长双歧杆菌NCC2705(CNCMI-2618)和免疫疾病 |
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| 申请号 | CN201080031175.9 | 申请日 | 2010-05-07 | 公开(公告)号 | CN102869365A | 公开(公告)日 | 2013-01-09 |
| 申请人 | 雀巢产品技术援助有限公司; | 发明人 | V·珀蒂; C·加西亚-罗德纳斯; M·尤莉塔; G·普里乌特; A·梅赛尼尔; S·努特恩; | ||||
| 摘要 | 本 发明 总地涉及 预防 和/或 治疗 炎性和传染性 疾病 的领域，特别是通过加强内源性抗 微 生物 防御来预防和/或治疗。本发明的一个实施方案是长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的用途，用于治疗或预防与免疫系统相关的疾病，包括传染病。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包含长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物，用于治疗或预防传染病和免疫系统相关的疾病，包括传染病。 |
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| 说明书全文 | 长双歧杆菌NCC2705(CNCM I-2618)和免疫疾病[0001] 本发明总地涉及预防和/或治疗炎性和传染性疾病的领域，特别是通过增强内源性抗微生物防御来预防和/或治疗。本发明的一个实施方案是长双歧杆菌(B.longum)NCC2705(保藏号CNCM I-2618)的用途，用于治疗或预防与免疫系统相关的疾病，包括传染病。 [0003] 此外，这些上皮细胞通过产生并分泌抗微生物剂来限制细菌和其他微生物的进入，从而有助于宿主防御。这些抗微生物分子构成了先天免疫的基础防线的关键组成部分。 [0004] 防卫素是人类最重要的抗微生物肽的类别之一。防卫素由肺、皮肤、口腔、泌尿生殖器、呼吸道和胃肠道的上皮细胞产生。在这些中，存在着β-防卫素家族，包括防卫素1(hBD1)和防卫素2(hBD2)。 [0005] HBD1在各种粘膜表面中表达，如口腔粘膜、唾液腺、胃、小肠、结肠、肝和胰腺。HBD2也存在于多种粘膜表面的上皮细胞中，包括胃肠道的粘膜表面。此外，这两种防卫素还存在于唾液和气道表面流体中(Cunliffe，R.N.和Mahida，Y.R.2004，J Leukoc.Biol.75：49-58)。 [0006] HBD2以非常低的水平存在于正常组织中，并且其表达受到细菌和促炎性细胞因子的上调。与hBD2相反，HBD1是组成型表达的，HBD1从未显示出受到细菌或炎症的组成型上调(Ou，G.等，2009，Scand.JImmunol 69：150-161)。 [0007] 公知益生菌能够加强各种肠道防御系：免疫排斥、免疫排除和免疫调节。还已知益生菌刺激对微生物病原体的非特异性宿主抵抗，并且因此有助于微生物病原体的根除。 [0008] 然而，尽管这样，已经报道了hBD1的组成型表达不受益生细菌的影响(O’Neil，D.A.等，J Immunol 163：6718-6724)，并且受到共生菌株(大肠杆菌(Escherichia coli)和致病菌株(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))非常轻微的上调(Ou，G.等，2009，Scand.J Immunol 69：150-161)。 [0009] 目前益生菌的应用在于降低与肠道屏障机能障碍相关的疾病的风险(E.Isolauri等，2002，Gut 2002；50：iii 54-iii 59)。认为通过在消化道中的存活、酸和胆汁稳定性以及在肠道中粘膜表面的短暂定殖，益生菌是有效的。 [0010] 因此，大部分公开的文献涉及活的益生菌。然而，几个研究调查了通过非复制性细菌展现的益处，并且大部分表明了益生菌的灭活，例如，通过热处理灭活，导致了它们阐明的健康益处的丧失(Rachmilewitz，D.等，2004，Gastroenterology 126：520-528；Castagliuolo 等，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol.43：197-204；Gill，H.S. 和K.J.Rutherfurd，2001，Br.J.Nutr.86：285-289；Kaila，M.等，1995，Arch.Dis.Child 72： 51-53)。 [0011] 然而，在食品中使用活细菌的工作目前还具有几个缺点。活细菌通常不是非常抗应力的，并且因此难以以工业规模来操作而同时保持生活力。此外，对于一些产品类别，由于安全问题，将活的微生物加入配方中可能不是最佳选择。 [0012] 另一方面，提供非复制性益生菌微生物使得可以例如进行粉末状营养组合物的热冲调，同时对于消费者病人保留健康益处。 [0013] 基于此，希望使用非复制性细菌替代其活的对应物来工作，但这方面可获得的研究尚未有鼓舞人心的。 [0014] 在文献中已经报道了使用活的益生菌作为治疗或预防炎性肠病的策略，并且 最 近 由Dotan等 进 行 了 综 述(Dotan，I. 和D.Rachmilewitz.2005；Curr.Opin.Gastroenterol.21：426-430)。