵時間を短縮することができるものの、特許文献１には、ビフィズス菌の保存生残性については一切記載がない。 一方、上記（２）の方法では、特定のビフィズス菌と特定の乳酸菌とからなる混合菌を用いることにより、増殖促進効果と生残性改善効果の両方が認められるものの、ビフィドバクテリウム・ブレーベ以外のビフィズス菌、例えば食品に汎用されているビフィドバクテリウム・ロンガムについては、一切記載がない。

本発明は、ビフィズス菌の生育性や保存生残性を改善させ得る乳酸菌を用いた発酵乳の製造方法、及び、該製造方法により製造された発酵乳を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地における発酵性に優れた乳酸菌の菌株について、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養による発酵試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性や、発酵終了後に急冷して１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性を有する乳酸菌を見出した。 そして、該乳酸菌を用いることにより、ビフィズス菌を大量に含有し、かつ保存生残性にも優れた発酵乳が得られることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、乳酸菌として、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌と、下記の菌学的性質を有するラクトコッカス（Lactococcus）属菌を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
（１）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３７℃の温度範囲で１６時間培養した場合に、培地が凝固する発酵性、（２）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇ以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性、及び（３）１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上とする、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性。
また、本発明は、前記ラクトコッカス属菌が、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しないことを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス属菌が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）である、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ラクトコッカス属菌の菌株が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４２）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５７）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４４）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４５）、及び、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６）からなる群より選ばれる１以上である、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）である、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７である、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記乳酸菌として、更に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）を用いることを特徴とする、発酵乳の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の発酵乳の製造方法により製造された発酵乳を提供するものである。

本発明の発酵乳の製造方法により、従来に無くビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムを多く含有する発酵乳を、効率よく製造することができる。 また、本発明の発酵乳は、生きているビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムの含有量が、流通過程においても充分に維持されるため、より整腸効果が高く、健康管理上も有用である。

本発明は、ビフィズス菌と、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するラクトコッカス属菌を用いて発酵させることを特徴とする、発酵乳の製造方法である。 特にビフィドバクテリウム・ロンガムを用いて発酵させる発酵乳の製造に適している。

本発明で用いられるビフィドバクテリウム・ロンガムとしては、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株等がある。 ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株は、乳性培地での発酵性、流通過程での耐酸性、及び胃酸耐性に優れているため、特に好ましい。 ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号 ３０５−８５６６））に平成１３年１０月３１日に受託されている。

本発明で用いられるラクトコッカス属菌は、上記（１）、（２）、及び（３）の特性を有するものである。
（１）は、発酵性に関するものである。 １０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３７℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができるほど増殖が早く、強い発酵性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、ビフィズス菌、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育性等をより効果的に改善することができる。 ここで、「培地が凝固する」とは、酸発酵により、培地のｐＨが乳蛋白質の等電点を下まわり、乳蛋白質が凝集し、培地が凝固することを意味する。 また、「１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地」は、還元脱脂粉乳（例えば、森永乳業社製）を１０質量％濃度で水に溶解して調製することができる。

通常、ラクトコッカス属菌に適した発酵温度範囲は、２０〜３０℃であるが、本発明で用いられるラクトコッカス属菌は、２５〜３７℃の温度範囲で強い発酵性を有する菌である。 すなわち、本発明で用いられるラクトコッカス属菌は、ビフィズス菌、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムに適した発酵温度範囲（３０〜４０℃）において、充分な発酵性を有する菌である。

（２）は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生育促進性に関するものである。 １０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地等の乳性培地は、ｐＨが４．６付近になると、通常、含有されるカゼイン等が沈殿し、培地全体が凝固し、風味、食感及び外観が優れたものになる。 このため、発酵乳製品を製造する場合には、一般に、ｐＨが４．６付近に達した時に、急冷等をすることにより発酵を停止する。 したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇ以上という高濃度にすることができるような生育促進性を有する乳酸菌であれば、発酵乳製造時に、発酵乳中のビフィズス菌、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム含有量をより効果的に改善することができる。

（３）は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの保存生残性促進性に関するものである。 発酵乳製品の品質保持期限は、一般に、１０℃以下の保存条件で２週間程度である。 したがって、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上とすることができるような保存生残性促進性を有する乳酸菌であれば、品質保持期限終了間際においても充分量のビフィズス菌、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムを含有し得る発酵乳を製造することができる。

