【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の分野
本発明は、食物材料の中又は薬剤の中において、種々の使用方法がある抗生物質を産生可能な、生体に有益な（probiotic）細菌株に関する。 より特異的には、本発明は、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）由来の生体に有益な（probiotic）菌株、及び当該菌株より得られ、バクテリオシン様の性質を有する、ペプチド抗菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
この１０年間において、ヒトの生体に有益な物質の分野において、多くの研究がなされてきた（Huis in't Veld et al.（1994）Tibtech 12,6-8の総説参照）。 この研究は、健康と福祉に対して公衆の関心が向けられた事により、推進されてきた。 多くの生体に有益な産物が、市場において現在入手可能であり、それらの生産物より得られる有効な効果のいくつかは、乳糖非耐性の緩和（Gilliland,SE（1990）FEMS Microbiol.Rev.87,175-188）から、下痢の防止（Marteau,P.et al.（1993）FEMS Microbiol.Rev.12,207-220）、また発癌の防止の可能性にまで及ぶ（Adachi,S.（1992）「健康と病気における乳酸菌」（Wood,Ed.）,233-262,E lsevier,Barking）。 標準的な方法がない為に、これらの有用な結果の多くには違いがあり、「生体に有益」な細菌を含む培養生産物の、有用であるかもしれない効果に関して、矛盾した結果が発表されている。
【０００３】
菌株の選択の幅があまりない事が、結果の不一致とバラツキに関与している因子の一つである、と言われており（Marteau,P.et al.（1993）pupra）（Kim,HS（1988）Cult.Dairy Prod.J.23,6-9）、またFuller,R.（Fuller,R.（1989）J.Appl.Bact.66,365-378）は、生体に有益な菌株の単離を成功させる事に関する基準の概略を述べた。 その菌株は、意図する宿主種が元来有している物でなければならず、また、（i）その宿主中において生存し、かつ生育し；（ii）標的部位において、有益な効果を示し；（iii）産物の製造及び貯蔵を通じて、担体の食物またはシステムの中に保存する事が可能である、という能力も有する必要がある。
【０００４】
生体に有益な物質を含む健康増進製品の市場は早急に拡大している。 その様な製品が数多く、現在入手可能である（Jong,SCand Birmingham,JJ,（1993）ATCC Quart.Newslett.13（1）,1-11）。 それらの製品のうち、最も重要な部分の一つは、微生物を用いたものである。 最も頻繁に用いられている種には、ビフィドバクテリウム種（Bifidobacterium sp.）、ラクトバシラス種（Lactobacillus sp.）及びプロピオニバクテリウム種（Propionibacterium sp.）が含まれる（O'Sullivan,MG,et al.（1992）Trends in Food Sci and Tech.3（12）309-314）。 その様な製品において現在用いられている生物は、消化管菌相に対して有益な効果を有する生物である、という事について、制御された試験による実質的な証拠が欠けている（Tannock,GW（1983）In Human Intestinal Microflora in Health and Disease 517-539 DJHentges（ed.）,New York,Academic Press）。 微生物の起源は、その微生物の生存において重要であり、それゆえにヒト消化管におけるその微生物の機能においても重要である。 Lee,YK及びSalminen,S.は（Lee,YK及びSalminen,S.（1995）Trends Food Sci.Technol.6,241-245）、一般的な要件として、生体に有益な菌株はヒト由来でなければならないと述べており、それは、いくつかの健康増進効果は種依存的である可能性があるからである。 常在微生物叢は、異種の侵入細菌の感染よりヒトを守る、主要な防御機構の一つであり（Tancrede,C.（1992）Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.11（11）,1012-1015）、免疫システムを支持している時にはヒトの最高の同盟者でもある事が、良く知られている。 異なったレベルの消化管における細菌の集団により、宿主の生理及び細菌間の相互作用に依存した、複雑な生態系が構成されている。
【０００５】
Brinkら（Brink et al.（1994）Journal of Applied Bacteriology 77 140-148）は、多数（〜１０００）のラクトバチラス菌株を単離して、抗微生物活性の作成についてスクリーニングした。 種々の発酵した食物及び飼料（ザワークラフト、チーズ、ソーセージ及びサイレージ）、ヒトの歯垢及び異なった実験動物（ラット、マウス、モルモット及びウズラ）及びヒトのボランティアより得た糞より、ラクトバチルスを単離した。 陽性菌株が８つだけ見つかり、その内２つ、即ちラクトバシラス・サリバリウスＭ７（Lactobacillus salivarius M7）及びラクトバシラス・アシドフィラスＭ４６（Lactobacjllus acidophilus M46）について研究した。 前者の菌株は、広いスペクトルのバクテリオシンであるサリバリシンＢ（salivaricin B）を産生し、サリバリシンＢはリステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、ブロコリックス・テルモスファクタ（Brochothrix thermosphacta）、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）および多くのラクトバシラスの生育を阻害する。 Ｌ． アシドフィラスＭ４６（L.acidophilus M46）は、バクテリオシンであるアシドシンＢ（acidocin B）を生成し、アシドシンＢは、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）の阻害と結びついているが、ラクトバシラス属における活性スペクトルは非常に狭い。 しかしながら、これらの菌株は、感染した宿主種が元来有しているものではなく、宿主が元来有している事は、ヒトに用いる生体に有益な菌株として成功するための基準の一つである。
【０００６】
Arihara,K.ら（Arihara,K.et al.（1996）Letters in Applied Microbiology 22,420-424）は、ラクトバシラス・サリバリウス亜種サリチニウスＴ１４０（Lactobacillus salivarius subsp.salicinius T140）由来のバクテリオシンである、サリバシン１４０（Salivacin 140）を単離した。 Ｔ１４０菌株は、動物の放牧場近くで生育した、日本の草原の牧草の葉の表面より単離され、そのため、その菌株は動物の糞に由来しているように思われる。
【０００７】
前述した基準に合う、生体に有益な菌株が必要とされている。 ラクトバシラスによるバクテリオシンの生産は、病原体およびヒトの腸管における他の望ましくない微生物の競合的な排除に重要な役割を果たしていると思われる。 バクテリオシンは、広範囲の微生物に対して殺菌効果を示す蛋白質様の化合物として、広く定義されている。
【０００８】
ラクトバシラスの種と棲息地は多様であるため、乳酸菌の中において、ラクトバシラスのバクテリオシン産生性は最も高い。 ラクトバシラスにより産生された、４０ものバクテリオシンが、現在単離されている（Klaenhammer,TR（1993）FEMS Microbiol.Rev.12,39-86）。
【０００９】
バクテリオシンは、ヒトの幼児の糞より単離されてきた。 しかしながら、バクテリオシンの宿主の範囲は狭く、他のラクトバシラス種に対してのみ活性を有している事が判った（Toba,T.et al.（1991）Lett.Appl.Microbiol.12,228-231）。
【００１０】
広いスペクトルの活性を有するバクテリオシンが求められている。
【００１１】
発明の開示
本発明は、切除され、洗浄されたヒトの消化管より単離された、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）の菌株を提供する。 当該菌株は、広範囲のグラム陽性及びグラム陰性の微生物を抑制し、また無細胞上清に抗菌活性を有する生成物を分泌し、前記活性は生育している細胞によってのみ産生され、またプロテイナーゼＫ及びプロナーゼＥにより破壊される。 前記菌株の阻害活性及びその分泌産物は、生理的濃度のヒト胆汁及び胃液の存在下で維持される。
【００１２】
好ましくは、本発明のラクトバシラス株は、リステリア、スタフィロコッカス及びバシラスを含む細菌に対して、広いスペクトルの活性を示すが、多くの密接に関連したラクトバシラスについては抑制しない。
【００１３】
二種の、特に好ましい菌株は、ラクトバシラス・サリバリウス株ＵＣＣ１（１９９６年１１月２７日にナショナルコレクション オブ インダストリアル アンド マリン バクテリア リミテッド（ＮＣＩＭＢ）に寄託され、アクセッションナンバーＮＣＩＭＢ４０８３０を与えられた）、及びラクトバシラス・サリバリウスＵＣＣ１１８株（１９９６年１１月２７日にＮＣＩＭＢに寄託され、アクセッションナンバーＮＣＩＭＢ４０８２９を与えられた）、及び同様の性質を有するそれらの突然変異体又は変異株である。
【００１４】
本発明のラクトバシラス・サリバリウス株より分泌される抗菌産物は、前記菌株と関連したプラスミド又は他の染色体外存在物の発現産物であるかもしれない。
【００１５】
本発明はまた、先に生体に有益な物であるとして規定した、ラクトバシラス・サリバリウス株を含む健康増進製品を提供する。
【００１６】
本発明のラクトバシラス・サリバリウス株は、ヒトの消化管（Ｇ．Ｉ．Ｔ）の虫垂及び大腸、小腸部位より、再生手術の間に単離したものである。
【００１７】
本発明の菌株を単離するのに好適な部位は、小腸である。 培養の維持が困難であることが判った細菌は、すべて廃棄した。 それらの細菌は、処理又は製造の条件下で働くのに適さないであろうと思われるからである。
【００１８】
このようにして、ラクトバシラス・サリバリウスの特定の菌株が同定され、その菌株は、現在使用されている生体に有益な菌株の多くと比較した場合、ヒトＧ． Ｉ． Ｔにおいて生存する可能性が高いであろうと思われる。
【００１９】
本発明の菌株は、接着アッセイを行った時に、Ｃａｃｏ−２及びＨＴ−２９細胞系の両者に対して高い接着性を有する事が見出された。
【００２０】
本発明のラクトバシラス菌株は、２．０という低いｐＨで生存する事が可能である。 生体に有益な菌株が消化管にコロニーを形成して生育する前に、胃の厳しい酸性条件の中を通過しなければならない。 胃を通過して腸に達する間に細菌が生存するかを決定するのに、４つの主要な因子があり、すなわち、胃液のｐＨ、食物の緩衝能、胃が空白になる速度、細菌それ自身の量および生理的な状態である。
【００２１】
胃酸は、宿主の重要な防御機構に関係しており、小腸上部において細菌の数を少なく保つ事に関与し、病原微生物による感染に対する抵抗性を助けている（殺菌活性）。 胃液において、細菌の生存に影響する鍵となる因子は、ｐＨである。
【００２２】
生体に有益な菌株が低いｐＨに耐性を有する機構は、胃を通過する間に生存する能力のために重要である。 低いｐＨ値で試す前に、本発明のラクトバシラス菌株の細胞を、緩衝培地中でインキュベーションする時間を延長すると、その菌株はｐＨ２．０で感受性を有する事が見られた。 この観察は、後に例示するように、耐性を獲得するために、これらの菌株は誘導可能な酸耐性機構を有している事を示している。
【００２３】
本発明のラクトバシラス菌株はまた、高い胆汁耐性を有する。 胆汁酸に対する耐性は、Ｇ． Ｉ． Ｔの厳しい環境中において生存するのに必要とされる、重要な生物学的菌株の特徴である、とみなされている。 ヒトの腸の中において、微生物が健康増進能を有するためには、それらの菌株は存在している胆汁酸の、潜在的な致死的効果に抵抗できなければならないだけでなく、デオキシコール酸（ＤＣＡ）及びリトコール酸（ＬＣＡ）のような毒性化合物を生産することにより宿主の健康を侵してはならない。 デオキシコール酸（ＤＣＡ）及びリトコール酸（ＬＣＡ）は、多くの細胞障害現象に関与している。
