肺功能衰退可能由气道变窄或氧通过肺上皮细胞向血流扩散降低 而引起。气道变窄导致例如提高的气道阻力(AR)和气道或支气管反 应过度(AHR或BHR)。AHR指的是对各种刺激物过度的支气管收缩响 应，并由对(气道变窄)刺激物提高的敏感性反映出来。此外，患者 的频繁AHR导致气道改造并因此导致气道变窄，增加的气道阻力，并 随后导致朝向肺功能进一步衰退事件的粘性循环(Babu和Arshed， 2003)。气道变窄是与各种肺病相关的症状，如慢性阻塞性肺病(COPD)， 哮喘，囊性纤维化和环境肺病。它还在上呼吸道感染之后和在特应性 非哮喘患者和具有哮喘既往史的那些患者中发生。
COPD是涵盖慢性支气管炎和肺气肿的总括术语。COPD的主要致病 因素是主动和/或被动吸烟。其他致病因素是职业引起的暴露和α-1 蛋白酶抑制剂(或α-1抗胰蛋白酶)的遗传缺失。慢性支气管炎患者 具有多日慢性痰咳的历史，每年至少3个月，连续2年。通常，观察 到缓慢地进展成咳嗽增加，呼吸困难，呼吸气流削弱，运动耐量降低 和日常生活的活动减少。增稠的粘液分泌和水肿的支气管壁是引起气 道变窄的原因。在肺气肿中，观察到肺泡壁溶解或围绕肺泡的肺毛细 血管丧失，末端支气管远侧气室扩大，肺泡壁破坏，和由于肺泡表面 积减小造成的气体扩散削弱。除了肺泡的萎陷，在COPD中看到的形态 学改变是平滑肌细胞的过度增殖。这些形态学改变导致降低的氧摄取 功能和平滑肌收缩的失调。这随后导致了肺(气道)对非特异性药物 如乙酰甲胆碱，组胺，冷空气等的反应过度，并导致气道阻力的增加。
哮喘是另一种肺部病痛。它是与如呼吸困难，胸紧，喘鸣，产痰 和咳嗽等症状相关的慢性病症。认为哮喘的发展和持续主要是由于抗 原诱导的炎症的存在及其对气道结构的影响(“过敏性哮喘”)。尽 管COPD的一些症状与哮喘相似，但存在表明哮喘和COPD不是相同的 且患有这些病症的患者应当接受不同治疗的大量证据。与COPD相反， 哮喘患者的气道阻塞是可逆的。
其中气道反应过度和/或气道阻力起重要作用的疾病是主要的健 康问题。例如，COPD是目前世界第五大常见的疾病和第四大死亡原因， 并预测到2020年，COPD可能位于全世界第三个最常见的死亡的原因。 在过去这些年超过三分之一的患者报告了他们的病症使他们不能工 作，限制了他们的工作能力，或导致他们错过工作时机。这些间接成 本，与初级和医疗保健级健康支出的直接成本一起在90年代中期的美 国，估计约为110亿美元。
在发达国家中哮喘的发病率是高的。例如，在2001年的英国，通 过国民健康活动中的哮喘检查，13个成人中有1个和8个儿童中有1 个目前正在接受哮喘治疗。对于哮喘，生产力损失的成本，健康治疗 和社会安全成本也是巨大的(估计在2001年的英国为22亿英镑)。
目前对肺病如COPD或哮喘的治疗方法包括药物治疗和帮助停止 吸烟。停止吸烟通常是患者难以实现的而药物则具有可能产生副作用 的缺陷。这些副作用包括例如心悸，心动过速，震颤，颤抖/神经过敏， 头疼，失眠，口干，视力模糊，易怒，坐立不安，恶心，呕吐，嘶哑， 肾上腺皮质功能不全，免疫抑制和腹泻，取决于所用的特定药物。此 外，患者可能变得对药物不敏感。
因此，存在对组合物和方法的其他需要，该组合物和方法通过降 低患者的AHR和AR具有对肺功能的有益效果，同时没有副作用。
微生物的一些菌株，尤其属于乳杆菌属(Lactobacillus)和/或 双歧杆菌属(Bifidobacterium)的那些，已知在人和/或动物活的食 用时具有有益效果，因此称为“益生菌”菌株。已经报道了对腹泻， 胃肠道或尿道感染，阴道感染，炎症疾病和过敏症的治疗和/或预防作 用。益生菌在这些病痛中的作用机理是通过直接排除病原菌和/或通过 调节免疫系统。例如，已经表明特定的益生菌菌株对促炎细胞因子 IFN-γ具有体外或体内肠内的降低作用(Schulte等，2003；Varcoe 等，2003；Madsen等，2001；Tejada-Simon 1999)。WO 03/010298 公开了唾液乳杆菌(L.Salivarius)的益生菌菌株，其具有炎症调节 作用，因为当它们存在于肠内时明显地降低了促炎细胞因子的水平。 相似地，WO 03/010297公开了双歧杆菌属的益生菌菌株，其具有抗炎 作用。WO 01/97822公开了乳杆菌GG(ATCC 53103)和乳酸双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)Bb-12菌株对于过敏性炎症的用途。WO 01/37865描述了给予益生菌后IgE抗体的下调。
尽管现有技术中已经描述了益生菌的用途，选择迄今为止所述的 细菌菌株的有益抗过敏症和/或免疫系统抗炎作用或抗病原菌作用。当 这些菌株已经表明具有有益作用时，这种作用在所有情况中通过这些 作用方式来发挥(间接或直接地)。例如，过敏症的治疗中，已经描 述益生菌菌株的食用具有抗炎作用，或对恢复Th1/Th2平衡的免疫系 统的作用，且因此推定这样的菌株可用于治疗过敏性哮喘。
发明概述
本发明者首次测试了分离的细菌菌株对肺功能(即，对PenH和因 此对AHR和/或AR)的直接作用且令人惊讶地发现乳酸产生细菌的一 些菌株(参见以下的第1和2组)对气道变窄尤其是对AHR具有显著 的体内有益作用，且这种作用通过与抗炎响应无关、与Th1/Th2细胞 因子响应再次平衡也无关的作用方式来发挥，Th1/Th2细胞因子响应 是在过敏性患者中观察到的(抗原特异性)免疫响应(参见Cross等， 2002)。此外，与以前所述的用于治疗呼吸道疾病的药物相反，本发 明的菌株不需要吸入，并可以摄食。因此本发明的菌株可用于治疗或 预防以前不知道用益生菌可治疗的呼吸道疾病，如例如COPD和非过敏 性哮喘。此外，在此包括共同给予本发明的一种或多种菌株，例如与 已知的益生菌菌株(例如，具有不同作用方式的菌株)一起。此外， 本发明的菌株可以作为死细胞，或包括这些死细胞的组合物来给予， 以提供对肺功能的有益效果。
发明详述
定义
