公知长双歧杆菌属菌(Bifidobacterium longum)、双歧 杆菌(Bifidobacterium)属菌(以下称为“双歧杆菌”)是在人 肠道内形成的肠道菌群的优势菌种之一，已知双歧杆菌具有恢 复肠内细菌平衡的调整肠道作用、免疫增强作用、抗癌作用等。 因此，近年来随着消费者健康意识的提高，对双歧杆菌发酵乳 等包含存活的双歧杆菌的发酵乳食品的需求增加。
双歧杆菌在乳性培养基中的增殖性差。因此，为了在发酵 乳中含有一定量的例如1×107CFU/mL的双歧杆菌，通常添加各 种各样繁殖促进物质。但是，该繁殖促进物质通常价格比较高， 并且，风味可能会受损。另外，双歧杆菌难以在酸性条件下保 存、易死亡。因此，发酵乳制品等在流通过程中，其中存活的 双歧杆菌量急剧减少。
因此，通过改善双歧杆菌的繁殖性、保存生存性，不但可 制造出大量含有存活的双歧杆菌的发酵乳，而且期待即使在消 费者食用时，也与刚制造完时同样富含存活的双歧杆菌。
已公开了通过与双歧杆菌以外的乳酸菌混合发酵，不添加 该繁殖促进物质等也可改善双歧杆菌的繁殖性、保存生存性的 种种方法。关于改善发酵乳制造中的双歧杆菌繁殖性的方法， 例如(1)公开了酸奶及其制造方法，其特征在于，其含有乳酸 乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌 乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)以及双歧杆菌(例 如参照专利文献1。)。
此外，关于改善发酵乳中的双歧杆菌保存生存性的方法， 例如(2)公开了双歧杆菌发酵乳的制造方法，其特征在于，在 以乳为主成分的培养基中，混合培养短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)、以及不生成双乙酰和乙偶姻的乳酸 乳球菌乳酸亚种。(例如参照专利文献2。)

发明要解决的问题
可是，上述(1)的方法虽可促进双歧杆菌的繁殖、缩短发 酵时间，但在专利文献1中，关于双歧杆菌的保存生存性根本没 有记载。另一方面，上述(2)的方法通过使用由特定的双歧杆 菌和特定的乳酸菌组成的混合菌，虽可以看到促进增殖的效果 和改善生存性的效果，但对于短双歧杆菌以外的双歧杆菌、例 如在食品方面广泛应用的长双歧杆菌根本没有记载。
本发明的目的在于提供使用可改善双歧杆菌的繁殖性和保 存生存性的乳酸菌来生产发酵乳的方法以及通过该生产方法制 备的发酵乳。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果，对在 10％(W/W)复原脱脂乳培养基中发酵性优异的乳酸菌的菌株， 与长双歧杆菌混合培养进行发酵试验，发现具有如下性质的乳 酸菌，其性质为:促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，pH达到4.4～ 4.6时，长双歧杆菌的菌数在5×108CFU/g以上；提高长双歧杆菌 的保存生存性的性能，即，发酵结束后快速冷却并在10℃下保 持2周时，长双歧杆菌的存活率在30％以上，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供生产发酵乳的方法，其特征在于， 使用双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌和具有下述细菌学性质 的乳球菌(Lactococcus)属菌作为乳酸菌进行发酵。
(1)发酵性，即，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中、 在25-37℃的温度范围内培养16小时的情况下，使培养基凝 固；(2)促进长双歧杆菌繁殖的性能，即，在10％(W/W)复 原脱脂乳培养基中与长双歧杆菌混合培养的情况下，在pH达 到4.4-4.6时，长双歧杆菌的菌数达到5×108CFU/g以上，以 及(3)提高长双歧杆菌的保存生存性的性能，即，在10％(W/W) 复原脱脂乳培养基中与长双歧杆菌混合培养的情况下，在pH 达到4.4-4.6时快速冷却后在10℃下保持2周时，长双歧杆菌 的存活率达到30％以上。
另外，本发明提供发酵乳的生产方法，其中，上述乳球菌 属菌不具有同化木糖的能力，而且，不生成双乙酰和乙偶姻。
本发明还提供生产发酵乳的方法，其中，上述乳球菌属菌 是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。
本发明还提供了生产发酵乳的方法，其中，上述乳球菌属 菌的菌株是选自由乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852(FERM BP-10742)、乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857(FERM BP-10757)、 乳酸乳球菌乳酸亚种MCC859(FERM BP-10744)、乳酸乳球菌 乳酸亚种MCC865(FERM BP-10745)和乳酸乳球菌乳酸亚种 MCC866(FERM BP-10746)所组成的组中的一种以上。
