新型乳酸菌以及使用其的青贮饲料或发酵饲料的制备方法 |
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| 申请号 | CN201280031729.4 | 申请日 | 2012-03-19 | 公开(公告)号 | CN103781898A | 公开(公告)日 | 2014-05-07 |
| 申请人 | 雪印种苗株式会社; | 发明人 | 北村亨; 大渊俊; 本间满; 上西宽司; 副岛洋; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的在于提供一种乳酸菌，针对因糖含量少而现有的乳酸菌无法得到充分的 发酵 品质改善效果地进行丁酸发酵的 青贮 饲料 或发酵饲料原料，其抑制丁酸发酵，能够稳定制备高品质的青贮饲料或发酵饲料。本发明提供在单糖和 二糖 的总计含量为0.1～0.4 质量 %的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌，含有该乳酸菌的青贮饲料制备用 微 生物 制剂，以及利用该制剂的青贮饲料或发酵饲料的制备方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种乳酸菌，其特征在于，在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素。 |
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| 说明书全文 | 新型乳酸菌以及使用其的青贮饲料或发酵饲料的制备方法技术领域背景技术[0002] 将作为家畜主食的牧草、饲料作物等在厌氧条件下进行乳酸发酵而得的青贮饲料是当今乳品业中必须的饲料，制备优质的青贮饲料对于奶农而言是非常重要的技术。在此之际，被称为不良发酵的问题屡屡发生，这是在青贮饲料中与乳酸菌相比丁酸菌的增殖更有优势，结果造成青贮饲料中的丁酸含量变高的问题。丁酸浓度变高的青贮饲料不仅引起牛的嗜好性降低，采食量的减少，而且会成为与酮症等疾病相关的问题。因此作为防止因这样的丁酸菌引起的腐败的一个方法，在青贮饲料制备时添加乳酸菌的技术正在普及。因而作为使用的乳酸菌已有大量报告，但大多数是通过加速乳酸发酵的进行，降低pH来抑制丁酸发酵。但是有时这些乳酸菌尤其是在因水分高、糖含量少、或者土壤的混入多等易发生丁酸发酵的条件下不能充分抑制丁酸菌，现在因丁酸发酵而制备腐败的青贮饲料也成为问题。 [0003] 作为添加到青贮饲料的乳酸菌出现效果的条件，材料牧草中的可溶性糖类最低也需要在干燥物中为5.0～6.0%（换算为原料物是1.0～3.0%）以上（非专利文献1）。另一方面，由于糖含量少的牧草、饲料作物也有很多，所以目前为止报告的青贮饲料用的乳酸菌不能充分发挥效果，丁酸发酵的情形多。 [0004] 然而，在乳酸菌的一部分中，已知有通过发酵或者培养会产生作为抗菌性蛋白质的细菌素。其中乳酸链球菌素是作为乳酸菌的一种的乳酸乳球菌的一部分株产生的抗菌性蛋白质，其由34个氨基酸构成且在分子内含有羊毛硫氨酸、3-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、脱氢酪氨酸、2-氨基丁酸。乳酸链球菌素中存在几个类似物，目前为止结构确定的类似物包括乳酸链球菌素A、乳酸链球菌素Z、乳酸链球菌素Q这3种。此外，近年报告了乳房链球菌（Streptococcus Uberis）产生的乳酸链球菌素U和乳酸乳球菌产生的乳酸链球菌素F。 [0005] 由于乳酸链球菌素以包括丁酸菌的革兰氏阳性菌为中心具有大范围的抗菌谱，将其添加到青贮饲料，具有抑制丁酸菌的可能性。实际上，在食品领域，自被WHO和FAO认可以来，作为类似物之一的乳酸链球菌素A在世界范围内广泛作为奶酪、蔬菜罐头等的食品保存剂加以利用。但是，将乳酸链球菌素直接添加到食品时，需要通过乳酸菌的培养产生高浓度的乳酸链球菌素并将其提取、精制、干燥的工序，通常存在费用昂贵的问题。此外，乳酸链球菌素具有速效性的抗菌作用，但其效果很难持续，因与添加对象的成分发生相互作用有时其效果会降低。 [0006] 因此，研究尝试将产生乳酸链球菌素的乳酸菌添加到奶酪、酸菜、豆味噌、米味噌等食品中（非专利文献2～5），但是没有将其实际用于作为青贮饲料原料的牧草、饲料作物、食品制造副产物等。作为其理由，一般认为这些青贮饲料原料与食品素材相比，缺乏包含乳酸菌的生长所必须的糖的营养源，没有像添加到食品素材时那样的杀菌工序，所以与其它微生物的竞争也很激烈，因而即使添加对食品素材有效果的产生乳酸链球菌素的乳酸菌，也不会获得充分的效果。因此，还报告了在合成培养基中产生高浓度乳酸链球菌素的乳酸菌、在发酵大麦提取物培养基中产生乳酸链球菌素（专利文献1、非专利文献6），但还没有即使在合成培养基或发酵大麦提取物培养基中能够产生高浓度的乳酸链球菌素，在营养源不同的青贮饲料材料中也产生高浓度乳酸链球菌素的现有文献。 [0007] 此外，在以青贮饲料作为对象的情形中，已报告了将产生细菌素的乳酸乳球菌RO50株添加到青贮饲料材料草的青贮饲料制备方法（专利文献2），但也报告了没有获得充分的发酵品质改善效果的案例，效果不稳定，进而在青贮饲料中是否产生细菌素完全不清楚（非专利文献7、8）。此外，专利文献3中，也有关于添加产生乳酸链球菌素的乳酸菌和乳酸链球菌素耐性乳酸菌的青贮饲料制备方法的报告，虽然在青贮饲料中检测到200IU/g的乳酸链球菌素活性，但是由于与不产生乳酸链球菌素的其它乳酸菌株添加区相比pH、有机酸含量、相对于全氮的氨态氮浓度等发酵品质没有变化，所以是在常见的乳酸菌也能够获得良好的发酵的糖含量（干燥物中5.0%以上、原料物中1.0%以上）下的结果，对于该乳酸菌在糖含量少的严格条件下的效果而言还不明确。 [0008] 现有技术文献 [0009] 专利文献 [0010] 专利文献1:日本再表WO2005/080550号公报 [0011] 专利文献2:日本特开2004-41064号公报 [0012] 专利文献3:EP1273237A1 [0013] 非专利文献 [0014] 非专利文献1:增子孝义（1999），青贮饲料科学的进步，Dairy Japan公司，99-101[0015] 非专利文献2:Delves-Broughton,J.et al.Antonie van Leeuwenhoek（1996）69:193-202 [0016] 非专利文献3:Harris，L.J.et al.Appl.Environ.Microbiol.（1992）58:1484-1589[0017] 非专利文献4:Takeo Kato et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.（1999）63:642-647[0018] 非专利文献5:Takeo Kato et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.（2001）65:330-337[0019] 非专利文献6:Furuta Y.et al.J.Biosci.Bioeng.（2008）106:393-397[0020] 非专利文献7:蔡义民等，畜产草地研究成果信息（2002）No.2:53-54 [0021] 非专利文献8:小林寿美等，日草志（2010）56:39-46 发明内容[0022] 本发明的目的在于提供以下技术，即，选拔即使在容易进行丁酸发酵的青贮饲料的发酵条件下也具有高浓度产生乳酸链球菌素能力的乳酸菌，并将含有具有该能力的乳酸菌的微生物制剂添加到青贮饲料中而稳定地制备高品质的青贮饲料或发酵饲料。 [0023] 本发明人为了选拔在青贮饲料环境中发挥能力的乳酸菌，制成完全不添加糖类而单糖和二糖含量非常低的牧草的煮汁培养基，利用其来培养乳酸菌，筛选出产生乳酸链球菌素的菌株。通过该筛选，在牧草煮汁培养基中，成功选拔出显示比已知乳酸链球菌素产生株强的乳酸链球菌素活性的乳酸菌，从而完成本发明。 [0024] 即，本发明涉及以下的［1］～［11］。 [0025] [1].一种乳酸菌，其特征在于，在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素。 [0026] [2].