“乳酸细菌”和“乳酸产生细菌”，在此可交替使用，并指的是 产生作为发酵终产物的乳酸的细菌，诸如，但不限于，乳杆菌属，链 球菌属(Streptococcus)，乳球菌属(Lactococcus)，酒球菌属 (Oenococcus)，明串菌属(Leuconostoc)，片球菌属(Pediococcus)， 肉杆菌属(Carnobacterium)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)， 肠球菌属(Entercoccus)和双歧杆菌属的细菌。
“益生菌”或“益生菌菌株”指的是活微生物优选细菌的菌株， 当患者摄入时(例如，肠内或经吸入)其对宿主具有有益效果。
“患者”在此指的是人或非人动物，尤其是脊椎动物。
术语“肺机能障碍”在此指的是由“非特异性气道变窄”引起的 气道通路衰退。术语肺机能障碍不包括“特异性气道变窄”，其在此 指的是与肺组织的免疫响应相关的气道变窄，如由过敏原引发时在过 敏性哮喘中观察到的。可以以气道阻力(AR)或气道反应过度(AHR) 来测量肺机能障碍。
“气道或支气管响应性过度”或“气道或支气管反应过度”(AHR 或BHR)指的是在对支气管收缩刺激物的响应中气道变窄的容易性和 程度的增加。通过本文别处所述的支气管刺激测试来测量AHR。在此 所用的“非特异性诱导的气道反应过度”(非特异性AHR)指的是与患 者中过敏性反应(由过敏原引起的)无关的AHR。相反，“特异性诱 导的AHR”指的是依赖于患者免疫系统的AHR，其对特异性过敏因子敏 感。
“气道阻力”(AR)指的是对空气以一定速度通过肺的气道阻力 的量度。在尚未给予支气管刺激时，AR具有和AHR基础水平一样的值。 也可以在支气管刺激测试中测量AR。
“FEV1”指的是用肺活量计测量的在第一秒钟呼气时的最大呼气 量。“FVC”指的是最大肺活量，也用肺活量计来测量。FEV1是对人 肺机能和气道变窄的量度。与测试动物中所用的PenH测试相反，对人 患者进行的支气管刺激测试通常测量FEV1。
具有“对气道变窄的显著有益效果”的菌株指的是与在此所述的 PenH测试中的合适对照相比较，具有显著降低的PenH值的菌株。当 然代替评价PenH，可以测定等价的替代值，如人测试中的FEV1。
将术语“显著的抗炎作用”定义为支气管肺泡灌洗中测定的炎症 细胞数目至少10％的增加。
术语“包含”应理解为具体说明所述部分、步骤或组分的存在， 但不排除一种或多种其他部分、步骤或组分的存在。包含乳酸细菌的 组合物因此可以包含另外的细菌菌株等。
当使用PenH测试测量几株乳酸细菌(口服给予)对卵清蛋白敏化 的小鼠的效果时，令人惊讶地发现乳酸产生细菌的一些菌株能够对 PenH尤其是对气道反应过度具有显著的有益效果，而没有对炎症的伴 随作用，如通过炎性细胞(例如，嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，淋巴 细胞和巨噬细胞)流入肺组织中而测定的。
令人惊讶地，基于它们对气道变窄的作用(如通过PenH测定的) 和抗炎/免疫调节作用，可以将细菌菌株区分开来并分组。因此，除了 对炎症或气道变窄没有活性的细菌菌株组以外，基于它们不同的作用 方式，可以将乳酸产生细菌分成3组。第1组的菌株(例如，菌株TD1， 即，Morinaga的短双歧杆菌(B.breve)菌株MV-16)具有显著的抗炎 作用和对气道变窄的显著有益效果。属于第1组的其他菌株是乳杆菌 GG和双歧杆菌Bb-12，在我们的实验中发现它们对PenH具有超过25％ 的降低作用。已知这些菌株具有显著的抗炎作用(WO 01/97822，在此 引入作为参考)。第2组的菌株(例如，菌株TD2，以保藏号No.LMG P-22110保藏于BCCMTM，Univ.Gent，比利时)不具有显著的抗炎作 用，但对气道变窄具有显著的有益效果。第3组的菌株(例如，菌株 TD5，即，Rhodia Food的婴儿双歧杆菌(B.infantis)Bi07)对气道 变窄不具有显著的有益效果，但具有显著的抗炎作用。这清楚地证明 了对气道变窄的有益效果和抗炎作用是不相关的，且乳酸产生细菌能 够对气道变窄具有显著的有益效果，与它们是否对炎症还具有效果无 关。
推断第2组的菌株没有通过免疫系统来发挥它们的作用，这通过 测量肺组织炎症的常用方法就可以测定，即，测量抗炎细胞，尤其是 嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，淋巴细胞和巨噬细胞流入支气管。然而， 不排除第2组的菌株还以一些使用这些方法不可以或不能测量的其他 的新的或不同的方式影响免疫系统。无论如何，这些菌株抗炎作用的 缺乏使它们与已知菌株(如双歧杆菌Bb-12和乳杆菌GG)清楚地区分 开来，这些已知菌株在过敏性患者中确实通过抗炎响应来发挥它们的 作用。在不限制本发明范围的情况下，可以设想对肺上皮细胞或肺中 的平滑肌细胞的直接作用，尽管这种对肺的作用的精确机理仍然有待 阐明。
在本发明的一个实施方案中，提供了乳酸产生细菌菌株在制备用 于治疗或预防肺机能障碍(如上所限定的)的组合物中的用途。适用 于制备该组合物的乳酸产生细菌是第1组和/或第2组的细菌，即对气 道变窄具有显著有益效果的细菌，如可以在PenH测试或在FEV1测试 中测量的。优选，使用PenH测试(如Hamelmann等，1997中所述的)。
如上所述，第1组的菌株是对测试对象的气道变窄(如所限定的) 具有显著有益效果且至少还具有显著抗炎作用的菌株。第1组菌株还 具有免疫调节作用，例如通过调节细胞因子水平。第1组菌株是例如 Morinaga的短双歧杆菌菌株MV-16(在此也称为菌株TD1)。
第2组菌株是新的菌株，其对气道变窄(如所限定的)具有显著 的有益效果但是至少缺乏伴随的抗炎作用。第2组菌株的实例是LMG P-22110(在此也称为TD2)。优选，第2组菌株不具有免疫调节活性。 使用本文别处所公开的方法可以容易地鉴定出第2组的其他菌株。
第3组菌株是对气道变窄(如所限定的)不具有显著有益效果但 至少具有抗炎作用的菌株。Rhodia Food的婴儿双歧杆菌Bi07(在此 也称为菌株TD5)是该组的实例。