本发明还提供生产发酵乳的方法，其中，上述双歧杆菌属 菌是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
本发明还提供生产发酵乳的方法，其中，上述长双歧杆菌 的菌株为长双歧杆菌FERM BP-7787。
本发明还提供生产发酵乳的方法，其特征在于，进一步使 用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)作为上述乳酸菌。
本发明还提供通过上述任何一种生产发酵乳的方法所制备 的发酵乳。
发明效果
根据本发明的发酵乳的生产方法，可高效制造目前没有的 大量含有双歧杆菌特别是长双歧杆菌的发酵乳。另外，本发明 的发酵乳，即使在流通过程中也可充分维持存活的双歧杆菌特 别是长双歧杆菌的含量，因此调整肠道效果更高，在健康维护 方面也有用。

本发明是生产发酵乳的方法，特征在于使用双歧杆菌与具 有上述(1)、(2)和(3)的特性的乳球菌属菌进行发酵。尤其 适合于使用长双歧杆菌发酵生产发酵乳。
本发明中所使用的长双歧杆菌为长双歧杆菌FERM BP-7787菌株，长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株等。长双 歧杆菌FERM BP-7787菌株由于在乳性培养基中的发酵性、流 通过程中的耐酸性以及耐胃酸性优异，所以是特别优选的。长 双歧杆菌FERM BP-7787菌株于2001年10月31日保藏于独立行 政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县 筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))。
本发明中使用的乳球菌属菌具有上述(1)、(2)和(3)的 特性。
(1)涉及发酵性。如果乳酸菌能够快速增殖并具有强的发 酵性，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中、在25-37℃的温 度范围内培养16小时时能够使培养基凝固，那么，在生产发酵 乳时，可以更加有效地改善双歧杆菌尤其是长双歧杆菌的繁殖 性等。这里的“使培养基凝固”是指，通过酸性发酵，培养基的 pH低于乳蛋白的等电点，从而乳蛋白凝集、培养基凝固。另外， “10％(W/W)复原脱脂乳培养基”可以通过以10质量％的浓度 将还原脱脂奶粉(例如，森永乳业公司生产)溶解在水中来制 备。
通常，适于乳球菌属菌的发酵温度范围是20-30℃，但本 发明中使用的乳球菌属菌在25-37℃的温度范围内具有强大的 发酵性。也就是说，本发明中使用的乳球菌属菌，是在适于双 歧杆菌、尤其长双歧杆菌的发酵温度范围(30-40℃)内具有 充分发酵性的细菌。
(2)涉及促进长双歧杆菌繁殖的性能。如果10％(W/W) 复原脱脂乳培养基等乳性培养基的pH接近4.6，通常，所含有的 酪蛋白等成分沉淀，培养基全部凝固，从而变得具有优异的味 道、口感和外观的产品。因此，在生产发酵乳制品的情况下， 通常，在pH达到4.6左右的时候，通过快速冷却等方式来停止发 酵。因此，在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中与长双歧杆菌 混合培养的情况下，如果乳酸菌所具有的繁殖促进性能使得在 pH达到4.4-4.6时，长双歧杆菌的菌数达到5×108CFU/g以上的 高浓度，那么在生产发酵乳时，该乳酸菌可以更有效地改善发 酵乳中的双歧杆菌、尤其长双歧杆菌的含量。
(3)涉及提高长双歧杆菌的保存生存性的性能。发酵乳制 品的保质期在10℃以下的保存条件下通常为2周左右。因此，在 10％(W/W)复原脱脂乳培养基中与长双歧杆菌混合培养的情 况下，在pH达到4.4-4.6时快速冷却后在10℃下保持2周，如果 乳酸菌具有使长双歧杆菌的存活率达到30％以上的提高保存生 存性的性能，那么能够生产即使在保质期结束时也含有充分量 的双歧杆菌、尤其长双歧杆菌的发酵乳。
本发明中所使用的乳球菌属菌例如可以通过以下方法来获 得。首先，从各种试样中分离出菌株，从中选择在10％(W/W) 复原脱脂乳培养基中具有优异发酵性的菌株，即，具有在10％ (W/W)复原脱脂乳培养基中、在25-37℃的温度范围内培养 16小时时，能够使培养基凝固的发酵性。然后，进行所选择的 菌株与长双歧杆菌的混合培养试验，选择具有上述(2)和(3) 所规定的促进双歧杆菌繁殖的性能和提高保存生存性的性能的 菌株。进一步优选的是:选择不具有木糖同化性和不产生双乙 酰和乙偶姻的菌株。
下文将更详细说明本发明。
1、菌株的获得
