含有益生生物的成长乳

申请号 CN201080020814.1 申请日 2010-05-11 公开(公告)号 CN102595916A 公开(公告)日 2012-07-18
申请人 雀巢产品技术援助有限公司; 发明人 A·梅赛尼尔; S·努特恩; G·普里乌特;
摘要 本 发明 涉及婴儿和幼儿的营养领域。特别地,本发明涉及包含待施用于大于10个月年龄的婴儿和幼儿的益生 微 生物 的成长乳。这些益生微生物可为非复制型益生微生物,例如生物活性的经 热处理 的益生微生物。
权利要求

1.成长乳组合物,其包含待施用于从10个月年龄起的婴儿或幼儿的益生生物
2.根据权利要求1的组合物,其具有在70-80kcal/100ml范围内的热密度,并且包含
2-3g/100kcal的量的蛋白质源,12-15g/100kcal的量的糖源,和3-4.6g/100kcal的量的脂类源。
3.根据前述权利要求之一的组合物,其包含0.15-0.25gLC-PUFA/100g脂肪酸,其中LC-PUFA可选自ARA、DHA或它们的组合。
4.根据前述权利要求之一的组合物,其包含1.5-2.5mg核苷酸每100mL配方乳。
5.根据前述权利要求之一的组合物,其中益生微生物包含非复制型益生微生物。
6 12
6.根据前述权利要求之一的组合物,其包含对应于约10 到10 cfu的益生微生物。
7.根据权利要求5-6之一的组合物,其中非复制型益生微生物是通过热处理成为非复制型的,优选地通过在至少71.5℃实施至少1秒的高温度处理。
8.根据权利要求7的组合物,其中热处理为在约71.5-150℃实施约1-120秒的高温度处理,并且优选地为高温度/短时间(HTST)处理或超高温度(UHT)处理。
9.根据权利要求8的组合物,用于炎性疾病预防治疗
10.根据权利要求7的组合物,其中在约70-150℃温度范围内约3分钟-2小时实施热处理,优选地在80-140℃范围内从5分钟-40分钟实施热处理。
11.根据权利要求10的组合物,用于预防或治疗与受损的免疫防御相关的疾病。
12.根据前述权利要求之一的组合物,其中至少90%,优选地至少95%,更优选地至少
98%,最优选地至少99%,理想地至少99.9%,最理想地全部益生菌剂为非复制型的。
13.根据前述权利要求之一的组合物,其中益生微生物选自双歧杆菌属
(bifidobacteria)、乳杆菌属(lactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria),或它们的组合,例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球 菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酰乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。
14.根据前述权利要求之一的组合物,其中益生微生物选自长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌La1、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002(NCC 1825)、大肠埃希氏菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287,或它们的组合。
15.根据前述权利要求之一的组合物,其每天剂量含有约0.005mg-1000mg非复制型微生物。

说明书全文

含有益生生物的成长乳

[0001] 本发明涉及婴儿和幼儿的营养领域。特别地,本发明涉及包含待施用于大于10个月年龄的婴儿和幼儿的益生微生物的成长乳。这些益生微生物可为非复制型益生微生物,例如生物活性的经热处理的益生微生物。
[0002] 母乳是婴儿健康成长和发育的理想的食物。在2001年世界卫生组织(WHO)把其推荐的专有的母乳喂养的持续时间从4到6个月改变到6个月,因而应该相应地鼓励和促进母乳喂养。
[0003] 从第六个月起婴儿行为开始变化。他们第一次坐起来或仅用一只手抓住玩具。婴儿的营养需要随着婴儿发育改变。营养物如变得更加重要。
[0004] 从一岁起,基于乳的饮料成为婴儿食物中重要的一项。但是牛乳本身不适应于幼儿的营养需要。特别地,牛乳含有过多的蛋白质,过多的矿物质、过少的铁、过多的饱和脂肪酸和不足够的不饱和脂肪。
[0005] 开发成长乳(growing up milks;GUM)以协助渡过这步。GUM保证了从母乳的较低蛋白质平到牛乳和成人使用的正常乳制品中存在的高蛋白质水平的稳定过渡。
[0006] 成长乳(GUM)目标为帮助初级阶段学步幼儿最大化他们在身体和智发育方面的潜力。GUM满足了学步幼儿的蛋白质需要,同时不会使仍未成熟的代谢系统过载。
[0007] 婴儿和幼儿早期营养的一个重要功能是生成健康的肠菌群和发育强壮的免疫系统。
[0008] 健康的肠菌群将促成功能性的胃肠道,这本身又有助于婴儿和幼儿合适地消化摄入的食物并将减少胃痛。
[0009] 一般地婴儿和幼儿每年患10次左右感冒。此类感冒是不舒服的并甚至可有更严重的后果。
[0010] 因此进一步改善成长乳的免疫加强作用是需要的。
[0011] 进一步改善成长乳的抗炎作用也是需要的。
[0012] 因此,本领域需要成长乳,所述成长乳确保从母乳的较低蛋白质水平到存在于牛乳中高蛋白质水平的稳定过渡。此类成长乳应该具有改善的免疫加强作用、抗炎作用和/或应该易于消化。如果通过使用天然成分来实现这一需要是优选的,所述天然成分对于施用是安全且没有副作用的,并且是使用本领域现有工业技术易于掺入到成长乳组合物中的。
[0013] 本发明人已经陈述了此需要。因此本发明的目的为改善本领域现有技术和提供GUM组合物,所述GUM组合物满足以上表述的需要。
[0014] 本发明人令人惊讶地看到通过独立权利要求的主题他们能够达到此目标。从属权利要求进一步发展了本发明的想法。
[0015] 因此,本发明人提出了提供包含益生菌剂的成长乳组合物。