通过测量测试菌株的显著(有益)效果，与对照菌株对气道变窄 的效果相比较，来测定细菌菌株对气道变窄的显著有益效果。可以使 用测试动物或人患者来进行，尽管各自的测试和所测量的参数是不同 的(分别为PenH测试和FEV1测试)，如下所述。因此，显著的PenH 或FEV1值确定了是否存在对气道变窄尤其是对AHR和/或AR的显著有 益效果。在这方面何种水平被认为是“显著的”取决于所用的测试和 参数，如下所讨论的。当进行适于所用测试的统计学分析时，重要的 因素是测试结果是统计学上显著的。优选，使用至少95％的置信界限。 使用这些测试中的任一个，或本领域已知的等价测试，本领域技术人 员将能够鉴定对气道变窄具有显著有益效果的菌株。这样的菌株适用 于根据本发明的组合物和方法中。
人患者-FEV1
在支气管收缩剂刺激之前和之后，通过肺活量测定法测定FEV1 是最常用的用于定量人患者中AHR响应和/或AR的方法。阳性测试的 特征在于特定剂量或水平的刺激物与限定的FEV1(1秒钟内的最大呼 气量)的降低一致。通常根据特定的实验方案来进行支气管刺激测试， 通过累积的剂量测量PD20(Yan等，1983)(PD20指的是FEV1下降 20％的刺激剂量)或通过较长的方法测量PC(Cockcroft 1985)(PC 指的是刺激浓度)。PC20＜0.25mg/ml(PD20＜0.1μmol)是严重响应， PC20 0.25-2.0mg/ml(PD20 0.1-0.8μmol)是中度响应而PC20 2.0-8.0mg/ml(PD20，0.8-8.0μmol)是温和响应。所用的支气管收 缩刺激物是药剂(组胺，乙酰甲胆碱)，物理刺激(非等渗气雾剂， 冷/干空气，运动)和特异性敏化剂(过敏原)。在人中，这样的支气 管刺激测试可以用于诊断或证实AHR的诊断来证明治疗干预或症状恶 化后AHR跟随AHR改变的严重程度，来排除具有慢性咳嗽患者的哮喘， 来确定谁在工作场所或在娱乐活动期间处于危险中，和/或来建立环境 或职业性暴露之前的对照或基线。
与对照对象相比较，在支气管刺激后在人测试对象中测定的，FEV1 至少10％的下降，被认为是肺功能的衰退(Cockroft 1985，Yan等， 1983)。当在补充特定菌株的过程中和/或之后FEV1的基础水平显著 提高(＜10％)时，或当支气管刺激后FEV1下降显著降低(＜10％)时， 认为菌株具有有益效果。
测试动物-PenH测试
由于在动物中不能测量FEV1，建立了测量气道变窄的其他方式 (即，测量PenH并因此测量AHR和AR)。优选使用体积描记器在测 试动物体内测量PenH，如通过Hamelman等(1997)中所述的，在此 引入作为参考。简而言之，将测试动物(通常是小鼠)放入体积描记 器的动物室中。当动物平静呼吸时，在该室内造成了压力波动，表示 呼吸过程中一次换气量和胸廓运动之间的差异。压差传感器测量动物 室和参照室之间的压力改变。除了已知的肺功能参数如呼气峰流量 (PEF)，一次换气量(TV)，呼气时间(Te)和频率(f)，还测量 了提高的暂停(PenH)。没有遭受任何肺功能衰退的正常动物中的基 础PenH大约为0.30。也认为动物中的基础PenH是AR的参数。在(由 乙酰甲胆碱引发的)支气管收缩过程中，PEF和PIF(吸入峰流量)提 高，而Tr(放松时间)和Te降低。这导致了提高的PenH。将有意识 不受限制的小鼠中的气道响应性的数据表示为PenH。PenH的提高与 FEV1的降低相关。因此，推定抑制动物中PenH提高的化合物不会降 低人的FEV1且因此减轻气道变窄并提高肺机能。
概括地说，在支气管刺激之后在对照对象和给予测试菌株的对象 之间至少10％，优选至少20％等，或更大的PenH值差异表明测试菌株 的显著效果。
上述的动物测试方法(PenH)或人测试方法(FEV1)可以用于确 定哪些菌株适用于制造本发明的组合物。以这种方式制得的组合物将 对人和/或动物患者肺机能障碍的治疗和/或预防具有有效效果。也可 以通过支气管刺激测试来测量这些菌株和/或含有这些菌株的组合物 对人患者的效果，如上所述。
为了测定对气道变窄具有显著有益效果的菌株是否属于第1组或 第2组，使用已知的方法，例如实施例中所述的，来测定菌株的抗炎 作用(和任选地免疫调节作用)。使用适于所使用测试的已知统计学 分析方法来测定效果是否显著。一般地说，对照和给予测试菌株对象 之间至少10％，优选至少20，30，40或50％的PenH差异表明测试菌株 的显著效果。
组合物
使用一种或多种根据本发明的菌株制成的组合物可以是适于患者 摄取的任何类型的组合物，尤其是适于患有肺机能障碍，如COPD，或 哮喘，或其中发生气道反应过度和/或气道限制的其他呼吸道疾病的人 患者。组合物可以是食品，食品补充组合物，营养(食品)组合物或 药物组合物。根据组合物的类型及其优选的给予方法，组合物的成分 和质地可以改变。食品或食品/营养组合物除了包含本发明的细菌菌株 以外，还包含合适的食品基料。食品或食品组合物在此认为包含用于 人或动物食用的固体(例如，粉末)，半固体和/或液体(例如，酒或 饮料)。食品或食品/营养组合物可以是乳制品，如发酵的乳制品，包 括但不限于酸奶，基于酸奶的饮料或酪乳。这样的食品或食品组合物 可以以本身已知的方式制得，例如，以合适的量(参见，例如，WO 01/82711)将本发明的菌株加入合适的食品或食品基料中。在另外的 实施方案中，将菌株用于食品或食品/营养组合物中或用于制备食品或 食品/营养组合物，例如，通过发酵。这样菌株的实例包括本发明的益 生菌乳酸产生细菌。在这种情况下，可以以本身已知的方式将本发明 的菌株用于制备这样的发酵食品或食品/营养组合物，例如，以本身已 知的使用乳酸产生细菌来制备发酵乳制品的方式。在这样的方法中， 除了通常所用的微生物以外还可以使用本发明的菌株，和/或可以用本 发明的菌株替代一种或多种或部分通常所用的微生物。例如，在制备 发酵乳制品如酸奶或基于酸奶的饮料中，本发明的活的食品级乳酸产 生细菌可以被加入发酵剂培养物中或用作发酵剂培养物的一部分或可 以在这样发酵的过程中适时加入。
食品补充组合物