本発明で用いられるラクトコッカス属菌は、例えば以下の方法により得ることができる。 まず、各種の試料から菌株を分離し、この中から１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性が優れたもの、すなわち、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地で、２５〜３７℃の温度範囲で１６時間培養した時に、培地を凝固させることができる発酵性を有するものを選択する。 次いで、選択された菌とビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、上記（２）および（３）で規定されるビフィズス菌の生育促進性及び保存生残性促進性を有する菌株を選択することにより得ることができる。 更に、キシロース資化性を有さず、かつ、ダイアセチル及びアセトインを生成しない菌株を選択することが好ましい。

以下、さらに詳細に説明する。
１． 菌株の取得 本発明者らは、前記の性質を有する菌株を自然界から取得すべく、日本国内の自然界から採集したサンプルを嫌気性希釈液（１９８０年叢文社発行、光岡知足著「腸内菌の世界」３２２ページ。以下、参考文献１と記載する。）で希釈し、Briggs liver broth（前記参考文献１、３１９ページ）の平板に塗布し、３０℃で嫌気培養した。 そして得られたコロニーの中で連鎖球菌の形態を示し、かつ塗布標本の顕微鏡観察によりグラム陽性である菌を釣菌した。 該釣菌した菌を、ＢＬ寒天培地平板に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。 これらの菌株を下記の方法を用いて、まず、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地中での発酵試験を行い、上記（１）で規定される発酵性を有する菌株を２０株得た。 続いて、ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験を行い、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌数を５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇ以上とすることのできる生育促進性と、ｐＨが４．４〜４．６に達した時に急冷して、１０℃で２週間保持した場合の、ビフィドバクテリウム・ロンガムの生残率を３０％以上とすることのできる保存生残性促進性を有する菌株を５株取得した。 該５菌株はそれぞれ、ＭＣＣ８５２、ＭＣＣ８５７、ＭＣＣ８５９、ＭＣＣ８６５、ＭＣＣ８６６と名付けられた。

２． 菌学的性質 前記５菌株の菌学的性質を、以下に示す。 なお、菌学的性質を測定するための試験は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Peter HA Sneath編、第２巻、Williams and Wilkins Company、１９８６年）にほぼ従って行った。

（Ｉ）菌形（ＢＬ寒天培地平板で３０℃、７２時間嫌気培養した時の光学顕微鏡観察時）
大きさ：直径１〜２μｍ
形 状：連鎖球菌（ＩＩ）グラム染色性：陽性（ＩＩＩ）リトマスミルク：凝固（ＩＶ）芽胞形成：陰性（Ｖ）グルコースからのガス生成：なし（ＶＩ）運動性：なし（ＶＩＩ）カタラーゼ活性：陰性（ＶＩＩＩ）アルギニンデカルボキシラーゼ試験：陽性（ＩＸ）クエン酸からのガス産生：陰性（Ｘ）温度感受性（６０℃３０分間及び６５℃３０分間）：何れも感受性（ＸＩ）グルコースの分解産物：Ｌ−乳酸

上記（Ｉ）〜（ＸＩ）に示す菌学的性質は、前記５菌株全てに共通しており、かつ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインであるＡＴＣＣ１９４３５とも共通していた。 （ＸＩＩ）生育温度、（ＸＩＩＩ）食塩耐性、（ＸＩＶ）ｐＨ耐性、（ＸＶ）メチレンブルー耐性、（ＸＶＩ）アルギニンからのアンモニアの産生、及び（ＸＶＩＩ）糖の発酵性については、各々、表１に示す性質を示した。 なお、糖の発酵性は、光岡の糖発酵性用培地（１９７４年、光岡知足著「乳酸菌の細菌学」、臨床検査１８、１１６３〜１１７２ページ）を用いて、２８種類の糖について試験を行った。

以上の結果から、前記５菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス菌種の菌学的性質を、共通して有していることが明らかである。 すなわち、前記５菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス菌種であることが確認された。 一方、上記（ＸＩＩ）〜（ＸＶＩＩ）に示す菌学的性質から、前記５菌株は、特に、キシロース資化性を有さない点で、タイプストレインとは異なることが明らかである。