本发明人为了从自然界获得具有上述性质的菌株，将从日 本国内的自然界采集的样品用厌氧稀释液(1980年丛文公司发 行，光冈知足著“肠内菌的世界”，第322页，以下称为参考文 献1)稀释，涂布在Briggs肝肉汤(briggs liver broth)(参见 上述参考文献1，第319页)的平板上，在30℃下厌氧培养。 而且，在所得菌落中挑选显示了链球菌形态而且通过涂布标本 的显微镜观察为革兰氏阳性的菌株。将所挑选的菌株划线涂布 在BL琼脂培养平板上，用如上所述的方法反复厌氧培养，获 得纯分离菌株。使用下述方法即首先将这些菌株在10％(W/W) 复原脱脂乳培养基中进行发酵试验，获得20株具有上述(1) 中规定的发酵性的菌株。接着，与长双歧杆菌进行混合培养试 验，获得5株菌株，该5株菌株具有在pH达到4.4-4.6时， 能使长双歧杆菌菌数达到5×108CFU/g以上的促进繁殖的性能， 以及具有在pH达到4.4-4.6时快速冷却后在10℃下保持2周 的情况下，能够使长双歧杆菌的存活率达到30％以上的提高保 存生存性的性能。该5株菌株分别被命名为MCC852、MCC857、 MCC859、MCC865和MCC866。
2、细菌学性质
以下示出了上述5株菌株的细菌学性质。另外，用于测定 细菌学性质的试验大体上根据Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Peter H.A.Sneath编，第2卷，Williams and Wilkins Company，1986年)进行。
(I)细菌形态(在BL琼脂培养平板上、在30℃下厌氧培 养72小时之后通过光学显微镜观察)
大小:直径1～2微米
形状:链球菌
(II)革兰氏染色:阳性
(III)石蕊牛奶:凝固
(IV)芽孢形成:阴性
(V)由葡萄糖产气:无
(VI)运动性:无
(VII):过氧化氢酶活性:阴性
(VIII):精氨酸脱羧酶试验:阳性
(IX):由柠檬酸产气:阴性
(X):温度敏感性(60℃下30分钟和在65℃下30分钟): 在两种情况下均敏感
(XI):葡萄糖降解产物:L-乳酸
[表1]

上述细菌学性质(I)-(XI)是所有前述5株菌株共有的， 而且也是乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC 19435所共有的。 表1分别示出了繁殖温度(XII)、耐盐性(XIII)、耐pH性(XIV)、 耐亚甲基蓝性(XV)、由精氨酸产氨的能力(XVI)和糖发酵 性(XVII)。另外，使用光冈的糖发酵性用培养基(1974年， 光冈知足著“乳酸菌的细菌学”，临床检查18，第1163-1172页) 对28种糖测试糖发酵性。
从上述结果可以看出，上述5株菌株共同具有乳酸乳球菌乳 酸亚种菌种所具有的细菌学性质。也就是说，该5株菌株被确认 是乳酸乳球菌乳酸亚种菌种。另一方面，从上述(XII)-(XVII) 所示的细菌学性质可以得出，上述5株菌株，尤其，从没有同化 木糖的能力这一点来看，不同于乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株。
因此，申请人将上述5株菌株作为新型菌株保藏在独立行政 法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑 波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))。乳酸乳球 菌乳酸亚种MCC852菌株的保藏号是FERM BP-10742，乳酸乳 球菌乳酸亚种MCC857菌株的保藏号是FERM BP-10757，乳酸 乳球菌乳酸亚种MCC859菌株的保藏号是FERM BP-10744，乳 酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株的保藏号是FERM BP-10745， 乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株的保藏号是FERM BP-10746。乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、859、865和866于 2006年12月1日保藏，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857于2007年1 月10日保藏。
3、在10％(W/W)复原脱脂乳培养基中的发酵性试验
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在95℃下灭菌30分钟， 在该复原脱脂乳培养基中接种3％(V/V)的各菌株的发酵剂， 在25℃、30℃和37℃的每一种温度下培养16小时。将所得培 养液快速冷却，测定凝固状况、pH和所含的乳酸菌数量。乳酸 菌数量使用市售BCP加计数琼脂培养基(荣研机材公司制造) 平板来测定。测定的结果在表2中示出。