[0016] 成长乳组合物为营养组合物。特别地成长乳为特定的营养组合物,所述营养组合物具有允许从母乳组合物到牛乳组合物的稳定过渡的组成。可逐步地做出此调整。可预见若干不同的成长乳伴随此过渡。例如,在10个月年龄开始可施用一种成长乳组合物,在12个月年龄开始可施用第二种成长乳组合物而在24个月年龄开始可施用第三种成长乳组合物。
[0017] 发现益生菌剂在成长乳的结构中能够提供它们的健康益处。此外,例如双歧杆菌,存在于母乳中并且为给予母乳其天然保护性质的一部分。
[0018] 因此,向婴儿和幼儿营养配方乳(formula)中加入益生微生物将使得它们更像母乳。
[0019] 然而,特别地由于待用水重构的粉状配方乳通常的贮存期限超过例如包含益生菌剂的酸奶饮料的贮存期限,通常益生菌剂不加入到此类配方乳中,这是因为例如在延长的贮存期限期间能够确保益生菌剂存活力的非确定性。
[0020] 本发明人现在能够表明甚至非复制型益生菌剂能够提供益生菌剂的健康益处和甚至可具有改善的益处。
[0021] 因此,本发明涉及包含待施用于从10个月年龄开始的婴儿或幼儿的益生微生物的成长乳组合物。
[0022] 成长乳提供了具有平衡的脂肪酸组成的合适量的脂类。脂类是最好的能量提供者(9kcal/g),为学步幼儿的增加的活动所需。但是脂肪酸也是细胞膜构建所需要的,并且是一些有生理活性的因子(例如激素凝固因子等)重要的前体。
[0023] FDA条例定义婴儿为不大于12个月年龄的人(Title 21,Code of Federal Regulations 21CFR 105.3(e))。
[0024] 本发明的成长乳组合物包含平衡的蛋白质含量。
[0025] 一方面,尤其在生长时期期间,例如构建身体组织例如肌肉时需要蛋白质。另一方面,高量蛋白质为学步幼儿的仍未成熟的肾功能添加了负担。如果肾功能还没有成熟,高蛋白质摄入能够损害肾功能。研究提示大于1岁龄的儿童趋向于具有高于儿科推荐的蛋白质摄入。高蛋白质摄入也牵涉了以后生活中的肥胖症
[0026] 牛乳具有对于婴儿和幼儿营养次佳的脂肪酸组成。饱和脂肪酸高而不饱和脂肪酸低,牛乳没有提供最佳和最健康的脂肪酸组成。生长需要不饱和脂肪酸,例如用于在神经系统中构建细胞,并且研究显示很多学步幼儿没有接受推荐的水平。例如,脑极富含DHA(n-3不饱和脂肪酸)。因此本发明的成长乳组合物可具有在两个家族的必需脂肪酸之间良好的平衡,在n-6脂肪酸如亚麻酸和n-3脂肪酸如α-亚麻酸之间具有约4-10的比率。
[0027] 如果作为干组合物提供,优选GUM组合物水活度在0.2以下,优选地在0.15以下以进一步提高贮存稳定性。例如,水活度在0.91以下时大多数细菌不生长,而水活度在0.80以下时大多数霉菌停止生长。
[0028] 水活度(aw)是在系统中水的能量状态的量度。它被定义为水的蒸气压力除以纯水的蒸气压力。因而,蒸馏水的水压力为1。
[0029] 本发明的成长乳组合物可具有在70-80kcal/100ml范围内的热密度,并且包含2-3g/100kcal的量的蛋白质源,12-15g/100kcal的量的糖源,和3-4.6g/100kcal的量的脂类源。
[0030] 待施用于10-12个月年龄的婴儿的本发明的成长乳组合物可具有在约70kcal/100ml范围内的热密度,并且包含2.2-2.3g/100kcal的量的蛋白质源,约
13g/100kcal的量的糖源,和4.3至4.4g/100kcal的量的脂类源。
[0031] 待施用于12-24个月年龄的儿童的本发明的成长乳组合物可具有在约70-80kcal/100ml范围内的热密度,并且包含2.2-2.9g/100kcal的量的蛋白质源,约
11.9-13.9g/100kcal的量的糖源,和3.9至4.6g/100kcal的量的脂类源。
[0032] 待施用于24个月以上年龄的儿童的本发明的成长乳组合物可具有约70kcal/100ml的热密度,并且包含约2.5g/100kcal的量的蛋白质源,约14.6g/100kcal的量的糖源,和3.9至4.6g/100kcal的量的脂类源。
[0033] 蛋白质源可由乳清蛋白和酪蛋白组成。例如,可使用乳清对酪蛋白在约20∶80到80∶20的范围内,例如40∶60到60∶40的比率。
[0034] 糖源可基本由乳糖组成。然而也可使用乳糖对麦芽糖糊精在3∶1到1∶1范围内的比率。
[0035] 本发明的喂养配方乳可包含0.2-0.3g LC-PUFA/100g脂肪酸。LC-PUFA可选自ARA、DHA或其组合。例如,LC-PUFA可包含ARA和DHA的组合。已经显示了含有DHA和ARA的配方乳提供视觉和智力发育,与母乳哺育的婴儿类似。
[0036] 本发明的喂养配方乳也可含有每100ml配方乳1.5-2.5mg核苷酸。不认为核苷酸和它们的基是“必需的,,因为婴儿身体能够从较简单的化合物合成它们。然而在某些时间,合成过程可能不能够满足需求,例如像在正常生长或在胃肠疾病中迅速细胞更新时期的期间。在这些时间,身体更多依赖于核苷酸的饮食源。
[0037] 组合物可包含部分或仅非复制型益生微生物。
[0038] 本发明人惊异地发现,例如,在免疫加强作用方面和/或在抗炎作用方面,非复制型益生微生物甚至可比复制型益生微生物更有效。
[0039] 这是令人惊异的,因为益生菌剂经常被定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”(FAO/WHO指南)。绝大多数公开的文献涉及活益生菌剂。此外,若干研究调查了由非复制型细菌递送的健康益处且它们多数表明了益生菌剂的失活,例如,通过热处理,导致损失了它们声称的健康益处(Rachmilewitz,D.等人,2004,Gastroenterology126:520-528;Castagliuolo 等 人,2005,FEMS Immunol.Med.Microbiol.43:197-204;