そこで、出願人は、前記５菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号 ３０５−８５６６））に新規菌株として寄託した。 受託番号は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２株がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４２、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７５７、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５９株がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４４、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６５株がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４５、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６６株がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６である。 なお、寄託日は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５９、８６５、及び８６６株が平成１８年１２月１日であり、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株が平成１９年１月１０日である。

３．１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地での発酵性試験 １０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９５℃で３０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、各菌株のスターターを３％（Ｖ／Ｖ）接種し、２５、３０、及び３７℃の各温度で１６時間培養した。 得られた培養液を急冷し、凝固状況、ｐＨ、及び含有される乳酸菌数を測定した。 乳酸菌数の測定は、市販されているＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研機材社製）平板で行なった。 測定結果を表２に示す。
なお、対照株として、特許文献２に記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。

ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、８６６のそれぞれの菌株、すなわち、本発明で用いられるラクトコッカス属菌を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが４．４〜４．６まで低下して培地が凝固した。 また、含有される乳酸菌数も１×１０ ^９ ＣＦＵ／ｇ前後であり、非常に増殖・発酵性の良いことが分かった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた場合には、何れの温度条件においても、ｐＨが５．５以上であり、培地は凝固しなかった。 また、本発明のラクトコッカス属菌と比較して、特に３０℃以上において、乳酸菌数が顕著に少なかった。

４． ビフィドバクテリウム・ロンガムとの混合培養試験（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株との混合培養試験 対照株として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、８６６の５菌株のそれぞれのカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャーを調製した。
また、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）入り１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを３０ｍＬ接種し、３０℃で１６時間培養して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株のカルチャーを調製した。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスの各菌株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）を接種し、３７℃で１６時間培養して発酵乳を得た。 該発酵乳を急冷し、ｐＨ及び含有されるビフィズス菌数を測定した。 さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。 ビフィズス菌数の測定は、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）平板で行なった。 測定結果を表３に示す。

ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、８６６の５菌株をそれぞれ用いた発酵乳は、発酵後ｐＨがおよそ４．５であり、ビフィズス菌数が５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇ以上に達した。 また、該発酵乳を１０℃で２週間保存した場合のビフィズス菌生残率は、何れも８０％以上であった。
一方、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスのタイプストレインＡＴＣＣ１９４３５株を用いた発酵乳は、発酵が進まず、発酵後ｐＨが５．０以上であり、１０℃での保存試験が不可能であった。 また、発酵終了直後のビフィズス菌数もおよそ１×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇであり、本発明のラクトコッカス属菌と比較して、顕著に少なかった。

すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、及び８６６の５菌株は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスの公知の他の菌株よりも、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株に対する生育促進性及び保存生残性促進性が優れていることが明らかである。
また、特許文献２に記載のダイアセチル及びアセトインを生成しないラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスと、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、ビフィドバクテリウム・ブレーベを用いた場合と異なり、特許文献２に記載されているような、ビフィズス菌の増殖促進効果と生残性改善効果の何れの効果も得ることができないことも明らかである。

（２）ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株との混合培養試験 本発明に用いられるラクトコッカス属菌の、ビフィドバクテリウム・ロンガムに対する生育促進性及び保存生残性促進性を、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株とビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株を用いて確認した。
まず、後記実施例１に記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のカルチャー、及び、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャーを調製した。
また、後記実施例２に記載の方法で、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）及びラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）の混合カルチャーを調製した。
さらに、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地を９０℃で３０分間殺菌し、該脱脂粉乳培地に対し、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のスターターを１０％（Ｖ／Ｖ）接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャーを調製した。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）若しくはビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％（Ｖ／Ｖ）を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。 該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。 さらに、１０℃で２週間保存し、保存後１週間及び２週間におけるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャー１．５％（Ｖ／Ｖ）若しくはビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャー１．５％（Ｖ／Ｖ）と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．４％（Ｖ／Ｖ）を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。 測定結果を表４に示す。

ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株と、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株の両株とも、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株と混合培養することにより、発酵乳中のビフィズス菌数は顕著に増大した。 また、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率も、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株で７１％、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株で３１％と、何れも３０％以上であった。
これに対し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株と混合培養しなかった場合には、１０℃で２週間保存後のビフィズス菌生残率は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株で２０％であり、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株では生きているビフィズス菌は検出されなかった。
なお、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株に代えて、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５９、８６５、又は８６６株をそれぞれ用いた場合にも同様の結果が得られた。