【００２４】
本発明はまた、本発明のラクトバシラス・サリバリウスの菌株より得られた抗菌因子を提供し、その物質は先にバクテリオシン様の性質を有すると規定した。
【００２５】
好ましくは、本発明の抗菌物質は、下記の性質：
（i）３０から１００ｋＤａの間の見かけの分子量；
（ii）熱安定性；
（iii）広い範囲のpHへの耐性；
（vi）界面活性剤処理に対する耐性；
（v）有機溶剤に対する耐性；
（vi）プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、トリプシン、α−キモトリプシン、フィチン及びパパインを含む蛋白分解酵素に対する感受性；及び（vii）リパーゼ、カタラーゼ、アルカリホスファターゼ、フォスフォリパーゼＣ及びリポプロテインリパーゼに対する耐性を有する。
【００２６】
本発明によるラクトバシラス・サリバリウスの菌株の２種類、すなわちＬ． サリバリウス株ＵＣＣ１、及びＬ． サリバリウスＵＣＣ１１８株につき、４種の指標となる菌株に対する生物活性をスクリーニングした。 それら指標となる菌株は、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonoas fluorescens）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバシラス・フェルメンタムＫＬＤ（Lactobacillus fermentum KLD）である。 これらの菌株を緩衝培地において試験すると、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）及びラクトバシラス・フェルメンタムＫＬＤ（Lactobacillus fermentum KLD）の指標菌株に対して阻害的である事が見出された。 阻害実験により、それら２種の菌株は、広範囲のグラム陽性及びグラム陰性微生物を阻害する事が示された。 両者の菌株は、無細胞上清中に抗菌活性を分泌し、この活性はプロテイナーゼＫ及びプロナーゼＥにより破壊された。 そこで、これらの化合物は、バクテリオシンであるとみなされた。
【００２７】
Ｌ． サリバリウス株ＵＣＣ１、及びＬ． サリバリウスＵＣＣ１１８株は、分泌性蛋白質様化合物を生産し、それらの物質は、それぞれＡＢＰ１及びＡＢＰ１１８という暗号名を与えられた。
【００２８】
ＡＢＰ１及びＡＢＰ１１８は、リステリア、スタフィロコッカス、及びバシラスを含む細菌に対して、非常に広範囲の活性を示すが、密接に関連したラクトバシラスは阻害しないが、Ｌ． フェルメンタムＫＬＤ（Lactobacillus fermentum KLD）、又はリュウーコノストック（Leuconostoc）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）のような他のＬＡＢは，その例外である。 これはバクテリオシンが普通に有する特徴ではなく（Klaenhammer,TR（1993）supra）、これらの菌株を生体に有益な物質として使用するにあたっての利点であるように思われる。 なぜなら、それらの菌株は望ましくない微生物と競合するであろうが、近接した菌株とは競合しないからである。 それらの菌株の他の珍しい特徴は、シュードモナス種に対するそれらの拮抗的活性である。 これは、グラム陽性細菌にとって、珍しい特徴である。
【００２９】
ＵＣＣ株１及び１１８は、それぞれの蛋白質様化合物である、ＡＢＰ１及びＡＢＰ１１８よりもずっと広い活性スペクトルを有している。 これは、生きている細胞が、ＡＢＰ１／ＡＢＰ１１８を増強するか又は相乗的に作用して、標的細胞を抑制する産物を生産している事を示しているのかもしれない。
【００３０】
ＡＢＰ１及びＡＢＰ１１８は、同一のバクテリオシンではないが（それらは異なった阻害スペクトルを有する）、非常に似ている。 なぜなら、それらは両者ともＬＡＢに対して活性を有さず、それぞれの生産者は、他者のバクテリオシンの活性に対して免疫となる。 交差免疫性は、これらのバクテリオシンが、同じ様に作用している事を示しているかもしれない。 ＡＢＰ１１８は、いくつかのメチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（S.aureus:MRSA）、ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）及びシードモナス・フルオレッセンス（P.fluorescens）菌株に対して活性である。 バクテリオシンによるＭＲＳＡの阻害の報告は、今日まで文献中に存在しない。
【００３１】
本発明は、抗菌物質の精製画分もまた提供する。 その抗菌物質は、先にＡＢＰ１１８であると同定されたものであり、下記の性質を有する：
（i）５．０−５．３ｋＤａの分子量であり、；
（ii）４５％以上の疎水性アミノ酸を含有し、１９−２１％のグリシン、１３−１４％のアラニン及び１１−１２％のロイシンを含有し、トリプトファン又はチロシンを含有せず、一つのメチオニン残基及び４つのプロリン残基を含有する、相対アミノ酸組成であり、；
（iii）アミノ末端、又はアミノ末端近傍における-Lys-Arg-Gly-Pro-Asn-C（配列番号１）のアミノ酸配列；及び（iv）アミノ酸配列Asn Met Lys Arg Gly Pro Asn Cys Val Gly Asn Phe Leu Gly Gly Leu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Pro Gln Gly Pro Cys（配列番号２）を含む。
【００３２】
抗菌物質ＡＢＰ１１８は、後に述べて例示する、非常に広いスペクトルの活性を有する。
【００３３】
本発明は、抗菌物質の精製画分もまた、提供し、その物質は先にＡＢＰ１と同定され、下記の性質を有する：
（i）５．３−６．１ｋＤａの分子量；及び（ii）２８−３０％以上の疎水性アミノ酸を含有し、１７％のグリシン及び１２−１３％のアラニンを含有し、トリプトファンは含有せず、２つのプロリン残基を含有する相対アミノ酸組成である。
【００３４】
上記に示した様に、ラクトバシラス・サリバリウス株ＵＣＣ１１８は、ヒト腸より単離され、抗菌蛋白質ＡＢＰ１１８を生産し、ＡＢＰ１１８はグラム陽性細菌及びいくつかのグラム陰性細菌に対して広範囲の阻害を示す。 ＡＢＰ１１８は熱安定性であり、広範囲のｐＨにおいて耐性であり、多くの界面活性剤及び有機溶剤処理に対して抵抗性である。 ＡＢＰ１１８は蛋白分解酵素に対して感受性であり、リパーゼ活性に対して感受性を有さない。 限外濾過により、ＡＢＰ１１８の粗抽出物について、見かけの分子量が３０−１００ｋＤａであると示唆される。 生育研究により、ＭＲＳ培養液ｐＨ５．５において、ＡＢＰ１１８は最大に生産される、と示される。 この培地よりツイーン８０（商品名）又はペプトンのいずれかを除去することにより、ＡＢＰ１１８の生産は５０％低下する。 Ｌ． サリバリウスＵＣＣ１１８は、生理的濃度（０．３％（ｖ／ｖ））のヒト胆汁が存在している牛乳基礎培地において、ＡＢＰ１１８を生産する。 共培養実験により、Ｌ． サリバリウスＵＣＣ１１８が、培養培地中でサルモネラの生育を阻害する能力を有する事が示される。 これは、ＡＢＰ１１８を含む抗菌化合物の生産による、と見られている。
【００３５】
バクテリオシンＡＢＰ１１８は、牛乳蛋白質の存在下において、活性かつ入手可能な形で検出される。 そこで、本発明に基づいて、バクテリオシン生産の為の扶養培地として、牛乳を使用する事が可能である。 更に、本発明のラクトバシラス・サリバリウスの菌株は、乳製品の発酵ために使用する事ができる。
【００３６】
上述したＡＢＰ１１８の性質、すなわちｐＨ、温度及び貯蔵安定性は、このバクテリオシンは食品産業及び薬品産業において価値がありそうだ、という事を示している。
【００３７】
そこで、本発明の抗菌物質は、食品材料として使用可能である。 それは、薬剤としてもまた使用可能である。
【００３８】
本発明の抗菌物質は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）に対して特に有効である。
【００３９】
後に実施例７及び８において示される様に、上記のアミノ酸配列（配列番号２）は部分ペプチドであり、そのアミノ酸配列はバクテリオシンの精製画分より決定された。 この部分ペプチドはプローブを設計するために用いられ、そのプローブにより内部遺伝子配列が同定され、そしてこの配列より８０塩基対の断片が単離され、配列が決定された。 このＤＮＡ配列は推定アミノ酸配列を与え、その推定アミノ酸配列は配列番号２の同一性を支持するものである。 そこで、本発明はバクテリオシンＡＢＰ１１８をコードするＤＮＡ配列を与え、即ち、その塩基配列は5'ATGAAACGCG GACCCAACTG TGTAGGTAAC TTCTTAGGTG GTCTATTTGC TGGAGCAGCT GCAGGTGTCC CCCAGGGCCC（配列番号６）である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明は、下記の実施例により、更に明らかにされるであろう。
発明を実施するための態様
実施例１
生体に有益な細菌の単離
虫垂及びヒトＧ． Ｉ． Ｔの大腸及び小腸部分を、再構成手術の間に採取し、表１に示す生体に有益な細菌株についてスクリーニングを行った。
【００４１】
【表１】
【００４２】
すべてのサンプルは、手術後すぐに、滅菌容器中に−８０℃で貯蔵した。
【００４３】
凍結組織を解凍し、秤量し、システインを加えた（０．０５％）１／４強度のリンゲル液中に置いた。 それぞれのサンプルを穏やかに震盪し、緩く付着している微小器官を除去した（洗浄'Ｗ'と名付ける）。 続いて２番目の量のリンゲル液に移し、そのサンプルを７分間ボルテックスして、強固に付着した細菌を除去した（サンプル'Ｓ'と名付ける）。 組織に入り込んだ細菌を単離する為に、サンプルＡ、Ｂ及びＣを、ブラウンブレンダー中でまたホモゲナイズした（ホモゲネート'Ｈ'と名付ける）。 その溶液を系列的に希釈し（洗浄したサンプル由来の１０
-1希釈物をＷ１とラベルし、１０ -2希釈物をＷ２とラベルし、同様のラベリングシステムを、'Ｓ'及び'Ｈ'サンプルに用いた）、下記の寒天培地に広げて平板培養した（１００μｌ）。 それらの培地は、ＲＣＭ（reinforced clostridial media：強化クロストリジアル培地）そしてＲＣＭは酢酸を用いてｐＨ５．５に調製した；ＴＲＹ（トリプティカーゼ、ペプトン及び酵母抽出物）（Chevalier,P,et al.（1990）J.Appl.Bacteirol 68,619-624）；ＭＲＳ（デマン、ロゴサ及びシャーペ（deMann,Rogosa and Sharpe））；ＲＯＧ（ロゴサ（Rogosa）の酢酸培地（ＳＬ））；ＬＬＡ（ラピエレ（Lapiere）の肝臓−乳糖寒天）；ＢＨＩ（脳心臓抽出寒天）；ＬＢＳ（ラクトバシラス選択的寒天）及びＴＳＡＹＥ（０．６％の酵母抽出物を添加した、トリプトンソーヤ寒天）である。 すべての寒天培地は、ＴＰＹ寒天を除き、オクソイド・ケミカルズより提供された。 プレートを、炭酸ガス発生キット（Anaerocult A,Mreck）を用いて、嫌気的な容器中（BBL,Oxford）で、37℃で２−５日間インキュベートした。
【００４４】
グラム陽性であり、カタラーゼ陰性の桿菌の形状又は二股／多型の細菌単離物を、純度検定のために、複合的で非選択的な培地（ＭＲＳ又はＴＲＹ）の上に、すじ状にのせた。 単離物をＭＨＳ又はＴＲＹ培地中で、さもなければ一定の培地中で、嫌気性条件下において３７℃で規定どうりに培養した。 ラクトバシラス種であろうと推定される物を、４０％グリセロール中でストックし、−２０℃及び−８０℃で貯蔵した。
【００４５】
発酵最終産物の解析
炭水化物であるグルコースの代謝、及び引き続いての有機酸最終産物を、ＬＫＢ Ｂｒｏｍｍａ、アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムを用いて試験した。 そのカラムを、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ（一定流圧）で６０℃に維持した。 使用したＨＰＬＣバッファーは、０．０１Ｎの硫酸であった。 解析に先立ち、１０ｍＭクエン酸、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭ乳酸及び１０ｍＭ酢酸を標準として、カラムを校正した。 培養液を、改変ＭＲＳ培地中で１−２日間、３７℃で嫌気的に増殖させた。 引き続いて１４０００ｇで１０分間遠心し、その上清をＨＰＬＣバッファーで１：５に希釈し、２００μｌをＨＰＬＣで解析した。 すべての上清を、２点（duplicate）で解析した。