除了有效量的第1组和/或第2组的一种或多种菌株以外，食品补 充剂可以包含一种或多种载体，稳定剂，益生素等。优选，组合物是 粉末形式，用于肠内(优选口服)给予，尽管鼻给予或吸入也是合适 的。当使用菌株的活细胞时，这些细胞可以以被膜包裹的形式存在以 防受到胃的作用。例如，组合物可以是包装于小袋中的粉末形式，其 可以溶解于水，果汁，牛奶或另一种饮料中。优选，组合物包含至少 一种第2组的菌株，如，例如，LMG P-22110。每株的活细胞剂量优选 为每株至少1×106cfu，优选每天约1×106-1×1012cfu(菌落形成单位)， 更优选约1×107-1×1011cfu/天，更优选约1×108-5×1010cfu/天，最优 选1×109-2×1010cfu/天。可以将有效剂量再分成几个更小的剂量并例 如以每天两份，三份或更多份给予。替代使用活细胞，在一些组合物 中可以使用死的或不能存活的细胞，如以下进一步所述的。
食品/营养组合物
除了合适剂量的第1组和/或第2组的一种或多种菌株以外，营养 组合物优选包含适于人和/或动物食用的碳水化合物和/或蛋白质和/ 或脂类。组合物可以含有或不含有其他生物活性组分，如其他的(益 生菌)菌株，和支持益生菌菌株的益生素。当使用菌株的活细胞时， 这些细胞可以以被膜包裹的形式存在以防受到胃的作用。每株的活细 胞剂量优选为至少1×106cfu，优选约每天1×106-1×1012cfu(菌落形成 单位)/天，更优选约1×107-1×1011cfu/天，更优选约1×108-5×1010cfu/ 天，最优选1×109-2×1010cfu/天。优选，组合物包含至少一种第2组 的菌株，如，例如，LMG P-22110。营养品优选是液体或粉末的形式。 在一个实施方案中，营养品是“Respifor”-样液体产品，可购得 (Nutricia，荷兰)，即，基于牛奶的、能量密集的、高蛋白和碳水 化合物的，富含抗氧化剂并包含调味料的营养品。营养品优选不替代 患者的正常食品/饮料摄入，而是除此以外额外食用的。营养品优选肠 内给予，如口服和通过管饲。
药物组合物
合适剂量的第1组和/或第2组的一种或多种菌株也可以用于制造 用于治疗或预防肺机能障碍的药物组合物。药物组合物通常用于肠内 (例如口服)，鼻/吸入，阴道或直肠给药。药物组合物除了本发明的 菌株以外通常包含药物载体。优选的形式取决于预期的给药方式和(治 疗)应用。药物载体可以是适于将菌株递送至所需的体腔例如患者的 肠中的任何相容的，非毒性物质。例如，无菌水，或惰性固体可以用 作载体，通常补充药物上可接受的助剂，缓冲剂，分散剂等。药物组 合物可以进一步包含另外的生物或药物活性组分。
在另外的实施方案中，替代活(或存活的)细菌或除了活(或存 活的)细菌以外，可以将菌株的死的或不能存活的细菌细胞用于上述 组合物中，例如WO 01/95741中所述的。所用的死的或不能存活的细 胞的量例如可以等于所用的活细菌的量。本领域技术人员可以容易地 确定合适的量。在这样的组合物中，当以“菌落形成单位”量度不可 行时，以本领域技术人员已知的不同方式来计数(例如，使用流式细 胞计数器)或测量细胞的量。
应当理解当提及含有活细胞的组合物时，这包括存活的细胞，如 例如冻干细胞，在用液体给药或重构后将再次变成活的。
食品，食品补充剂，营养或药物组合物是液体形式，例如，稳定 的菌株悬浮液，或固体形式，例如粉末，或半固体形式，例如对于口 服给药，可以以固体剂型，如胶囊，片剂和粉末，或以液体剂型，如 酏剂，糖浆和悬浮液给予菌株。可以将菌株与非活性组分和粉末载体 一起包封于明胶胶囊中，这些载体如例如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露 醇，淀粉，纤维素或纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸，糖精钠，滑 石，碳酸镁等。如上所述，组合物可以包含另外的组分，如蛋白质， 碳水化合物，维生素，矿物质，微量元素，氨基酸，其他生物或药物 活性化合物，载体，稳定剂，调味剂，其他益生菌菌株，益生素等。
第2组的菌株尤其适于制备用于治疗或预防肺机能障碍，如COPD， 非过敏性哮喘，囊性纤维化，吸入，支气管内肿瘤，气管内肿瘤，由 非特异性吸入的刺激物引起的肺机能障碍，肺水肿，气管狭窄或声带 机能障碍的组合物。当然，第2组的菌株可以与已知具有抗炎活性的 菌株(如第1组和/或第3组的菌株)合用。这样的组合物适于治疗或 预防与炎症相关的肺病或呼吸道疾病/病症，例如过敏性哮喘。
含有根据本发明的一种或多种菌株的组合物适于治疗已经患有肺 机能障碍的患者或可以预防性地给药于处于产生这种肺机能障碍的高 危险的对象，如例如暴露于烟/吸烟，寒冷等的对象。
所用的细菌菌株优选是乳酸产生细菌，优选乳杆菌属或双歧杆菌 属。细菌应当是食品级的，即，当人或动物患者摄入时，可以将它们 视为是无害的。应当理解已经将其改良使得当患者摄入时不再有害的 非食品级细菌，例如致病菌，包括于本发明的范围内。乳杆菌菌株可 以是以下的菌种：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，干酪乳杆菌 (L.casei)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，瑞士乳杆菌(L. helveticus)，德氏乳杆菌(L.delbrueckii)，罗伊氏乳杆菌 (L.reuteri)，短乳杆菌(L.brevis)，卷曲乳杆菌(L.cripatus)， 清酒乳杆菌(L.sakei)，詹氏乳杆菌(L.jensenii)，旧金山乳杆 菌(L.sanfransiscensis)，食果糖乳杆菌(L.fructivorans)， 高加索酸奶乳杆菌(L.kefiri)，弯曲乳杆菌(L.curvatus)，类植 物乳杆菌(L.paraplantarum)，高加索酸奶粒乳杆菌(L. kefirgranum)，类高加索酸奶乳杆菌(L.parakefir)，发酵乳杆菌 (L.fermentum)，植物乳杆菌(L.plantarum)，嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，加氏乳杆菌(L. gasseri)，乳乳杆菌(L.xylosus)，唾液乳杆菌(L.salivarius) 等。优选的菌种是鼠李糖乳杆菌，干酪乳杆菌，类干酪乳杆菌，罗伊 氏乳杆菌，卷曲乳杆菌，发酵乳杆菌，植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，约 氏乳杆菌，加氏乳杆菌，唾液乳杆菌，更优选是植物乳杆菌，干酪乳 杆菌或鼠李糖乳杆菌。最优选使用属于干酪乳杆菌菌种的乳杆菌属的 菌株。