すなわち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、８６６のそれぞれの菌株は、保存生残性に優れたビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株以外のビフィドバクテリウム・ロンガムに対しても、優れた生育促進性及び保存生残性促進性を有することが明らかである。

５． 特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物との比較試験 まず、上記４（２）記載の方法で、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のカルチャー、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャー、及び、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャーを調製した。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー０．０１％（Ｖ／Ｖ）を接種し、３７℃でｐＨが４．６になるまで培養して発酵乳を得た。 該発酵乳を急冷し、含有されるビフィズス菌数を測定した。
一方、対照として、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地を９０℃で１０分間殺菌し、該還元脱脂粉乳培地に対し、上記のように調製したビフィドバクテリウム・ロンガム タイプストレインＡＴＣＣ１５７０７株のカルチャー１％（Ｖ／Ｖ）と、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスの混合物「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）２％（Ｖ／Ｖ）を接種し、３８℃でｐＨが４．６になるまで培養して得た発酵乳のビフィズス菌数を同様に測定した。 なお、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」は、特許文献１に記載の「ＥＺＡＬ ＭＲ０１４」（Ｒｈｏｄｉａ社製）に相当する混合物である。

ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株を用いた発酵乳では、ビフィズス菌数は５．５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇであった。 これに対し、「ＥＺＡＬ ＭＡ１４」を用いた発酵乳を１０ ^６倍に希釈した希釈溶液からは、ビフィズス菌が全く検出されず、該発酵乳に含有されるビフィズス菌数は１×１０ ^６ ＣＦＵ／ｇ以下であることが判明した。

すなわち、特許文献１記載のラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスを、ビフィドバクテリウム・ロンガムとを、混合培養した場合には、特許文献１に記載されているような、ビフィズス菌の生育促進及び発酵時間の短縮という効果を得ることができないことが明らかとなった。

以上のように、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５２、８５７、８５９、８６５、８６６の５菌株、すなわち、本願発明に用いられるラクトコッカス属菌は、ビフィズス菌に適した発酵温度範囲における乳性培地で、強い発酵性を示し、さらに、ビフィドバクテリウム・ロンガムと混合培養した場合に、ビフィズス菌の生育及び保存生残に対し、優れた促進効果を示すことから、ラクトコッカス属の公知の菌株にみられなかった性質を持っていることは明らかである。 また、本願発明に用いられるラクトコッカス属菌は、ダイアセチル及びアセトインを生成しないため、風味の良い発酵物を製造し得ることも期待できる。

本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス属菌の前培養に用いられる培地は、通常用いられる培地であれば、特に限定されるものではないが、乳性培地であることが好ましい。 取り扱いが簡便であるため、還元脱脂粉乳培地が特に好ましい。 該還元脱脂粉乳培地の濃度は、３％（Ｗ／Ｗ）以上が好ましく、８％（Ｗ／Ｗ）以上が特に好ましい。 その他、前培養に用いられる培地には、酵母エキス等の生育促進物質や、Ｌ−システイン等の還元剤等を添加することができる。 特にビフィズス菌は乳性培地での増殖性が低いため、生育促進物質を添加した培地を用いることが好ましい。 例えば、０．１〜１％（Ｗ／Ｗ）の酵母エキスを含有した培地を用いることができる。 また、前培養に用いられる培地は、殺菌処理をしたものを用いる。 該殺菌処理は、通常用いられる方法で行うことができ、例えば、８０〜１２２℃で５〜４０分間、好ましくは８５〜９５℃で５〜３５分間の加熱処理により行うことができる。

本発明において、ビフィズス菌とラクトコッカス属菌を用いた発酵に用いられる発酵用ベースは、発酵乳の製造に通常用いられるベースであれば、特に限定されるものではない。 該ベースは、例えば、牛乳、脱脂乳、生クリーム、バター、全粉乳、脱脂粉乳等に、必要に応じて蔗糖等の甘味料、ペクチン、果実、フルーツジュース、寒天、ゼラチン、油脂、香料、着色料、安定剤、還元剤等を配合し、常法に従って殺菌、均質化、冷却等することにより調製することができる。

