[0001] 本发明涉及新型双歧杆菌属细菌的制作方法、根据本制作方法得到的新型双歧杆菌属细菌和该细菌的检测方法。

[0002] 双歧杆菌属细菌是人体肠内细菌菌落中的主要细菌，已知具有便秘、腹泻的改善性等的整肠作用、血清胆固醇上升抑制作用、免疫活化作用等对人体健康有益的作用。因此，以各种发酵饮食品、活菌制剂等的形态有多种市售品出售，特别是发酵乳饮食品，具有优异的嗜好性，因此，适于双歧杆菌属细菌的持续摄取。

[0003] 双歧杆菌属细菌是专性厌氧菌，对氧、低pH、高酸度敏感，发酵饮食品中制造时的增殖、保存时的存活性等操作困难的点很多。为了得到双歧杆菌属细菌的生理效果，认为必须要使尽可能多的菌活着到达肠道，特别是提高饮食品中的菌的存活性、即饮食后的到达肠道的到达率是非常重要的因素。

[0004] 为了解决这样的问题，通过改良制造方法、添加各种存活性改善剂，例如，N-乙酰葡糖胺、泛酸、肽类、乳果糖等，进行发酵饮食品水平的存活性改善。但是，这样的双歧杆菌属细菌的存活性改善剂的添加，会导致制造成本增加，引起嗜好性的降低等问题，因此不容易使用。此外，还研究了将刚制造后的含有双歧杆菌属细菌的发酵物填充以在不透氧性的包装构成的容器中，完全切断与氧的接触的方法。但是，不透氧性容器并不完美，缺乏成型的自由度，并且使用复合材料，废弃物处理很复杂，容器本身价格也高，其利用有很多制约。

[0005] 因此，改善发酵饮食品等中的双歧杆菌属细菌的存活性的根本解决方法，是制作即使在好氧的条件、低pH、高酸度的条件下也具有高的存活性的双歧杆菌属细菌，作为这样的菌株的例子，可以列举短双歧杆菌YIT 10001（FERM BP-8205）（专利文献1）、短双歧杆菌SBR3212（FERM P-11915）（专利文献2）、两歧双歧杆菌YIT 4002（FERM BP-1038）（专利文献3）等。

[0006] 但是，这些存活性改善株存在只能够期待在其制作方法中所使用的环境下的存活性改善效果的问题。即，双歧杆菌属细菌变异株的制作中，通常使用在双歧杆菌属细菌繁殖困难的环境下进行传代培养保存、从而获得生存株的方法，能够期待在这些菌株的制作阶段中所使用的环境下一定的存活性改善效果，但是在除此以外的环境下，无法期待存活性改善效果。因此，以现有方法所得到的双歧杆菌属细菌，不能适用于在与变异株制作条件不同的条件下流通的饮食品中，具有极低的通用性。

[0007] 此外，虽然原因仍不清楚，但是已知在环境因素恶化的条件（例如，酸性区域pH）下进行传代培养保存而得到的存活性改善菌株，在更稳定条件的中性区域pH下适用该菌株，也不能发挥存活性改善效果，这也是无法得到在各种饮食品中能够适用的通用性高的菌株的一个原因。

[0008] 现有技术文献

[0009] 专利文献

[0010] 专利文献1：WO03/040350号国际公开小册子

[0011] 专利文献2：日本专利第2922013号

[0012] 专利文献3：日本特公昭61-19220

[0013] 发明所要解决的问题

[0014] 因此，本发明的课题在于提供即使在环境因素不同的各种条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌的制作方法、根据本制作方法得到的新型双歧杆菌属细菌和该细菌的检测方法。

[0015] 用于解决发明的方法

[0016] 本发明的发明人为了解决上述课题，进行了深入的研究，结果发现，通过在作为环境因素不同的条件的至少2种系统中交替进行2次以上的传代培养保存，能够得到在交替传代培养保存中所使用的全部条件下的存活性优异的双歧杆菌属细菌。

[0017] 并且，对于所得到的新型双歧杆菌属细菌的特异的检测方法进行了研究，结果发现，能够对该细菌DNA片段进行特异性扩增的引物，使用该引物，能够特异地检测、定量该细菌。并且，发现组合这些引物和膜透过性色素，能够定量该细菌的活菌数目。

[0018] 即，本发明提供一种双歧杆菌属细菌的制作方法，其特征在于，在作为环境因素不同的条件的至少2种系统中交替进行2次以上的传代培养保存。

[0019] 此外，本发明提供由上述制作方法得到的双歧杆菌属细菌。

[0020] 此外，本发明提供饮食品，特别是发酵乳饮食品，其特征在于，含有上述双歧杆菌属细菌。

[0021] 此外，本发明提供具有序列号1或序列号2所示的碱基序列或与该序列互补的碱基序列的DNA片段。

[0022] 此外，本发明提供具有序列号1或序列号2所示的碱基序列或与该序列互补的碱基序列的短双歧杆菌YIT 12272（FERM BP-11320）用引物。

[0023] 此外，本发明提供短双歧杆菌YIT 12272的检测方法，其特征在于，使用上述引物。

[0024] 此外，本发明提供短双歧杆菌YIT 12272的菌数的定量方法，其特征在于，使用上述引物。

[0025] 此外，本发明提供短双歧杆菌YIT 12272（FERM BP-11320）的活菌数定量方法，其特征在于，对以膜透过性色素处理过的被检测体，使用上述引物进行PCR反应。

[0026] 发明的效果

[0027] 通过本发明的双歧杆菌属细菌的制作方法，能够得到在产品或流通条件等的环境因素不同的条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌。该菌株能够适用于各种饮食品，并且，饮食品中的菌的存活性高，因此，能够有效地发挥双歧杆菌属细菌所具有的生理效果。此外，通过本发明的制作方法对具有抗幽门螺杆菌作用等的特异生理效果的双歧杆菌属细菌进行改良，由此，能够制作能够在各种饮食品中利用的菌株，因此，本发明的工业上的利用性极高。

[0028] 使用本发明的DNA片段，能够特异地检测、定量饮食品中、粪便中或肠内的上述存活性优异的短双歧杆菌YIT 12272。附图说明

[0029] 图1是表示短双歧杆菌YIT 12272特异的RAPD带的碱基序列。以四边包围YIT12272特异的引物的碱基。

[0030] 图2是表示由利用膜透过性色素处理进行定量的PCR得到的YIT12272的定量值的变化。

[0031] 图3是表示PMA处理的最适条件。

[0032] 图4是表示由PMA处理得到的粪便中加热处理后的YIT 12272的定量值的变化。

[0033] 图5是表示粪便中所添加的活的YIT 12272的菌数和定量的PCR（PMA处理）得到的YIT 12272的定量值的关系。

[0034] 在本发明中，作为环境因素，是指对双歧杆菌属细菌的增殖或存活性有影响的全部因素，可以列举培养液或饮食品中的pH、渗透压、酸度、培养·保存温度、培养·保存时间、溶解氧量、光、压力、水分活性、共存微生物、营养因子（糖类、蛋白质、肽、乳脂肪成分等脂肪类、维生素类、矿物质类、脱脂乳固体成分、酵母提取物等的双歧杆菌属细菌的增殖因子等）、抗生素、培养方法（静置培养、搅拌培养、振动培养、通气培养等）、灭菌方法、调合方法、填充方法、保存容器的材质等，特别优选使用对双歧杆菌属细菌的增殖和存活性有影响的重要的环境因素的pH、渗透压、酸度、培养温度、营养因子等。这里，光包括可见光、非可见光的任一种，酸度是指中和9g的试样所需要的1/10规定氢氧化钠水溶液的量（mL）。

[0035] 此外，“作为环境因素不同的条件的至少2种系统”是指使某种特定环境因素的质和/或量发生变化的至少2种系统，例如，使培养液或饮食品的pH、渗透压、酸度、培养温度、营养因子等发生变化的至少2种类以上的系统，更具体来说，可以列举例如使培养液或饮食品的pH从5变化到3，例如使渗透压从600mOsm（毫渗透摩尔）变化到950mOsm，例如使酸度从6变化到20，例如使培养液的培养温度从37℃变化到30℃，例如使培养液或饮食品中的糖类从消化性糖变化为难消化性糖，例如通过搅使的溶解氧浓度提高等方法来改变的系统。