【００４６】
生化学的及び生理学的特性解析
同定の助けとするために、細菌単離物の生化学的及び生理学的特徴を決定した。 硝酸還元能、インドール生成能及びβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。 １５℃及び４５℃の両者における生育、塩化ナトリウムの濃度を５．０％まで増加させた中での生育、ゼラチン上でのプロテアーゼ活性を決定した。 リトマスミルクの中における生育特性もまた、評価した。
【００４７】
種の同定
菌株の炭水化物発酵のプロファイルによりラクトバシラス種を同定するために、ＡＰＩ５０ＣＨＬ（バイオメリエウックスＳＡ、フランス）システムを用いた。 ＭＲＳを一晩培養したものを遠心分離で回収し、キットと共に供給された懸濁培地中に再懸濁した。 製造元の取り扱い説明書に従い、ＡＰＩストリップを植えつけて、解析した（２４又は４８時間後）。 ラクトバシラス種の同定は、全細胞蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析により確認した。
【００４８】
酵素活性のプロファイル
ラクトバシラス単離物により生産される構成的酵素の半定量測定に、ＡＰＩ ＺＹＭ（バイオメリエウックスＳＡ、フランス）システムを用いた。 対数増殖後期にある細菌細胞を、１４０００ｇで１０分間遠心分離して回収した。 沈殿した細胞を、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８で洗浄し、その中に再懸濁し、同じ光学強度とした。 ストリップを製造元の取り扱い説明書に従って植えつけて、３７℃で４時間インキュベートし、発色を記録した。
【００４９】
抗生物質感受性プロファイル
単離物の抗生物質感受性プロファイルは、「ディスク感受性」アッセイを用いて決定した。 培養液を、適切な培養培地中において生育させ、寒天培地上に広げて平板培養し（１００μｌ）、既知の濃度の抗生物質を含むディスクを寒天上に置いた。 嫌気的条件下において１−２日インキュベートした後、菌株の抗生物質感受性を試験した。 １ｍｍ又はそれ以上の阻害の範囲が見られたら、菌株が感受性であると見做した。
【００５０】
プラスミドプロファイル解析
１０種のラクトバシラス種のプラスミドプロファイルの解析を、以下の改変をした可溶化方法（Anderson,DLand McKay LL,（1983）Appl.Env.Microbiol.46.549-552）を用いて行った。 細菌細胞を、４ｍＭのＤＬ−スレオニンを添加した１００ｍｌのＭＲＳ培地中に稙え込んで（４％）、４−５時間インキュベートした（対数期中期）。 遠心により回収した細胞を、プラスミドＤＮＡの調製に、すぐに使用した。 可溶化段階の前に、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）及びムタノリシン（１０μｇ／ｍｌ）を細胞懸濁液中に添加し、３７℃で１時間、続いて４℃で３０分間インキュベートした。 ５Ｍの塩化ナトリウムを添加した後、ライゼートを氷上に３０分間置いた。 ＤＮＡを、０．７％の垂直アガロースゲル上、トリス酢酸緩衝液中で、１００Ｖで４−５時間電気泳動を行った。
【００５１】
ラクトバシラス種の単離
ヒトＧ． Ｉ． Ｔより採取した７つの組織部位につき、ラクトバシラス属に属する菌株が存在しているか、スクリーニングを行った。 下記のように、組織サンプルの間で、いくらかの差異があった。 サンプルＡ（回腸）及びＥ（虫垂）における数は最も少なく、１グラムの組織につきおよそ１０
2の細胞が単離された。 それと比較して、他のサンプルから、１ｇの組織より１０ 3 ｃｆｕ以上が回収された。 似た様な数の細菌が、'洗浄'及び'サンプル'段階の間に単離され、Ｆ（回腸）及びＧ（回腸−盲腸）の'サンプル'溶液において、やや高い数となった。 強固に接着した細菌（ホモゲナイズされた）をスクリーニングした中では、Ｃ（回腸−盲腸）のみが有意な数を与える組織部位であった。
【００５２】
いくつかの組織部位、例えばＣ及びＢ）のスクリーニングを行う間において、希釈系列の中で、得られた計測数の間に直接的な相関関係が存在しなかった。 これは、血液又は組織のいずれかに由来するいくつかの成長因子が、最初の懸濁液中の増殖が難しい細菌を生育させるために、与えられているであろう事を示しており、その懸濁液は続いて希釈される。
【００５３】
菌株の選択及び特性解析
異なったサンプルに由来する、およそ１５００のカタラーゼ陰性の細菌単離物を選択し、それらのグラム反応、細胞の大きさ及び形態、１５℃と４５℃における生育、及びグルコース由来の発酵最終産物の点につき、特性解析を行った。 試験した単離物の６０％以上はグラム陽性であり、発酵の性質が同一の球菌であり、その四連球菌、鎖、又は房のいずれかが改変されたものであった。 単離物の１８パーセントはグラム陰性桿菌及び発酵の性質が異なる球菌細菌であった。 残った単離物（２２パーセント）は、非常に発酵の性質が似ている球菌細菌であった。 ３８パーセントの菌株につき、より詳細に特性解析した。 １３の単離物はＧ由来であり、４つはＦ由来、８つはＤ由来、９つはＣ由来、３つはＢ由来、１つはＥ由来である。 ３８の単離物はすべて、硝酸還元能及びトリプトファンからのインドール生産能の両方につき陰性であった。
【００５４】
種の同定
ＡＰＩ ５０ＣＨＬにより、ラクトバシラス単離物の迅速な同定が可能であった。
【００５５】
７つの単離物は、その炭水化物発酵のプロファイルにつき、サリバリウス（salivarius）種の非常に典型的なものであった。 ７つすべてがフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース及びラフィノースを、効率的に発酵した。 どれもアミグダリンを発酵しなかった。 いくつかの差異はあった：４つの菌株はリボースを発酵し、２つはラクトースの利用につき陰性であり、３つの単離物はラムノースを部分的に発酵した。 それらは、しかしながら、サリバリウス種では一般的な特徴ではない（ベルゲイのマニュアル）。 ３つの単離物は、ラクトバシラス・カセイ亜種カセイ（Lactobacjllus casei subsp.casei）と類似した発酵プロファイルを有していた。 それらはリボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、アルブチン、セロビオース、ラクトース、サッカロース、タガロース及びグルコネートを発酵した。 しかしながら、どれもゲンチビオース又はツラノースを発酵せず、一つの菌株はソルビトール及びアミグダリン上での生育につき陰性であった。 ３つの単離物はグリセロールを発酵し、それはカセイ亜種カセイ菌株の２０パーセントに共通する特徴である。 ５つの単離物を、プランタラム（plantarum）／ペントサス（pentosus）グループに、仮に分類した。 それらはリボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルビトール、ラクトース、セリビオース及びエスキュリンの発酵について陽性であった。 全てではないが、２つはメレジトースを発酵し、４つはトレハロースにつき陽性であり、２つはタガロースにつき、１つはグルコネートにつき陽性であった。 全ての菌株はＬ−アラビノースを発酵したが、Ｄ−アラビノースを発酵したのは一つだけであった。
【００５６】
ラフィノース上で生育できるものは無かった。 ラクトバシラス種の全細胞蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、２つの主要な種であるサリバリウス（salivarius）及びパラカセイ（paracasei）である事が明らかとなった。
【００５７】
表２には、菌株同定の概略が含まれている。 表２の中、及び続きの表３−６、及びそれと関連した記述の中において、ラクトバシラス菌株について、接頭語であるＵＣＣは除いてある。
【００５８】
【表２】
【００５９】
酵素活性プロファイル
試験した１７のラクトバシラス種の酵素活性プロファイルを実行し、その結果は下記の様である。
【００６０】
どの菌株も、リパーゼ、トリプシン、α−キモトリプシン、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−フコシダーゼ活性を示さず、弱いβ−グルコシザーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミナーゼ活性が３つの菌株により観察された（４３３３２、４３３３８、４３３６４）。 試験したすべての菌株は、強い酸フォスファターゼ活性（平均５．０）を有し、フォスフォヒドロラーゼ及びアルカリフォスファターゼ活性はそれより弱く菌株により差異が大きい、という特徴を有していた。 顕著なβ−ガラクトシダーゼ活性が、１７の菌株のうち９つに発現したが、α−ガラクトシダーゼ活性が殆どない事は明らかであった。 中程度から高度のロイシン、バリン及びシスチンアリルアミダーゼ活性が観察された。
【００６１】
抗生物質感受性プロファイル
ヒトの臨床において重要な抗生物質を使用して、選択したラクトバシラスの感受性プロファイルを確認した。 試験したラクトバシラスは、アンピシリン（ampicillin）、アモキシシリン（amoxycillin）、セフタキシム（ceftaxime）、セフトリアキソン（ceftriaxone）、シプロフロキサチン（ciprofloxacin）、セフラジン（cephradine）、リファンピシン（rifampicin）及びクロラムフェニコール（chloramphenicol）に対して感受性であった。 それらはまた、ネチルミシン（netilmicin）、トリメトプリム（trimethoprim）、ナリディクス酸（nalidixic acid）、アミカシン（amikacin）、バンコマイシン（vancomycin）及びゲンタマイシン（gentamicin）に対して耐性であった。 ラクトバシラスは、テイコプラニン（teicoplanin）及びセフティゾキシム（ceftizoxime）に対する感受性に差がある事もまた、観察された。
【００６２】
実施例２
菌株の由来及び維持
使用したラクトバシラス菌株は、実施例１において述べた様に単離した。
【００６３】
ヒト胃液
ヒト胃液は、胃ゾンデチューブ（メルシー病院、コーク、アイルランド）を通じて吸引する事により、健康被験者より得た。 それをすぐに、１３０００ｇで３０分遠心し、すべての固体微粒子を除き、０．４５μｍ及び０．２μｍのフィルターを通じて滅菌し、４０ｍｌに等分して分割し、分割したものを４℃及び−２０℃で貯蔵した。
【００６４】
実験に用いる前に、サンプルのｐＨ及びペプシン活性を測定した。 ペプシン活性は、定量的ヘモグロビンアッセイ（Gautam,S.and de LaMotte,RS,（1989）「蛋白質分解酵素、実用的アプローチ」Proteolytic enzymes,a practical approach.Chapter 3.RJBeynon and JSBond（eds.）,IRL Press,Oxford University Press;（Dawson,RM（1969）「生化学的研究のためのデータ」In Data for Biochemical Research 138.RMDawson,DCElliot and KMJones（eds.）,Clarendon Press,Oxford）を用いて測定した。簡単には、等量の胃液（１ｍｌ）を５ｍｌの基質（０．７Ｍ尿素、０．４％（ｗ／ｖ）ウシヘモグセビン（シグマ ケミカルＣｏ．）、０．２５Ｍ ＫＣｌ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ２．０）に添加し、２５℃でインキュベートした。サンプルを０、２、４、６、８、１０、２０及び３０分の間隔で採取した。５％のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）を添加して反応を停止し、攪拌せずに３０分間置いた。アッセイ混合液をその後濾過し（ワットマン、Ｎｏ．１１３）、１４０００ｇで１５分間遠心し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。ペプシン酵素活性の１ユニットは、ｐＨ２．０で、１分間あたりＡ
280 ｎｍを、０．００１ユニット増加させるのに必要な酵素量として規定し、当該酵素活性はヘモグロビンを基質として用いて、ＴＣＡ可溶性生成物として測定した。
【００６５】
低いｐＨにおけるラクトバシラスの生育