另外，使用专利文献2中记载的乳酸乳球菌乳酸亚种模式 菌株ATCC19435菌株作为对照菌株。
[表2]

在使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865和866 的每一株菌株，即本发明中所使用的乳球菌属菌的情况下，在 任何一种温度条件下，pH都降低到4.4-4.6，培养基凝固。另 外，所含有的乳酸菌数量也在1×109CFU/g左右，因此具有非常 好的增殖性、发酵性。
另一方面，在使用乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株 ATCC19435菌株的情况下，在任何一种温度条件下，pH都在 5.5以上，培养基未凝固。而且，与本发明的乳球菌属菌比较， 尤其在30℃以上，乳酸菌数量明显减少。
4、与长双歧杆菌的混合培养试验
(1)与长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的混合培养试验
使用乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC19435作为对照 菌株。
首先，按照后面记载的实施例1中所述的方法，分别制备 乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865和866这5株 菌株每一菌株的培养物以及长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的 培养物。
另外，将1000mL的含有0.2％(W/W)酵母提取物(Difco 公司生产)的10％(W/W)复原脱脂乳培养基，在90℃下灭菌 30分钟，接种30ml的乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC 19435菌株的培养物，在30℃下培养16小时，从而制备乳酸乳 球菌乳酸亚种模式菌株ATCC 19435菌株的培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌10分钟， 在该复原脱脂乳培养基上接种1％(V/V)的如以上所述制备的 每一乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的培养物和1％(V/V)的长双歧 杆菌FERM BP-7787菌株的培养物，在37℃下培养16小时，得 到发酵乳。将该发酵乳快速冷却，测定pH和所含有的双歧杆菌 数。另外，在10℃下保存2周，测定保存之后1周和2周的双歧杆 菌数。双歧杆菌数通过TOS丙酸琼脂培养基(由 YAKULTPHARMACEUTICAL INDUSTRY CO.，LTD.药品工业 公司制备)平板进行测定。测定结果在表3中示出。
[表3]

分别采用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865和 866五株菌株的发酵乳，在发酵后pH大约为4.5，双歧杆菌数量 达到5×108CFU/g以上。另外，该发酵乳在10℃下保存2周时的 双歧杆菌存活率均为80％以上。
另一方面，使用乳酸乳球菌乳酸亚种模式菌株ATCC 19435 菌株的发酵乳，不能进行发酵，发酵后pH为5.0以上，不能进 行10℃下的保存试验。而且，发酵刚结束之后的双歧杆菌为大 约1×108CFU/g，与本发明的乳球菌属菌相比明显减少。
因此，可以看出，与其它公知的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株 相比，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865和866五 株菌株对长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的繁殖促进性能和提 高保存生存性的性能更优异。
另外，还可以看出，在将专利文献2中所述的不产生双乙 酰和乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种与长双歧杆菌混合培养的情 况与使用短双歧杆菌的情况不同，既不能得到如专利文献2中 所述的双歧杆菌的增殖促进效果，也不能得到生存性改善效果。
(2)与长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的混合培养试 验
使用长双歧杆菌FERM BP-7787菌株与长双歧杆菌模式菌 株ATCC15707菌株，检验本发明中所使用的乳球菌属菌对长双 歧杆菌的繁殖促进性能和提高保存期存活率的性能。
首先，按照后面记载的实施例1中所述的方法，制备乳酸 乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物以及长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物。