[0036] 对作为标的的环境因素、其质和/或量的变化没有特别限定，优选考虑要适用以本发明的方法制作的双歧杆菌属细菌的1种以上的培养液或饮食品的环境因素和其条件，选择对双歧杆菌属细菌的增殖或存活性有影响的环境因素和其条件，使用该环境因素和条件进行交替传代培养保存。双歧杆菌属细菌的培养条件根据菌种不同而不同，通常，为脱脂乳固体成分5～30%、乳脂肪成分0～10%、渗透压150～1000mOsm、pH4.0～7.0、溶解氧浓度0～2ppm，培养温度30～39℃左右，可以是在这些范围内使条件变化，或者设定超出该范围的条件。此外，保存条件根据培养液或饮食品的种类形态而不同，例如饮食品的保存温度可以是常温、冷藏、冷冻各不相同，因此，适当选择适用的培养液或饮食品的环境因素和条件使用即可。

[0037] 此外，在培养液中加入糖浆（甜味料）而作为饮食品时，使用各种糖，但是这时有根据使用的糖的种类而渗透压升高的情况，相反也有降低的情况，因此，也可以将此作为变化的条件。

[0038] 此外，从调和饮食品的罐填充到容器之前，在调和罐内将饮食品保存一定期间时，在填充前需要搅拌使其均匀化，此时，有卷入调合罐的顶部空间的氧的溶解氧浓度上升至饱和温度的情况，因此，也可以将此作为变化的条件。

[0039] 本发明的制作方法能够使用的双歧杆菌属细菌的种类没有特别限定，例如，可以列举短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、长双歧杆菌（B.longum）、两歧双歧杆菌（B.bifidum）、动物双歧杆菌（B.animalis）、猪双歧杆菌（B.suis）、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、青春双歧杆菌（B.adolescentis）、链状双歧杆菌（B.catenulatum）、假小链双歧杆菌（B.pseudocatenulatum）、乳双歧杆菌（B.lactis）、球双歧杆菌（B.globosum）等。其中，短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌从以前积累了大量用于乳制品的安全性等的数据，并且，存活性的改善效果高，故而优选，特别优选短双歧杆菌。

[0040] 通过上述双歧杆菌属细菌作为亲株、在作为环境因素不同的条件的至少2种系统交替进行2次以上的传代培养保存，能够得到在交替传代培养保存中所使用的全部条件下的存活性优异的双歧杆菌属细菌。具体来说，（1）在环境因素A培养作为亲株的双歧杆菌属细菌，得到培养液或饮食品，保存所得到的培养液或饮食品，浓缩或选择在环境因素A的条件下存活性得到改善的株。（2）接着，在环境因素B下培养该存活性改善株得到培养液或饮食品，保存所得到的培养液或饮食品，浓缩或选择在环境因素B的条件下存活性得到改善的株。（3）重复上述工序2次以上，能够得到在环境因素A和B下存活性优异的双歧杆菌属细菌。

[0041] 作为交替传代培养保存的方法，在使环境因素A和环境因素B下的条件变化时，能够依次进行A→B→A→B→A、A→A→B→B→A→A→B→B→A→A→B→B这样的任意组合，但优选进行2次以上的交替传代培养保存。优选进行2～100次，更优选4～
100次，特别优选4～50次。

[0042] 设定的环境因素的条件变化为2种以上即可，例如，作为设定3个条件变化A、B、C时的交替传代培养保存方法，能够任意进行A→B→C→A→B→C→A→B→C、A→A→A→B→B→C→A→B→B→B→C→C→A等。

[0043] 作为该环境因素，优选使选自pH、渗透压、酸度、培养温度、营养因子中的1种以上、2种以上、特别优选3种以上作为A和B变化。这里，这些条件变化的范围优选：pH为4.0～7.0之间0.1～3的变化，渗透压为150～1000mOsm之间10～700mOsm的变化，酸度为5～30之间1～20的变化，培养温度为30～39℃之间1～6℃的变化。作为营养因子，优选糖的种类从帕拉金糖变化为还原麦芽糖糖浆。另外，乳脂肪成分优选在0～10%之间变化0.1～6%。另外，脱脂乳固体成分优选在5～30%之间变化0.1～20%。

[0044] 此外，对作为亲株的双歧杆菌属细菌实施紫外线、亚硝基胍（NTG）、乙基甲烷磺酸（EMS）等的突变诱导剂等的处理，之后，进行上述的交替传代培养保存，能够选择具有期望的性质的菌株。

[0045] 这里，存活性是表示培养液或饮食品的保存后存在何种程度活菌的性质，活菌数目能够通过通常的方法求出。例如，能够通过适当稀释保存中所使用的培养液或饮食品，涂抹到TOS丙酸酯琼脂培养基中，测定在37℃厌氧培养72小时之后的培养基上的菌落而求出。通过保存后的活菌数相对于保存中所使用的培养液或饮食品的保存前的活菌数的比例，能够表示存活率。

[0046] 本发明的制作方法中所使用的培养液，能够使用GAM培养基、MILS培养基（Iwata&Morishita,Letter in Applied Microbiology,vol 9,165-168,1989）、TOS丙酸酯培养基、豆乳、蔬菜汁、果汁、麦汁等能够培养双歧杆菌属细菌的任意培养基，优选乳作为主要成分的培养基，作为乳，可以列举牛乳（全脂乳）和作为其加工品的脱脂乳、来自乳的肽等。根据使用的乳原料和其配合量能够任意设定脱脂乳固体成分和脂肪成分，也可以加入酵母提取物等的双歧杆菌属细菌的增殖因子。这些脱脂乳固体成分、脂肪成分、双歧杆菌属细菌增殖因子等任一个都能够成为环境因素。

[0047] 此外，在由乳培养基构成的培养液中添加糖浆等的任意成分得到的发酵乳饮食品，其环境因素接近最终形态的产品，能够更高效地浓缩最终形态的产品中显示高存活性的菌，因此优选在这样的育种改良中使用发酵乳饮食品。这样的发酵乳饮食品中能够配合糖类等的糖浆（甜味料）、乳化剂、增稠（稳定）剂、维生素类、矿物质类等的任意成分，这些任一都能够成为环境因素。作为糖浆，可以列举葡萄糖、蔗糖、果糖、果糖葡萄糖液糖、葡萄糖果糖液糖、帕拉金糖、海藻糖、乳糖、木糖、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等的糖类、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、帕拉金糖醇、还原糖浆、还原麦芽糖浆等的糖醇、阿斯巴甜、索马甜、三氯蔗糖、安赛蜜K、甜菊等的高甜味度甜味料。此外，发酵乳饮食品中还能够配合蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、卵磷脂等的乳化剂、琼脂、明胶、卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、刺槐豆胶、结冷胶、羧甲基纤维素、大豆多糖类、藻酸丙二醇酯等的增稠（稳定）剂。除此以外，也能够配合维生素A、维生素B类、维生素C、维生素D、维生素E类等的维生素类、钙、镁、锌、铁、锰等的矿物类、柠檬酸、乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸等的酸味料、奶油、黄油、酸奶油等的乳脂肪、酸乳酪、浆果类、橙子类、木瓜类、紫苏类、柑橘类、苹果类、薄荷类、葡萄类、杏类、梨、乳蛋糕乳脂、桃、甜瓜、香蕉、热带水果、药草类、红茶、咖啡等的香料类、药草提取物、黑糖提取物等。

[0048] 培养液、发酵饮食品中，也能够并用双歧杆菌属细菌以外的微生物。作为这样的微生物，例如，可以列举干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、植物乳杆菌（L.plantarum）、布氏乳杆菌（L.buchneri）、鸡乳杆菌（L.gallinarum）、嗜淀粉乳杆菌（L.amylovorus）、短乳杆菌（L.brevis）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、高加索酸奶乳杆菌（L.kefiri）、类干酪乳杆菌（L.paracasei）、弯曲乳杆菌（L.curvatus）、玉米乳杆菌（L.zeae）、瑞士乳杆菌（L.helveticus）、唾液乳杆菌（L.salivarius）、加氏乳杆菌（L.gasseri）、发酵乳杆菌（L.fermentum）、路氏乳杆菌（L.reuteri）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）、德式乳杆菌保加利亚亚种（L.delbrueckii subsp.Bulgaricus）、德式乳杆菌德氏亚种（L.delbrueckii subsp.delbrueckii）、约氏乳杆菌（L.johnsonii）等的乳杆菌属细菌、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等的链球菌属细菌、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）等的乳球菌属细菌、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（E.faecium）等的肠球属细菌、枯草杆菌（Bacillus subtilis）等的芽孢杆菌属细菌、属于啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、乳酒假丝酵母（Candida kefyr）等的酵母属、圆酵母属、假丝酵母属等的酵母。