Gill,H.S. 和 K.J.Rutherfurd,2001,Br.J.Nutr.86:285-289;Kaila,M. 等 人,1995,Arch.Dis.Child 72:51-53.)。一些研究显示了灭活的益生菌剂可保留一些健康作用 (Rachmilewitz,D. 等 人,2004,Gastroenterology 126:520-528;Gill,H.S. 和K.J.Rutherfurd,2001,Br.J.Nutr.86:285-289),但明确地,本领域迄今认为活益生菌剂为更有效的。
[0040] 根据本发明的组合物可包含任意有效量的益生微生物,例如对应于约106到12
10 cfu/g干重的量。
[0041] 益生微生物可为非复制型益生微生物。
[0042] “非复制型”益生微生物包括已被热处理的益生细菌。这包括失活的、死亡的、非活的和/或以片段例如DNA、代谢物细胞质复合物、和/或细胞壁物质存在的微生物。
[0043] “非复制型”意为没有活细胞和/或菌落形成单位能够由经典的平板培养法检出。此类经典的平板培养法总结于微生物学书中:James Monroe Jay,Martin J.Loessner,David A.Golden.2005.Modern food microbiology.第7版,Springer Science,New York,N.Y.790p。一般地,能够按如下示出活细胞不存在:在琼脂平板上没有可见的菌落或在用不同浓度的细菌制备物(“非复制型”样本)接种和在适当条件(需和/或厌氧环境至少
24小时)温育之后液体生长培养基中没有增加的浊度
[0044] 为了本发明的目的,定义益生菌剂为“对宿主的健康或安康具有有益作用的微生物细胞制备物或微生物细胞组分”(Salminen S,Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:how should they be defined”Trends Food Sci.Technol.1999:10107-10)。
[0045] 使用非复制型益生微生物的可能性提供了若干优势。在严重免疫损伤的儿童中,由于患菌血症的潜在危险在特殊情形中活益生菌剂的使用可受限制。可无任何问题地使用非复制型益生菌剂。
[0046] 额外地,提供的非复制型益生微生物在保持健康益处同时允许热重构。
[0047] 本发明的组合物包含足够至少部分地产生健康益处的量的益生微生物和/或非复制型益生微生物。实现此的足够的量被定义为“治疗有效量”。对此目的有效的量将取决于本领域技术人员所知的许多因素例如重量和儿童的总体健康状态,并取决于食物基质的影响。
[0048] 在预防性的应用中,对消费者施用足够至少部分地减少患病危险的量的根据本发明的组合物,所述消费者易感或有患病的危险。定义此类量为“预防有效量”。再一次,准确的量取决于许多因素例如儿童的健康和重量状态,并取决于食物基质的影响。
[0049] 本领域技术人员能够适当地调整治疗有效量和/或预防有效量。
[0050] 总之来说,本发明的组合物含有治疗有效量和/或预防有效量的益生微生物和/或非复制型益生微生物。
[0051] 一般地,治疗有效量和/或预防有效量是每日剂量在约0.005mg-1000mg益生微生物和/或非复制型益生微生物范围内。
[0052] 在数量方面,“短时间高温度”处理的非复制型微生物可以对应于104和1012等价的cfu/g干组合物之间的量存在于组合物中。显而易见地,非复制型微生物不形成菌落,因4 12
而,此术语理解为从10 到10 cfu/g的复制型细菌获得的非复制型微生物的量。此包括失活的、非活的或死亡的或以片段例如DNA或细胞壁或细胞质复合物存在的微生物。换句话说,以微生物的在菌落形成能力(cfu)上的量表示组合物含有的微生物的量,如同全部微生物是活的而不考虑它们是否是活的,实际上,它们是非复制型的,例如失活的或死亡的、片段的或任何或全部这些状态的混合物。
[0053] 优选地,非复制型微生物以等同于104和109cfu/g干组合物之间的量存在,更优选5 9
地以等同于10 和10cfu/g干组合物之间的量存在。
[0054] 通过本领域已知的任何方法可使益生菌剂成为非复制型。
[0055] 当今可用的使得益生菌株成为非复制型的技术通常为热处理、伽辐射、UV线或使用化学试剂(福尔马林,多聚甲)。
[0056] 优选地使用使得益生菌剂非复制性的技术,所述技术在食品工业中工业环境下相对简单地应用。
[0057] 在它们的生产过程中,当今市场上的多数含有益生菌剂的产品被热处理。因此,在益生菌剂保持或提高它们的有益的性质或甚至获得对消费者新的有益的性质的同时,能够与生产的产品一起或至少以相似的方法热处理益生菌剂将是方便的。
[0058] 然而,在文献中通过热处理的益生微生物失活与至少部分益生菌剂活性丢失普遍地相关联。
[0059] 本发明人现在惊异地发现,例如,通过热处理使得益生微生物成为非复制型不导致益生菌剂健康益处的丢失,相反地,可增强现存的健康益处并甚至生成新的健康益处。
[0060] 因此,本发明的一个实施方案是组合物,其中非复制型益生微生物通过热处理成为非复制型。
[0061] 在至少71.5℃达至少1秒可实施此热处理。
[0062] 可使用长时程热处理或短时程热处理。
[0063] 在当今工业规模中通常优选短时程热处理,例如UHT-样热处理。这类热处理减少细菌负荷,并且减少加工时间,从而减少营养物质的破坏。
[0064] 发明人第一次展示了不论它们初始的性质,被高温度短时间热处理的益生微生物表现了抗炎的免疫谱。特别地通过此热处理发展新的抗炎谱或加强现有的抗炎谱。
[0065] 因此通过使用特定的热处理参数,现在可能生成具有抗炎免疫谱的非复制型益生微生物,所述热处理参数对应于一般的工业可应用的热处理,即使活的对应物是非抗炎菌株。
[0066] 因此,例如,热处理可为在约71.5-150℃达约1-120秒高温度处理。高温度处理可为高温度/短时间(HTST)处理或超高温度(UHT)处理。
[0067] 益生微生物可在约71.5-150℃达约1-120秒的短时程高温度处理。
[0068] 更为优选地益生微生物可在约90-140℃,例如90-120℃,达约1-30秒的短时程高温度处理。
[0069] 此高温度处理使得微生物至少部分成为非复制型。