另外，按照后面记载的实施例2中所述的方法，制备嗜热 链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)的混合培养物。
另外，将含有0.2％(W/W)酵母提取物的11％(W/W)脱 脂乳培养基在90℃下灭菌30分钟，在该脱脂乳培养基中接种 10％(V/V)的长双歧杆菌模式菌株ATCC 15707菌株的发酵剂， 在37℃下培养至pH达到4.6，从而制备长双歧杆菌模式菌株 ATCC15707菌株的培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌10分钟。 在该复原脱脂乳培养基上接种1％(V/V)如以上所述制备的乳 酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物、1％(V/V)长双歧 杆菌FERM BP-7787菌株的培养物或者1％(V/V)长双歧杆菌 模式菌株ATCC15707菌株的培养物、以及0.01％(V/V)嗜热链 球菌和保加利亚乳杆菌的混合培养物，在37℃下培养至pH达到 4.6，得到发酵乳。将该发酵乳快速冷却，测定所含有的双歧杆 菌数。另外，在10℃下保存2周，测定保存之后1周和2周的双歧 杆菌数。
另一方面，作为对照，将10％(W/W)复原脱脂乳培养基 在90℃下灭菌10分钟。在该复原脱脂乳培养基上接种1.5％ (V/V)如上述那样调制的长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的 培养物或者1.5％(V/V)长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株 的培养物以及0.4％(V/V)嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混 合培养物，在37℃下培养至pH达到4.6，同样地测定所得发酵 乳的双歧杆菌数。结果在表4中示出。
[表4]

通过将长双歧杆菌FERM BP-7787与长双歧杆菌模式菌株 ATCC 1570两株菌株与乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株混合 培养，发酵乳中的双歧杆菌数显著增加。在10℃下保存2周后的 双歧杆菌存活率均为30％以上，其中长双歧杆菌FERM BP-7787菌株为71％，长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株为 31％。
相反，在不与乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株混合培养 的情况下，在10℃下保存2周后的双歧杆菌的存活率为:长双 歧杆菌FERM BP-7787菌株的存活率为20％，而长双歧杆菌模 式菌株ATCC15707菌株没有检出存活的双歧杆菌。
另外，分别使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、859、865 或866菌株代替乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株，获得了同 样的结果。
即，可以看出:乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、 865和866的每一株菌株，对于具有优异的保存生存性的长双歧 杆菌FERM BP-7787菌株以外的长双歧杆菌，也具有优异的繁 殖促进性能和提高保存生存性的性能。
5.与专利文献1中所记载的乳酸乳球菌乳酸亚种与乳酸乳 球菌乳脂亚种的混合物的对比试验
首先，按照上述4(2)中所述的方法，制备乳酸乳球菌乳 酸亚种MCC857菌株的培养物、长双歧杆菌模式菌株 ATCC15707菌株的培养物、以及嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌 的混合培养物。
将10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌10分钟， 在该复原脱脂乳培养基上接种1％(V/V)的如以上所述制备的 乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物、1％(V/V)的长 双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培养物以及0.01％(V/V) 的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合培养物，在37℃下培养 至pH达到4.6，得到发酵乳。将该发酵乳快速冷却，测定所含有 的双歧杆菌数。