[0049] 发酵饮食品的制造根据通常方法进行即可，例如，制造发酵乳饮食品时，在灭菌后的乳培养基上单独或与其他微生物同时接种培养作为亲株的双歧杆菌属细菌，对其进行均质化处理，得到发酵乳。接着，添加混合其他途径调制的糖浆溶液，在均化器等中均质化，再添加香料，得到最终产品。

[0050] 根据上述方法，以短双歧杆菌YIT 4125（FERM BP-7813）作为亲株，制作在环境因素不同的条件下存活性特别优异的双歧杆菌属细菌1株，作为短双歧杆菌YIT 12272（FERM BP-11320），在平成22年2月16日，寄存于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心（茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6）。短双歧杆菌YIT 12272与其亲株短双歧杆菌YIT 4125相比，具有以下的菌学性质。

[0051] 表1

[0052]YIT4125株 YIT 12272株
革兰氏染色 阳性 阳性
菌体形态 多形性杆菌 多形性杆菌
菌落颜色 白色 白色
菌落形态 周边圆滑的圆形 周边圆滑的圆形

[0053] 在 添 加 琼 脂 的 MILS 培 养 基（Iwata & Morishita,Letter in Applied Microbiology,vol 9,165-168,1989）上接种各菌株，在37℃、厌氧培养（Anaero Pack（三菱瓦斯化学））中重复进行单一菌落的分离，由此，观察纯化的菌株的菌形态（在MILS培养基培养一夜之后，革兰氏染色）和菌落性状。

[0054] 表2

[0055] 由API 50CH得到的糖发酵性试验结果

[0056]YIT 4125 YIT 12272
对照 - -
甘油 - -
赤藻糖醇 - -
D-阿拉伯糖 ± -
L-阿拉伯糖 - -
D-核糖 ＋ ＋
D-木糖 - -
L-木糖 - -
D-核糖醇 - -
甲基-βD-吡喃木糖醇 - -
D-半乳糖 ＋ ＋
D-蔗糖 ＋ ＋
D-果糖 ＋ ＋
D-甘露糖 （＋） ＋
L-山梨糖 - -
L-鼠李糖 - -
半乳糖醇 - -
肌醇 - -
D-甘露醇 - -
D-山梨糖醇 - -
甲基-αD-甘露糖苷 - -
甲基-αD-吡喃葡萄糖苷 ＋ ＋
N-乙酰葡糖胺 - -
杏苷 ＋ ＋
熊果苷 ＋ ＋
七叶树糖苷柠檬酸铁 ＋ ＋
水杨酸 ＋ ＋
D-纤维二糖 ＋ ＋
D-麦芽糖 ＋ ＋
D-乳糖 ＋ ＋
D-蜜二糖 ＋ ＋
D-蔗糖 ＋ ＋
D-海藻糖 ± （＋）
菊粉 - -
D-松三糖 ＋ ＋
D-棉子糖 ＋ ＋
淀粉 - （＋）
糖原 - -
木糖醇 - -
龙胆二糖 ＋ ＋
D-松二糖 ＋ ＋
D-来苏糖 ± -
D-塔格糖 - -
D-海藻糖 - -
L-海藻糖 （＋） （＋）
D-阿糖醇 - -
L-阿糖醇 - -
葡萄糖酸盐 - -
2-酮基葡萄糖酸盐 - -
5-酮基葡萄糖酸盐 - -

[0057] ＋：强阳性，（＋）：弱阳性，-：阴性，±：阴性或滞后的弱阳性

[0058] 使用API 50CH（bioMerieux Japan制造），依照使用说明的方法，在各基质接种1晚培养后的菌液。将其在37℃厌氧培养7日后，判定各基质的发酵性。

[0059] 根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌的利用形态没有特别限定，可以是冻结干燥的，或者能够作为包括这些细菌的培养物利用，但是，任一种形态中均优选细菌为活菌形态。

[0060] 根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌，能够与固体或液体的医药用无毒性载体混合，以惯用的医药品制剂的形态利用。作为这样的制剂，例如，可以列举片剂、颗粒剂、散粉、胶囊剂等的固体形态，溶液剂、悬浊液、乳剂等的液剂，冻结干燥剂等。这些制剂能够通过制剂上常用的方法调制。作为上述医药用无毒性载体，例如，可以列举葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油脂、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。此外，根据需要，还能够适当添加稳定化剂、湿润剂、乳化剂、结合剂、等渗剂、赋形剂等的惯用的添加剂。

[0061] 根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌，不仅可以形成上述制剂，也能够在饮食品中配合使用。在饮食品中配合时，直接或与各种营养成分一起含有即可。具体来说，在饮食品中配合根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌时，适当使用作为饮食品能够使用的添加剂，使用惯用方法成型为适合食用的形态，即，颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等，或者，添加到各种食品，例如火腿、香肠等的食肉加工食品、鱼糕、竹轮等的水产加工食品、面包、点心、黄油、奶粉中使用，也可以添加到水、果汁、牛奶、清凉饮料、茶饮料等的饮料中使用。其中，饮食品中包括动物的饲料。

[0062] 根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌，能够适用于环境不同的各种类的饮食品，在饮食品中的菌的存活性高，因此，能够有效发挥双歧杆菌属细菌所具有的整肠作用等的通常的生理效果。此外，根据本发明的制作方法，改良了原来所具有幽门螺杆菌的除菌作用等的特殊生理效果的双歧杆菌属细菌，该菌株能够在各种饮食品中利用，提高了含有该菌株的饮食品的嗜好性，并且，消费者的选择变广。再者，通过改善该菌株的存活性，能够增强该菌株具有的生理效果。

[0063] 作为饮食品，适当使用以活菌的状态含有根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌的发酵乳饮食品、发酵豆乳、发酵果汁、发酵蔬菜汁等的发酵饮食品，特别是优选发酵乳饮食品的利用。这些发酵乳饮食品的制作依照常法进行即可，能够通过上述方法制造。这样得到的发酵乳饮食品，能够制成不含糖浆（甜味料）的普通型、软型、水果型、固体型、液状等的任一种形态的产品。

[0064] 此外，本发明涉及含有根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌的饮食品、特别是含有甜味料的发酵乳饮食品。作为发酵乳饮食品的种类、制造方法、形态，可以列举与前述相同的种类、制造方法、形态。并用根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌和选自乳杆菌属细菌、链球菌属细菌、乳球菌属细菌中的1种以上来制造发酵乳饮食品，能够得到高的嗜好性、能够持续饮用，故而优选。

[0065] 此外，在利用双歧杆菌属细菌的饮食品中，为了提高保存时的存活性，主要使用了玻璃、铝涂层纸等的不透氧性的包装构成的容器，但是根据本发明的方法得到的双歧杆菌属细菌，具有高的存活性，不需要严密的厌氧状态，因此，也能够适用氧透过性高的树脂（聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等）作为容器素材。使用这些树脂的容器与不透过氧性的包装构成的容器比较，成本低，成型的自由度高，因此具有优势。

[0066] 本发明的DNA片段和引物，具有序列号1或序列号2所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列。本发明的DNA片段引物来自对多个双歧杆菌属细菌和其相关菌（related bacteria）的DNA进行PCR，通过RAPD法检索得到。即，对来自双歧杆菌属细菌的DNA，使用多个随机引物进行PCR，扩增夹在随机引物之间的DNA片段。根据得到的RAPD带图案进行克隆，确定短双歧杆菌YIT 12272特异的PCR扩增产物的碱基序列（序列号3）。从该碱基序列，设计本发明的DNA片段引物（序列号1和2）。本发明的DNA片段引物包括具有与序列号1或2所示的碱基序列互补的碱基序列。

[0067] 本发明的引物，优选使用序列号1和序列号2所示的2个碱基序列的组合，或者与该序列互补的2个碱基序列的组合。并且，优选将具有碱基序列1或与其互补的序列的引物作为正向引物，将具有序列号2或与其互补的序列的引物作为逆向引物。