例如，八种活的益生细菌的高度浓缩混合物(VSL#3)已经显示出在人的复发性或难治愈的隐窝炎的预防(Gionchetti，P.等，2003，Gastroenterology124：1202-1209) 和 治 疗(Gionchetti，P. 等，2000，Gastroenterology 119：305-309； Mimura，T.等，2004，Gut 53：108-114)中是有效的。令人感兴趣地，使用DSS-诱发大肠炎的鼠模型，Rachmilewitz等(Rachmilewitz，D.等，2004，Gastroenterology 126：520-528)报道了用活的和γ-辐射的VAL#3而不是热杀灭的VSL#3的处理保护了免受大肠炎。相似地，热灭活的卷曲乳杆菌(L.crispatus)不能保护免受DSS-诱发的大肠炎，但其活的对应物明显降低了体重的减轻和消化道中的MPO活性(Castagliuolo等，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol.43：197-204)。这些研究表明益生菌就消化道炎症而言，活的比其非复制性对应物更有效。 [0015] 发现灭活的路氏乳杆菌(L.reuteri)(热灭活的和γ-辐射的)不能够降低TNFα诱导的T84细胞的IL-8产生，而其活的对应物呈现出显著的有益效果(Ma，D.等，2004，Infect.Immun.72：5308-5314)。 [0016] 因此，本领域中对在工业条件下易于操作、安全且易于施用并且可以预防和/或治疗炎性和传染性疾病的天然组合物存在着需求，特别是通过加强内源性抗微生物防御来预防和/或治疗。 [0017] 理想地，天然组合物应当从益生菌培养物制得，特别是从目前公认的和消费者了解的用于赋予健康益处的益生菌微生物制得。有利地，组合物应当含有非复制性细菌，并且应当比其活的对应物更有效。 [0018] 发明人解决了这种需求。 [0019] 因此，本发明的目的是改进现有技术，并且提供一种天然组合物，该组合物可以预防和/或治疗炎性和传染性疾病，特别是通过增强内源性抗微生物防御来预防和/或治疗，并且其满足上述需求。 [0022] 发明人描述了长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)对诱导抗微生物肽表达比之前在文献中鉴定和描述的那些具有更优的效果。 [0023] 发现了，例如： [0024] -长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)比其他微生物以及8种细菌的组合物更强烈地诱导hBD2表达(Mondel，M.等，2009，Mucosal.Immunol.2：166-172；Schlee，M.等，2007，Infect.Immun.75：2399-2407)，和 [0025] -热处理过的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)比其活的对应物更强烈地上调了hBD2，并且还上调了hBD1。 [0026] HBD1和hBD2展示出对抗宽谱细菌的抗细菌活性，细菌包括大肠杆菌和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、幽门螺旋杆菌(H.pylori)(Nuding，S.等，2009，Microbes.Infect.11：384-393)，并且还对抗酵母，如白色念珠菌(Candida albicans)(O’Neil，D.A.2003，Mol.Immunol 40：445-450)和病毒(人免疫缺陷病毒)(Kota，S.等，2008，J.Biol.Chem 283：22417-22429)。因此，这些抗微生物肽可以加固粘膜屏障，并且因此限制细菌粘附和入侵。 [0027] 越来越多的证据表明防卫素的水平在特定的病理生理状况中下降并且这是传染性和炎性疾病的发病机理和并发症的风险因素，传染性和炎性疾病如(Doss，M.等，2010，J Leukoc.Biol 87：79-92；Rivas-Santiago，B等，2009，Infect.Immun.77：4690-4695)： [0028] -在呼吸道中： [0030] -在胃肠道中： [0031] 节段性回肠炎(结肠和回肠)、溃疡性结肠炎、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎和胃溃疡、传染性腹泻、坏死性小肠结肠炎、抗生素相关的腹泻、肠不成熟 [0032] -在泌尿生殖道中： [0033] 细菌性阴道病、HIV、单纯疱疹病毒、尿道感染 [0034] -在皮肤中： [0035] 特应性皮炎、慢性溃疡、癌症、特应性湿疹、烧伤 [0036] -在口腔中： [0037] HIV病人、扁桃腺炎、齿龈炎、龋齿 [0038] -眼睛中的角膜炎 [0039] 在此所呈现的结果表明长双歧杆菌NCC 2705(CNCM I-2618)比之前鉴定的益生细菌具有更强的增强内源性抗微生物防御的能力，并且因此在SIBO(小肠细菌生长过度)、炎性和传染性疾病的预防和治疗中更有效。此外，发明人的数据表明-与文献中预期的相反-热处理没有降低，而是进一步提高了长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的强抗微生物作用。 [0040] 因此，本发明的一个实施方案是包含长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物，用于治疗或预防与免疫系统相关的疾病，包括传染病。 [0041] 根据本发明，可以通过提高内源性hBD1和/或hBD2表达来治疗或预防与免疫系统相关的疾病。 [0042] 本发明还涉及包含长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物，用于治疗或预防与降低的hBD1表达相关的疾病，例如，如微生物感染。 [0043] 本发明还涉及长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)在制备用于治疗或预防与免疫系统相关的疾病的组合物中的用途。 [0044] 可以至少部分地使用非复制性长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)。非复制性，特别是热灭活的，长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)具有比其活的对应物更有效的优势。 [0045] 非复制性微生物，如热灭活的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCMI-2618)，替代其活的对应物的使用，具有更多的优点： [0046] -降低敏感目标群中活的益生菌相关的脓毒症的潜在风险， [0047] -代表了免疫受损病人的安全替换方案，和 [0048] -降低了加工障碍，可以掺入耐存储的液体产品中，具有长的货架期。 [0049] 因此，在本发明的一个实施方案中，至少90％，例如，至少95％，优选至少98％，最优选至少99％，理想地至少99.9％，或全部的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)是非复制性的。 [0050] 本发明还涉及包含长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物，其中至少95％，优选至少98％，最优选至少99％，理想地至少99.9％，或100％的长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)是非复制性的。 [0051] 因此，本发明还涉及生物活性的、非复制性(例如，热灭活的)长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)。 [0052] “非复制性”长双歧杆菌NCC 2705包括已经热处理过的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)。这包括灭活的、死的、无活力的和/或作为片段(如DNA、代谢物、细胞质化合物和/或细胞壁材料)存在的长双歧杆菌NCC 2705。 [0053] “非复制性”意思是通过传统涂布方法没有检测到有活力的细胞和/或菌落形成单位。这样的传统涂布方法概括于微生物学教科书中：James Monroe Jay，Martin J.Loessner，David A.Golden.2005.Modern food microbiology(现代食品微生物学)，第7版，Springer Science，纽约，N.Y.790p。通常，不存在活细胞可以显示为如下情况：接种不同浓度的细菌制备物(“非复制性”样品)并且在适当的条件下(需氧和/或厌氧气氛下持续至少24h)培养后琼脂平板上没有可见的菌落或液体生长培养基的浊度没有提高。 [0054] 可以通过热灭活使长双歧杆菌NCC2705成为非复制性的。热灭活可以在至少约70℃下进行。 [0055] 任何热处理可以用于灭活益生菌，只要进行足够长时间来实现灭活。例如，这样的热处理可以进行至少10秒钟。 [0056] 通常，高温将需要短的加热时间，而较低的温度将需要较长时间的加热。 [0057] 例如，可以在110°至140°下持续1-30秒，例如，10-20秒，或在75°至95°下持续10-30分钟，使得长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)成为非复制性的。 [0058] 这给出的时间范围指的是长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)接受给定温度的时间。注意到根据其中提供长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物的性质和含量，并且根据所用的加热装置的结构，加热时间可以不同。 [0060] 如果其中提供长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物无论如何都要进行热处理，例如，在包装和配销之前，可以优选使用这种热处理步骤来灭活长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)。 [0061] 通常，可以通过高温短时(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温(UHT)处理来处理含有长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物。 [0062] UHT处理是超高温处理过程或超热处理(两者都缩写为UHT)，其涉及在超过135℃(275℉)的温度下(该温度是杀灭奶中细菌孢子所需的温度)，通过短时(大约1-10秒)加热使组合物至少部分灭菌。