在本发明的一个实施方案中，排除鼠李糖乳杆菌菌株，尤其是 L.GG菌株，因为它们可能导致安全问题且因为例如L.GG菌株具有对 于特定的应用可能不理想的特征(参见实施例)。
双歧杆菌菌株可以是以下的菌种：长双歧杆菌(B.longum)，短 双歧杆菌(B.breve)，动物双歧杆菌(B.animalis)，婴儿双歧杆菌 (B.infantis)，双歧双歧杆菌(B.bifidum)，青春双歧杆菌 (B.adolescentis)，假长链双歧杆菌(B.pseudolongum)，链状双 歧杆菌(B.catenulatum)，假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)， 角双歧杆菌(B.angulatum)等。优选的菌种是短双歧杆菌和/或动物 双歧杆菌(尤其是动物双歧杆菌乳酸亚种)。
微生物的种身份可以用生化方法或通过测序(例如，保守区域) 或通过已知的方法如脉冲场凝胶电泳测定。通常，如果在16S rRNA 区域中(例如，当通过例如程序GAP或BESTFIT使用系统设定的参数 进行最佳比对时)细菌菌株显示出至少97％核酸序列同一性，则它们 属于相同菌种。
干酪乳杆菌菌株TD2，根据布达佩斯条约保藏于比利时微生物协 调保藏中心(Blegian Co-ordination Collections of Microorganisms)，BCCMTM，Gent，比利时，保藏号为LMG P-22110。 LMG P-22110尤其适于制备上述的组合物，尽管本发明不只限于该菌 株。
应当理解本发明包括保藏菌株或根据本发明的任何其他菌株的复 制品和/或衍生物。术语“复制品”指的是表示材料基本上未改变拷贝 的生物材料，如通过微生物生长例如培养基中的细菌生长产生的材料。 术语“衍生物”指的是从该生物材料形成且被实质性改变以具有新特 性的材料，例如，由遗传物质的可遗传改变引起的。这些改变可以同 时发生或可以是所用化学和/或物理试剂(例如，诱变剂)的结果和/ 或通过本领域已知的重组DNA技术。当提及“源自”另一菌株的菌株 时，应当理解为包括该菌株的“复制品”以及该菌株的“衍生物”两 者，只要衍生的菌株仍然保持其所源自的菌株对气道变窄的有益效果， 且因此可用于治疗和/或预防肺机能障碍。
在本发明的另一实施方案中，至少两种或多种菌株合用于一种组 合物中或共同给予患者。优选，将至少一种具有抗炎作用的菌株(例 如，本领域已知的菌株如TD5，或第1组的菌株，如TD1)和至少一种 对气道变窄具有有益效果但不具有抗炎作用的其他菌株(例如，第2 组的菌株，例如，TD2)组合。在一些情况中，菌株的这种组合优于只 给予具有抗炎活性的菌株，因为发挥不同作用方式的菌株的组合可能 对肺功能具有增强的效果。菌株可以存在于不同的组合物中且在将不 同组合物给予患者后只在体内组合。或者，菌株可以存在于单个组合 物中。在这两种情况中，两种或多种菌株的给予称为“共同给予”。
在另外的实施方案中，提供了包含至少一种根据本发明的菌株的 组合物，如上所述的。
在本发明的再一个实施方案中，提供了菌株LMG P-22110(TD 2) 或源自所述菌株的任何菌株。
本发明还提供了容器，包含根据本发明的组合物，如上所述。这 样的容器可以是存储1-100个，和1至100之间的每个单个值，如1， 5，10，20，30，40，50，100个或更多剂量的片剂、胶囊、粉末、安 瓿，小袋等的包装。同样，包装可以存储1-200个，1-500个或更多 的剂量。当欲共同给予不同菌株时，应当理解容器可以包含分开剂量 的含有每个菌株的组合物。优选，容器包括在外表面上标明组合物的 有益效果或健康效果的书面标签。例如，容器可以标明该组合物是“用 于COPD患者”或“改善健康状况”的。容器可以是硬纸盒，塑料的， 和金属的等。如果组合物是液体或粉末形式，容器还可以包括适于给 予该组合物的工具，如吸入器。此外，容器可以包括书面使用说明书。
本发明的目的还在于提供一种制备用于治疗或预防肺机能障碍的 组合物的方法，包括下列连续的步骤：
-使用PenH测试或通过测定人患者的FEV1值来测试细菌菌株， 优选乳酸产生细菌对气道变窄的效果，
-基于对PenH和/或FEV1的效果，选择对气道变窄，尤其是对 AHR具有显著有益效果的菌株，
-使选定的菌株生长于合适的液体或固体培养基中，
-任选地从培养基中分离菌株，例如，通过离心和/或过滤并如本 领域已知的进行下游加工，例如冻干，喷雾干燥和/或冷冻，
-将菌株配制成适于给予患者的形式。
任选地，还测试了分离的菌株是否能够对患者提供显著的抗炎作 用。
应当注意上述方法中测试的菌株优选从其天然环境中分离，并且 其没有污染物。分离的菌株可以生长于人造培养基或天然培养基上， 如(低脂)牛奶，酸奶等。然后可以将其直接用于制造根据本发明的 组合物，或可以通过离心和/或过滤从培养基中将细菌浓缩或分离，然 后配制成合适的组合物。应当理解现有的食品组合物，如例如包含不 明确的微生物混合物(例如，酵母，各种菌种的细菌)的酸乳酒，排 除在本发明的组合物之外，因为这样的产品在它们的细菌组成(菌种) 以及细菌浓度(剂量)方面都是未确定的。然而，它们可以用作的食 品基料，可以将根据本发明的一种或多种菌株加入其中。只有由此所 产生的组合物(包含至少一种根据本发明的菌株)及其用途被看作是 本发明的实施方案。