[0070] 可在正常大气压力但也可在高压力下实施高温度处理。一般的压力在从1到50巴范围内,优选地从1到10巴,更为优选地从2到5巴。明显地,加热时,优选在培养基中热处理益生菌剂,所述培养基为液体或固体。应用的理想的压力将因此取决于提供微生物的组合物的本性和使用的温度。
[0071] 在约71.5-150℃,优选地约90-120℃,更为优选地约120-140℃的温度范围内可实施高温度处理。
[0072] 可实施高温度处理达约1-120秒,优选地约1-30秒,更为优选地约5-15秒的短时程。
[0073] 此给出的时间框架指益生微生物在给出的温度的处理时间。需注意的是,取决于提供微生物的组合物的本性和量以及取决于使用的加热装置的构造,热应用的时间可不同。
[0074] 然而一般地,通过高温度短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或超高温度处理(UHT)来处理本发明的组合物和/或微生物。
[0075] UHT处理是超高温度加工或超热处理(两者都缩写为UHT),涉及通过大约1-10秒,温度超过135℃(275F)短时间加热组合物的至少部分灭菌,所述温度是杀死奶中的细菌芽孢所必需的。例如,使用超过135℃温度用这种方法加工奶使得在必要持续时间内(至2-5秒)降低细菌负荷,使能够连续流操作。
[0076] 有两种主要类型的UHT系统:直接和间接系统。在直接系统中,通过蒸汽注射或蒸汽输注处理产品,而在间接系统中,使用平板热交换器、管状热交换器或刮面热交换器热处理产品。可在产品制备方法中的任一步骤或多个步骤中应用UHT系统的组合。
[0077] HTST处理如下定义(高温度/短时间):巴氏灭菌法设计达到5-log减少,杀死在奶中活的微生物数量的99.9999%。对于破坏几乎全部酵母、霉菌和常见的腐败细菌认为这是足够的,并且也保证常见病原性热抗性生物的足够的破坏。在HTST方法中加热奶至71.7℃(161°F)达15-20秒。
[0078] 巴氏瞬间灭菌法是易腐的饮料(像水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的热巴氏灭菌法的方法。它先于装入容器中完成,为的是杀死腐败微生物,以使得产品更安全以及延长它们的贮存期限。液体在71.5℃(160°F)到74℃(165°F)温度达约15到30秒处理的同时以受控制的连续流移动。
[0079] 为了本发明的目的,术语“短时间高温度处理”应包括例如高温度短时间(HTST)处理、UHT处理、和巴氏瞬间灭菌法。
[0080] 由于此类热处理提供了具有提高的抗炎谱的非复制型益生菌剂,本发明的组合物可用于炎性疾病的预防或治疗。
[0081] 不特别地限制能够通过本发明的组合物治疗或预防的炎性疾病。例如,它们可选自急性炎症例如脓毒病;灼伤;和慢性炎症,例如炎性肠病,例如,节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、隐窝炎(pouchitis);坏死性小肠结肠炎;皮肤炎症,例如UV或化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤;肠易激综合征;眼炎症;变态反应、哮喘;和它们的组合。
[0082] 如果使用长时程热处理使得益生微生物成为非复制型,可在约70-150℃温度范围内达约3分钟-2小时,优选地在80-140℃范围内从5分钟-40分钟实施此类热处理。
[0083] 尽管现有技术通常教导通过长时程热处理变成非复制型的细菌通常在它们益生特性上不如活细胞有效,本发明人能够展示出与它们的活对应物相比被热处理的益生菌剂在刺激免疫系统中是优越的。
[0084] 本发明也涉及包含益生微生物的组合物,所述微生物通过在至少约70℃达至少约3分钟的热处理成为非复制型。
[0085] 通过体外免疫谱分析确认非复制型益生菌剂的免疫加强作用。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子谱分析并且作为测试免疫调节化合物的标准模型在本领域中被广为接受(Schultz等人,2003,Journal of Dairy Research70,165-173;Taylor 等 人,2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235;
Kekkonen等人,2008,World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203)。
[0086] 若干作者/研究队伍已经使用了体外PBMC测定法例如根据益生菌剂的免疫谱,即它们的抗或促炎特征对它们分类(Kekkonen等人,2008,World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203)。例如,在结肠炎小鼠模型中已经显示出此测定法允许预测益生候选者的抗炎作用(Foligne,B.,等人,2007,World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外,在临床试验中此测定法被经常地用作读出(read-out)测定法并且显示了此测定法导致与临床结果一致的结果(Schultz等人,2003,Journal of Dairy Research
70,165-173;Taylor等人,2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。
[0087] 在过去的几十年中变态反应性疾病稳定地上升并且当前WHO认为它们是流行病。一般地,认为变态反应由免疫系统的Th1和Th2应答的不平衡造成,所述不平衡导致强烈偏向于Th2介质的生产。因此,通过恢复免疫系统的Th1分路和Th2分路之间的适当的平衡能够缓和、下调或预防变态反应。这暗示了减少Th2应答或至少瞬时增强Th1应答的必要性。后者将是免疫加强应答的特征,通常由例如较高水平的IFNγ、TNF-α和IL-12伴随。(Kekkonen等人,2008,World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203;Viljanen M.等人,2005,Allergy,60,494-500)。
