由于前述的见解，本发明者重复了广泛的调查研究以克服上述问题。 结果发现，在日本专利申请公开第Sho-63-94938号中被认为对提高双歧 杆菌的存活力没有效果并且由于在培养早期会杀死双歧杆菌而在日本专 利申请公开第Sho-54-14585号中被认为是不合用的一种特定乳酸菌与一 种特定双歧杆菌混合培养，甚至在不含生长促进剂的纯乳培养基中都能 得到比用普通培养方法明显更高的双歧杆菌活菌数；并且，在发酵乳的 储存期间双歧杆菌的存活力能得到高度提高，导致了本发明的完成。
因此，本发明提供了一种生产双歧杆菌发酵乳的方法，它包括在主 要由乳构成的培养基中混合培养短双歧杆菌和既不产生丁二酮也不产生 3-羟基丁酮的乳酸乳球菌乳亚种；由此得到的双歧杆菌发酵乳；以及一 株新菌株：乳酸乳球菌乳亚种YIT2027(FERM BP-6224)。 贯彻本发明的最好方式
通常利用乳酸乳球菌乳亚种来生产干酪等，但本发明中所应用的菌 株的特征在于它既不产生丁二酮也不产生3-羟基丁酮。具体例子包括菌 株YIT2027(FERM BP-6224)和菌株YIT2008(ATCC19435)，其中特别 优选菌株YIT2027。应当指出，新分类学中的“乳酸乳球菌乳亚种”包含 上述日本专利申请公开第Sho 63-94938号中应用的旧分类学上的乳链球 菌双乙酰乳亚种，然而，后者会产生丁二酮和3-羟基丁酮，因而与本发 明中应用的菌株显著不同。本发明中应用的乳酸菌对应于旧分类学上的 乳链球菌乳亚种，在上述文献中，这种细菌被视为具有既不产生丁二酮 也不产生3-羟基丁酮的能力，对提高双歧杆菌的存活力没有效果。由于 在有氧条件下进行单核细胞培养时，培养48小时后所得产物的酸度至少 为10，因此，本发明中应用的乳酸菌不包括日本专利申请公开第Sho 54-14585号中所指的“缓慢产酸乳酸菌”。它相当于一群原来被认为在培 养早期会使双歧杆菌死亡因而不适用的乳酸菌。
属于既不产生丁二酮也不产生3-羟基丁酮的乳酸乳球菌乳亚种的 菌株YIT2027的生物化学特性列在表1和表2。
表1 YIT202 7 乳酸乳球菌 乳亚种a) 乳酸乳球菌乳亚 种b) 革兰氏染色 形态 过氧化氢酶 由葡萄糖产生气体 增殖 10℃ 40℃ 45℃ 60℃30分钟 2％NaCl 4％NaCl 6.5％NaCl 0.1％亚甲蓝乳 40％胆汁 精氨酸的水解 七叶苷的水解 淀粉的水解 马尿酸盐的水解 硝酸盐的还原 V-P检验 GC含量(％) 阳性 球形 - - + + - + + + - + + + - - - - 阳性 球形 - - + + - + + - + d d d 38.6(Tm法) 阳性 球形 - - 35.8 a)：数据描述于“Bergey手册(Bergey’s Mannual)Vo.2” b)：数据描述于“微生物，第6卷，第1期(1990)” +：阳性，-：阴性，d：11到89％阳性 表2   YIT2027 乳酸乳球菌 乳亚种a) 乳酸乳球菌 乳亚种b) 糖发酵实验 阿拉伯糖 木糖 鼠李糖 核糖 甘露糖 果糖 半乳糖 蔗糖 麦芽糖 纤维素二糖 乳糖 海藻糖 蜜二糖 棉子糖 松三糖 甘露糖醇 山梨糖醇 七叶苷 水杨苷 苦杏仁苷 山梨糖 肌醇 菊粉 淀粉 α-甲基-D-葡糖苷 葡萄糖 糊精 糖原   -   -   -   +   +   +   +   -   +   +   +   +   -   -   -   -   -   +   +   +   -   -   -   +   -   +   +   - - + - - - - d + + + + d + + + + - - - - - + d d + a)：数据描述于“Bergey手册，第2卷” b)：数据描述于“微生物，vol.6，No.1(1990)” +：阳性，-：阴性，d：11-89％阳性