根据本发明的第1组和/或第2组的菌株在制备用于治疗或预防肺 机能障碍，尤其是用于治疗或预防COPD，非过敏性哮喘，囊性纤维化， 吸入，支气管内肿瘤，气管内肿瘤，由于非特异性吸入的刺激物引起 的肺机能障碍，肺水肿，和/或声带机能障碍的药物中的用途是本发明 另外的实施方案。在尤其优选的实施方案中，将药物用于治疗和/或预 防选自COPD，吸入，由于非特异性吸入的刺激物引起的肺机能障碍， 肺水肿和/或气管狭窄的肺机能障碍。
在另一实施方案中，提供了益生菌乳酸细菌在制备用于治疗或预 防患者慢性阻塞性肺病(COPD)的药物中的用途。
以下的非限制性实施例描述了根据本发明的菌株的鉴定和使用。 除非另外指出，本发明的实施将使用分子生物学、病毒学、微生物学 或生物化学的标准常规方法。
实施例
实施例1：菌株TD2的描述和特征以及益生菌特性
菌株分离
从健康人志愿者的粪便中分离出菌株TD2。研究健康成人志愿者 粪便中的益生菌菌株。“健康的”，意思是没有疾病，没有痛苦，未 患有胃肠道疾病，至少6周没有使用抗生素，至少一周没有食用益生 菌产品，没有对乳蛋白的不耐受性，并具有规律的大便习惯的成人。 记录有关饮食习惯的日志。
在厌氧室中分析新鲜的人粪便。将粪便在90ml贮存培养基(每升 20g/l缓冲的蛋白胨水，1.0ml/l吐温80，0.5g/l L-半胱氨酸-HCl 和1片刃天青片剂，pH6.3(用2M HCl调节))中稀释十倍，然后使 用Ultra-Turrax均化。在减少的蛋白胨(1.0g/l)生理盐溶液中进行 连续稀释并将102-107稀释液铺在LAMVAB上(Harternik等，1997)。 这个最终的培养基由52g/l De Man Rogosa和Sharpe(MRS，Oxoid)， 0.25g/l L-半胱氨酸-HCl，0.025g/l溴甲酚绿，20g/l琼脂，和20mg/l 万古霉素组成。将MRS(104g/l)，L-半胱氨酸-HCl(0.5g/l)和溴 甲酚绿(0.05g/l)与琼脂(40g/l)分开在121℃高压灭菌15分钟， 并冷却至50℃。将万古霉素的储液(2mg/ml)通过使用0.2μm的滤器 过滤灭菌。将高压灭菌的琼脂和MRS+半胱氨酸+溴甲酚绿以1∶1的比 例混合。随后将万古霉素加入至20mg/ml的终浓度，此后将其倒在平 板上。然后将平板在厌氧罐中37℃温育三天。为了纯度将菌落在MRS 琼脂上划线培养并在37℃温育。
菌株分类
16sRNA的测序给出了菌株的可靠鉴定。根据Boom等(1990)描 述的方法进行菌株DNA的提取。用表1中所提及的8f和1510r引物来 完成16sRNA区域的扩增和测序。扩增程序是94℃ 5分钟；94℃ 30s， 54℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；最后72℃ 4分钟。
表1：引物   引物   序列(5’→3’)   8f   338r   338f   515f   515r   968f   968r   1401r   1501r   CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C) TGG CTC AG   GCT GCC TCC CGT AGG AG   CTC CTA CGG GAG GCA GC   TGC CAG CAG CCG CGG TAA TAC GAT   ATC GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA   AAC GCG AAG AAC CTT AC   GTA AGG TTC TTC GCG TT   CGG TGT GTA CAA GAC CC   GTC AAG CTT ACG G(C/T)T ACC TTG TTA CGA CTT
使用Sanger等(1977)详述的DNA测序的双-脱氧方法进行测序。 在循环测序反应(CSR)中使用ABI PRISM BigDye终止子循环测序迅 速反应试剂盒(Applied Biosystems Inc.，Nieuwekerk aan de IJssel， 荷兰)结合表2中提及的所有引物。CSR的程序为96℃ 30s，接着96 ℃ 10s，50℃ 5s和60℃ 4分钟，25个循环。随后借助ABI PRISM 310 基因分析仪(Applied Biosystems Inc.，Nieuwekerk aan de IJssel， 荷兰)来分析CSR-混合物。用Chromas V1.51(Technelysium Pty Ltd.， Tewantin，澳大利亚)来分析序列数据并借助Windows V2.5的DNASIS (Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.，Wembley，英国)来 比对。将完整的双链16S rDNA测序区域输入Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)程序(Altschul等，1990)中并与GenBank， EMBL，DDBJ和PDB数据库中的其他(菌株)的(16S rDNA)序列相比 较来进行菌株鉴定。因此将菌株鉴定为属于干酪乳杆菌种。
菌株存活
评价从人粪便中分离的菌株干酪乳杆菌TD2，以及已知的益生菌 菌株在胃和小肠中的存活。当该菌株用作人的益生菌时，在胃和小肠 中的存活是重要的。
使细菌在MRS中生长24小时，随后在MRS中再接种24小时。将 1ml生长培养物加入9ml胃培养基中，胃培养基由8.3g/l细菌蛋白胨， 3.1g/l NaCl，0.11g/l CaCl2，1.1g/l KCl，0.6g/l KH2PO4，1.0g/lD- 葡萄糖，22.2mg/l胃蛋白酶和22.2mg/l脂酶组成，pH3.0。将细菌在 胃培养基中37℃温育3小时。此后，将1ml用细菌温育的胃培养基与 9ml小肠培养基混合并在37℃再温育3小时。小肠培养基由5.7g/l 细菌蛋白胨，1.25g/l NaCl，0.055g/l CaCl2，0.15g/l KCl，0.68g/l KH2PO4，1.0g/l NaHCO3，0.3g/l Na2HPO4，0.7g/l葡萄糖，20.3g/l胰 酶和5.5g/l胆汁组成，pH6.5。在t＝0，3和6小时时取样并涂布于 MRS琼脂上来测定菌落形成单位。