[0088] 本发明的组合物因而允许其治疗或预防与受损的免疫防御相关的疾病。
[0089] 因此,不特别地限制能够通过本发明的组合物治疗或预防的与受损的免疫防御相关的疾病。
[0090] 例如,它们可选自感染,特别地为细菌的、病毒的、真菌的和/或寄生虫感染;吞噬细胞缺陷;低的到严重的免疫抑制水平例如由压力或免疫抑制药物、化学疗法或放射疗法诱导的那些免疫抑制水平;较少免疫活性的免疫系统的天然状态,例如新生儿的那些免疫系统;变态反应;以及其组合。
[0091] 本发明描述的组合物也允许其增强儿童对疫苗的应答,特别地为对口服疫苗的应答。
[0092] 任何量的非复制型微生物将会是有效力的。然而,普遍地优选,如果至少90%,优选地,至少95%,更优选地至少98%,最优选地至少99%,理想地至少99.9%,最理想地全部益生菌剂为非复制型。
[0093] 在本发明的一个实施方案中全部微生物为非复制型。
[0094] 因此,在本发明的组合物中至少90%,优选地,至少95%,更优选地至少98%,最优选地至少99%,理想地至少99.9%,最理想地全部益生菌剂可为非复制型。
[0095] 全部益生微生物可用于本发明的目的。
[0096] 例如,益 生微生物 可选自双 歧杆菌 属(bifidobacteria)、乳杆菌 属(lactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria),或其组合,例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酰乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。
[0097] 根据本发明组合物可包含例如选自长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌La1、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002(NCC 1825)、大肠埃希氏菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC
2287,或它们的组合的益生微生物。
[0098] 全部这些菌株在布达佩斯条约下保藏和/或是可商购的。
[0099] 在布达佩斯条约下保藏的菌株如下:
[0100] 长双歧杆菌NCC 3001: ATCC BAA-999
[0101] 长双歧杆菌NCC 2705: CNCM I-2618
[0102] 短双歧杆菌NCC 2950 CNCM I-3865
[0103] 乳双歧杆菌NCC 2818: CNCM I-3446
[0104] 类干酪乳杆菌NCC 2461: CNCM I-2116
[0105] 鼠李糖乳杆菌NCC 4007: CGMCC 1.3724
[0106] 嗜热链球菌NCC 2019: CNCM I-1422
[0107] 嗜热链球菌NCC 2059: CNCM I-4153
[0108] 乳酸乳球菌NCC 2287: CNCM I-4154
[0109] 干酪乳杆菌NCC 4006: CNCM I-1518
[0110] 干酪乳杆菌NCC 1825: ACA-DC 6002
[0111] 嗜酸乳杆菌NCC 3009: ATCC 700396
[0112] 保加利亚乳杆菌NCC 15: CNCM I-1198
[0113] 约汉逊氏乳杆菌La1 CNCM I-1225
[0114] 路氏乳杆菌DSM17983 DSM17983
[0115] 路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730
[0116] 大肠埃希氏菌Nissle 1917:DSM 6601
[0117] 本领域技术人员将理解他们能够自由地组合本发明此处描述的全部特征而不偏离本发明公开的范围。
[0118] 本发明另外的优势和特点从下述实施例和图中显而易见。
[0119] 图1A和B显示了受“短时间高温度”处理的益生菌剂的抗炎免疫谱的增强。
[0120] 图2显示了非抗炎益生菌株变为抗炎的,即非抗炎益生菌株在受“短时间高温度”处理后表现了显著的体外抗炎免疫谱。
[0121] 图3A和B显示了在可商购的产品中使用的益生菌株,在被“短时间高温度”处理之后所述益生菌株表现了增强的或新的体外抗炎免疫谱。
[0122] 图4A和B显示了乳品起子菌株(即Lc1起子菌株),在高温度热处理时所述起子菌株表现了增强的或新的体外抗炎免疫谱。
[0123] 图5显示了非抗炎益生菌株,在被HTST处理之后所述益生菌株表现了体外抗炎免疫谱。
[0124] 图6:用以它们活的和热处理(140℃达15秒)形式的益生和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析(IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、IL-10)。每一个点代表用NCC数字或名称标识的活的或热处理的一株菌株。
[0125] 图7显示了活的和热处理的(85℃,20分钟)菌株的IL-12p40/IL-10比率。总体地,在85℃达20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比率上升,与本发明的“短时间高温度”处理相反(图1、2、3、4、和5)。
[0126] 图8显示了来自用热处理的细菌刺激的人PBMCs的体外细胞因子分泌的增强。
[0127] 图9显示了在受盐水攻击的OVA致敏的小鼠中(阴性对照)、在受OVA攻击的OVA致敏的小鼠中(阳性对照)和在受OVA攻击以及用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA致敏的小鼠中观测到的腹泻强度百分数。以腹泻强度百分数展示结果(从4个独立实验中计算平均值±SEM),100%腹泻强度对应于在阳性对照(由变态反应原致敏和攻击)组中发展的症状。