ラクトバシラス菌株の生育が、胃で起こるのと同等の低いｐＨ値で起こるかどうか測定する為に、１Ｎ塩酸を用いて、ｐＨ４．０、３．０、２．０及び１．０に調整した新鮮なＭＲＳ培地中に、一晩培養した培養液を植えつけた。 一定の間隔で同量（１．５ｍｌ）を採取し、６００ｎｍにおける光学強度（ＯＤ
600 ）を測定し、プレート計測法を用いて計算した、ｍｌあたりのコロニー形成ユニット（ｃｆｕ／ｍｌ）を測定した。 生育を、２４−４８時間間隔で観察した。
【００６６】
低いｐＨ環境中における、菌株の生存
低いｐＨにおける菌株の生存を、インビトロにおいて、２つのアッセイを用いて検討した。
（ａ）細胞を、一晩培養したばかりの培養液より回収し、リン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で２回洗浄し、ＭＨＳ培地中に再懸濁し、ラクトバシラスの最終濃度をおよそ１０
8 ｃｆｕ／ｍｌとした。 ＭＲＳ培地は、ｐＨ３．５、３．０、２．５及び２．０に調整した（１Ｎ ＨＣｌにより）。 細胞を３７℃でインキュベートし、プレート計測法を用いて、５、３０、６０及び１２０分の間隔で、生存を測定した。
（ｂ）ラクトバシラス菌株を、緩衝したＭＲＳ培地中（ｐＨ６．０）で、毎日、５日間増殖した。 細胞を回収し、洗浄してｐＨを調整したＭＲＳ培地中に再懸濁し、プレート計測法を用いて、２時間以上の生存を測定した。
【００６７】
ヒト胃液中における、微生物の生存
ラクトバシラスが胃を通過する中で生存する能力を測定するために、ヒト胃液を用いて、イクス−ビボの研究を行った。 一晩培養したばかりの培養液から細胞を回収し、バッファー（ｐＨ６．５）中で２回洗浄し、ヒト胃液中に再懸濁し、菌株により、１０
6から１０ 8 ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度とした。 ３７℃で３０−６０分間以上インキュベーションして、生存を観察した。 その実験は、ｐＨ１．２以下（調整していない）及びｐＨ２．０及びｐＨ２．５（１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した）の胃液を用いて行った。
【００６８】
低ｐＨにおける、ラクトバシラス種の生育
ラクトバシラス菌株（ヒト由来）は、ｐＨ６．８とｐＨ４．５において正常に生育し、８時間後に静止期に達し、ダブリングタイムは８０−１００分であった。 ｐＨ３．５では、生育は制限され、ダブリングタイムは６−８時間に増加した。 ｐＨ２．５又はそれ以下では生育は観察されなかった。 そこで、低いｐＨにおける菌株の生存を試験した。
【００６９】
低いｐＨにおける、ラクトバシラス種の生存
塩酸−調整培地：ラクトバシラス菌株は、３．５、３．０及び２．５のｐＨ値に対して、通常は耐性である。 ｐＨ２．０において、菌株による差異が明らかとなった（図１参照）。 ヒト由来のラクトバシラス菌株は、１時間の間、ほとんど対数で減少せずに生存したが、しかしながら、ラクトバシラス１１８は、２時間インキュベートの後に、対数で２−４減少した（図２参照）。
【００７０】
ヒト胃液：
ラクトバシラス菌株が、ヒトの胃において遭遇する条件で生存する能力を測定するために、種々の菌株を、ｐＨ１．２及びｐＨ２．５のヒト胃液の中で試験した。 ｐＨ２．５に調整した胃液を用いて、胃液によるこれら菌株の抑制において、ｐＨ以外の因子が重要であるのか、測定した。 本発明の菌株を、ｐＨ１．２の胃液中で３０分間インキュベーションした後に回収したが、その程度は低下していた。 ｐＨ２．５の胃液中では、多くの場合において生存率はほとんど１００％であり、ｐＨが胃液の主たる抑制因子である事が示された。
【００７１】
ラクトバシラス種における、誘導可能な酸耐性
緩衝されたキャリア培地中において生育した後に、低いｐＨにおいて菌株が生存するか測定するために、その菌株をｐＨ７．０において１週間の間連続して生育し、そして１Ｎ塩酸を用いてｐＨ２．０−３．５に調整したＭＲＳ中において試してみた。 ラクトバシラス菌株は、３．５及び３．０の値のｐＨに対して、耐性であった。 より低いｐＨにおいて、明らかな細胞生存率の低下が観察された。
【００７２】
ｐＨ２．０において、急速な細胞数の低下が記録され、例えば１時間インキュベーションした後に、ラクトバシラス種１１８及び他の８つの菌株は回収されない、という結果となった（図３参照）。 更に１時間インキュベートを行った後、５つの菌株が回収され、その程度はおよそ１０
5 ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００７３】
本研究において、ラクトバシラス菌株を緩衝培地中で前もって生育させると、当該菌株はインビトロにおいて、低ｐＨに対して、ずっと感受性が増加する事が観察された。 ｐＨ２．０で３０から６０分間インキュベーションすると、生きた細胞は回収されなかった。 緩衝していない培地中で生育した細胞の生存と比較すると、これらの菌株をｐＨが４．０−４．５の環境中において、前もって生育させると、低いｐＨ環境に対して適応する能力を持っている事は明らかである。
【００７４】
実施例３
使用したラクトバシラス菌株は、実施例１において述べた様にして単離した。
【００７５】
ウシ及びブタ胆汁の存在下における、培養物の生育
新鮮な培養液を、ＭＲＳ／ＴＰＹ寒天プレート上に筋状にのせた。 ＭＨＳ／ＴＲＹ寒天プレートには、０．３、１．０、１．５、５．０及び７．５％（ｗ／ｖ）の濃度のウシ胆汁（Ｂ−８３８１、シグマケミカル社、ポーオレ）、及び０．３、０．５、１．０、１．５、５．０及び７．５％（ｗ／ｖ）の濃度のブタ胆汁（Ｂ−８６３１、シグマケミカル社、ポーオレ）を添加した。 プレートを、嫌気的条件下において３７℃でインキュベートし、２４−４８時間後の生育を記録した。
【００７６】
ヒト胆汁存在下における培養物の生育
いくつかのヒト胆嚢より単離した胆汁サンプルを、使用前に−８０℃で貯蔵した。 実験作業の前に、胆汁サンプルを解凍し、プールし、８０℃で１０分間滅菌した。 ヒト胆汁の胆汁酸組成を、パルス化した電流測定検出器を備えた逆相ＨＰＬＣを用いて、Dekker,RRらの方法（Dekker,RRet al.,（1991）Chromatographia 31（11/12）255-256）に従って測定した。 ヒト胆汁を、０．３％（ｖ／ｖ）の濃度で、ＭＲＳ／ＴＰＹ寒天培地に添加した。 新たに筋状にのせた培養液の、２４時間と４８時間後の生育を調べた。
【００７７】
個々の抱合型、及び脱抱合型胆汁酸の存在下における生育
ヒト胆嚢の胆汁は、５０−１００ｍＭの濃度の胆汁酸を有しており、小腸で希釈されてこの濃度は５−１０ｍＭに低下する（Hofmann,AF,et al.,（1983）J,Clin.Invest.71,1003-1022）。 更に、生理的状態においては、胆汁酸はナトリウム塩として見出される。 そこで、下記のそれぞれの胆汁酸のナトリウム塩を含む、ＭＲＳ／ＴＰＹ寒天プレート上における培養液の生育をスクリーニングした。 それらの胆汁酸（シグマケミカル社、ポーオレ）は：（ａ）抱合型：タウロコール酸（ＴＣＡ）；グリココール酸（ＧＣＡ）；タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）；グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）；タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びグリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）；（ｂ）脱抱合型：リトコール酸（ＬＣＡ）；ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）；デオキシコール酸（ＤＣＡ）及びコール酸（ＣＡ）である。 それぞれの胆汁酸につき、１、３及び５ｍＭの濃度を用いた。 ２４及び４８時間、嫌気的にインキュベーションをした後の、生育を記録した。
【００７８】
胆汁酸脱抱合活性の検出
定性的アッセイ（寒天プレート）、及び定量的アッセイ（ＨＰＬＣ）の両者を、脱抱合活性の測定に用いた。
プレートアッセイ：全ての培養液を、ＭＲＳ／ＴＰＹ寒天プレート上に、筋上にのせ、ＭＲＳ／ＴＰＹ寒天プレートに（ａ）０．３％（ｗ／ｖ）ブタ胆汁、（ｂ）３ｍＭ ＴＤＣＡ又は（ｃ）３ｍＭ ＧＤＣＡを添加した。 脱抱合は、コロニーを取り巻く、ぼんやりとした沈殿物として観察された（Dashkevicz,MP,et al.（1989））Appl.Env.Microbiol.55（1）,11−16）。
高速液体クロマトグラフィー：ヒト胆汁の脱抱合のインビトロの解析は、ＨＰＬＣを用いて行った（Dekker,RRet al.,（1991）supra）。 簡単には、一晩培養した培養液を、０．３％（ｖ／ｖ）ヒト胆汁を添加したＭＲＳ／ＴＰＹ培地中に植え込み（５％）、３７℃で嫌気的にインキュベートした。 ２４時間以上の種々の時間間隔で、サンプル（１ｍｌ）を採取し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 希釈しない無細胞上清（３０μｌ）を、その後ＨＰＬＣで解析した。
【００７９】
胆汁酸耐性が増加した、ラクトバシラス変異体の単離
ラクトバシラスのコロニーの一つを、０．３％ブタ胆汁を含むＭＲＳ培地中に植え込み、一晩インキュベートした。 培養液を１４０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、洗浄して４分の１強度のリンゲル液中に再懸濁した。 １００マイクロリットルの１０
-3希釈液を、０．３から０．５％のブタ胆汁濃度勾配から成る、ＭＲＳ寒天プレート上に広げてのせた。 それらのプレートを、３７℃で２日間インキュベートした。 単離したコロニーを、０．５％のブタ胆汁を含んでいる寒天の部位より取り出して、０．５％のブタ胆汁を添加したＭＲＳ上に、再び筋状にのせた。 多くのコロニーを、その後４分の１強度のリンゲル液中に再懸濁し、１０ -3に希釈し、ブタ胆汁の濃度を増加させた濃度勾配プレート上に置いた（０．５／１．０％、１．０／１．５％、１．５／２．０％、２．０／２．５％及び２．５／３．０％）。 耐性を高めたコロニーにつき、コロニーの形態、グラム染色、湿重量及びカタラーゼ試験を行った。
【００８０】
胆汁に対する耐性（ウシ、ブタ及びヒト）
試験した１７種のラクトバシラス菌株は全て、使用した３種に由来する胆汁酸の上で、生育する事が可能であった（胆汁酸耐性）。 ウシ胆汁に対する耐性は、ブタ胆汁に対する耐性より、ずっと高い事が観察された。 ラクトバシラス菌株は、ウシ胆汁濃度が５．０％に至るまで、及び５．０％の濃度のウシ胆汁に対して耐性であり、１７種の菌株の中で１４種は７．５％で生育した。
【００８１】
ブタ胆汁は、表３で見られる様に、全ての菌株に対して阻害性が強かった。
【００８２】
【表３】
【００８３】
０．５％及びそれ以上の濃度では、１７種のラクトバシラス菌株のうち、１０種は抑制されたが、一方、ラクトバシラス種４２３１９、４２３５４及び４２３６１は、７．５％でコンフルエントまで生育した。
【００８４】
ウシ胆汁及びブタ胆汁の両方が存在している時の、それらの胆汁耐性プロファイルに関わらず、ラクトバシラス菌株は、ヒト胆汁の生理的濃度である０．３％（ｖ／ｖ）において、コンフルエントになるまで生育した。
【００８５】
個々の抱合型、及び脱抱合型胆汁酸に対する耐性
ラクトバシラス菌株は、個々の胆汁酸に対する耐性を特異的に解析した時、タウリンと抱合した胆汁酸の存在下では良く生育したが、グリシン抱合した胆汁酸の存在下における生育には差異があった。 ラクトバシラス単離物は、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ及びＴＣＤＣＡのタウリン抱合体の濃度が５ｍＭに至るまで、及び５ｍＭの濃度のタウリン抱合体に対して耐性である。 試験したグリシン抱合体の中で、ＧＣＤＣＡは阻害性が最も強く、４つのラクトバシラス種のみが、３ｍＭ及び５ｍＭの濃度において生育可能であった。 表４に示す様に、３つのグリシン抱合体の中で、ＧＤＣＡの阻害性はより弱く、ＧＣＡの阻害性は最も弱かった。
【００８６】
【表４】
【００８７】
全菌株は、５ｍＭのＧＣＡを添加した寒天培地上で生育したが、ＧＤＣＡ上における生育には差異があった。
【００８８】
脱抱合した胆汁酸の存在下における生育もまた、試験した。 すべての菌株は５ｍＭの濃度のＬＣＡに対して耐性であった。 試験した１７種のラクトバシラス菌株中、１５種はＤＣＡの濃度が５ｍＭに至るまで、及び５ｍＭの濃度のＤＣＡにおいて生育した。 ２つの菌株である、ラクトバシラス種１及び４３３４８は、低濃度のＤＣＡ（１ｍＭ）に対して感受性であった。 ＣＡの存在下における生育には、表５で見られる様に、差異があった。
【００８９】
【表５】
【００９０】