根据[1]所述的乳酸菌，其中，在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.7质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生100IU以上的乳酸链球菌素。 [0027] [3].根据[1]或[2]所述的乳酸菌，其中，在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生100IU以上的乳酸链球菌素。 [0028] [4].根据[1]～[3]中任一项所述的乳酸菌，是乳酸乳球菌SBS-0001株（NITE BP-1107）或乳酸乳球菌SBS-0002株（NITE BP-1108）。 [0029] [5].一种青贮饲料制备用微生物制剂，其特征在于，含有在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌。 [0030] [6].根据[5]所述的青贮饲料制备用微生物制剂，其中，乳酸菌是[2]～[4]中任一项所述的乳酸菌。 [0031] [7].根据[5]或[6]所述的青贮饲料制备用微生物制剂，其中，进一步含有具有耐酸性的乳酸菌。 [0032] [8].根据[7]所述的青贮饲料制备用微生物制剂，其中，具有耐酸性的乳酸菌是副干酪乳杆菌SBS-0003株（NITE BP-1109）。 [0033] [9].一种青贮饲料或发酵饲料的制备方法，其特征在于，添加青贮饲料制备用微生物制剂，所述青贮饲料制备用微生物制剂含有在单糖和二糖的总计含量为0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌。 [0034] [10].根据[9]所述的青贮饲料或发酵饲料的制备方法，其中，乳酸菌是[2]～[4]中任一项所述的乳酸菌。 [0035] [11].根据[9]或[10]所述的青贮饲料或发酵饲料的制备方法，其中，所述青贮饲料制备用微生物制剂进一步含有具有耐酸性的乳酸菌。 [0036] 本发明提供在大多受苦于青贮饲料或发酵饲料的丁酸发酵的奶农中，在作为实际的青贮饲料发酵条件的糖含量少的材料中也能产生乳酸链球菌素的乳酸菌。此外，提供通过在上述乳酸菌中加入具有耐酸性的乳酸菌从而抑制丁酸发酵且使品质良好的乳酸发酵成为可能的微生物制剂。由此本发明使制造安全性高、家畜采食性好的青贮饲料或发酵饲料成为可能。 具体实施方式[0037] 本发明的产生乳酸链球菌素的乳酸菌通过选拔以下的乳酸菌而得到，该乳酸菌在单糖和二糖的总计含量为1.0质量%以下、优选为0.7质量%以下、更优选为0.4质量%以下的牧草煮汁培养基中产生乳酸链球菌素。 [0038] 本发明中，在用于选拔产生乳酸链球菌素的乳酸菌的牧草煮汁培养基中使用的牧草只要是用于青贮饲料或发酵饲料的牧草即可，无特别限制，例如可例举苜蓿、三叶草、梯牧草、鸭茅、草芦、偃麦草、意大利黑麦草、多年生黑麦草、高羊茅、草甸羊茅、Festulolium（フェストロリウム）、草地早熟禾、小糠草、坚尼草、非洲虎尾草、象草等牧草。优选假定易发生丁酸发酵的条件，优选使用糖含量少的苜蓿、三叶草、梯牧草、鸭茅、草芦、偃麦草、坚尼草、非洲虎尾草、象草等。作为牧草的形态，可以以割取的鲜草的状态使用，也可以以冷藏或冷冻保存的状态使用，也可以以将通风干燥、冷冻干燥的牧草粉碎后的干燥粉末的状态使用。此外，也可以利用作为饲料流通的苜蓿草颗粒（ルーサンペレット）或干草块。 [0039] 作为牧草煮汁培养基，使用仅将这些牧草用热水浸出的浸出液作为营养源的培养基。此处热水的温度优选为50～100℃，进一步更优选为70～100℃。此外，牧草浸出到热水的时间优选为10～180分钟，进一步优选为30～120分钟。浸出液优选根据需要过滤除去固体成分来使用。为了在糖含量少的条件下选拔产生乳酸链球菌素的乳酸菌，优选用水将牧草煮汁培养基中的单糖和二糖的总计含量稀释调整为1.0质量%以下、优选为0.7质量%以下、进一步优选为0.4质量%以下来使用。此外，优选的单糖和二糖的总计含量的下限是0.1质量%，更优选为0.2质量%。 [0040] 用于选拔本发明的产生乳酸链球菌素的乳酸菌的培养条件，是常用的乳酸菌生长的条件即可，例如可以在牧草煮汁培养基中以0.1～1.0质量%接种，在25～35℃静置培养8～24小时。 [0041] 通常，由于乳酸链球菌素产生株具有乳酸链球菌素耐性，所以作为1次筛选，当然可选拔在乳酸链球菌素添加培养基中生长的株。这种情况下，作为用于选拔的培养基，可使用含有乳酸链球菌素100～1000IU/mL的MRS培养基等。进一步地，与本发明的目的一致的乳酸链球菌素产生菌的选拔，可通过测定培养基上清液中的乳酸链球菌素浓度或测定乳酸链球菌素活性来进行。乳酸链球菌素浓度例如可通过高效液相色谱法等进行测定。此外，乳酸链球菌素活性以对乳酸菌或者丁酸菌的乳酸链球菌素敏感性株的抗菌活性为指标进行测定，例如，通过测定对保加利亚乳杆菌的抗菌活性来进行测定。乳酸链球菌素活性优选以乳酸链球菌素含量进行测定。培养液上清液的乳酸链球菌素含量可依照通常知晓的方法进行测定，例如，其活性可通过Agar Well法进行测定。即，在1.5%琼脂MRS培养基的平板上放置青霉素杯（直径8mm），此处将混合有作为指示菌的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus Tbulgaricus）JCM1002 株的培养液0.1%的0.75%琼脂MRS培养基重叠。琼脂固化后，去除青霉素杯，将其作为抗菌试验用平板使用，将过滤除菌后的培养液上清液添加到由青霉素杯形成的孔中，在37℃厌氧培养24小时后，测定对指示菌的阻止圆的直径。利用作为标准物的乳酸链球菌素制剂（Sigma公司，含有乳酸链球菌素2.5%），能够测定每1μg乳酸链球菌素的活性值是40IU（每1μg乳酸链球菌素制剂为1IU）。 [0042] 本发明的乳酸菌是，在单糖和二糖的总计含量是0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌。 [0043] 此外，本发明的乳酸菌的优选方式是在单糖和二糖的总计含量是0.1～0.7质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生100IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌。更优选为在单糖和二糖的总计含量是0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生100IU以上的乳酸链球菌素的乳酸菌。 [0044] 进而，进一步优选所述牧草煮汁培养基的单糖和二糖的总计含量为0.2～0.4质量%。该培养基的乳酸链球菌素产生量是每1mL上清液为40IU以上，优选为100IU以上，进一步优选为100～400IU，进一步优选为100～300IU。 [0045] 此外，本发明的乳酸菌即使在pH为5的低pH条件下也具有在单糖和二糖的总计含量是0.1～0.4质量%的牧草煮汁培养基中每1mL上清液产生40IU以上的乳酸链球菌素的能力。在如此的低pH条件下产生乳酸链球菌素意味着本发明的乳酸菌能发挥更长时间效果。 [0046] 作为上述的产生乳酸链球菌素的乳酸菌，优选为属于乳球菌属的乳酸菌，进一步优选为属于乳酸乳球菌的乳酸菌。作为具体例子，可举出乳酸乳球菌SBS-0001株（NITE BP-1107）、乳酸乳球菌SBS-0002株（NITE BP-1108）、乳酸乳球菌SBS-0004株、乳酸乳球菌SBS-0005株，优选举出乳酸乳球菌SBS-0001株（NITE BP-1107）、乳酸乳球菌SBS-0002株（NITE BP-1108）。 [0047] 上述的SBS-0001株以及SBS-0002株保藏于（独）制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心（地址:日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8，邮编292-0818）（保藏日:平成23年06月15日）。 [0048] 由于本发明的乳酸菌具有即使在糖含量低的牧草的存在下也能生长、发酵的能力，能大量产生乳酸链球菌素，所以作为青贮饲料制备用微生物制剂的成分是有用的。 [0049] 上述的乳酸菌的培养可使用常见的乳酸菌用培养基进行。作为培养基，只要是用于乳酸菌培养的培养基即可，无特别限制，例如可使用GYP培养基（小崎道雄等（1992），乳酸菌实验手册，朝仓书店刊）、MRS培养基（de Man，J.C.et al.（1960），Journal of Applied Bacteriology，Vol.23，130-135）。关于培养条件无特别限制，通常可在pH5.0～7.0、25～40℃培养10～24小时。培养的乳酸菌可以以培养液或者将菌体浓缩的浓缩液的状态添加到青贮饲料或发酵饲料中，也可将这些液体以冷冻品的形式使用。此外，也可以以使培养的乳酸菌与适当的保护剂或基材一起冷冻干燥、喷雾干燥、流动层干燥而得到的粉末的状态进行使用。 [0050] 本发明的微生物制剂中，可含有一种或者多种本发明的产生乳酸链球菌素的乳酸菌株。此外，也可含有其它乳酸菌。特别地，通过含有具有耐酸性的乳酸菌，从而可以提供在抑制丁酸发酵的基础上还能够良好乳酸发酵的微生物制剂。这种情况下，其它乳酸菌当然优选为乳酸链球菌素耐性高的株。作为具有耐酸性的乳酸菌无特别限制，例如可举出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等。优选为副干酪乳杆菌SBS-0003株（NITE BP-1109）、鼠李糖乳杆菌SBT-2300株、植物乳杆菌畜草1号株，进一步优选为副干酪乳杆菌SBS-0003株（NITE BP-1109）。 [0051] 上述的SBS-0003株保藏于（独）制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心（地址:日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8，邮编292-0818）（保藏日:平成23年06月15日）。 [0052] 上述微生物制剂中的本发明的乳酸菌与具有耐酸性的乳酸菌的含有比例无特别限制，以质量比计优选为1:100～100:1，更优选为1:9～9:1，进一步优选为3:7～7:3。 [0054] 本发明中的微生物制剂可用于多种青贮饲料或发酵饲料的制备。作为用于青贮饲料或发酵饲料的制备的青贮饲料或发酵饲料原料只要是作为常见饲料使用的原料即可，无特别限制，例如作为牧草或饲料作物，可举出苜蓿、三叶草、梯牧草、鸭茅、草芦、偃麦草、意大利黑麦草、多年生黑麦草、高羊茅、草甸羊茅、Festulolium（フェストロリウム）、草地早熟禾、小糠草、坚尼草、非洲虎尾草、象草、燕麦、大麦、黑麦、高粱、苏丹草、日本稷子、玉米、饲料稻等。作为食品制造副产物，可举出啤酒粕、豆腐粕、茶粕、清酒粕、威士忌粕、甜菜渣、甘蔗渣、咖啡粕、果汁渣、羽衣甘蓝粕、淀粉粕等。作为农产副产品，可举出稻杆、麦杆、非标准蔬菜等。此外，也可以在将食品制造副产物、青贮饲料、农产副产品、干草、精饲料、维生素·矿物质制剂等混合制备的发酵TMR中添加。优选将这些青贮饲料或发酵饲料原料的水分调节为40～90质量%来使用。 [0055] 作为添加的方法，包括将微生物制剂溶解·混悬于水等中对原料喷雾的方法，将粉状的微生物制剂分布·混合于原料的方法等。 [0056] 添加的菌数，优选以总计每1g原料103～107个、优选为104～106个的方式进行添加。 [0057] 青贮饲料或发酵饲料通常在厌氧条件下发酵。用于发酵的容器，只要能够保持厌氧状态的程度即可，无特别限制，例如可举出地面青贮仓、青贮仓（スタックサイロ）、沟式青贮窖、青贮塔、地下青贮窖、混凝土筒仓、杯式筒仓（カップサイロ）、辊包（ロールベール）、柔性集装袋等。通常在外部气温（5～30℃左右）放置一周以上进行发酵。 [0058] 使用本发明的微生物制剂得到的青贮饲料或发酵饲料，由于丁酸发酵有效地被抑制，因此牛的嗜好性、采食量良好，而且不发生酮症。实施例 [0059] 以下，举出实施例对本发明进行说明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。 [0060] ＜实施例1＞牧草煮汁培养基中的乳酸链球菌素活性 [0061] 测定了各乳酸菌在牧草煮汁培养基中培养时的培养液上清液的乳酸链球菌素活性。 [0062] 牧草煮汁培养基按照以下方法制成。向苜蓿草颗粒100g中加入1升蒸馏水，沸水浴中液温达到90℃后熬煮30分钟。用纱布过滤，挤压残渣，将滤液进行离心分离后由滤纸进行过滤。将滤液定容为1升，分装于试管中，在高压釜（115℃，20分）中灭菌。 [0063] 牧草煮汁培养基中的糖含量，按照以下方法测定。在培养基360μl中加入乙腈840μl进行混合，室温静置15分钟。通过离心（15000rpm、15分钟）去除沉淀，将上清液用 0.2μm的过滤器过滤后以HPLC进行分析。将检测的单糖和二糖（木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖）的含量进行合计，作为糖含量。 [0064] 将如表1所示的各乳酸菌在MRS液体培养基中进行前培养，将该前培养液离心弃去培养基，在菌体中加入与培养基等量的生理盐水。将该菌体悬浮液以1%接种于牧草煮汁培养基中，32℃静置培养8小时，测定培养液的吸光度（660nm）。将该培养液离心，通过Agar Well法测定用0.2μm的过滤器去除菌体的培养上清液中的乳酸链球菌素活性。 [0065] [表1] [0066]菌株 SBS-0001 试验株 SBS-0002 试验株 RO50 对照株：产生细菌素 ATCC11454 对照株：产生乳酸链球菌素A JCM7638 对照株：产生乳酸链球菌素Z [0067] Agar Well法按照以下方式进行。在1.5%琼脂MRS培养基的平板上放置青霉素T杯（直径8mm），此处将混合有作为指示菌的保加利亚乳杆菌JCM1002 株的培养液0.1%的 0.75%琼脂MRS培养基重叠。琼脂固化后，去除青霉素杯，用作抗菌试验用板。将过滤除菌后的培养液上清液添加到由青霉素杯形成的孔中，37℃厌氧培养24小时后，测定对指示菌的阻止圆的直径。利用作为标准物的乳酸链球菌素制剂（Sigma公司，含有乳酸链球菌素 2.5%），每1μg乳酸链球菌素的活性值是40IU（每1μg乳酸链球菌素制剂为1IU）。 [0068] [表2] [0069]乳酸菌株 O.D.660 乳酸链球菌素活性(IU/mL) SBS-0001(实施例) 0.88 165.56 SBS-0002(实施例) 0.85 165.56 RO50(对照) 0.82 30.36 ATCC11454(对照) 0.75 0 [0070] 牧草煮汁培养基的糖含量:0.33% [0071] [表3] [0072]乳酸菌株 O.D.660 乳酸链球菌素活性(IU/mL) SBS-0001(实施例) 0.75 145.03 SBS-0002(实施例) 0.84 169.94 JCM7638(对照) 0.77 0 [0073] 牧草煮汁培养基的糖含量:0.31% [0074] [表4] [0075]乳酸菌株 O.D.660 乳酸链球菌素活性(IU/mL) SBS-0001(实施例) 1.15 192.91 SBS-0002(实施例) 1.21 229.66 JCM7638(对照) 1.14 96.05 [0076] 牧草煮汁培养基的糖含量:0.68% [0077] [表5] [0078]乳酸菌株 O.D.660 乳酸链球菌素活性(IU/mL) SBS-0001(实施例) 0.53 44.59 SBS-0002(实施例) 0.54 40.25 RO50(对照) 0.62 0 [0079] 牧草煮汁培养基的糖含量:0.33%，初期pH:5.0 [0080] 由表2、表3可知，已知产生乳酸链球菌素A的ATCC11454株、已知产生乳酸链球菌素Z的JCM7638株、已知产生细菌素的RO50株，在糖含量为约0.3%的牧草煮汁培养基中虽然以与SBS-0001株、SBS-0002株相同程度地生长（O.D.660），但是乳酸链球菌素活性非常弱。另一方面，SBS-0001株和SBS-0002株在糖含量为约0.3%的牧草煮汁培养基中显示非常高的乳酸链球菌素活性。 [0081] 此外，由表4可知，SBS-0001株和SBS-0002株在糖含量为约0.7%的牧草煮汁培养基中与在糖含量为约0.3%的牧草煮汁培养基中相比生长、乳酸链球菌素活性均出现增加。