[0068] 本发明的引物对上述短双歧杆菌YIT 12272特异，对于该短双歧杆菌YIT 12272的检测、细菌数的定量和活菌的定量有用。作为本发明的检测、定量法的检测体，可以列举含有上述YIT 12272的饮食品、医药品、粪便等。

[0069] 作为YIT 12272的检测、定量法，例如，可以列举（1）提取检测体中的DNA的工序；（2）使用本发明引物进行PCR反应的工序和（3）检测通过工序（2）扩增的DNA片段的工序。

[0070] 更详细来说，首先，从粪便、饮食品等中提取DNA，作为PCR的样品。作为从粪便等的稀释液中提取DNA的方法，优选作为定法的Marmur，作为其变体的酶法和苄基氯法。此外，在缓冲液或灭菌水中悬浊菌体的一部分，在95℃加热15分钟左右，能够将得到的产物作为样品，提供给PCR。

[0071] 在提取得到的DNA中组合本发明的引物，进行扩增反应，由此，能够得到目的DNA片段（PCR产物）。通常，在PCR法等中使用引物时，优选2种引物为1组使用。例如，使用序列号1和2的引物组合，在多种类存在的细菌群中，只有上述短双歧杆菌YIT 12272的DNA在两个引物间发生扩增反应，能够鉴定该短双歧杆菌YIT 12272。此外，进行PCR时，预先梯度性稀释模板DNA的量，与求出检测界限同样进行解析，能够将目的菌定量化。

[0072] 用这样得到的DNA进行电泳，能够从分带的有无鉴定上述短双歧杆菌YIT 12272。

[0073] 此外，以膜透过性色素对检测体进行处理之后，对其进行PCR反应，能够仅检测、定量上述短双歧杆菌YIT 12272的活菌。作为所使用的膜透过性色素，可以列举乙锭单叠氮溴（EMA）、丙锭单叠氮溴（PMA）等，特别优选丙锭单叠氮溴（PMA）。检测体的膜透过性色素处理，例如，在添加最终浓度5～250μM的膜透过性色素溶液后进行光照射。对于这样处理后的检测体，与上述同样进行PCR即可。

[0074] 实施例

[0075] 以下，列举实施例更详细地说明本发明的内容，但是本发明不受这些实施例任何限制。

[0076] （实施例1）交替传代培养法得到的短双歧杆菌YIT 10001、YIT4125的育种改良[0077] 以短双歧杆菌YIT 10001株（FERM BP-8205）和短双歧杆菌YIT4125株（FERM BP-7813）作为亲株，进行交替传代浓缩。

[0078] （1）在135℃对20.7%的全脂奶粉培养基进行3.5秒钟灭菌，之后，接种0.5%短双歧杆菌YIT 10001株或YIT 4125株的种菌（seed starter）、1%两歧双歧杆菌的种菌，在33℃混合培养直到pH5.3，调制菌液A1（400mL）。

[0079] （2）在菌液A1中调合糖浆液A，使得帕拉金糖的最终浓度在10%，调制乳制品A1（630mL）。将乳制品A1（200mL）分注入300mL烧瓶中，在放置棉塞的好氧条件下，在5℃搅拌（90rpm）1周，保存（以后，省略为好氧搅拌保存）后，满杯填充到试验管中，在放置丁基橡胶塞的厌氧条件下，在10℃静置保存1周（以后，省略为厌氧静置保存）。

[0080] （3）在10mL添加有头孢菌素的牛奶培养基（12%脱脂奶粉、0.1%酵母提取物、0.03%L-半胱氨酸盐酸盐、0.2%沉淀性碳酸钙、头孢菌素5μg/mL，以后，省略为添加有头孢菌素的牛奶培养基）中接种在本条件保存的乳制品A1（1mL），在37℃进行24小时厌氧培养，得到短双歧杆菌的母菌（mother starter）2。在30mL牛奶培养基（12%脱脂奶粉、0.1%酵母提取物、0.03%L-半胱氨酸盐酸盐、0.2%沉淀性碳酸钙、以后，省略为牛奶培养基）中接种母菌2（0.03mL），在37℃进行厌气培养24小时，调制短双歧杆菌的种菌2。使用种菌2与上述同样重复操作。即，好氧搅拌保存以种菌2调制的乳制品A2，之后，厌氧静置保存，调制短双歧杆菌的母菌3、种菌3。

[0081] （4）接着，在120℃对23.5%脱脂奶粉培养基进行3.5秒灭菌，之后，接种2%短双歧杆菌的种菌3、0.01%乳酸乳球菌的种菌，在37℃混合培养直到pH4.4，调制菌液B1（100mL）。

[0082] （5）此外，在120℃灭菌3.5秒后的19.7%脱脂粉乳培养基中加入乳肽0.08%之后，接种0.5%嗜热链球菌的种菌，在37℃培养直到pH4.3，调制菌液C1（700mL）。向菌液B1中加入菌液C1（混合比1︰2），然后调和糖浆液B，使得还原麦芽糖糖浆的最终浓度为5%，调制乳制品B1（870mL）。

[0083] （6）与乳制品A1同样，在10mL添加由头孢菌素的牛奶培养基中接种在好氧搅拌保存之后厌氧静置保存得到的乳制品B1（1mL），在37℃进行厌氧培养24小时，得到短双歧杆菌的母菌4。在牛奶培养基30mL中接种母菌4（0.03mL），在37℃进行厌氧培养24小时，调制短双歧杆菌的种菌4。使用种菌4，重复进行与上述同样的操作。即，将以种菌4调制的乳制品B2在好氧搅拌保存后，厌氧静置保存，调制短双歧杆菌的母菌5、种菌5。

[0084] 这样，使用在乳制品A的调制、重复好氧搅拌保存和厌氧静置保存2次之后存活的短双歧杆菌，进行乳制品B的调制、重复好氧搅拌保存和厌氧静置保存2次，进行短双歧杆菌的浓缩操作。以这一系列工序为1个循环，合计重复4个循环。最终，从在10℃厌氧静置保存2周的乳制品A8和乳制品B8，取出各1mL涂抹到添加有头孢菌素5μg/mL的TOS丙酸酯琼脂培养基（Yakult药品工业）中，在37℃以Anaero Pack（三菱瓦斯化学）进行厌氧培养，分离单一菌落。通过重复进行本单一菌落的分离，进行纯化，从乳制品A8分离计21株来自短双歧杆菌YIT 10001株和YIT 4125株的单一菌落，从乳制品B8中分离计21株，合计42株。

[0085] （实施例2）存活性确认试验

[0086] 使用亲株和分离株，以实施例1方法分别调制乳制品A、B，在好氧条件下，5℃，搅拌保存1周，之后，在厌氧条件下，10℃，静置保存2周。选择在乳制品A、B两者存活性良好的短双歧杆菌YIT 12272株（来自YIT 4125，由乳制品A8分离）。

[0087] 在表3中表示YIT 12272株、对照菌（YIT 10001株、YIT 4125株）的乳制品A、B中的存活性结果。YIT 12272株不论在乳制品A、B任一个中，在好氧条件下、5℃、搅拌保存7
1周后，在厌氧条件下、10℃、静置保存2周，也残留3×10CFU/mL以上的活菌。另一方面，
7
以对照菌制作的乳制品A、B的任一个，残留3×10CFU/mL以上的活菌，但两者的产品无法表示良好的存活性。

[0088] 此外，乳制品A、B的物性如表4所示。在菌液A中调和糖浆A，调制乳制品A，乳制品A的pH、酸度分别为5.6、3.4，渗透压菌液A为550mOsm，乳制品A增加到950mOsm。另一方面，在菌液B中调和菌液C和糖浆B，调制乳制品B，乳制品B的pH、酸度分别为4.4、7.5。渗透压菌液B为900mOsm，乳制品B减少为600mOsm。

[0089] 如上所述，可知：短双歧杆菌YIT 12272株，在培养温度、pH、酸度、糖浆调和带来的渗透压变化、脱脂乳固体成分、乳脂肪成分不同的乳制品A、B两者，与对照菌相比，存活性增强。

[0090] 表3

[0091] 乳制品A、B保存后的短双歧杆菌YIT 12272株的活菌数

[0092]