从人粪便分离的干酪乳杆菌，LMG P-22110，在胃和小肠培养基中 呈现与其他益生菌菌株相似或甚至更好的存活，如以下表2中所示的。
表2   菌株   来源   胃培养基中的   存活   小肠培养基中的   存活   总存活   干酪乳杆菌   LMG P-22110   人粪便   105％   164％   172％   鼠李糖乳杆菌GG   人粪便   109％   139％   152％   动物双歧杆菌Bb 12   ？   100％   105％   105％
菌株粘附
益生菌的特性之一是它们可以粘附于小肠细胞上并与病原菌竞争 上皮细胞的结合位点。对上皮细胞的粘附也与定居的能力和对宿主的 益生菌效果相关。
测试了干酪乳杆菌LMG P-22110的粘附性。
通过离心(10分钟，4000rpm，Sorval RT17)收集菌株的过夜培 养物并重悬浮于PBS中。在显微镜下使用Burker Turk计数室来计数 细胞的数量。将细菌再次离心并将沉淀重悬浮于无Pen/Strep的 Caco-2 1％FCS-培养基中。Caco-2细胞是2周后汇合并在24孔平板 中生长(1-2×105个Caco-2细胞每孔)。每孔加入1×108CFU细菌并 在含有5％CO2的温育箱中37℃温育1小时。温育后，从Caco-2细胞 中除去培养基，并用PBS(37℃)洗涤细胞3次。用无菌Mili Q水将 细胞裂解，制备裂解细胞的连续稀释液并涂布于MRS琼脂上。
结果表明干酪乳杆菌LMG P-22110(TD2)的粘附至少和其他公知 的益生菌菌株一样好。粘附性好于阳性对照。粘附了约13％净增的培 养物。
没有观察到有害的特性，如溶血，或组胺和酪胺的产生。
实施例2：其中用几种乳酸细菌菌株预防性治疗清蛋白敏化小鼠 的动物实验
动物：
从Charles River(Maastricht，荷兰)获得无特异性病原菌的 雄性BALB/c小鼠。随意提供食物和水，当6-9周龄时使用小鼠。所有 实验均由荷兰乌特勒支大学动物论理学委员会批准。
试剂：
清蛋白(V级)和乙酰-β-甲基胆碱氯化物(乙酰甲胆碱)从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)购得。氢氧化铝(AlumInject) 从Pierce(Rockford，IL，USA)购得。
敏化，治疗和激发：
通过在第0和第7天两次i.p.注射吸附于100μl盐水中2.25mg 氢氧化铝上的10μg清蛋白或单独的盐水来敏化小鼠。在第35，38和 41天通过在有机玻璃暴露室中吸入清蛋白气雾剂20分钟来激发小鼠。 通过使用Pari LC Star喷雾器(Pari呼吸设备，Richmond，VA，USA) 将盐水中的清蛋白溶液(10mg/ml)喷雾来产生气雾剂。在第28天开 始直至实验结束(即，第42天)每日通过管饲法口服109(CFU)每株 乳酸细菌来治疗小鼠。
气道响应性的测定：
在最终气雾剂激发后24小时时使用整体体积描记器(BUXCO， EMKA，Paris，法国)测定对有意识的，不受限制的小鼠对吸入的喷雾 乙酰甲胆碱的气道响应性。将气道响应表示为提高的暂停(PenH)。
支气管肺泡灌洗：
测量胆碱能气道响应后，将动物处死并进行支气管肺泡灌洗，测 定细胞的总数并将细胞区别开来。将第一毫升灌洗液的上清液分离并 冷冻于-70℃直至进一步的分析。将全部细胞(嗜中性粒细胞，巨噬细 胞，嗜曙红细胞+淋巴细胞)的流入作为肺组织炎症的量度。
统计学分析：
通过常规的线性模型或重复测量后组之间的post-hoc比较来统 计学分析对乙酰甲胆碱的气道响应曲线。使用Mann-Whitney U检验来 统计学分析细胞计数。概率值p＜0.05被认为是统计学上显著的。
结果：
结果显示于表3中。菌株TD2显示了对气道反应过度的显著效果， 但是对炎症没有显著效果，而菌株TD5显示了对气道反应过度没有显 著效果，但显示了对炎症有效果。菌株TD1显示对气道反应过度和炎 症都具有效果。
这些结果表现出一些乳酸产生细菌菌株对肺功能的不同效果，且 表明对肺炎症的有益效果并非必然导致对肺功能的有益效果，反之亦 然。因此，这些结果表明对肺功能具有有益效果的产乳酸菌株对涉及 肺机能障碍的疾病具有治疗和/或预防作用，不同于具有抗炎作用的那 些菌株。这些结果表明属于干酪乳杆菌种的菌株尤其有效。
表3：
在清蛋白敏化小鼠中各种乳酸细菌菌株对气道反应过度和炎症的 效果。   治疗   炎症c(％)   气道反应过度d(％)   指定的组   对照a   100   100   菌株TD1(短双歧杆菌菌   株MV16，Morinaga)   58*   60*   第1组   菌株TD2(LMG P-22110)   94   42*   第2组   菌株TD5(婴儿双歧杆菌   Bi07，Rhodia Food)   69*   93   第3组   TD6f(L.GG.ATCC 53103)   nde   66*   第1组   对照b   0   0
a：没有用乳酸细菌治疗的清蛋白敏化的小鼠
b：没有用清蛋白敏化的对照大鼠
c：用支气管肺泡肺灌洗中存在的细胞数量来估量炎症
d：将气道反应过度的降低表示为在最高测试剂量乙酰甲胆碱 (50mg/ml)对PenH的效果
*与没有用乳酸细菌治疗的清蛋白敏化的小鼠相比较，P＜0.05
e：未测定
f：在分开的实验中测定的
实施例3：在内毒素诱导的肺气肿期间显示乳酸细菌在小鼠模型 中的效果的动物实验
通过LPS处理可以诱导小鼠的肺气肿。
动物：
从Charles River(Maastricht，荷兰)获得无特异性病原菌的 雄性BALB/c JIco小鼠。随意提供食物和水，并在7-8周龄时使用小 鼠。所有实验均由荷兰乌特勒支大学动物论理学委员会批准。
试剂：
LPS：大肠杆菌(E.coli)，血清型O55：B5：Sigma Chemical Co.