另一方面，JCM7638株仅具有SBS-0001株、SBS-0002株的一半以下的活性。 [0082] 由于青贮饲料在发酵过程中pH降低，因此为了发挥更长时间效果，优选即使在低pH下也产生乳酸链球菌素，但是众所周知乳酸链球菌素的产生伴随着培养pH降低会减少。由表5可知，对于牧草煮汁培养基的初期pH为5.0的情形，各菌株培养上清液中的乳酸链球菌素活性全部出现降低，RO50株的乳酸链球菌素活性为0，与此相对，SBS-0001株和SBS-0002株显示40IU/mL以上的乳酸链球菌素活性。 [0083] ＜实施例2＞青贮饲料制备和发酵品质 [0084] 将各乳酸菌添加到牧草，制备青贮饲料，调查发酵品质。 [0085] 乳酸菌即表6所示的菌株按照以下方式制成。向GYP液体培养基接种各菌株，37℃培养24小时。将培养液离心（6500rpm，15分钟），弃去上清液，向残留的菌体加入10%海藻糖、1%谷氨酸钠溶液进行混悬，并用冷冻干燥机进行干燥。 [0086] [表6] [0087] [0088] 青贮饲料制备按照以下方法进行。将梯牧草、鸭茅、草芦、偃麦草、意大利黑麦草、黑麦在出穗期进行割取，将苜蓿在开花期进行割取，切断为约2cm的长度。将各乳酸菌的冷5 冻干燥粉末溶解于水，在仅有1株的情形中，以每1g材料草为1.0×10cfu的菌数的方式向 4 材料草中添加并混合，在2株混合的情形中，分别以5.0×10cfu的菌数的方式向材料草中添加并混合。将这些材料草装入1升容积的聚乙烯制塑料瓶或者塑料制pouch袋（尼龙和聚乙烯的层叠膜）。向塑料瓶中塞入材料草600g，关闭盖子进行密封，向pouch袋中放入材料草100g，用市售的抽吸封口机将袋内的空气吸出并密封。将它们在25℃发酵2个月。对得到的青贮饲料用pH计分析pH，用HPLC分析有机酸含量。 [0089] [表7] [0090] 梯牧草青贮饲料的发酵品质(塑料瓶) [0091] [0092] [表8] [0093] 草芦青贮饲料的发酵品质(塑料瓶) [0094] [0095] [表9] [0096] 梯牧草青贮饲料的发酵品质(pouch袋) [0097] [0098] [表10] [0099] 鸭茅青贮饲料的发酵品质(pouch袋) [0100] [0101] [表11] [0102] 苜蓿青贮饲料的发酵品质(pouch袋) [0103] [0104] [表12] [0105] 草芦青贮饲料的发酵品质(塑料瓶) [0106] [0107] [表13] [0108] 偃麦草青贮饲料的发酵品质(塑料瓶) [0109] [0110] [表14] [0111] 意大利黑麦草青贮饲料的发酵品质(pouch袋) [0112] [0113] [表15] [0114] 黑麦青贮饲料的发酵品质(pouch袋) [0115] [0116] 由表7、8可知，在对于作为青贮饲料用乳酸菌而以市售制品使用的SBT-2300株而言几乎不能改善发酵品质的材料中，即使添加牧草煮汁培养基中的乳酸链球菌素产生能为40IU/mL以下的RO50株，也基本没有发酵品质改善效果或丁酸降低效果弱，与此相对，通过添加牧草煮汁培养基中的乳酸链球菌素产生能力高的SBS-0001株明显能够降低丁酸含量，青贮饲料发酵品质得到改善。 [0117] 由表9可知，SBS-0003株与SBT-2300株相比乳酸发酵能力优异，但是通过加入SBT-0001株、SBT-0002株，丁酸含量进一步降低。 [0118] 由表10、11可知，在对于SBT-2300株、SBS-0003株而言完全没有获得发酵品质改善效果的材料中，通过在SBS-0003株中加入SBS-0001株、SBS-0002株，丁酸含量大幅降低，发酵品质也大幅得到改善。 [0119] 由表9、10、11、12、13、14、15可知，在因未添加而发酵品质变坏、即使添加SBT-2300也未得到充分的发酵品质改善效果的多种材料中，通过向SBS-0003株添加SBS-0001株、SBS-0002株，丁酸含量大幅降低，发酵品质也大幅得到改善。 |
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