[0093] 在好氧条件下、5℃、搅拌保存1周后，在厌氧条件下、10℃、静置保存2周，在添加有头孢菌素5μg/mL的TOS丙酸酯琼脂培养基中测定活菌数

[0094] 表4

[0095] 乳制品A、B的物性

[0096]

[0097] 渗透压使用（株）京都第一科学公司生产的Osmo OM-6040测定

[0098] （实施例3）人工胃液耐性确认试验

[0099] 将短双歧杆菌YIT 12272株和对照菌（YIT 10001株、YIT 4125株）分别在牛奶培养基中在37℃厌氧培养一晚。在37℃、温热30分钟后的人工胃液10mL中加入0.5mL本菌液，迅速混合，之后，在37℃保温。保温（人工胃液处理）0分钟后、120分钟后，分取1mL，适当稀释后，在TOS丙酸酯琼脂培养基（Yakult药品工业，37℃，厌气培养）测定活菌数。

[0100] 其中，人工胃液的调制如下进行。即，在离子交换水中溶解，使得最终浓度为月示蛋白胨（Becton,Dickinson and Co.）：5g/L、胃粘膜素（和光纯药）：1.5g/L、氯化钠：5g/L、碳酸氢钠：3g/L、磷酸二氢钠：1g/L，在3.6规定的盐酸中，调整到pH 2.8，将本溶液在115℃、在高压釜中灭菌15分钟，在4℃保存。接着，在离子交换水中溶解，使得胃蛋白酶（和光纯药）为400mg/L之后，使用膜过滤器（DISMIC-25cs，Advantec 0.45μm）过滤灭菌，制成胃蛋白酶溶液。对将pH再次调整为2.8的180mL上述溶液，在使用之前加入20mL胃蛋白酶溶液，制成人工胃液。

[0101] 在表5表示人工胃液处理0分钟后、120分钟后的活菌数。短双歧杆菌YIT 12272株经过120分钟人工胃液处理，活菌数几乎不变化，但是对照菌（YIT 10001株，YIT 4125株）经过本处理活菌数降低。可知YIT 12272与对照菌相比，人工胃液耐性也很强。

[0102] 表5

[0103] 短双歧杆菌YIT12272株的人工胃液耐性

[0104]

[0105] （实施例4）人工胃液、人工胆汁肠液连续处理耐性确认试验

[0106] 使用短双歧杆菌YIT 12272株和对照菌（YIT 10001株、YIT 4125株），与实施例1同样调制乳制品B。将用各菌株调制得到的乳制品B（200mL）分注入300mL烧瓶中，在放置棉塞的好氧条件下，在5℃搅拌1周（90rpm）保存，之后，满杯填充到试验管中，在放置丁基橡胶塞的厌氧条件下，在10℃静置保存。此外，用YIT 4125株调制的乳制品B，用氮气置换300mL烧瓶的气相，之后，在放置棉塞的好氧条件下，在5℃搅拌1周（90rpm）保存，再在厌氧条件下，在10℃静置保存。

[0107] 以与实施例3同样的方法，将在10℃、静置保存4日的乳制品B的0.5mL加入pH调整到3.3的人工胃液10mL中，在37℃进行60分钟人工胃液处理。在本试验溶液2mL加入预先在37℃保温过的人工胆汁1mL，迅速搅拌。接着，向本混合物加入37℃、30分钟保温过的人工肠液4mL和人工胰液1mL的混合物5mL，搅拌后，在37℃保温。在人工胃液处理0、60分钟后，人工胆汁肠液处理60分钟后分别取出1mL，适当稀释后，在添加有头孢菌素5μg/mL的TOS丙酸琼脂培养基（Yakult药品工业，37℃，厌氧培养）测定活菌数。

[0108] 其中，人工胆汁，在离子交换水中溶解胆汁粉末（Oxgall，Difco），使得浓度为40g/L，以3M的碳酸钠调整pH到8.0之后，以离子交换水稀释，使得胆汁粉末的浓度为1%（W/V），在121℃用高压釜灭菌15分钟后使用。此外，人工肠液，在离子交换水中溶解，使得最终浓度为氯化钠：5g/L、氯化钾：1g/L、碳酸氢钠：3g/L，用3M的碳酸钠调整pH到8.0，之后，在121℃，用高压釜灭菌15分钟二调制。人工胰液，在试验之前溶解在人工肠液中，使得胰脏脂肪酶（MP Biomedicals）为20g/L，用膜过滤器（DISMIC-25cs，Advantec，0.45μm）过滤灭菌后，在水中保存使用。

[0109] 在表6中表示人工胃液处理0分钟后、60分钟后、人工胆汁肠液处理60分钟后的活菌数。保存后的乳制品B中的短双歧杆菌YIT 12272株与对照菌（短双歧杆菌YIT 10001株、YIT 4125株）相比，不仅人工胃液处理后的活菌数高，人工胃液、人工胆汁肠液连续处理后的活菌数也高。可知YIT 12272株，与对照菌相比，人工胃液耐性、人工胆汁、肠液耐性得到强化。

[0110] 表6

[0111] 乳制品B保存后的短双歧杆菌YIT 12272株的人工胃液、人工胆汁肠液连续处理的耐性

[0112]

[0113] 将好氧条件下（YIT4125株在厌氧条件下）5℃、搅拌1周保存后，在厌氧条件下，10℃、保存4日的乳制品B经过人工胃液（pH3.3）处理，接着，经过人工胆汁（胆汁粉末1%）肠液处理，测定活菌数

[0114] （实施例5）发酵乳饮食品的制造

[0115] 在506g水中溶解124g全脂奶粉，在135℃灭菌3秒后，接种0.5%短双歧杆菌YIT12272株、1%两歧双歧杆菌、0.001%嗜酸乳杆菌，在33℃培养直到pH 5.3，在15MPa进行均质化，得到菌液630g。另一方面，在水中溶解98g帕拉金糖、8g胡萝卜汁、2.5g含DHA油、7g乳化钙、0.1g乳铁卵白、0.02g维生素D、1g香料，加水到总量为370g，之后，在120℃灭菌3秒，得到糖浆液。混合菌液、糖浆液，填充到利乐容器中，得到pH 5.6、酸度3.4、脱脂乳固体
8
成分8.7%、乳脂肪成分3.2%的发酵乳（短双歧杆菌YIT 12272株的初始菌为9.5×10CFU/mL）。

[0116] 将该发酵乳在10℃下保存14日，结果，短双歧杆菌YIT 12272株的存活率为30%，风味良好。

[0117] （实施例6）发酵乳饮食品的制造

[0118] 在90g水中溶解25g脱脂奶粉，在120℃灭菌3.5秒，之后，接种2%短双歧杆菌YIT12272株、0.01%乳酸乳球菌，在37℃培养直到pH4.4，在15MPa进行均质化，得到115g菌液A。另外，在水中溶解60g脱脂奶粉、0.25g乳肽，加水到总量为330g，在120℃灭菌3.5秒，之后，接种0.5%嗜热链球菌，在37℃培养直到pH4.3，在15MPa进行均质化，得到330g菌液B。另一方面，在水中溶解47g麦芽糖醇、29g聚葡萄糖、14g低聚半乳糖液糖、3.5g乳化铁、
3g果胶、1g胶原多肽、0.3g维生素B混合物、0.1g阿斯巴甜，加入1g香料、1g维生素E油，再加水到总量为555g，之后，在120℃灭菌3秒，得到糖浆液。混合菌液A、菌液B、糖浆液，填充到利乐容器，得到pH4.4、酸度7.5、脱脂乳固体成分8.1%、乳脂肪成分0.1%的发酵乳
8
（短双歧杆菌YIT12272株的初始菌数为8.8×10CFU/mL）。

[0119] 将该发酵乳在10℃保存16天，结果，短双歧杆菌YIT 12272株的存活率为34%，风味良好。

[0120] （实施例7）发酵乳饮食品的制造

[0121] 在198g水中溶解58g脱脂奶粉，在120℃灭菌3.5秒，之后，接种1%短双歧杆菌YIT 12272株、0.2%乳酸乳球菌、0.01%嗜热链球菌，在37℃培养直到pH 4.5，在15MPa进行均质化，得到256g菌液。另一方面，在水中溶解25g低聚半乳糖液糖、16g乳糖醇、16g帕拉金糖、3g果胶、0.05g三氯蔗糖，再加入1g香料，然后加水到总量为744g，之后，在
120℃灭菌3秒，得到糖浆。混合菌液、糖浆，填充到利乐容器，得到pH4.4、酸度5.3、脱脂乳固体成分5.5%、乳脂肪成分0.1%的乳酸菌饮料（短双歧杆菌YIT 12272株的初始菌数为
9
1.3×10CFU/mL）。