另一方面，作为对照，将10％(W/W)复原脱脂乳培养基 在90℃下灭菌10分钟，在该复原脱脂乳培养基上接种1％(V/V) 的如上所述制备的长双歧杆菌模式菌株ATCC15707菌株的培 养物和2％(V/V)的由乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂 亚种组成的混合物“EZAL MA14”(Rhodia公司生产)，在38℃ 下培养至pH达到4.6，同样地测定所得发酵乳的双歧杆菌数。 另外，“EZAL MA14”对应于专利文献1中所述的混合物“EZAL MR014”(Rhodia公司生产)。
在使用乳酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的发酵乳中，双 歧杆菌数为5.5×108CFU/g。与之相反，把使用“EZAL MA14”的 发酵乳稀释106倍获得稀释溶液，从该稀释液中完全检测不到双 歧杆菌，因此表明该发酵乳中含有的双歧杆菌数为1×106CFU/g 以下。
换句话说，可以看出，在将专利文献1所述的乳酸乳球菌乳 酸亚种与乳酸乳球菌乳脂亚种和长双歧杆菌混合培养的情况 下，不能获得如专利文献1中所述那样的促进双歧杆菌繁殖和缩 短发酵时间的效果。
如上所述，乳酸乳球菌乳酸亚种MCC852、857、859、865 和866五株菌株，即本发明中使用的乳球菌属菌在适于双歧杆菌 的发酵温度范围内、在乳性培养基中表现了强的发酵性，另外， 在与长双歧杆菌混合培养的情况下，表现了优异的促进双歧杆 菌繁殖和保存生存性的效果。因此，可以看出它们具有公知的 乳球菌属菌所没有的性能。另外，本发明中所使用的乳球菌属 菌由于不产生双乙酰和乙偶姻，预期可以制备良好味道的发酵 物。
在本发明中，对用于双歧杆菌和乳球菌属菌的预培养的培 养基只要是通常使用的培养基就没有特定限制，但乳性培养基 是优选的。复原脱脂乳培养基由于处理简便是更优选的。该复 原脱脂乳培养基的浓度优选为3％(W/W)以上，尤其优选8％ (W/W)以上。另外，在预培养中使用的培养基中，可以添加 酵母提取物等繁殖促进物质和L-半胱氨酸等还原剂等。尤其， 由于双歧杆菌在乳性培养基中的增殖能力低，因此优选使用添 加了繁殖促进物质的培养基。例如，可以使用含有0.1-1％ (W/W)的酵母提取物的培养基。另外，预培养中使用的培养 基使用进行灭菌处理后的培养基。该灭菌处理可以根据常规方 法进行，例如，可以通过在80-122℃下加热处理5-40分钟， 优选在85-95℃下加热处理5-35分钟来进行。
在本发明中，采用双歧杆菌和乳球菌属菌的发酵中所使用 的发酵用基本培养基，只要是发酵乳制备中常用的培养基就没 有特定限制。发酵用基本培养基例如可以通过在牛乳、脱脂乳、 鲜奶、黄油、全脂奶粉、脱脂奶粉等中根据需要配合蔗糖等甜 味剂、果胶、水果、果汁、琼脂、明胶、油脂、香料、着色剂、 稳定剂、还原剂等，根据常规方法灭菌，均质化，冷却等来制 备。
对接种到发酵用基本培养基中的双歧杆菌与乳球菌属菌的 发酵剂的接种比例没有特定限制，优选为100:1～1:10，更优选 10:1～1:1。另外，对在发酵用基本培养基中的添加量也没有特 定限制，以发酵用基本培养基为基准计，双歧杆菌与乳球菌属 菌的总添加量优选是0.01～10(V/V)％，尤其优选0.1～5(V/V) ％。
本发明中所使用的乳酸菌中，只要是在不妨碍乳球菌属菌 对双歧杆菌的繁殖促进效果和提高保存生存性的效果的范围 内，还可以进一步含有双歧杆菌和乳球菌属菌以外的其它乳酸 菌。对所述其它乳酸菌没有特定限制，只要是在通常发酵乳制 备中使用的乳酸菌即可，但优选是嗜热链球菌和保加利亚乳杆 菌。对作为发酵剂接种到发酵用基本培养基中的双歧杆菌与乳 球菌属菌的总引入量与此外的乳酸菌的总引入量之间的接种比 例只要不干扰乳球菌属菌对双歧杆菌的效果就没有特定限制， 但优选是1000:1-10:1。
在本发明的发酵乳生产方法中，混合培养的温度优选为 30～40℃，尤其优选36～38℃。因为这是双歧杆菌与本发明中 使用的乳球菌属菌二者可以充分繁殖的温度范围。另外，培养 时间根据所要制备的发酵乳的种类来适当决定，培养时间优选 为5～18小时。
通过培养得到的发酵乳可以直接作为食品，也可以例如均 质化加工成液态。另外，例如还可以适宜添加果汁、水果等。 对填充到容器内的方法没有特定限制，可以使用常用的方法。
在下文中通过实施例来进一步详细说明本发明，但本发明 不受以下实施例的限制。
实施例1
将10％(W/W)复原脱脂奶粉(森永乳业公司生产)在水 中溶解由此得到1000mL的10％(W/W)复原脱脂乳培养基， 将其在90℃下灭菌30分钟，然后接种30mL的乳酸乳球菌乳 酸亚种MCC857菌株的种子培养物，在25℃下培养16小时。 另一方面，将1000mL含有0.2％(W/W)酵母提取物的11％ (W/W)脱脂乳培养基在90℃下灭菌30分钟，接种100mL长 双歧杆菌FERM BP-7787菌株的种子培养物，在37℃下培养6 小时。