[0128] 实施例1:
[0129] 方法学:
[0130] 细菌制备物
[0131] 通常认为活的益生菌制剂对宿主免疫系统递送的健康益处是菌株特异性的。已经显示了诱导高水平的IL-10和/或体外诱导低水平的促炎细胞因子(PBMC测定法)的益生菌剂是强烈的体内抗炎菌株(Foligné,B.等人,2007,World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0132] 使用若干益生菌株以研究热处理的益生菌剂的抗炎性质。这些菌株为长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002(NCC 1825)、和大肠埃希氏菌Nissle。也测试了包括商业用于生产NestléLc1发酵产物的一些菌株在内的若干起子培养物菌株:嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、保加利亚乳杆菌NCC 15和乳酸乳球菌NCC 2287。
[0133] 在对每一菌株优化的条件中在5-15L的生物反应器中培养细菌细胞。全部的典型细菌生长培养基为可用的。此类培养基为本领域技术人员所知。当调整pH至5.5时,连续地加入30%碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。当足够时,通过用CO2充气液面上空间维持厌氧的条件。在标准需氧条件下培养大肠埃希氏菌。
[0134] 通过离心(5000xg,4℃)收集细菌细胞并且重悬于足够体积的磷酸缓冲盐水9 10
(PBS)中以达到约10-10 cfu/ml的最终浓度。一部分制备物以15%甘油冷冻在-80℃。
通过以下方法热处理另一部分细胞:
[0135] -超高温度:140℃达15秒;通过间接蒸汽注射。
[0136] -高温度短时间(HTST):通过间接蒸汽注射74℃、90℃和120℃达15秒。
[0137] -在水浴中长时间低温度(85℃,20分钟)
[0138] 热处理后,在-80℃冻存样品直到使用。
[0139] 细菌制备物的体外免疫谱分析
[0140] 评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即从体外人血细胞诱导特定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在通过细胞密度梯度分离之后,收集并用Hank平衡盐溶液洗涤两次单核细胞。随后在用10%胎牛血清(Bioconcept,Paris,法国)、1%L-谷酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)和0.1%庆大霉素补充的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM,Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活6 5
的和热处理的细菌(等同于7x10cfu/孔)温育PBMC(7x10 个细胞/孔)达36小时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用,所述个体供体被分为两个分离的实验。在温育36小时之后,冷冻并在-20℃保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实施(即,在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。
[0141] 在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNFα、BD OptEIA人IFN-γ)确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-12p40、TNF-α和IL-10)的水平。IFN-γ、IL-12p40、和TNF-α是促炎细胞因子,而IL-10是强烈的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果,并且结果代表了两个单独实验,每一个所述单独实验用4个供体实施。对每一菌株计算IL-12p40/IL-10的比率作为体内抗炎作用的预测值(Foligné,B.,等人,2007,World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0142] 把对每一菌株通过ELISA(见上)确定的许多细胞因子数值(pg/ml)转移入BioNumerics v5.10软件(Applied Maths,Sint-Martens-Latem,比利时)。在此数据集上实施主成分分析(PCA,量度技术)。此分析包括从数值减去平均值和数值除以方差。
[0143] 结果
[0144] 通过超高温度(UHT)/高温度短时间(HTST)样处理生成的抗炎谱
[0145] 研究中的益生菌株受到一系列热处理(超高温度(UHT)、高温度短时间(HTST)和85℃达20分钟)并且把它们的免疫谱和活细胞的那些免疫谱体外作比较。当与人PBMC一起温育时(图1、2、3、4和5)活微生物(益生菌剂和/或乳品起子培养物)诱导了细胞因子产生的不同水平。这些微生物的热处理以温度依赖性的方式改变了由PBMC生产的细胞因子的水平。“短时间高温度”处理(120℃或140℃达15秒)生成了具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图1、2、3和4)。实际上,在维持或诱导额外的IL-10产生的同时(与活的对应物对比),UHT-样处理的菌株(140℃,15秒)诱导了更少的促炎细胞因子(TNF-α,IFN-γ,IL-12p40)。对于任何UHT-样处理的菌株获得的IL-12p40/IL-10比率与活细胞相比更低(图1、2、3和4)。对于由HTST-样处理,即受到120℃达15秒(图1、2、3和4)、或74℃和