根据表1和表2，显然可以看出，本发明所说的菌株在许多特性方面 与已知的乳酸乳球菌乳亚种相一致，但在马尿酸盐的水解及木糖、蔗糖 和糊精的糖发酵特性方面有所不同。因此，本发明的申请人鉴定它为一 种新菌株，并将其作为FERMBP-6224，按照布达佩斯条约，保藏于国际 贸易和工业部国立生物科学和人类技术研究所(地址：1-3，Higashi 1- chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，Japan)(最初保藏日： 1997年2月10日)。
在本发明中应用的短双歧杆菌例子包括菌株YIT4065[FERM BP-6223， 保藏于国际贸易和工业部国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，Japan)，保藏日期： 1996年2月29日]和菌株YIT4014(ATCC15700)，其中特别优选菌株 YIT4065。
在本发明中，用于混合培养上述双歧杆菌和乳酸菌的培养基只要主要 由乳组成，即没有任何特别限定。例如，常规用于乳酸菌培养、乳固体 物质含量约为8-20wt.％的任何乳(全乳，脱脂乳以及这种乳粉的重溶 乳)都可以应用。双歧杆菌或乳酸菌常规培养基中常常添加的生长促进 剂，如酵母提取物或者蛋白胨，或者像L-抗坏血酸或L-半胱氨酸这样的 还原剂在这里不需要使用，但是当它对终产物风味的影响降到可以容许 的范围内或者并不妨碍终产物的性质时是可以添加的。
双歧杆菌引酵物(starter)与乳酸菌引酵物的接种比率优选为10000∶ 1-1∶1，其中特别优选100∶1-10∶1。接种量优选0.5-10wt.％(在 下文将简称为“％”)，特别优选1-2％。
培养是在既能容许双歧杆菌又能容许乳酸菌生长的温度下进行的，更 具体地说就是35-39℃，特别优选36-38℃。进行培养，直至双歧杆菌 和乳酸菌达到稳定增殖状态。更具体地说，优选培养至pH值达到4.2- 4.6，特别是pH4.3-4.5。
培养得到的产物可以不经进一步处理而作为含有双歧杆菌和乳酸菌的 食品提供，或者根据需要加入甜味剂、果汁、水、香料等用来调整其浓 度及风味后作为饮料提供。此外，它可以作为含有双歧杆菌和乳酸菌的 干燥粉末或片剂形式的食品或制剂提供。对培养产物的加工方法或者加 工后产品的形态没有限制，只要不会引起这些细菌死亡即可。
如上所述，与既不产生丁二酮也不产生3-羟基丁酮的乳球菌乳亚种共 同培养时，短双歧杆菌既呈现有增殖促进效应也有存活力提高效应。一 些缓慢产酸的乳酸菌如嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaris)具有双歧杆菌的增殖促进效应，但它们没有明显的存活力提高 效应。两种效应出现的原因据推测是因为，当双歧杆菌与乳球菌乳亚种 联合应用时，考虑到乳球菌乳亚种和短双歧杆菌最佳培养温度之间的差 别，能够通过控制温度而在对双歧杆菌有利的条件下进行培养，并且在 它们之间建立了一种容许短双歧杆菌营养需求和氧耐受性改善的共生关 系。
-实施例-
本发明在下文将通过实施例更具体地描述。但是应当记住本发明并不 限于这些实施例。
实施例1
与乳酸菌混合培养后产生的对双歧杆菌的增殖促进效应和存活力提高效 应的证实
用作发酵底物的10％重溶脱脂乳培养基在95℃加热30分钟消毒并冷 却到37℃后，每份接种1％的短双歧杆菌菌株YIT4065(FERM BP-6223) 引酵物。向所得培养基中接种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌或乳酸乳球 菌乳亚种菌株YIT2027(FERM BP-6224)，接种量0.01％。将接种后的培 养基和只接种了上述双歧杆菌的对照培养基在37℃培养至pH值为4.3。 对培养后的双歧杆菌活菌数进行测量。培养后的细胞液倒入一玻璃制成 的容器内，随后在10℃厌氧存放2周。再测量存放后的双歧杆菌活菌数。 结果见表3。 表3     乳酸菌   双歧杆菌活菌数(/ml)   当培养完成时   存放后     没有加入   8.0×108   *     嗜热链球菌   6.3×107   7.0×105     保加利亚乳杆菌   1.5×107   1.0×105     乳酸乳球菌乳亚种   2.0×109   3.4×108