[0122] 将该乳酸菌饮料在10℃保存23天，结果，短双歧杆菌YIT 12272株的存活率为41%，风味良好。

[0123] （实施例8）发酵乳饮食品的制造

[0124] 在487g水中溶解58g全脂奶粉和42g脱脂奶粉、0.02g乳肽，在135℃灭菌3秒，之后，分别接种0.5%短双歧杆菌YIT 12272株和1.0%嗜酸乳杆菌的种菌，在33℃培养直到pH 5.3，在15MPa进行均质化，得到菌液587g。

[0125] 另一方面，在水中溶解98g帕拉金糖、8g胡萝卜汁、1g香料，加水到总量为413g，之后，在120℃灭菌3秒钟，得到糖浆液。

[0126] 混合菌液、糖浆液，填充到利乐容器，得到pH5.6、酸度2.9、脱脂乳固体成分8.1%、8
乳脂肪成分1.4%的发酵乳（短双歧杆菌YIT 12272株的初始菌数为9.5×10CFU/mL）。

[0127] 将该发酵乳在10℃保存14日，结果，短双歧杆菌YIT 12272株的存活率为30%，风味良好。

[0128] （实施例9）片剂的制造

[0129] 按照下述处方混合各种成分，经过造粒、干燥、整粒之后，进行压锭制造片剂。

[0130]

[0131] 1）将短双歧杆菌YIT 12272株的活菌冻结干燥而制造

[0132] （实施例10）清凉饮料的制造

[0133] 根据下述处方，依照常法配合各成分，均质化，得到清凉饮料。将所得到的清凉饮料填充到褐色瓶中，用铝盖封印，实施加热处理。所得到的清凉饮料外观、风味良好，保存稳定性良好。

[0134]

[0135] 1）将短双歧杆菌YIT 12272株的活菌体冻结干燥而制造

[0136] （实施例11）使用Random amplified polymorphic DNA（RAPD，随机扩增多态性DNA）法的菌株特异引物的制作

[0137] 使用属于短双歧杆菌的细菌62菌株，按照以下的顺序，从菌体提取DNA，进行PCR，由此进行RAPD，检索YIT 12272的特异性序列。

[0138] （1）从菌体提取DNA

[0139] 使用在GAM培养基（日水制药）中添加1%蔗糖的液体培养基，使用在37℃厌氧培养T24小时的属于短双歧杆菌的细菌62菌株（短双歧杆菌YIT 4014、YIT 4015、YIT 4023、YIT
4024、YIT 4043、YIT 4049、YIT 4063、YIT 4064、YIT 12272、其他53株）。离心0.5mL的菌液，除去上清液之后加入0.25mL DNA提取缓冲液（100mM Tris-HCl、40mM EDTA pH9.0）、
0.05mL的10%SDS、0.5mL的TE饱和苯酚、0.7g玻璃珠（φ0.1mm），剧烈震荡，将菌体破碎。
加入0.15mL的3M乙酸钠之后离心，将上清液移至其它的管。进行异丙醇沉淀、70%乙醇的清洗，风干，最后溶解在0.1mL的TE缓冲液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA）中。

[0140] （2）RAPD法

[0141] 使用27种随机引物（表7）进行。以总量为20μL、含有10mMTris-HCl（pH 8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP混合物、1.5μM随机引物、1.5U Taq DNA聚合酶（Takara公司）、10ng模板DNA的反应液，通过DNA热循环仪PTC200（MJ Research公司），进行94℃120秒、（94℃20秒、36℃30秒、72℃90秒）6个循环，（94℃20秒、36℃30秒、
72℃90秒）30个循环、72℃180秒的PCR反应。扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶以50V进行电泳，溴化乙锭染色后，照射UV进行确认。

[0142] 表7

[0143] RAPD法用随机引物的序列

[0144]

[0145] （3）克隆

[0146] 比较属于短双歧杆菌的细菌62株的RAPD带图案，使用TA克隆试剂盒（invitrogen公司生产），依照附属的指南克隆对YIT 12272特异的PCR扩增产物。即，在pCR2.1载体插入PCR扩增产物后，导入大肠菌中，进行转化。其后，将转化后的大肠菌涂抹在含有X-gal的添加有50μg/mL的氨苄青霉素的LB（Luria Bertani）琼脂培养基上进行培养，之后，在LB液体培养基上形成的白色菌落进行增殖，之后，提取DNA，得到克隆DNA。通过通常方法，使用染色终止剂（dye terminator）法，确定克隆的PCR扩增产物的DNA碱基序列（图1）。

[0147] （4）菌株特异的引物的制作和特异性的确认

[0148] 从通过克隆得到的YIT 12272特异的PCR扩增产物的DNA碱基序列中，选择对YIT12272最特异的、PCR的反应性高的序列，制作YIT 12272特异的引物。在表8中表示该序列。使用该YIT 12272特异的引物，对属于短双歧杆菌的细菌62菌株和从人肠道分离的12属78种82菌株（表9）、以及从144菌株提取的DNA进行PCR，确认特异性。PCR，以总量为
20μL、含有10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μM dNTP混合物、0.3μM引物、0.5U Taq DNA聚合酶、10ng模板DNA的反应液，进行94℃120秒、（94℃20秒、60℃10秒、72℃20秒）32循环、72℃180秒的PCR反应。对于扩增产物，使用1.5%琼脂糖凝胶，在
100V下进行电泳，溴化乙锭染色后，在UV照射下确认。其结果，确认制作的YIT 12272特异引物对短双歧杆菌YIT 12272特异。

[0149] 表8

[0150] YIT 12272特异引物（pBbrY）的序列

[0151]

[0152] 表9

[0153] 使用菌株

[0154]

[0155] （实施例12）活的YIT 12272的PCR法检测

[0156] （1）膜透过性色素的最适化

[0157] 对短双歧杆菌YIT 12272使用作为膜透过性色素的乙锭单叠氮溴（EMA）和丙锭单叠氮溴（PMA）。使用添加有GAM+1%蔗糖的液体培养基，对在24小时37℃厌氧条件下培养后的YIT 12272直接（活菌）或者在80℃加热10分钟得到的死菌体、10日37℃继续培养得到的死菌体，分别添加色素，使得最终浓度为240μM EMA或50μM PMA，在室温下保温5分钟，之后，使用2个500W的卤灯，在灯下20cm的距离照射2分钟光。其后，从这些菌体提取DNA，使用YIT 12272特异的引物的定量PCR，进行YIT 12272的定量（定量的PCR方法为International Journal of Food Microbiolog(2008)Vol.126,p210-215中记载的方法）。其结果，EMA和PMA都能够抑制死菌体的PCR扩增，但EMA还抑制来自活菌的PCR扩增。PMA不会抑制YIT 12272的活菌的PCR扩增，而抑制死菌的PCR扩增，因此PMA适用于使用活的YIT 12272的定量PCR检测定量（图2）。

[0158] 为了实现PMA处理的最适化，改变PMA的浓度（5μM、50μM、150μM）和光照射时间（1、2、5分钟），处理YIT 12272的活菌和加热死菌，使用YIT 12272的特异引物进行定量PCR。其结果，光照射时间对PMA处理没有影响，低浓度（5μM）和高浓度（150μM）的PMA处理，与50μM的PMA处理相比，可知来自加热死菌体的PCR扩增抑制效果弱（图3）。因此，可知对YIT 12272的PMA处理，适宜50μMPMA、2分钟光照射。

[0159] （2）粪便中的活YIT 12272的检测、定量

[0160] 在通过选择培养基和使用YIT 12272特异引物定量PCR确认了YIT 12272不存在的粪便中添加YIT 12272的加热死菌体，进行PMA处理（50μM PMA，2分钟光照射）。其结果，来自粪便中的YIT 12272的加热死菌体的PCR扩增被抑制，YIT 12272的死菌的定量值减少为约20,000分之一（图4）。另一方面，在粪便中添加24小时培养后的活YIT 12272，进行PMA处理，使用YIT 12272特异引物定量的PCR，定量YIT 12272，结果显示，PMA处理5
不会阻碍YIT 12272的PCR扩增，YIT 12272在每1g粪便中存在10 以上时，能够正确地定量（图5）。这里，能够通过以下式3计算YIT 12272的活菌数。