８種のラクトバシラス菌株のみが、３ｍＭのＣＡの存在下で生育可能であった。 １ｍＭのＣＤＣＡの存在下において、１７種の菌株の生育は見られなかった。
【００９１】
ラクトバシラス種の脱抱合活性
生育研究より、いくつかの菌株は胆汁塩の脱抱合活性を有している事が観察され、更なる検討により、１７種の内３種のラクトバシラス菌株（４３３６１、４２３１９及び４２３６１）が同定され、それらは胆汁酸を脱抱合する事が可能であった。 これは、０．３％のブタ胆汁、ＴＤＣＡ（３ｍＭ）及びＧＤＣＡ（３ｍＭ）を添加した寒天培地上で示された。 すべての場合において、脱抱合は、活性コロニーを取り巻いている、沈殿した脱抱合した胆汁それ自身のぼんやりとした領域として、検出された（Dashkevics,MPand Feighner,SD,（1989）Appl.Env Microbiol.55（1）,ll-16）。
【００９２】
寒天プレート上で観察される、胆汁酸脱抱合活性は、ヒト胆汁及び分解産物のＨＰＬＣ解析を用いて確認された。 胆汁サンプル中に、抱合した胆汁酸のみが検出された。
【００９３】
胆汁酸耐性の誘導
胆汁酸耐性が増加したラクトバシラス菌株を単離する方法を、考え出した。 ２種のラクトバシラス菌株（４３３３及び４３３１０）を選択し、それらは最初は０．５％のブタ胆汁の存在下で生育する事ができなかったが、０．３％の濃度では生育する事ができた（表３の上参照）。 ブタ胆汁の濃度を増加させた（０．３から３．０％）中で、引き続いて連続的に継代培養すると、４３３３及び４３３１０菌株の耐性は増加した。 ＭＲＳ寒天上で規則的に継代培養した菌株の、誘導された胆汁耐性は、３．０％のブタ胆汁を含むＭＲＳ寒天上に再び筋上にのせた時に維持された。 更に、胆汁耐性が誘導された菌株は、その後ブタ胆汁を脱抱合する事が可能であった。
【００９４】
試験した両菌株で、ブタ胆汁の濃度増加と共に、コロニー形態の変化が観察された。 胆汁の存在下で、コロニーは変則的であり、平坦部分も突起部分もあり、灰色の、ぼんやりとしたプラークとして見えた。 しかしながら、ＭＲＳ寒天上に再び筋上にのせた時には、そのコロニーは、元来の、平滑で、クリーム色で、凸上の、輝く外観を取り戻した（顕微鏡下で観察したところ、両者のコロニー変異体は、単一又は一組となっている、短い桿菌として見えた）。 胆汁の非存在下で、延長して継代培養をした後には、両者の菌株はまだ脱接合しており、高レベルのブタ胆汁に対して耐性を維持した。
【００９５】
実施例４
培養液の生育及び維持
抗菌物質生成のスクリーニングをした微生物は、表３に挙げた１７種の菌株であり、それらは実施例１の中で述べられた様に、ヒト腸管より単離された。 全ての菌株は、ＵＣＣ培養コレクションに属していた。
【００９６】
培養液は、適切な生育培地及び４０％のグリセロールの中で、−２０℃で凍結ストックとして保存した。 ラクトバシラスは、デマン・ロゴサ・シャーペ（deMann Rogosa Sharpe:MRS）培地中で、厳密な嫌気性条件下において、３７℃で日常的に培養した（メルク アナエロカルトＡガスパックシステムを用いたＢＢＬガスジャー）。
【００９７】
本実施例の中で用いた指標微生物は、その多くはメルシー病院（コーク、アイルランド）において単離された野生型菌株であり、下記の培地中で、下記の生育条件下で培養した。 ：スタフィロコッカス（３７℃、好気的）、バシラス（３７℃、好気的）、シュードモナス（３０℃、好気的）、大腸菌（３７℃、嫌気的）、サルモネラ（３７℃、嫌気的）及びリステリア（３０℃、好気的）は０．６％酵母抽出物（ＴＳＡＹＥ、オキソイド）を添加したトリプトン・ソーヤ培地／寒天中で、バクテロイド（３７℃、嫌気的）、ヘリコバクター（３７℃、嫌気的）、プロテウス（３７℃、嫌気的）、ヘモフィルス（３７℃、嫌気的）及び肺炎連鎖球菌（３７℃、嫌気的）は血液寒天倍上で、カンジダ（３７℃、好気的）はＹＰＤ培地（酵母（１％）、ペプトン（２％）及びデキストロース（２％））中で、クロストリジウムは強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ、オキソイド）中で、ラクトコッカス（３０℃、好気的）はＭ１７培地中（オキソイド）で、ストレプトコッカス（３７℃、嫌気的）はトッド・ヒューイット培地（オキソイド）中で、そしてエンテロコッカス種（３７℃、嫌気的）はブルインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）で培養した。 全ての菌株を、新鮮な生育培地中に植え込んで、実験に用いる前に一晩生育させた。 寒天スロッピー（重層物）及びプレートは、それぞれ０．７％（ｗ／ｖ）及び１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を、培養培地中に添加する事により調整した。
【００９８】
抗菌活性の検出
上記菌株の抗菌活性は、次に述べる方法を用いて検出した（Tagg JR,et al（1976）Bactriol.Rev 40,722-756）。 最初のスクリーニングで用いた指標は、Ｌ． イノキュア（L.innocua）、Ｌ． フェルメンタムＫＬＤ（L.fermentum KLD）、Ｐ． フルオレッセンス（P.flourescens）及び大腸菌Ｖ５１７である。 簡単には、ラクトバシラス（ＭＲＳ）を１２−１６時間インキュベートした。 １０倍系列希釈液を、ＭＲＳ寒天培地上に広げて平板培養した（１００μｌ）。 一晩インキュベートした後、明確なコロニーを有するプレートの上に、指標細菌を加えた重層物をのせた。 指標ローンは、溶かした重層物に、２％（ｖ／ｖ）の指標細菌を一晩培養した培養液を植え込む事により調製し、指標ローンを植えつけたＭＲＳプレートの表面に注いだ。 そのプレートを、指標細菌の生育に適した条件下で、一晩再インキュベートした。 半径で１ｍｍ以上の阻害領域を有する指標培養液は、試験細菌に対して感受性であるとみなした。
【００９９】
全ての寒天培地に、２％のβ−グリセロフォスフェイトバッファー及びカタラーゼ（１００ユニット／ｍｌ；シグマケミカル、ポーオレ）を添加して、本方法を繰り返した。 β−グリセロフォスフェイトバッファー及びカタラーゼは、それぞれ、酸及び過酸化水素の生成による拮抗的活性を除外するために添加した。 バクテリオファージ活性による阻害は、植え込んだＭＲＳ寒天プレートの上下をひっくり返して、指標細菌を重層する事により除外した。 バクテリオファージは、寒天を通じて拡散する事はできない。
【０１００】
無細胞系上清中の抗菌活性の検出
抗菌活性は自然に分泌されているのか測定するために、ラクトバシラス（ＭＲＳ）を、培地中で１２−１６時間生育し、同量の培養液（５００μｌ）を濾過滅菌し（０．４５μｍ）、無細胞上清の、４種の同じ指標菌株に対する抗菌活性をアッセイした。 無細胞上清の活性は、バクテリオシンのアッセイに通常用いられている限界希釈法を改変して測定した（Mayr-Harting,A.,et al.,（1972）Methods in Microbiology Vol.7A,315-422）。 ２倍希釈系列を、新たに植菌した、Ｌ． イノキュア（L.innocua）及びＬ． フェルメンタムＫＬＤ（L.fermentum KLD）のローン上にスポットし（５μｌ）、プレートを適切にインキュベートした。 タイターは、指標ローンを完全に阻害する阻害剤の、最高希釈の逆数として規定され、タイターはミリリットル（ｍｌ）あたりの活性ユニット（ＡＵ）として表現した。
【０１０１】
抗菌活性の硫酸アンモニウム沈殿
抗菌物質を生成する菌株、Ｌ． サリバリウス１及び１１８を、ＭＲＳ培地中（８００ｍｌ）で、嫌気的な条件下３７℃でインキュベートし、抗菌活性が最高となる時に細胞を回収した（３％の植菌で通常６−８時間）。 上清を、４℃で１時間、常に攪拌しながら、４０％硫酸アンモニウムで処理し、４℃で一晩で置き、その後１３０００ｇで３０分間遠心分離した。 ペレット及び薄膜（上清の最上層）を混合して、２０ｍｌのリン酸バッファー、ｐＨ６．５に溶解した。 その溶液を５Ｌのリン酸バッファー、ｐＨ６．５に対して、４℃で２４時間、バッファーを２−３回交換しながら透析した。 溶液をその後濾過滅菌し、微菌活性についてアッセイし、４℃で貯蔵した。 比活性を増加させるために、７０％及び１００％における無細胞系上清の硫酸アンモニウム沈殿もまた、実施した。
【０１０２】
抑制的宿主のスペクトル
ラクトバシラスの抑制スペクトルを、Tagg,JRらの方法（1976）を用いて、上述した方法で測定した。 無細胞上清（ＣＳＦ）及び硫酸アンモニウムで沈殿した溶液（ＡＰＳ）の、広範囲のグラム陽性及びグラム陰性微生物に対する阻害活性もまた、アッセイした。 それぞれの指標菌の重層物を、寒天プレート上に調製し、乾燥した。 ＣＳＦ及びＡＰＳのスポット（５μｌ）を、稙菌したプレート上に置き、乾燥させて、一晩インキュベートした。 ヘリコバクター（Helicobacter）、プロテウス（Proteus）、バクテロイド（Bacteroid）及びキャンピロバクター（Campylobacter）種の阻害について、寒天ウェル拡散法もまた用いた。 寒天プレートに、指標生物を重層するか、又は塗りつけるかして、乾燥した。 寒天プレート内にウェル（４ｍｍ）を作成し、ＣＳＦ（３０−４０μｌ）をウェル中に置き、２４−４８時間インキュベートする前に、室温で２０−４０分間寒天中を拡散し、インキュベートした後に阻害区域を測定した。
【０１０３】
蛋白質分解酵素に対する、抗菌物質の感受性
個々の産生菌株に由来する、抗菌活性を有する一定量のＣＳＦにつき、蛋白質分解酵素に対する感受性をアッセイした。 プロティナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ ＫＨ
2 ＰＯ 4 、ｐＨ７．５）及びプロナーゼＥ（５０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ ＫＨ 2 ＰＯ 4 、ｐＨ７．５）を、３７℃で１時間、３：１の比で個別にＣＳＰとインキュベートした。 酵素処理した、及び酵素処理していないＣＳＦの両者を、新たに植菌した指標重層寒天上にスポットし（５μｌ）、適切なインキュベーションを行った。
【０１０４】
ヒト胆汁中における抗菌活性の生成
１及び１１８の培養液を、０．３％のヒト胆汁を含有する、緩衝ＭＲＳ寒天プレート上にスポットし、３７℃で一晩嫌気的にインキュベートした。 それらの上に指標菌株を重層し、更に１２−１８時間インキュベートした。 １ｍｍ以上の範囲の阻害は、陽性であるとみなした。
【０１０５】
抗菌活性の検出
１７種のラクトバシラス菌株の阻害活性を、Ｌ． イノキュア（L.innocua）、Ｌ． フェルメンタムＫＬＤ（L.fermentum KLD）、Ｐ． フルオレッセンス（P.fluorescens）及び大腸菌を指標微生物として用いて、スクリーニングした。 試験菌株を非緩衝ＭＨＳ上に植え込んだ時、４つの指標菌株の抑制が見られた。 大きさの範囲が１ｍｍから５ｍｍの領域が、測定された。 ラクトバシラスにより、Ｌ． イノキュアの最大の阻害範囲が作成された。
【０１０６】
抑制は、過酸化水素によるものではない。 なぜならば、スクリーニング中にＭＲＳプレートへカタラーゼを混入しても、抗菌活性には影響しなかった。 同じく、バクテリオファージ活性も、上述した様に排除された。 ラクトバシラスを緩衝したＭＲＳに植え込んだところ、指標菌株に対する阻害は殆ど観察されなかった。 ２つの例外があり、それらはＬ． サリバリウス１及び１１８であり、非緩衝ＭＲＳ中において指標菌株に対して作成する阻害領域と比べて、それらの菌株が作成する抑制領域は、わずかに小さいのみであった。
【０１０７】
抗菌活性の特性解析
ラクトバシラス種１及び１１８の抗菌活性は、ＭＲＳ培地中で８時間生育した後に、無細胞系上清中に分泌され、それは、Ｌ． イノキュア（L.innocua）及びＢ． コアギャランス１７６１（B.coagulans 1761）に対してアッセイした時に示された。 １１８のＣＳＦは、Ｐ． フルオレッセンス（P.fluorescens）に対する阻害もまた示したが、この指標の感度は、前者の２つより劣っている。 ＡＢＰＩ又はＡＢＰ１１８のいずれによっても大腸菌の抑制は、観察されなかった。 ２０００ＡＵ／ｍｌ及び１０００ＡＵ／ｍｌ（それぞれ、Ｌ．イノキュア及びＬ．フェルメンタムＫＬＤを使用した）までのタイターについて、測定した。 Ｌ． サリバリウス１及び１１８、ＡＢＰ１及びＡＢＰ１１８はそれぞれ、蛋白質様物質である事が見出された。 なぜなら、蛋白質分解酵素で処理したＣＳＦについて、高感度の指標の抑制が見られなかったからである。 これは、両菌株がバクテリオシンを生成する事を示している。
【０１０８】
抑制的宿主のスペクトル