90℃达15秒(图5)处理的细菌此现象也是有效的。热处理(UHT-样或HTST-样处理)在益生菌株体外免疫谱(图1、2、3和5)和乳品起子培养物上(图4)具有相似的效果。对用活的和热处理的(140℃,15秒)益生菌剂和乳品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析揭示了活的菌株全部沿X轴分散,表明菌株表现了非常不同的体外免疫谱,为促炎细胞因子的从低(左侧)到高(右侧)的诱导物。热处理的菌株聚集在图表左侧,显示了热处理菌株更少诱导促炎细胞因子(图6)。与之相反,在85℃达20分钟的热处理的细菌比活细胞诱导较多的促炎细胞因子和较少的IL-10,导致更高的IL-12p40/IL-10比率(图7)。
[0146] 由UHT-样和HTST-样处理增强或生成抗炎谱。
[0147] 无论它们各自初始的免疫谱(活细胞),UHT和HTST处理的菌株表现了抗炎谱。在“短时间高温度”处理以后,显示了已知为体内抗炎和体外表现抗炎谱的益生菌株(长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950,乳双歧杆菌NCC 2818)表现出增强的体外抗炎谱。如图1中所示,UHT-样处理的双歧杆菌属菌株的IL-12p40/IL-10比率比低于来自活的对应物的那些比率,因此显示了UHT-样处理的样品的提高的抗炎谱。更突出地,对于非抗炎活菌株也确认了由HUT-样和HTST-样处理生成抗炎谱。活鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC2461都表现了体外高IL-12p40/IL-10比率(图2和5)。显示了两个活菌株对小鼠中TNBS-诱导的结肠炎是非保护性的。在“短时间高温度”处理以后(UHT或HTST)由鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL-10比率剧烈下降,低至用双歧杆菌属菌株获得的水平。这些低IL-12p40/IL-10比率由于与没有变化(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或IL-10分泌的剧烈诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)相结合的低水平IL-12p40产生所致。
[0148] 因此:
[0149] -通过UHT-样和HTST-样热处理能够增强活微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC 2705、长双歧杆菌NCC 3001、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)。
[0150] -通过UHT-样和HTST-样热处理能够从非抗炎活微生物生成抗炎谱(例如鼠李糖乳杆菌NCC 4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起子嗜热链球菌NCC 2019)。
[0151] -对于从可商购的产品(图3A&B)(包括益生大肠埃希氏菌菌株)分离的菌株也显示了抗炎谱。
[0152] 对于全部测试的益生菌剂和乳品起子例如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属,UHT/HTST-样处理的影响是相似的。
[0153] 对若干乳杆菌、双歧杆菌和链球菌施用UHT/HTST-样处理表现了不同的体外免疫谱。在UHT/HTST-样处理以后全部的菌株诱导了比它们活的对应物较少的促炎细胞因子(图1、2、3、4、5和6),这展示了UHT/HTST-样处理在获得的非复制型细菌的免疫性质上的作用能够概括到全部益生菌剂,特别地到乳杆菌属和双歧杆菌属和特定的大肠埃希氏菌株以及到全部乳品起子培养物,特别地到链球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。
[0154] 实施例2:
[0155] 方法学:
[0156] 细菌制备物:
[0157] 使用5株益生菌株以研究非复制型益生菌剂的免疫加强性质:3株双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2株乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。
[0158] 在37℃达16-18小时无pH控制下分批发酵在MRS上生长细菌细胞。把细菌细胞离心下来(5,000xg,4℃)并在盐水中稀释以前重悬于磷酸缓冲盐水中,以达到约10E10cfu/ml的最终浓度。在水浴中在85℃达20分钟热处理长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007。在水浴中在90℃达30分钟热处理短双歧杆菌NCC2950。分装热处理的细菌悬液并冻存于-80℃直到使用。活细菌储存在-80℃15%PBS-甘油中直到使用。
[0159] 细菌制备物的体外免疫谱分析
[0160] 评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导人血细胞特定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在通过细胞密度梯度分离之后,收集并用Hank平衡盐溶液洗涤两次单核细胞。随后在用10%胎牛血清(Bioconcept,Paris,法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)和0.1%庆大霉素补充的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM,Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活6 5