例如，以这种使用超过135℃温度的方式来处理奶，在所需的保持时间(至2-5s)内可以降低细菌负荷，使得能够连续流动操作。 [0063] 存在两种主要类型的UHT系统：直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽喷射或蒸汽注入来处理产品，而在间接系统中，使用板式热交换器、管式热交换器或刮擦式表面热交换器来热处理产品。可以在产品制备过程中的任一个步骤或多个步骤中使用UHT系统的组合。 [0064] 如下定义HTST处理(高温/短时)：设计来实现奶中活微生物量的5-log降低，杀灭99,9999％的巴氏杀菌方法。认为这足以用于破坏几乎所有酵母、霉菌和常见腐败细菌并且还确保了足够的常见致病耐热生物体的破坏。在HTST处理中，将奶加热至71.7℃(161℉)，持续15-20秒。 [0065] 巴氏瞬间灭菌法是容易腐败的饮料(如果汁和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的热巴氏杀菌的方法。在灌装容器之前进行，以杀灭腐败微生物，使得产品更安全并延长它们的保质期。液体以受控连续流动来移动，同时接受71.5℃(160℉)至74℃(165℉)的温度，持续15至30秒。 [0066] 对于本发明的目的，术语“短时高温处理“应当包括例如高温短时(HTST)处理、UHT处理和巴氏瞬间灭菌、低温长时处理。 [0067] 本发明的组合物可以包括含量足以至少部分地治疗与免疫系统相关的感染和疾病和/或其并发症的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)。将足以实现这的含量定义为“治疗有效量”。对于该目的有效的含量将取决于本领域技术人员已知的各种因素，如疾病的严重程度、消费者的体重和一般健康状况以及食物基质的影响。 [0068] 在预防性应用中，将根据本发明的组合物以足以至少部分地降低产生所述疾病风险的含量施用于易患免疫系统相关疾病的消费者或另外处于免疫系统相关疾病风险中的消费者。将这样的含量定义为“预防有效量”。再者，精确的含量取决于各种病人的特定因素，如病人的健康状况和体重，以及食物基质的影响。 [0069] 本领域技术人员将能够适当地调整治疗有效量和/或预防有效量。 [0070] 通常，本发明的组合物含有治疗有效量和/或预防有效量的长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)。 [0071] 通常，治疗有效量和/或预防有效量在每日剂量约0.005mg-1000mgLa1的范围内。 [0072] 就数量而言，长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)可以以对应于104至1012等价cfu/g干组合物的含量存在于组合物中。显然，非复制性微生物不形成菌落，因此，将4 12 该术语理解为从10 至10 cfu/g复制细菌获得的非复制性微生物的含量。这包括灭活的、无活力的或死的或作为片段(如DNA或细胞壁或细胞质化合物)存在的微生物。换句话说，组合物含有的微生物量以如同所有微生物是活的之微生物量的菌落形成能力(cfu)来表示，与它们实际上是否是非复制性的(如灭活的或死的，片段化的或任何或所有这些状态的混合物)无关。 [0073] 例如，根据本发明的组合物可以含有含量对应于每日剂量约104至1012cfu的长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)。 [0074] 本发明的组合物可以含有每日剂量约0.005mg-1000mg的长双歧杆菌NCC2705(保藏号CNCM I-2618)。 [0075] 本发明的组合物可以是任何种类的组合物。例如，可以口服、肠内、非肠道(皮下或肌内)、局部或眼睛，通过吸入、直肠内和阴道内施用组合物。 [0077] 可以添加益生元。在益生菌变成非复制性之前，益生元可以支持益生菌的生长。益生元还可以与组合物中存在的和/或添加的活益生细菌协同作用。 [0078] 与免疫系统相关的疾病选自传染病，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫感染；炎症；吞噬细胞缺乏；上皮屏障机能障碍或免疫系统不成熟、SIBO及其组合。 [0079] 在本发明的一个实施方案中，包含长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的组合物可以用于治疗或预防微生物感染，如病毒、真菌和/或寄生虫感染。 [0080] 与免疫系统相关的疾病还可以选自与降低水平的防卫素相关的疾病，特别是hBD2。 [0081] 此外，在使用非复制性长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的情况中，与免疫系统相关的疾病还可以选自与降低水平的hBD1相关的疾病。 [0082] 这样的疾病可以选自囊肿性纤维化、反应性气道疾病、抽烟引起的肺部感染、哮喘、肺炎、鼻炎、耳炎、窦炎、结核、节段性回肠炎(结肠和回肠)、溃疡性结肠炎、肠不成熟、由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎和胃溃疡、传染性腹泻、坏死性小肠结肠炎、抗生素相关的腹泻、细菌性阴道病、HIV、单纯疱疹病毒、尿道感染、特应性皮炎、慢性溃疡、癌症、特应性湿疹、烧伤、扁桃腺炎、齿龈炎、龋齿、眼睛中的角膜炎，及其组合。 [0083] 本发明的组合物可以用于加强内源性抗微生物防御。 [0084] 例如，这可以通过加强内源性hBD2表达来实现；并且-在使用非复制性长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的情况中-通过另外地加强hBD1表达来实现这。 [0085] 本发明人发现了长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)强烈地诱导了组成型hBD2表达；非复制性，例如，热处理过的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)上调了hBD2表达，甚至高于其活的对应物；热处理过的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)也上调了hBD1表达。 [0086] 因此，本发明的主题还包括提高长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)在治疗或预防免疫系统相关疾病中的有效性的方法，包括例如通过热处理使长双歧杆菌NCC2705成为非复制性的步骤。 [0087] 例如，免疫系统相关疾病可以是以上所列的疾病之一。 [0088] 特别地，疾病可以是与降低的β-防卫素水平相关的疾病。 [0089] 在本发明的一个实施方案中，方法包括在至少约70℃热处理至少约10秒的步骤。 [0090] 本领域技术人员将理解他们可以自由地组合在此所述的本发明的所有特征，而没有脱离所公开的本发明的范围。特别地，对于本发明的组合物所述的特征可以应用至本发明的用途和/或方法，反之亦然。 [0092] 图1显示出在120℃下热处理15秒的长双歧杆菌(保藏号CNCM I-2618)在体外比其他热处理过的菌株更强烈地诱导肠上皮细胞中的hBD2mRNA。将T84细胞与热处理过的菌株孵育4h。通过实时PCR分析hBD2的基因表达。数据表示归一化至未受刺激细胞的基础表达的平均值±sem。 [0093] 图2显示出在85℃下热处理20min的长双歧杆菌(保藏号CNCM I-2618)呈现出最强的hBD2(A)和hBD1(B)诱导。用活的和120℃下热处理15秒或85℃下热处理20min的长双歧杆菌(保藏号CNCM I-2618)将T84细胞刺激4h。通过实时PCR分析hBD2的基因表达。数据表示归一化至未受刺激细胞的基础表达的平均值±sem。实施例： [0094] 实验方案： [0095] 使用来自30-40代的T84细胞，并且在含有5％胎牛血清(FCS)(Amined BioConcept)和2mM谷胺酰胺的Dulbecco’s改良必需培养基/F-12(Sigma D 6421)中培6 养。以2×10 细胞/孔的浓度将细胞接种于6-孔培养平板中，并且在37℃下在5％CO2-95％空气气氛中生长成单层。用无血清和抗生素的培养基将汇合后生长至1周的细胞培养至少 12H。该步骤对于消除血清诱导的防卫素表达以及防止抗生素对益生菌和细胞免疫应答的任何影响是必需的。用益生菌或热处理过的菌株将细胞再培养4H。在培养时间结束时，根TM 据供应商的实验方案，用PBS洗涤细胞并且用TriPure 分离试剂收集。通过定量PCR来测定如此处理的细胞中的人hBD1和hBD2基因表达。 [0096] 该实验中所用的细菌菌株是长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)(NCC 2818，保藏号CNCM I-3446)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)(La1，NCC 533，保藏号CNCM I-1225)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)(ST11，NCC 2461，保藏号CNCM I-2116)。以活的或在120℃下15秒或85℃下20min热处理过的来测试这些菌株。 [0097] 结果： [0098] 所有研究的热处理过(120℃，15秒)的菌株上调了hBD2mRNA的表达，但长双歧杆菌(NCC 2705)(保藏号CNCM I-2618)比其他热处理过的菌株诱导了强得多的效果(图1)。 [0099] 此外，所呈现的数据表明长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)的热处理提高了其对hBD2mRNA表达的作用。实际上，在120℃下15秒或85℃下20min热灭活的长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)比活的菌株更有效(图2)。 [0100] 此外，长双歧杆菌NCC 2705(保藏号CNCM I-2618)在低温(85℃)和长时间(20min)的灭活不仅强烈地提高了hBD2表达，而且还提高了hBD1mRNA表达(图2A和B)。 [0101] 打印输出(原始电子表格) [0103] [0104] [0105] 仅供受理局使用 [0106] [0107] 仅供国际局使用 [0108]0-5 该表格由国际局接受于： 2010年5月25日 0-5-1 授权官员 Peter WIMMER |
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