ラクトバシラスが、緩衝及び非緩衝培地の両者の中において、広範囲のグラム陽性及びグラム陰性の指標微生物の両方を阻害する事が、見られた。 ストレプトコッカス（Streptococcus）及び他のラクトバシラスの様な乳酸菌に対しては、阻害活性はほとんど観察されなかった。 Ｌ． サリバリウス１及び１１８の阻害スペクトルは、非常に広範囲であった。 乳酸菌の阻害はほとんど観察されなかったが、しかしながら、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、バシラス（Bacillus）、サルモネラ（Salmonella）、大腸菌、シュードモナス（Pseudomonas）及びリステリア（Literia）種の阻害は、はっきりと目に見えるものであった。 この阻害は、生理的濃度のヒト胆汁の存在下においても作成された。 ＣＳＦとＡＰＳの１と１１８、ＡＢＰ１とＡＢＰ１１８のそれぞれについて、広範囲の微生物の阻害活性を試験し、それらの多くはグラム陽性細菌に対して活性が非常に強く、ＡＢＰ１１８はグラム陰性微生物シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）に対してもまた、活性であった。 ＣＳＦは、他の関連した乳酸菌に対してもまた、非常に高い阻害活性を示した。 それらの菌株にはラクトバシラス又はリューコノストック（Leuconostoc）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）又はペディココッカス（Pedicococcus）種の様なものがある。 エンテロコッカス種に対しても、活性が見られた。 最も顕著な事は、ＡＢＰ１１８及びＡＢＰ１による、表６に示される、ヘリコバクターピロリ及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の菌株に対する抑制である。
【０１０９】
【表６−１】
【表６−２】
【表６−３】
【０１１０】
実施例５
培養の生育と保存管理
実施例１に述べたように人の腸内部位からラクトバシラス・サリバリウス118を単離し、同定し、培養した。
【０１１１】
この実施例で使用した標識微生物は、次の生育条件下で、0.6％イーストエキス（TSAYE、Oxoid）を補ったTryptone Soya肉汁中で増殖させた。 バチルス（37℃、好気性）、大腸菌（37℃、嫌気性）、サルモネラ（37℃、嫌気性）及びリステリア（30℃、好気性）。 実験に使用する前に、全菌株を新鮮な生育培地に接種し、一晩中生育した。 肉汁培地へそれぞれ0.7％（ｗ／ｖ）及び1.5％（w/v）寒天を加えることにより寒天スロッピー（オーバレイ）及びプレートを調製した。
【０１１２】
抗菌薬活性の検出
ラクトバシラス・サリバリウス118をMRS肉汁中で12〜16時間の間生育し、培養液を10分間14000ｇで遠心分離した。 リステリア・イノキュア及びバシラス・コアギュランス1761を接種した新鮮な培地上に無細胞系の上清液（CFS）を点着した（5-10μl）。 抑制領域を測定した。
【０１１３】
バクテリオシンの測定に一般的に使用する臨界的な希釈方法（Mayr-Harting等（1972）に変更を加えてCFSの活性を測定した。新たなリステリア・イノキュア及びバチルスコアグラン1761を接種した培地中に連続的な希釈液を点着し（５μl）、プレートを適切にインキュベーションした。タイターは、これは、抑制剤の最も高い希釈度の逆数として定義し、指示薬培地の完全な抑制を立証するものであり、かつ、ミリリッター当たりの活性単位として表現した。
【０１１４】
ABP １１８を含む無細胞系の上清液の硫酸アンモニウム沈殿物
37℃嫌気性条件下でラクトバシラス・サリバリウス１１８を肉汁中（800ml）で生育し、６〜８時間インキュベーション後に細胞を収集した。 上清液を一定攪拌下1時間4℃で40％硫酸アンモニウムを用いて濃縮し、4℃で一晩中放置し、その後30分間、13000ｇで遠心分離した。 ペレットと菌膜（上清液の最上面）を収集し、pH6.5の少量のリン酸緩衝液で溶解した。 溶液を緩衝液を2-3取り換えて4℃で24時間、pH6.5リン酸緩衝液の5リットルで透析した。 その後、溶液をろ過殺菌し、抗菌薬活性を測定し、4℃で貯蔵した。 他に述べなければ、この方法を以下の実験にも使用した。
【０１１５】
ラクトバシラス・サリバリウス118の生育及びABP118の生産に影響する因子 pH：
ラクトバシラス・サリバリウス118を37℃でMRS肉汁（50ml）の中に一晩中生育し、それから、37℃で、穏やかにかき混ぜ（200ppm）自動pH制御装置に連結した発酵容器（Model502D；LHFermentation,Stoke Poges,Bucks.）においてMRS肉汁（1.5リットル）の中へ接種（２％）した。 容器には、５％CO2を連続的に流した。 次のpH条件を4つの異なる実験に設定した。 すなわち、（1）pH5.5；（2）pH5.0；（3）pH4.5及び（4）pH4.0で、実験中に８％水酸化アンモニウム水溶液を用いてpHを維持した。 規則的な間隔で、pH、OD600、細菌数（cfu/ml）及び抗菌薬活性（AU/ml）を24時間に渡って記録した。
【０１１６】
生育培地
様々な実験培地についてラクトバシラス・サリバリウス118の生育及びABP118の生産の両方を支援するそれらの能力に対して試験した。 これらは、MRS、ブルインハートインフュージョン（BHI）、GM17及び0.6％イーストエキス（TSBYE）で補ったトリプトンソーヤ肉汁を含んでいた。 生育及び抗微生物生産の際にMRS肉汁からの培地成分を除去した場合の効果も評価した。 除去した成分には、a）Tween 80、b）ペプトン、c）イーストエキスd）ビーフエキスe）Tween 80及びビーフエキス及びf）Tween 80、ビーフエキス及びペプトンが含まれていた。
【０１１７】
生育と抗微生物生産は、13.5％脱脂乳、0.6％イーストエキスで補った13.5％脱脂乳、２％グルコースで補った13.5％脱脂乳及び２％グルコース及び0.6％イーストエキスで補った脱脂乳及び、0.3％ヒト胆汁を補ったMRS肉汁（ヒト胆のうから抽出し、10分間80℃で殺菌した）においてモニターした。 一定の間隔で、pH、OD600、細菌数及び抗微生物活性を記録した。 すべての生育曲線を嫌気性条件下で、37℃で行った。
【０１１８】
ABP118のpH及び温度安定性
ABP118についてアルカリ性及び酸性条件下の両方でその安定性を試験した。 活性CFSのpHを、1NNaOH及びHClを用いて1〜10に調整した。 溶液をろ過、殺菌し、室温で1時間インキュベーションした後、指示薬としてリステリア・イノキュアを用いて調整する前と後とで活性を計算した。 それからpHを調整した溶液を1NNaOH及びHClを用いてpH7に再調整し、再び室温で1時間インキュベーションし、AU/mlを測定した。 使用したコントロールは同じpH値に調整したMRS肉汁であった。
【０１１９】
ABP118の温度安定性を決定するために、複数の分画（10ml）を様々な温度で異なった時間インキュベーションし、指示薬リステリア・イノキュアを使用してインキュベーションの前後で活性を計算した。
【０１２０】
酵素、洗浄剤及び有機溶媒の作用に対するABP118の感受性
抗菌活性の性質と安定性を決定するために、ABP118を次の酵素を用いて30〜60分間インキュベーションし、抗菌活性を測定した。 プロテイナーゼK（50mg/ml、50mM KH2PO4、pH7.5）；プロナーゼE（50mg/ml、50mM KH2PO4、pH7.5）；トリプシン（50mg/ml、67mM Na2PO4、pH7.6）；α-キモトリプシン（50mg/ml、80mMトリス、pH7.8）；α-アミラーゼ（50mg/ml、20mM Na2PO4、pH6.9）；無プロテアーゼリパーゼ（50mg/ml）；フィチン（10mM KH2PO4、pH7.0）；カタラーゼ（50,000U/ml dH2O）；リゾチーム（10mg/ml、25mMトリスHCl、pH8.0）；アルカリ性フォスファターゼ（80mMトリス-HCl、pH8.0）；ペプシン（10mM HCl）；フォスフォリパーゼC（10mM KH2PO4、pH7.0）及びパパイン（10mM KH2PO4、pH7.0）。 これら溶液の各部分標本（５μl）をリステリア・イノキュラ及びバシラス・コアギュランス1761で予め接種したプレート上に滴らした。 コントロールは、緩衝液と酵素、及びABP118を含んでいた。
【０１２１】
ABP118も37℃で1-2時間多数の溶媒と洗浄剤で処理した。 使用した溶媒は、５％β−メルカプトエタノール；10％クロロホルム；10％アセトン；10％イソプロパノール；25％エタノール；50％アセトニトリル；10％ブタノール及び50％ジクロロメタンであった。 使用した洗浄剤は、Tween 80（1％）、Tween 20（1％）、トリトンX-100（1％）、N-ラウリルサルコシン（1％）及びSDS（0.1％及び1％）とした。 インキュベーション後、溶液を透析し、真空乾燥あるいは凍結乾燥を行い、活性を測定した。
【０１２２】
ABP118の酵素活性
ABP118を構造的な酵素活性を測定するために使用されるZYMキット（BioMerieux、France）へ適用した（上述の実施例１を参照）。 溶血活性及びタンパク質分解活性を測定するために、ABP118を血液寒天上及び脱脂乳寒天プレート上にそれぞれ点着（10μl）した。 37℃で24時間及び48時間インキュベーションした後、反応を記録した。
【０１２３】
限外濾過によるABP118の分子の大きさの決定
ABP118の大きさをラクトバシラス・サリバリウス118培養物の硫酸アンモニウム沈殿溶液（APS；上述の実施例４参照）と無細胞系の上清液（CFS）から評価した。 複数の分画を100-、30-、10-及び3kDa分子排除サイズを含む様々な膜（アミコンInc.、MA.、USA）を通じて限外濾過した。 バクテリオシン活性を保持された分画及び通流した分画中て決定した。
【０１２４】
ABP118生産物における変種の不完全物の単離
ラクトバシラス・サリバリウス118を接種（2％）したMRS肉汁（100ml）を最適生育を可能とする温度より高い温度（40℃、42℃及び45℃）でインキュベーションした。 36〜48時間生育後、肉汁を連続的に希釈し、MRS寒天上に広げて被覆した（100μl）。 それから、コロニーをMRS寒天及び２％β-グリセロリン酸緩衝液を補ったMRS寒天上でレプリカ法に従い移した。 感受性標識（B.coagulans1761）で被覆物を覆い、非抑制コロニーを純度を保持するためすじをつけ、−20℃で４０％グリセロール中に貯蔵する。 菌株の生育速度及び炭水化物発酵プロフィール（API 50CHL）を記録し、野生型ラクトバシラス・サリバリウス118のそれと比較した。
【０１２５】
共培養研究
ラクトバシラス・サリバリウス118及びサルモネラ（S・トリフィムリウム及びS・エンテリジチス）の共同生育を（酢酸ナトリウムなしに）変更MRS培地において研究した。 指示薬及び生産菌は、１：１の割合で接種した。 コントロールとして、同じ培地において菌株を単独で生育した。 接種した培地を、37℃で嫌気的にインキュベーションした。 サンプルを規則的間隔で採取し、細胞生育（cfu/ml）を決定した。 サルモネラ-シゲラ（Oxoid）及びMRS（Oxoid）培地をサルモネラ及びラクトバシルスをそれぞれ選別するために使用した。 0.6％イーストエキス（TSAYE）で補ったトリプトンソーヤ寒天を使用し、全プレート数値を得た。 サルモネラも野生型ラクトバシラス・サリバリウス118の非ABP118生産変種を用いて１：１で共同培養した。
【０１２６】
抗微生物化合物ABP118の性質
例えば、表７及び８に示されるように、ABP118は、抑制剤、プロナーゼＥ、トリプシン及びペプシン等のタンパク質分解酵素によって失活されるので、性質上タンパク質であり、また、上清液において活発に分泌される。
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
プロテアーゼは、抗微生物活性を消滅させ、該活性は、プロテアーゼの不活性化後にも、回復できなかった。 ABP118は、リパーゼが活性において影響を与えない（表７参照）という事実に基づき脂質の成分を有していないように考えられる。 この化合物は、pH範囲1〜10において活性があり、（リステリア・イノキュアに対する）活性の減少は、観察されなかった。 同化合物は、100℃で少なくとも1時間は100％の活性を維持する熱安定性タンパク質であり、表９に示したようにオートクレーブによって過酷な熱処理の後、50％だけ活性が消失した。
【０１３０】
【表９】
【０１３１】
抑制剤ABP118は、4℃で4か月貯蔵したとき、活性の消失がなく非常に安定であった。 多数の有機溶媒及び洗浄剤を用いて化合物を処理したが、表10に示すように活性の減少はなかった。