的和热处理的细菌(等同于7x10cfu/孔)温育PBMC(7x10 个细胞/孔)达36小时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用,所述个体供体被分为两个分离的实验。在温育36小时之后,冷冻并在-20℃保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实施(即,在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。
[0161] 在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNFα、BD OptEIA人IFN-γ)确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-12p40、TNF-α和IL-10)的水平。IFN-γ、IL-12p40、TNF-α是促炎细胞因子,而IL-10是强烈的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果,并且结果代表了两个单独实验,每一个所述单独实验用4个供体实施。
[0162] 活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变态反应性腹泻中的体内作用[0163] 使用变态反应性腹泻的小鼠模型以测试短双歧杆菌NCC2950的Th1促进作用(Brandt E.B等人.JCI 2003;112(11):1666-1667)。在致敏(间隔14天;第0和第14天的卵清蛋白(OVA)和硫酸2次腹膜内注射)之后用OVA口服攻击雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)导致瞬时的临床症状(腹泻)和免疫参数的改变(总IgE、OVA特异性的IgE、小鼠肥大细胞蛋白质酶1即MMCP-1的血浆浓度)。通过管饲法在OVA致敏之前四天(第-3、-2、-1、0天和第11、12、13和14天)和在攻击时期期间(第23至399
天)施用活的或在90℃达30分钟热处理的短双歧杆菌NCC2950。使用约10 菌落形成单位(cfu)或等同的cfu/小鼠的日细菌剂量。
[0164] 结果
[0165] 在热处理以后‘促炎’细胞因子分泌的诱导
[0166] 体外评估热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PMBC)分泌细胞因子的能力。在相同的体外测定法中比较经热处理的细菌刺激PBMC与活细菌细胞诱导的基于4种细胞因子的免疫谱。
[0167] 铺平板并评估热处理的制备物无任何活细胞的计数。热处理的细菌制备物在铺平板后不产生菌落。
[0168] 当与人PMBC一起温育时活的益生菌剂诱导不同的和菌株依赖性水平的细胞因子产生(图8)。与它们的活的对应物相比,益生菌剂的热处理改变了PMBC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比它们的活的对应物诱导了更多的促炎细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-12p40)。相反,与活细胞对比,热处理的细菌诱导了相似或较低量的IL-10(图8)。这些数据显示了热处理的细菌比它们的活的对应物更能够刺激免疫系统且因此更能够加强弱化的免疫防御。换言之,体外数据说明了在热处理之后细菌菌株的增强的免疫加强效果。
[0169] 为了说明热处理的短双歧杆菌NCC2950在免疫系统上的增强的作用(与活细胞相比),在变态反应性腹泻的动物模型中测试活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950(菌株A)。
[0170] 与阳性对照组相比,在用热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后腹泻的强度显著地和持续地下降(41.1%±4.8)而在用活的短双歧杆菌NCC2950处理后腹泻的强度仅降低了20±28.3%。这些结果显示了热处理的短双歧杆菌NCC2950表现了比它的活的对应物增强的对变态反应性腹泻的保护作用(图9)
[0171] 因此,显示了在热处理以后益生菌剂增强免疫防御的能力被提高了。
[0172] 额外的实施例:
[0173] 可以制备以下成长乳组合物
[0174]>10个月
蛋白质(g/100kcal) 2.23
乳清/酪蛋白 50/50
CHO(g/100kcal) 13.0
乳糖(g/100kcal) 7.7
麦芽糖糊精(g/100kcal) 4.0
淀粉(g/100kcal) 1.0
蔗糖(g/100kcal)
脂肪(g/100kcal) 4.31
益生素(g/100kcal) -
能量Kcal/100ml 70
9
[0175] 成长乳组合物含有10cfu约汉逊氏乳杆菌La1/g干重
[0176]
[0177] 成长乳组合物含有109cfu热处理的(75℃,20分钟)长双歧杆菌NCC3001/g干重[0178]
[0179] 成长乳组合物含有109cfu热处理的UHT处理的约汉逊氏乳杆菌La1/g干重[0180] PCT 打印出来的(原为电子形式)
[0181] 此页不是国际申请的部分且并不算作国际申请的页
[0182]
[0183]
[0184] 打印出来的(原为电子形式)
[0185] 此页不是国际申请的部分且并不算作国际申请的页
[0186]
[0187] 打印出来的(原为电子形式)
[0188] 此页不是国际申请的部分且并不算作国际申请的页
[0189]
[0190] 打印出来的(原为电子形式)
[0191] 此页不是国际申请的部分且并不算作国际申请的页
[0192]
[0193] 仅用于接受机构
[0194]
[0195] 仅用于国际局
[0196]
QQ群二维码
意见反馈