ビフィズス菌とラクトコッカス属菌のスターターの発酵用ベースへの接種比率は、特に限定されるものではないが、１００：１〜１：１０が好ましく、１０：１〜１：１が特に好ましい。 また、発酵用ベースへ添加する量も、特に限定されるものではないが、ビフィズス菌とラクトコッカス属菌を合わせた添加量が、発酵用ベースに対して０．０１〜１０（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、０．１〜５（Ｖ／Ｖ）％が特に好ましい。

本発明に用いる乳酸菌には、ラクトコッカス属菌のビフィズス菌に対する生育促進効果及び保存生残性促進効果を阻害しない範囲において、ビフィズス菌とラクトコッカス属菌の他に、他の乳酸菌を含有してもよい。 該他の乳酸菌は、通常発酵乳の製造に用いられるものであれば、特に限定されないが、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスが好ましい。 ビフィズス菌とラクトコッカス属菌を合わせた摂取量と、その他の乳酸菌を合わせた摂取量の、スターターとしての発酵用ベースへの接種比率は、ラクトコッカス属菌のビフィズス菌に対する効果を阻害しない限り、特に限定されるものではないが、１０００：１〜１０：１が好ましい。

本発明の発酵乳の製造方法における、混合培養の温度は、３０℃〜４０℃が好ましく、３６℃〜３８℃が特に好ましい。 ビフィズス菌と本発明に用いるラクトコッカス属菌の両方が充分に生育可能な温度範囲であるためである。 また、培養時間は、製造する発酵乳の種類によって適宜決定されるが、５〜１８時間が好ましい。

培養後得られた発酵乳は、そのまま食品としてもよく、例えば、均質化して液状に加工してもよい。 その他、例えば、果汁、果実等を適宜添加してもよい。 また、容器への充填等は、特に限定されるものではなく、通常用いられる方法で行うことができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳（森永乳業社製）を水に溶解して得た１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。 一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳、ペクチン、及び蔗糖からなる原料を混合溶解して得られた、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖５．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。 該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８５７株のカルチャー５０ｍＬとビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７のカルチャー株５００ｍＬを接種し、３７℃１６時間培養して発酵乳を得た。 該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを得た。 得られたドリンクヨーグルトは乳酸酸度０．６８％、ｐＨ４．６４、粘度７５ｍＰａ・ｓであり、７．０×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。 この該ドリンクヨーグルトを１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は５．２×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇであり、生残率は７４％であった。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。 一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。 また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。 該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６６株のカルチャー５００ｍＬ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５ｍＬを接種し、５００ｍＬ容の樹脂容器に充填し、密封し、３７℃７時間培養した後、直ちに冷却した。 得られた発酵乳は乳酸酸度０．７２％、ｐＨ４．５５であり、５．８×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。 この該発酵乳を１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．６×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇであり、生残率は６２％であった。

１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６５株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。 一方、０．２％（Ｗ／Ｗ）酵母エキス入り１１％（Ｗ／Ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のシードカルチャーを１００ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。 また、１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１５００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ハンゼン社製）とラクトバチルス・ブルガリクス（ハンゼン社製）の混合カルチャー５０ｍＬを接種し、４２℃５時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．４％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分１２．２％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５００Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。 該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＭＣＣ８６５株のカルチャー５Ｌ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株のカルチャー５Ｌ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃７．５時間培養した後、直ちに冷却した。 得られた発酵乳をさらに攪拌によりカードを破砕し、破砕発酵乳と、常法により調製したブルーベリープレザーブを、７：３の割合で混合し、攪拌して均一にした後、１２０ｍＬ容の酸素バリア性紙容器に充填した。 得られたブルーベリー果肉入り発酵乳は乳酸酸度０．８０％、ｐＨ４．４５であり、５．５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇのビフィズス菌を含有していた。 この該ブルーベリー果肉入り発酵乳を１０℃で２１日間保存した時のビフィズス菌数は３．９×１０ ^８ ＣＦＵ／ｇであり、生残率は７１％であった。

本発明の製造方法により、消費期限終了直前であっても、生きているビフィズス菌を従来に無く多く含有する発酵乳を製造することができるため、発酵乳等の製造分野で利用が可能である。