【０１３２】
【表１０】
【０１３３】
ABP118を脱脂乳寒天上に点着させた時、37℃又は室温で24時間に渡ってインキュベーションしたがタンパク質の分解は観察されなかった。 血液寒天（ウサギ及び馬）上での反応は、決定的なものではなかった。 小さい領域の溶解が記録されたけれども、濃縮したMRS肉汁を血液寒天プレート上に点着したとき、小さい領域での溶解も観察された。 エステラーゼ及びリパーゼ活性を含む広い範囲の酵素活性を測定するZYMキットは、ABP118に対する明白な酵素活性を示さなかった。
【０１３４】
培養上清液と一部精製したABP118を限外濾過した場合、大部分の活性が、100kDaカットオフ膜の保持液中に存在し、また、すべての活性が30kDaカットオフ膜において保持されることが示された。
【０１３５】
ABP118生産の反応速度論
ABP118の生産は、生育の時期に依存していた。 ラクトバシラス・サリバリウス118による生育と抗微生物生産の反応速度論を図４に示した。 ABP118の生産は、静止期にABP118濃度の減少を伴って対数増殖期で最大であった。 pHをpH5.5に制御したとき、ABP118活性が最大濃度を見出され、バイオマスがかなり高い場合３、４時間後に4000AU/mlまで生産された。 。 pH4で培養の生育が減少し、ABP118は、検出されなかった。 これら研究は、ABP118が生育細胞によってのみ生産され、非生育細胞によっては生産されないことを示した。
【０１３６】
試験した4つの研究培地のうち、MRS及びBHIは、高濃度のABP118の生産を支援するために最も適切な2つの培地であった。 複雑さの少ない培地でもABP118の生産を支援するかどうかを決定するために、Tween 80、イーストエキス及びペプトン源の影響を測定した。 結果は、これらのうちのいずれか一つが欠けている場合、ABP118の濃度が、MRS肉汁において生産された濃度の50％だけにしかならないことを示した。 しかしながら、試験したどんな他の培地よりもイーストエキスを欠く培地においてABP118活性は、さらに安定性を維持した。
【０１３７】
ラクトバシラス・サリバリウス118の生育及びABP118の生産を支援するために適当なキャリアーとして作用する脱脂乳ベースの培地の能力を調査した。 脱脂乳、脱脂乳＋イーストエキス及び脱脂乳＋グルコースにおける生育は、非常に悪かった。 12時間インキュベーション後に、pHが5.7より低くなく、ABP118活性が検出されたにしてもごくわずかであった。 しかしながら、ラクトバシラス・サリバリウス118を脱脂乳＋イーストエキス＋グルコースにおいて生育したとき、12時間及び24時間インキュベーション後のpHはそれぞれ、4.4、及び3.87の値に達した。 ABP118活性が2時間後低レベルで検出され、ABP118の大部分（バチルスコアグラン1761に対して10,000AU/ml）は生育の静止期初期に対数増殖期後から生産した。 10時間インキュベーション後に乳液が固まり始めるのも観察された。
【０１３８】
0.3％ヒト胆汁におけるラクトバシラス・サリバリウス118の生育速度はMRS肉汁における生育速度に相当した。 しかしながら、ABP118の濃度の３分の１だけ生産されるに過ぎなかった。
【０１３９】
実施例６
抗微生物活性の検出
点着測定：
ラクトバシラス・サリバリウス118をMRS肉汁において生育し、培養液を10分間14,000gで遠心分離した。 無細胞系の上清液（CFS）を新たに接種した指示薬の培地の上に点着し（5-10μl）、インキュベーションし、抑制の領域を記録した。 バクテリオシン（上記Mayr-Harting等（1972））の測定のために一般的に使用される臨界希釈法の変更方法によって、無細胞系の上清液の活性を測定した。 一連の希釈液をリステリアイノキュラ、バチルスコアグラン1761及びラクトバシルスファーメンタムKLDの新たに接種した培地上に点着し、プレートを適切にインキュベーションした。 タイターを指示薬培地を完全に抑制することを証明する抑制剤の最大希釈度の逆数として定義し、ミリリットル（ml）当たりの活性単位（AU）として示した。
【０１４０】
ミクロタイタープレート測定法：
Holo,.H.、等（1991）J.Bacteriol.173,3879-3887によって記載されているようにミクロタイタープレート測定法による精製過程の間に、バクテリオシン活性を測定した。 TSAYE肉汁におけるバクテリオシンエキス（50μl）の2倍連続希釈液をミクロタイタープレート（Greiner GmbH、Frickenhausen）において調製した。 タイター115μlの新たな指示薬培地（A600〜0.1）の及び50μlのTSAYEを加え、プレートを37℃でインキュベーションした。 指示薬菌株の生育を600nmで分光測光法で測定した。 １バクテリオシン単位をこの測定において50％の生育抑制（バクテリオシンを含まないコントロール培地の濁度の50％）を引き起こすバクテリオシンの量として定義した。
【０１４１】
バクテリオシン精製
硫酸アンモニウム沈降 ラクトバシラス・サリバリウス118を2リットルのMRS肉汁（Oxoid）において対数増殖後期まで生育し、20分間12000rpmで遠心分離した。 硫酸アンモニウム（300g/l）を無細胞系の上清液に加え、4℃で1時間攪拌し、30分間8000rpmで遠心分離した。 ペレットと菌膜（浮遊している固体物質）を一緒にし、100mlH2Oで溶解した（分画I）。
【０１４２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー分画Iを10gのアンバーライトXAD-16（Supelco）で30-45分間混合し、カラムに適用し、H2O（100ml）で一度洗浄し、さらに40％エタノール（100ml）で２回洗浄した。 バクテリオシンを、100ml（10×10ml）の70％イソプロパノール10mMHClを用いてカラムから溶出した（分画II）。
【０１４３】
陽イオン交換クロマトグラフィー：
分画IIをH2O+0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）でpH2-3に調整し、前もって5mMリン酸緩衝液、pH5.4（緩衝液A）で平衡化した2ml S-セファロース高速流陽イオン交換カラムに直ちに適用した。 次いで40mlの緩衝液Aで洗浄後、バクテリオシンを緩衝液A中で20mlの1MNaCl（分画III）で溶出した。
【０１４４】
C2/C8逆相FPLC：
分画IIIを0.1％TFA溶液Aを含むイソプロパノールを用いて平衡化したC2/C8逆相FPLCカラム（Pep RPC）へ適用した。 バクテリオシンを、40分間30％-37％の直線勾配濃度の溶液Aで、次いでさらに５分間、勾配37-100％の溶液Aで溶出した。 流速0.5ml/minで、1ml分画を収集した。 ミクロタイタープレート測定法を用いて、それぞれの分画の活性を測定した。 高いバクテリオシン活性を有する複数の分画を混合し、逆相カラム上で再度クロマトグラフィーを行った。
【０１４５】
アミノ酸の組成及び配列の分析
精製したバクテリオシンを前に述べたようにアミノ酸分析器（Fykse,EM,等（1988）Biochem J.256,973-980）上で加水分解し、分析した。 オンライン120Aフェニルチオヒダントインアミノ酸分析器を備えたアプライド・バイオシステム・モテル477A自動配列決定器（Cornwell,GG,等（1988）Biochem.Biophys.Res.Commun.154,648-653）を用いてエドマン分解により、アミノ酸配列決定を行う。 ブロモシアン（CnBr）（Sletten,K.,等（1974）Eue.J.Biochem 41,117-125）を用いてバクテリオシンを切断後、配列のＣ末端部分を得た。
【０１４６】
ABP118の活性の方法
吸着測定法：
感受性及び抵抗性菌株の細胞壁へ吸着するABP118の能力を調べた。 簡単に述べると、リステリア・イノキュア、ラクトバシラス・サリバリウスUCC118、ラクトバシルスファーメンタムKLD、大腸菌1266及びバチルスコアグラン1761を新鮮な肉汁（20ml）においてそれぞれ継代培養し、対数増殖中期まで生育した。 遠心分離によって細胞を収集し、pH6.5、50mMリン酸ナトリウム緩衝液で2回洗浄し、そして、2000AU/mlのABP118を含むpH4.0、6.0及び8.0緩衝液に再懸濁した。 混合物を37℃で２時間インキュベーションした。 それから、細胞を遠心分離によって取り除き、上清液の抗微生物タイターを決定した。 コントロールとしては、細胞のないABP118の2000AU/mlのインキュベーションしたもの及び、ABP118のない細胞をインキュベーションしたものとした。
【０１４７】
ABP118の静菌性活性に対する殺菌活性
2組のリステリア・イノキュア、ラクトバシルスファーメンタムKLD及びバチルスコアグラン1761を、対数増殖期（OD600、0.2-0.5）まで生育した。 5000AU/mlのABP118を1組目の細胞へ加えた。 第2組目の細胞を2回洗浄し、5000AU/mlのABP118を付加する前にpH6.5リン酸緩衝液に再懸濁した。 さらに7-8時間適当な状況下で生育（cfu/ml）を行い、モニターした。 静止期細胞を使用してこの実験を繰り返した。
【０１４８】
感受性細胞のDNA、RNA及びタンパク質合成におけるABP118の効果
感受性指示薬バチルスコアグラン1761をTSAYE生育培地に接種（3％（v/v））し、37℃で対数増殖初期まで（3-4時間）生育した。 培養物を２つに分割した。 一方の半分の培地に対して5000AU/mlの抗菌化合物を加え、一方、等量の生育培地を他の半分に加えた。 それから、それぞれの半分の培地を、放射性標識した物質を用いて補った。 以下の物質（New England Nuclear Corps.）を使用した。 すなわち、５μCi/mlの[5,6-3H]ウリジン（39.6Ci/ml）；５μCi/mlのメチル［３H］チミジン（6.7Ci/mmol）及び５μCi/mlのL−［35S］メチオニン（1175Ci/mmol）。 一定間隔で、サンプルを培養物から取り出し、生育培地を加えた（pH5.8）。 それから、各サンプルを１５％トリクロロ酢酸（TCA）で補充し、十分に混合し、そして18時間、氷上でインキュベーションした。 それから、複数のサンプルをガラス繊維フィルターを通して濾過し、５％TCAで洗浄し、乾燥した。 ベックマンエコーライト（Beckman Ecolite）シンチレーション装置を有するシンチレーション容器上にフィルターを置き、ベックマン（Beckman）液体シンチレーション計数器においてカウントした。
【０１４９】
ABP118の精製
対数増殖期（実施例５参照）において生産されたABP118を、硫酸アンモニウムで沈降させ培養培地から20倍濃縮することにより（分画I）、表11及び12に示したように250％の回収で特異的な活性が292倍増加した。
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
【表１２】
【０１５２】
疎水性XAD-16カラムを通過した後、収率が3.75％で特異的活性が劇的に失なわれた（表１２、分画II）。 純粋なABP118を生じる最終的な精製段階は、逆相クロマトグラフィーであった。 １つの分画として収集された、活性ピークは、100％イソプロパノールの濃度で溶出した。 このピークを再びカラムにかけたとき、純粋な活性ピークは、31.5％イソプロパノールで溶出した。 純粋なABP118の特異的な活性は培養上清液より135倍大きく、最終的な回収率は0.047％であった（表12、分画IV）。 FPLCより前に陽イオン交換カラムを通すことによって、特異的な活性が減少したが、より良い精製結果を生じた。 最終タンパク質濃度は、130μg/mlであると推定された。
【０１５３】
アミノ酸組成と配列の分析 純粋なABP118のアミノ酸組成を表13に示すように決定した。
【０１５４】
【表１３】
【０１５５】
異常なアミノ酸は、検出されなかった。 高い割合でグリシン、アラニン及びロイシンが検出された。 トリプトファン又はチロシン残基は存在しなかった。 エドマン分解のおいて、N-末端はブロックされた。 一つのメチオニン残基が存在していたので、ブロモシアン切断を行い、N末端あるいはその近接の５アミノ酸残基-Lys-Arg-Gly-Pro-Asn-C（SEQ ID NO：1）を決定した。 43-47アミノ酸のなかで２１個のものは疎水性であった。 ブロモシアン切断を行う能力は、N末端のリジン残基の上流のメチオニン残基が存在するかどうかを示す。
ABP118の活性の方法ABP118は感受性細胞へ吸着する。
【０１５６】