除此之外，将通过将包括脱脂奶粉、全脂奶粉、果胶和蔗 糖的原料混合并溶解而获得的50L含有0.5％(W/W)乳脂肪、 8.0％(W/W)非脂乳固体组分、5.0％(W/W)蔗糖和0.2％(W/W) 果胶的基本培养基在90℃下灭菌10分钟，冷却到40℃。在该 灭菌过的基本培养基中，接种50mL如上所述进行预培养的乳 酸乳球菌乳酸亚种MCC857菌株的培养物和500mL长双歧杆菌 FERM BP-7787的培养物，在37℃下培养16小时，获得发酵 乳。立即将该发酵乳搅拌、冷却，将冷却的发酵乳在15MPa的 压力下均质化，随后填充到200mL容积的玻璃容器内，密封， 获得酸性乳饮料。所获得的酸性乳饮料具有0.68％的乳酸含量， 4.64的pH和75mPa.s的粘度，并且含有7.0×108CFU/g的双歧 杆菌。当将该酸性乳饮料在10℃下保存21天时，双歧杆菌数 为5.2×108CFU/g，存活率为74％。
实施例2
将1000mL的10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌 30分钟，然后接种30mL乳酸乳球菌乳酸亚种MCC866菌株的种 子培养物，随后在25℃下培养16小时。另一方面，将1000mL含 有0.2％(W/W)酵母提取物的11％(W/W)脱脂乳培养基在90℃ 下灭菌30分钟，接种100mL长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的种 子培养物，在37℃下培养6小时。另外，将1500mL的10％(W/W) 复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌30分钟，接种50mL的嗜热链球 菌(HAN SEN生产)和保加利亚乳杆菌(HANSEN生产)的混 合培养物，然后在37℃下培养5小时。
除此之外，将50L含有3.0％(W/W)乳脂肪和9.0％(W/W) 非脂乳固体组分的原料乳加热到70。℃，在15MPa的压力下均 质化，然后，在90℃下灭菌10分钟，冷却到40℃。在该灭过 菌的基本培养基中，接种500mL如上所述进行预培养的乳酸乳 球菌乳酸亚种MCC866菌株的培养物、500mL的长双歧杆菌 FERM BP-7787菌株的培养物以及5mL的嗜热链球菌和保加利 亚乳杆菌的混合培养物，填充到500mL容积的树脂容器内，密 封，在37℃下培养7小时，然后立即冷却。所获得的发酵乳具 有0.72％的乳酸含量，4.55的pH，并且含有5.8×108CFU/g的 双歧杆菌。当将该发酵乳在10℃下保存21天时，双歧杆菌数 为3.6×108CFU/g，存活率为62％。
实施例3
将1000mL的10％(W/W)复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌 30分钟，然后接种30mL的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株的 种子培养物，在25℃下培养16小时。另一方面，将1000mL含有 0.2％(W/W)酵母提取物的11％(W/W)脱脂乳培养基在90℃ 下灭菌30分钟，接种100mL长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的种 子培养物，在37℃下培养6小时。另外，将1500mL10％(W/W) 复原脱脂乳培养基在90℃下灭菌30分钟，接种50mL的嗜热链球 菌(HANSEN生产)和保加利亚乳杆菌(HANSEN生产)的混 合培养物，然后在42℃下培养5小时。
除此之外，将500L的含有3.4％(W/W)乳脂肪和12.2％ (W/W)非脂乳固体组分的原料乳加热到70℃，在15MPa的 压力下均质化，然后，在90℃下灭菌10分钟，随后冷却到40℃。 在该灭过菌过的基本培养基中，接种5L如上所述进行预培养 的乳酸乳球菌乳酸亚种MCC865菌株的培养物、5L的长双歧杆 菌FERM BP-7787菌株的培养物以及50mL的嗜热链球菌和保 加利亚乳杆菌的混合培养物，在37℃下培养7.5小时，然后立 即冷却。通过将所得发酵乳进一步搅拌，将凝乳粉碎，将粉碎 过的发酵乳与通过常规方法制备的蓝莓果浆按7:3的比例混 合，搅拌至均一后，填充到容积120mL的隔绝氧气性的纸制容 器内。这样获得的具有蓝莓果浆的发酵乳具有0.80％的乳酸含 量，4.55的pH和5.5×108CFU/g的双歧杆菌。这种含有蓝莓果 浆的发酵乳在10℃下保存21天时，双歧杆菌数为 3.9×108CFU/g，存活率为71％。
工业实用性
通过本发明的生产方法，能够制备即使到了消费者手中也 能含有以往所没有的大量存活的双歧杆菌的发酵乳，因此可以 在发酵乳等的生产领域中应用。
本申请要求2007年2月13日提交的日本特愿2007-032646号 的优先权，该申请的内容在本文引入供参考。
专利文献1:日本特许第3364491号公报
专利文献2:日本特许第3068484号公报