*在pH5.0时培养终止，因此没有进行存放检测。
如表3所列，已认识到，不仅与对照相比，而且与同其它乳酸菌一起 培养的短双歧杆菌相比，与菌株YIT2027一起培养的短双歧杆菌具有更 多双歧杆菌活菌数，表明具有明显的双歧杆菌增殖促进效应。甚至在细 胞液存放后，在低pH值时双歧杆菌活菌数仍保持高水平，表明具有明显 的存活力提高效应。
实施例2 在含8％脱脂乳固体物质的产品中双歧杆菌存活力的证实(厌氧存放)
将1％的短双歧杆菌菌株YIT4065(FERM BP-6223)引酵物和0.01％的 乳酸乳球菌乳亚种菌株YIT2027(FERM BP-6224)引酵物接种到20％重溶 脱脂乳培养基中，然后在37℃培养至pH值达到4.4。用常规方法匀浆培 养产物。向匀浆化产物中加入通过培养嗜热链球菌获得的细胞液、甜味 剂、含有HM果胶的糖浆作为稳定剂以及调味香料以调整风味，借此得到 一种脱脂乳固体物质含量为8％的发酵乳品。作为一个相比较的实施例， 将短双歧杆菌菌株YIT4065接种在常规使用的含0.05％酵母提取物的10％ 重溶脱脂乳培养基中，相似地获得了一种含8％脱脂乳固体物质的发酵乳 品。这些制品分别装入玻璃制成的容器中，随后在10℃厌氧存放2周。 测量存放前和存放后双歧杆菌的活菌数。结果见表4。 表4     培养方法            双歧杆菌活菌数(/ml) 存放0天  存放7天 存放14天     常规方法     (应用酵母提取物) 3.1×108  4.5×107  1.7×107     本发明方法     (应用乳酸菌) 6.9×108  5.1×108  1.8×108
由表4可明显看出，本发明应用于发酵乳饮料的生产时，能够得到高 活菌数的双歧杆菌，并且，即使在存放后，保持的活菌数至少10倍于应 用生长促进剂的常规方法所保持的活菌数。
实施例3 会4％脱脂乳固体物质的产品中双歧杆菌存活力的证实(有氧存放)
将1％的短双歧杆菌菌株YIT4065(FERM BP-6223)引酵物和0.01％的 乳酸乳球菌乳亚种菌株YIT2027(FERM BP-6224)引酵物接种到20％重溶 脱脂乳培养基中，然后在37℃培养至pH值达到4.4。用常规方法匀浆培 养产物。向匀浆化产物中加入通过培养嗜热链球菌获得的细胞液、甜味 剂、含有HM果胶的糖浆作为稳定剂以及调味香料以调整风味，借此得到 一种脱脂乳固体物质含量为4％的发酵乳品。作为一个相比较的实施例， 将短双歧杆菌菌株YIT4065接种在常规使用的含0.05％酵母提取物的10％ 重溶脱脂乳培养基中，相似地获得了一种含4％脱脂乳固体物质的发酵乳 品。这些制品分别装入玻璃制成的容器中，随后在10℃存放2周。测量 存放前和存放后双歧杆菌的活菌数。结果见表5。 表5     培养方法              双歧杆菌活菌数(/ml)   存放0天   存放7天   存放14天     常规方法     (应用酵母提取物)   1.5×108   1.1×107   9.2×105     本发明方法     (应用乳酸菌)   4.7×108   1.0×108   2.3×107
从表5可以明显看出，甚至对于脱脂乳固体物质含量低的产品或者生 产后暴露于有氧存放条件的产品，都具有明显较高的存活力提高效应， 因此本发明的高度通用特征得到了证实。 工业开发的性能
如上所述，根据本发明，即使不添加生长促进剂也能明显提高双歧杆 菌活菌数，另外，发酵乳存放期间的双歧杆菌活菌数也能显著提高。由 于不含丁二酮和3-羟基丁酮，根据本发明得到的双歧杆菌发酵乳有良好 的风味。