ABP118の吸着をpH4.0〜8.0の範囲に渡って試験した。 ABP118はテストした感受性細胞へ結合した（表14参照）が、抵抗性生産菌株、ラクトバシラス・サリバリウスUCC118へは結合しなかったことが観察された。
【０１５７】
【表１４】
【０１５８】
大腸菌1266に結合したABP118がpH8.0で観察されたが、テストしたより低いpH値では観察されなかった。 37℃で2時間のインキュベーション後、感受性細胞へのABP118の40％の吸着が測定された。 100％の全吸着量は、一度も観察されなかった。 実験を4℃で繰り返したとき、検出された吸着はより少なかった。 細胞をオートクレーブにかけたとき、感受性細胞及び抵抗性細胞の両方について、４０％の吸着量を記録した。 プロテアーゼで細胞を処理したとき、感受性細胞又は抵抗性細胞のいずれに対する吸着量もほとんど増加しなかった。
【０１５９】
ABP118は殺菌性及び静菌性活性の両方を所有する。 ：抑制剤ABP118は、性質上殺菌性である。 これの最も印象的な例は、生育の対数増殖期及び静止期の両方の間でのバチルスコアグラン1761の生育に対してABP118が持つ影響である（洗浄した細胞及び洗浄していない細胞の両方に対して、図５A−５Ｄ参照）。 ABP118の添加後、最初の2,3時間の間、肉汁が清浄化したが、これは、ABP118の細胞溶解活性を証明するものである。 リステリア・イノキュア及びラクトバシルスファーメンタムKLDに対する殺菌性活性は、静止期におけるより生育の対数増殖期において更に明白であった。 ABP118の添加し、4時間静止期細胞をインキュベーション後、KLD菌株細胞の生存能が急速に減少することが分かった。 グラム陰性P・フルオレッセンス菌株及びメチシリン抵抗性S・アウレウス菌株にするABP118（5000AU/ml）の活性も試験した。 60〜90分インキュベーション後、両方の菌株の生育に対する静菌性効果が顕著に明白であった（図6及び7）。 30/37℃で1時間インキュベーションしたのち、細胞を2つに分割し、ABP118を一方の分に加え（矢印）、生育を更に8-9時間モニターした。 ◆−◆線はABP118の静菌性効果を説明する。
【０１６０】
ABP118はDNA及びRNA合成を抑制する：対数増殖期細胞へ5000AU/mlのABP118を添加しても、チミジン又はウリジンのいずれにも取り込みを生じなかった。 これは、それぞれ高分子DNA、RNAの合成の抑制することを示す。 バクテリオシンを加えないとき、細胞は、活発にチミジン及びウリジンと結合する。 タンパク質合成の抑制は、試験物とコントロールとの両方における放射性標識したアミノ酸の取り込み率が低いために証明されなかった（おそらくTSAYE培地に通常存在するアミノ酸の濃度が高い結果として）。
結果を図8A及び8Bに示した。
実施例７
ABP １のアミノ酸組成及び配列分析
ABP118のアミノ酸組成を得る際に実施例６に従う手順を、純粋なABPIのアミノ酸組成を決定するために繰り返した。 アミノ酸組成を表15に示す。
【０１６１】
【表１５】
【０１６２】
ABP118に関して異常なアミノ酸は検出されなかった。 グリシン及びアラニンは高い割合で検出され、ロイシンの割合が比較的高かった。 トリプトファンは検出されなかったが、チロシン及びバリンは検出された。 46-52アミノ酸のうち13-16個のアミノ酸は、疎水性であった。
【０１６３】
実施例８
ABPの配列順序
全ゲノムDNAを、Leenhouts等1991（J.Bacteriol.173：4794-4798）の方法によって40mM DL−スレオニンで補ったMRSで生育したUCC118から単離し、以下の変更を加えたCsClエチジウムブロミド浮遊密度勾配遠心分離法によって精製した。 STE緩衝液中、pH8.0（6.7％サッカロース、50mMトリス塩酸ImM EDTA）で細胞をペレット化し、洗浄した後、再ペレット化した細胞を−20℃近傍で貯蔵した。 1時間アイス上で8mg/mlのリゾチーム及び50U/mlのミュータノリシンを用いて細胞を溶解し、それから45分間37℃でインキュベーションした。 SDS溶液を加える前に、2mg/mlのプロテアーゼＫを加え、1時間55℃でインキュベーションした。
【０１６４】
UCC118に対する全ゲノムDNAを、製造者の指示（Boehringer Mannheim）に従って、BamHI制限エンドヌクレアーゼで消化した。 オリゴヌクレオチドプライマーをBeckma Oligo 1000MDNA合成器で合成した。 ABPの推定構造遺伝子を含む断片を、BIOTAQTMポリメラーゼ（Bioline）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅し、次いでQiaexIIゲル摘出キット（Quagen）を用いてアガロースゲルから精製した。 大腸菌JM109コンピタント細胞の中に形質転換を行ったpGEM-Tベクター系（Promega）においてクローニングを行い、次にイソプロピル-β-D-チオガラクトサイド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトサイド（X-ゲル）を用いて、ブルーホワイトスクリーニングによって可能性のあるpGEM-T組換え体を同定した。 挿入物が存在するかどうかを、T7及びSP6プロモータの既知の配列に設計したpGEMT配列プライマーを使用して、PCRによって確認した。 これらPCR増幅断片を、Ampli Taq DNAポリメラーゼ、FS（Applied Biosystems）を有する染色ターミネーターサイクル配列迅速反応キットを使用して自動DNA配列決定機373ストレッチXL（PE Applied Biosysystems）によって順序つけた。
【０１６５】
ブロモシアンの切断後、次いで配列決定し、以下に示すように同定できない1つのアミノ酸を含む、ABP118のC-末端領域からの30アミノ酸配列を得た。
【０１６６】
＊は、位置8、11，13，19，20，21及び25での1以上のアミノ酸種の可能性を示す。
？ は、同定できないアミノ酸配列。
（ ）は、間違った配列の可能性を示す。
【０１６７】
この配列は、変性プライマーを用いてBamHI制限された全DNAとのPCRによって確認し、先のプライマー（5'ATGAAACGNGGNCCNAAC3'）（配列番号４）を最初の６つの既知のＮ末端アミノ酸に設計し、一方逆プライマー（5'GGGCCTRNGGNACNCC3'）（配列番号５）をアミノ酸21から26へ設計した。 Ｒは、プリンであった。 80bp断片を単離し、ついで次のように順序つけた。
【０１６８】
このDNA配列を控除し、オリジナル配列における位置7，8，11，13，19，20，21及び25でアミノ酸の同定を確実にし次のタンパク質配列を与えた。
DNA配列はデータバンクにおいて既知の配列に相同性がないことを示した。
【０１６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＨ２．０のＭＲＳ培地中において、洗浄したラクトバシラス菌株（ｃｆｕ／ｍｌ）の細胞の生存を、時間（分）に対して示したグラフである。
【図２】
ｐＨ２．０のＭＨＳ培地中において、洗浄したラクトバシラス菌株（ｃｆｕ／ｍｌ）の細胞の生存を、時間（分）に対して示したグラフである。
【図３】
緩衝していない培地 、及び緩衝した培地中で、ラクトバシラス菌株ＵＣＣ１１８（ｃｆｕ／ｍｌ）の生存を、時間（分）に対して示したグラフである。
【図４】
Ｌ． サリバリウス ＵＣＣ１１８（対数ＯＤ６００）の生育及びＡＢＰ１１８（ＡＵ／ｍｌ）の生産を、時間（時間）に対して示したグラフである。
【図５】
ＡからＤは 、洗浄した（そして緩衝液中に再懸濁した）又は洗浄していない、バシラス・コアギュランス１７６１（Bacillus coagulans 1761）の対数期及び静止期の細胞に対する、ＡＢＰ１１８（５０００ＡＵ／ｍｌ）の殺菌効果を示した図である。
【図６】
ＡＢＰ１１８ （５０００ＡＵ／ｍｌ）を添加した（◆）、及び添加していない（□）ＴＳＡＹＥ培地中で、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）の生育を示すグラフである。
【図７】
ＡＢＰ１１８ （５０００ＡＵ／ｍｌ）を添加した（◆）、及び添加していない（□）ＴＳＡＹＥ培地中で、メシチリン耐性黄色ブトウ球菌１４８（Staphylococcus aureus 148）（ＭＲＳＡ）の生育を示すグラフである。
【図８】
Ａは 、バシラスコアギュランス１７６１（Bacillus coagulans 1761）によるＤＮＡ合成に対する、ＡＢＰ１１８の阻害効果を示す図である。
【図８】
Ｂは 、バシラスコアギュランス１７６１（Bacillus coagulans 1761）によるＲＮＡ合成に対する、ＡＢＰ１１８の阻害効果を示す図である。
【配列表】
配列表（1）一般情報:
（i）出願人:
（A）名前: フォーバイルト（トレーディング アズ バイオケミカル アイルランド）
（B）ストリート: グラスニヴィン（C）市: ダブリン9
（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（G）電話: +353-1-8370177
（H）テレファックス: +353-1-8370176
（A）名前: ユニヴァゥシティ カレッジ コーク（B）ストリート: カレッジ ロード（C）市: コーク（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（A）名前: コリンズ ジョン ケヴィン（B）ストリート: スパー ヒル（C）市: ドークロイニ，カウンティ コーク（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（A）名前: オサリヴァン ジェラルド クリストファー（B）ストリート: ボーリンヴェルティック カラヒーン ロード，ビショップスタウン（C）市: コーク（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（A）名前: ソーントン ジェラルダン メアリー（B）ストリート: ボーリマー（C）市: ウォターフォール，カウンティ コーク（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（A）名前: オサリヴァン，マリアン メアリー ジェラルダン（B）ストリート: キャスル ファーム １２６
（C）市: シャンキル，カウンティ ダブリン（E）国: アイルランド（F）郵便番号: なし（ii）発明の題: ラクトバシラス サリバリウス由来の生体に有益な菌株及びそれより得られた抗菌剤（iii）配列の数: 6
（iv）コンピュータ解読形式:
（A）メディア形式: フロッピーディスク（B）コンピュータ: IBM PC コンパティブル（C）作動システム: PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア: パテントイン リリース#1.0，バージョン#1.30（EPO）
（2）配列番号１の情報: 1:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: 5アミノ酸（B）配列の型: アミノ酸（C）鎖の数:
（D）トボロジー: 不明（xi）配列:配列番号: 1:
（2）配列番号２の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: ２９アミノ酸（B）配列の型: アミノ酸（C）鎖の数:
（D）トボロジー: 不明（xi）配列:配列番号:２:
（2）配列番号３の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: ３２アミノ酸（B）配列の型: アミノ酸（C）鎖の数:
（D）トボロジー: 不明（xi）配列:配列番号:３
（2）配列番号４の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: １８塩基対（B）配列の型: 核酸（C）鎖の数: １本鎖（D）トボロジー: 直鎖状（xi）配列:配列番号:４:
（2）配列番号５の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: １６塩基対（B）配列の型: 核酸（C）鎖の数: １本鎖（D）トボロジー: 直鎖状（xi）配列:配列番号:５:
（2）配列番号６の情報:
（i）配列の特徴:
（A）配列の長さ: ８０塩基対（B）配列の型: 核酸（C）鎖の数: ２本鎖（D）トボロジー: 直鎖状（xi）配列:配列番号:６:
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