乙酰甲胆碱(乙酰-β-甲基胆碱，从Janssen Chimica(Beerse， 比利时)获得)。
敏化，治疗和激发
通过鼻内给予LPS(50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5μg)来诱导 肺气肿，或作为对照，给予PBS(50μl)，一周两次，共四周(第0， 3，7，10，14，17，21和24天)。在第14天开始直至实验结束(即， 第42天)每日通过管饲口服0.2ml含有109(CFU)每株乳酸细菌的盐 水(0.9％w/v NaCl)来治疗小鼠。作为对照，加入0.2ml盐水。
如实施例2中所述测定气道反应过度和支气管肺泡灌洗。
右心室肥大
右心室肥大是肺气肿的征兆。在第42天分离整个心脏(10只动 物中4只的)并在解剖显微镜下完全分离无壁的右心室(RV)并取出。 在吸干后将左心室和隔膜(LV+S)和RV分别称重。将RV重与LV+S 重之比用作右心室肥大的指数。
统计学分析：
将对乙酰甲胆碱的气道响应曲线，支气管肺泡灌洗(BAL)细胞计 数，和右心室(RV)肥大的数据表示为算术平均±平均的标准误差，并 使用一种方式方差分析(ANOVA)(和非参数的)来进行组之间的比较， 接着进行组之间的post-hoc比较(Bonferroni’s多重比较检验)。 p＜0.05的概率值被认为是统计学上显著的。对于气道响应的测量， n＝10，对于BAL细胞计数，n＝6，对于RV肥大，n＝4。
结果：
结果显示于表4中。菌株TD2再次显示出对气道反应过度的显著 效果，但是对炎症没有显著效果。
结果表明乳酸产生细菌菌株TD2对患有LPS诱导的肺气肿小鼠的 气道反应过度和右心室肥大具有有益效果，且该效果不是通过抗炎机 理产生的。这些结果表明一些对PrnH具有效果的特定菌株在治疗和/ 或预防肺机能障碍，如肺气肿和/或COPD中是有益的。这些结果表明 干酪乳杆菌菌株是合适的，尤其菌株TD2是合适的。
表4：
在肺气肿LPS模型中乳酸细菌菌株对气道反应过度、右心室肥大 和炎症的效果。  治疗   炎症c(％)   气道反应过度d(％)   右心室肥大(％)  对照a   100   100   100  菌株TD2(LMG  P-22110)   93   16*   56*  对照b   0   0   0
a：没有用乳酸细菌治疗的LPS处理的小鼠
b：没有用LPS处理的对照大鼠
c：用支气管肺泡肺灌洗中存在的细胞数量来估量炎症
d：将气道反应过度的降低表示为在最高测试剂量乙酰甲胆碱
(50mg/ml)对PenH的效果
*与LPS处理的对照小鼠相比较，P＜0.05
实施例4：含有乳酸细菌菌株的组合物
食品补充组合物
1.含有0.5g脱脂奶粉及0.5g半乳糖寡糖和果糖多糖的混合物且 每克含有5×109cfu TD2的胶囊。剂量：每天2×1g。
2.粉末，麦芽糖糊精，每克含有5×109cfu TD1和5×109cfu TD2； 包装于小袋中。剂量：每天2×1g。在食用前将其溶解于水、果汁、牛 奶或酸奶等中。
食品/营养组合物
1.适用于患有COPD的患者的液体营养品，每125ml含有5×109 热灭活的TD1细胞。推荐剂量为每天3×125ml。
每100ml：
-7.5g蛋白质(乳清酪蛋白混合物，1/1)
-22.5g碳水化合物(葡萄糖0.3g，乳糖2.0g，麦芽糖1.0g，蔗 糖3.0g，多糖15.8g)。
-3.3g脂肪(0.5g饱和脂肪酸，1.9g单不饱和脂肪酸，0.9g多 不饱和脂肪酸)
-矿物质(55mg Na，110mg K，60mg Cl，155mg Ca，100mg P， 15mg Mg)
-微量元素(3.2mg Fe，2.4mg Zn，360μg Cu，0.66mg Mn，0.20mg F，20μg Mo，23μg Se，13μg Cr，27μg I)
-维生素(维生素A 127μg RE；前β类胡萝卜素73μg RE；0.8mg 类胡萝卜素，1.4μg维生素D，5.0μg α-TE维生素A，0.30mg硫胺素， 0.32mg核黄素，3.6mg NE烟酸，1.1mg泛酸，0.35mg维生素B6，53μg 叶酸，0.50μg维生素B12，8.0μg生物素，40mg维生素C)
-胆碱74mg。
2.基于牛奶的粉末；85g包装于小袋中；待与240ml液体例如牛 奶，酸奶或果汁混合；
每100g粉末含有：
-1×1010cfu TD2
-4.7g蛋白质
-68.2g碳水化合物(糖25g)
-24.7g脂肪
-矿物质(140mg Na，570mg K，130mg Ca，400mg P，14mg Mg)。
参考文献
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比利时微生物协调保藏中心-BCCM
LMG保藏
表格BCCM/LMG/BP/4/......03-167的第1页......原始保藏的收据
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约 在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCM/LMG根据细则7.1
             出具的原始保藏的收据
        国际表格BCCM/LMG/BP/4/......03-167
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地址                    Eerste Stationsstraat 186
                        NL-2712 HM Zoetemeer
                        The Netherlands(荷兰)
I.微生物的标识
I.1.保藏人给予的标识参考号  NumRes6
I.2.国际保藏机构给予的保藏号   LMG P-22110
比利时微生物协调保藏中心-BCCM
LMG保藏
表格BCCM/LMG/BP/4/......03-167的第2页......原始保藏的收据
II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有：
(用叉标记所应用的格子)
科学描述
□    建议的分类学命名
III.收到和受理
国际保藏机构接受以上I中标识的微生物，其接收于：
安全保藏中心的原始保藏日期：    2000年11月23日
请求转换的日期：                2003年11月17日
IV.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCCM)
Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling (LMG)
Universlteit Gent(根特大学)
K.L.Ledeganckstraat 35
B-9000Gent，Belgium(根特，比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
            D.Janssens，curator IDA
日期：                           2003年11月25日