[0161] （记号）

[0162] PMA不处理时的YIT 12272的PCR定量值：X个细胞/g

[0163] PMA处理时的YIT 12272的PCR定量值：Y个细胞/g

[0164] 样品中的YIT 12272的活菌数：L个细胞/g

[0165] 样品中的YIT 12272的死菌数：D个细胞/g

[0166] 式1：X=L+D

[0167] 式2：Y=L+D/20000

[0168] 式3（通过式1、2导出式3）：L=（20000Y-X）/19999

[0169] 从粪便中提取DNA，使用以下方法。使用厌氧的稀释液（表10），离心0.2mL粪便的10倍稀释液后，除去上清液，进行在1.0mL的PBS缓冲液中再次悬浊的清洗操作，重复3次。其后，粪便颗粒在-80℃保存直到提取核酸为止。解冻冻结保存的粪便颗粒后，添加
0.6mL的ASL缓冲液（Qiagen公司），在70℃加热5分钟，之后，加入0.5mL TE饱和苯酚、
0.7gφ0.1mm玻璃球，使用FastPrep FP120（Bio101公司），在6.5m/s剧烈震荡30秒。添加0.1mL的3M乙酸钠后，进行离心，得到上清液。向0.7mL上清液添加ASL缓冲液0.7mL和Inhibit EX片（Qiagen），充分混合后，离心，得到上清液。向0.55mL上清液加入0.55mLAL缓冲液（Qiagen）和0.55mL 100%乙醇，搅拌后，全部通过QIAmp离心柱（Qiagen），DNA吸附在柱上，将柱洗净之后，加入0.1mLAE缓冲液（Qiagen），离心，回收DNA。

[0170] 表10

[0171] 厌氧稀释液的组成

[0172]

[0173] （3）YIT 12272饮用试验中的粪便中的活YIT 12272的检测、定量

[0174] 对健康成人，禁止摄取含有活菌的食品3周后，实施连续10日每日饮用1份（100mL）实施例6的发酵乳（含有1010.5/份的YIT 12272）的试验。

[0175] （3-1）组合选择培养基和YIT 12272特异引物的活的YIT 12272的检测[0176] 使用稀释缓冲液（PBS）将含有YIT 12272的实施例6的发酵乳的饮用前后的粪便进行10倍梯度稀释，将其100μL涂抹在YIT 12272选择培养基（T-CBPC，表11）上，在37℃厌氧培养72小时，形成菌落。将所得到的菌落在添加有1%蔗糖的GAM液体培养基（日水制药）在37℃下厌氧培养24小时，得到菌体。从菌体提取DNA，将其作为模板，使用YIT 12272特异引物进行PCR。此外，对一部分菌株通过RAPD试验进行菌株识别。其结果，由两者进行的YIT 12272识别的结果完全一致。到目前为止，将在选择培养基上形成的菌落确认为YIT 12272需要耗费时间和精力的RAPD试验、使用YIT 12272特异的单克隆抗体的ELISA试验（Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附试验），但是使用YIT 12272特异引物能够迅速、简便地进行。

[0177] 表11

[0178] YIT12272的选择培养基（T-CBPC）的组成

[0179]

[0180] *在115℃15min高压釜后添加

[0181] 每50mL包括：

[0182] 羧苄青霉素钠盐 0.001g

[0183] 链霉素硫酸盐 5000000U

[0184] （3-2）粪便中的活的YIT 12272的定量

[0185] 为了检测含有YIT 12272的实施例6的发酵乳的饮用前后的粪便中的活的YIT12272，在0.5mL的PBS中悬浊溶解的粪便颗粒，添加1.4μL 20mM的PMA溶液（最终浓度为
50μM），轻轻搅拌之后在暗处保管5分钟。之后，使用卤灯照射2分钟强光，离心后，除去上清液。从PMA处理后的粪便提取DNA，组合使用YIT 12272特异引物的定量PCR，定量粪便中的活的YIT 12272。此外，同时定量不进行PMA处理的包括死菌的粪便中的YIT 12272的总菌数。在表12中一并表示该结果和使用T-CBPC琼脂选择培养基得到的YIT 12272的CFU。含有YIT 12272的发酵乳的饮用前的粪便中，培养法和使用YIT 12272特异引物的定量PCR的任一种中都没有检测出YIT 12272。另一方面，饮用结束后的粪便1克中，不进
8.1±0.8
行PMA处理、通过定量PCR检测得到的YIT 12272的总数（活菌和死菌）为10 个细胞，
7.5±1.0
PMA处理、通过定量PCR检测得到的活的YIT 12272为10 个细胞，菌株特异的选择培
6.9±1.5
养基检测得到的YIT 12272为10 CFU。此外，PMA处理时的死菌体的PCR的定量值非常少，因此，式3计算的YIT 12272的活菌数与PMA处理时的定量的PCR菌数（表12）相等。
因此，确认了通过使用PMA处理和定量PCR能够测定粪便中的YIT 12272的活菌数。

[0186] 表12

[0187] 含有YIT12272的发酵乳的饮用前后的粪便中的YIT 12272的菌数

[0188]5

[0189] a）YIT 12272的定量PCR中的检测界限为1g粪便10 个细胞，培养法中的检测界2
限为10CFU。

[0190] b）平均和S.D.为检测界限以下的检测体时，以检测界限的菌数计算

[0191] 到目前为止，检测定量粪便中的YIT 12272的方法是通过在选择培养基上形成菌落而进行的，但是确认菌落为YIT 12272的确定检查耗费大量的精力和时间。此外，在选择培养基上使用高浓度的抗生物质，因此，损伤菌等不能够分裂，有可能造成活的YIT 12272评价过低。使用本发明的YIT 12272特异引物的定量PCR，不管活菌还是死菌，能够定量粪便中的全部YIT 12272。并且，与作为膜透过性色素的PMA组合，能够迅速简便地定量粪便中活的YIT 12272。

[0192] （实施例13）饮用菌的回收性试验

[0193] 将19名20多岁到50多岁的健康成人随机分为2组，进行7日观察（观察期）之后，依照实施例6所述的方法，使他们以1份（100mL）/日摄取7日（摄取期1）摄取以YIT12272株制作的发酵乳（试验饮料）或以YIT 10001株代替YIT 12272株制作的发酵乳（对照饮料）。10天的停止期后（停止期），对调摄取试验饮料和对照饮料的被试验者，再摄取7日（摄取期2）。收集观察期、各摄取期、停止期的最终日的次日的粪便。其中，试验期间，禁止进行试验饮料或对照饮料以外的乳饮品或益生菌制品的摄取。此外，试验饮料和对照饮
8 8
料的双岐乳杆菌菌数分别为6.8～8.9×10CFU/mL、2.9～4.2×10CFU/mL。

[0194] 以实施例12为基准，使用T-CBPC琼脂选择培养基，求出粪便中的饮用菌（YIT12272株或YIT 10001株）的CFU。使用RAPD法和表8的YIT 12272株特异引物，进行菌株的定性试验。

[0195] 饮用前，从任一个被试验者的粪便中都没有检测出饮用菌，但是，饮用后，试验饮料组、对照饮料组中检测出的饮用菌的菌数分别为7.3±0.8Log CFU/g、5.9±1.1LogCFU/g，与对照饮料组相比，试验饮料组的值显著提高（表13）。其中，试验期间，确认没有伴随试验饮料、对照饮料的饮用的有害事项。

[0196] 表13

[0197] 来自粪便中的饮用菌的检测菌数

[0198]饮用前 饮用后
试验饮料组（n=19）
饮用菌的检测菌数(Log CUF/g) ND 7.3±0.8##
对照饮料组（n=19）
饮用菌的检测菌数(Log CUF/g) ND 5.9±1.1

[0199] ##：p<0.01与对照饮料组相比较（独立2组t检验）

[0200] ND：检测界限（102CFU）以下

[0201] 可知，通过本发酵乳的饮用，发酵乳中的YIT 12272株、YIT 10001株任一种以活的状态从粪便回收，但其菌数YIT 12272株显著更多。其结果反映出YIT 12272株在产品中的存活性良好，并且人工胃液耐性、人工胆汁、肠液耐性强化。

[0202] （实施例14）整肠作用试验1

[0203] 以年龄63岁以上的便秘或便秘倾向者57名（排便次数3～5次/周，便的水分含量不足70%，男性27名，女性30名，平均年龄68.7±5.4岁）为对象，观察2周后，使其以1份（100mL）/日饮用4周实施例8所述的发酵乳，进行开放试验，调查观察期和饮用期的最终周的排便情况、粪便性状（布里斯托大便分类法）。其中，试验期间，禁止本发酵乳以外的乳制品、益生菌制品的摄取。本发酵乳的双岐乳杆菌菌数为1×108CFU/mL以上。

[0204] 与饮用前相比，饮用后的排便次数、排便日数、排便量显著增加，此外，粪便性状得分显著改善，硬的粪便正常化（表14）。此外，试验期间，确认没有伴随本发酵乳的饮用的有害事项。根据本结果，确认本发酵乳具有整肠作用。

[0205] 表14

[0206] 观察期和饮用期的排便状况和便性状

[0207]观察期 饮用期
排便次数(次数/周) 5.0±1.7 6.2±1.9**
排便日数(日数/周) 4.3±1.2 5.2±1.2**
排便量(单位/周)1) 21.7±9.7 27.4±11.8**
便性状得分2） 3.6±0.9 3.8±0.7#

[0208] 1）：直径2cm×高度5cm的圆柱为1个单位

[0209] 2）：基于布里斯托大便分类法，分为分离的块状（1）、硬块状（2）、表面裂痕（3）、表面光滑（4）、半固体（5）、泥状（6）、液体状（7），7个等级

[0210] **：p<0.01与观察期的比较（关联2组t检验）

[0211] #：p<0.05与观察期的比较（Wilcoxon符号秩和检验）

[0212] 实施例15）整肠作用试验2

[0213] 以有便秘倾向的女学生75名（18～23岁，排便次数为5次以下/周）为对象，进行4周观察，之后，使其以1份（100mL）/日饮用4周实施例6的发酵乳（试验组）或安慰性饮料（不含菌、低聚半乳糖和聚葡萄糖的未发酵乳，安慰剂对照组）的安慰对照双盲实验并行组间试验，调查观察期和饮用期的最终周的排便情况、粪便性状（布里斯托大便分类法）。其中，试验期间，禁止本发酵乳或者安慰性饮料以外的乳制品和益生菌制品的摄取。本发酵
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乳的双岐乳杆菌菌数为1×10CFU/mL以上。

[0214] 对粪便的水分含量不足70%的被试验者44名进行分析（表15），结果是，排便次数，饮用期与安慰剂对照组相比，试验组显示增加的倾向（p=0.081）。排便日数，与观察期相比，饮用期安慰剂对照组没有变化，试验组显著增加，饮用期中，与安慰剂对照组相比，试验组显著增多。粪便性状得分，与观察期相比，饮用期安慰剂对照组没有变化，试验组显著增高，便性状改善。此外，饮用期中，与安慰剂对照组相比，试验组表现出增高倾向（p=0.070）。其中，试验期间，确认没有伴随本发酵乳、安慰饮料的饮用的有害事项。根据本结果，确认本发酵乳具有整肠作用。

[0215] 表15

[0216] 观察期和饮用期的排便状况和便性状

[0217]观察期 饮用期
排便次数（次/周）
安慰剂对照组（n=20） 4.1±1.2 4.2±1.8
试验组（n=24） 4.7±1.7 5.5±2.9a)
排便日数（日数/周）
安慰剂对照组（n=20） 3.8±1.2 3.6±1.4
试验组（n=24） 3.8±1.0 4.6±1.6*#
便性状得分1)
安慰剂对照组（n=20） 3.0±1.2 3.1±0.9
试验组（n=24） 3.2±0.9 3.6±0.7*b)

[0218] 1）：基于布里斯托大便分类法，分为分离的块状（1）、硬块状（2）、表面裂痕（3）、表面光滑（4）、半固体（5）、泥状（6）、液体状（7），7个等级

[0219] *：p<0.05与观察期的比较（关联2组t检验或Wilcoxon符号秩和检验）[0220] #：p<0.05与安慰剂对照组的比较（独立2组t检验）

[0221] a）：p=0.081与安慰剂对照组的比较（独立2组t检验）

[0222] b）：p=0.070与安慰剂对照组的比较（Wilcoxon符号秩和检验）

[0223] （实施例16）腐败产物产生抑制作用试验

[0224] 将从二十多岁到七十多岁的健康女性39名以年龄、身高、体重、BMI均等分为2组，4周前观察后，使其以1份（100mL）/日饮用4周实施例6的发酵乳（试验组）或安慰性饮料（不含菌、低聚半乳糖和聚葡萄糖的未发酵乳，安慰剂对照组）的安慰对照双盲实验并行组间试验，在观察期和饮用期的最终周从手腕采血。其中，试验期间，禁止本发酵乳或安慰性
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饮料以外的乳制品或益生菌制品的摄取。此外，本发酵乳的双岐乳杆菌菌数为1×10CFU/mL。

[0225] 从收集的血液按照通常方法制备血清，在-80℃冻结保存。搅拌混合25μL血清、475μL mili Q水、200μL盐酸、10μL内部标准液（用乙酸乙酯（sigma公司）稀释4-氯苯酚（东京化成）300倍）后，在密塞的试验管中在100℃加热60分钟。冷却后，添加2mL二乙酯，搅拌后，收集1mL二乙酯层，与含有1mL 0.05N氢氧化钠的甲醇混合。使用离心蒸发器将本混合液干固后，在200μL乙酸乙酯中溶解，用0.45μm的过滤器（Ultrafree-MC，Millipore公司）过滤，作为HPLC试样。此外，混合25μL用乙酸乙酯将对甲酚（Nacalai公司）稀释到0～0.01%的溶液、675μL乙酸乙酯、10μL上述内部标准液，作为标准溶液。在以下的条件下，进行对甲酚的HPLC分析。

[0226] HPLC系统：Alliance2695（Waters公司）

[0227] 检测器：荧光检测器Ex260nm、Ev305nm（UV检测器270nm并用）

[0228] 柱：L-column4.6×150mm，颗粒直径5μm（CERI公司）

[0229] 株温度：40℃

[0230] 洗脱液：%A：0.1%磷酸，%B：乙腈，%A/%B=80/20（等强度）

[0231] 流量：1.0mL/min

[0232] 注入量：10μL

[0233] 试样室温度：10℃

[0234] 测定时间：30分钟

[0235] 饮用后的对甲酚浓度与饮用前相比，安慰剂对照组没有变化，试验组显著降低，与安慰剂对照组相比，试验组为显著的低值（表16）。此外，试验期间，确认没有伴随本发酵乳或安慰性饮料的饮用的有害事项。

[0236] 表16

[0237] 饮用前后的血中对甲酚浓度

[0238]饮用前(μM) 饮用后（μM）
安慰剂对照组(n=19) 61.9±16.7 67.0±11.1
试验组（n=20） 74.0±13.0 34.3±7.5*#
*

[0239] ：p<0.05与饮用前的比较（关联2组t检验）#

[0240] ：p<0.05与安慰剂对照组的比较（独立2组t检验）

[0241] 根据以上结果可知，通过本发酵乳的饮用，可以使由肠内细菌产生的对活体有毒性的肠内腐败物质（对甲酚）的血中浓度降低，这是由于由肠内环境改善作用得到肠内的对甲酚产生抑制的结果。即，本发酵乳具有肠内环境改善作用。

[0242] 工业上的可利用性

[0243] 根据本发明的双歧杆菌属细菌的制作方法，能够得到环境因素不同的条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌。该菌株适用于各种各样的饮食品，并且在饮食品中的菌的存活性高，因此，能够有效发挥双歧杆菌属细菌所具有的生理效果。此外，通过本发明的制作方法改良了具有抗幽门螺杆菌作用等的特异的生理效果的双歧杆菌属细菌，能够制作能够在各种各样的饮食品中利用的菌株，因此，本发明的工业上的利用性极高。