用于诱导饱腹感和/或饱食的益生菌 |
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| 申请号 | CN200780100798.5 | 申请日 | 2007-07-25 | 公开(公告)号 | CN101808527A | 公开(公告)日 | 2010-08-18 |
| 申请人 | 康必奶荷兰控股有限公司; 丹尼斯科公司; | 发明人 | 马尔塔·兹齐斯拉瓦·科尔钦斯卡; 沃特·赫尔曼·诺德曼; 亚瑟·康斯坦丁·奥乌汉德; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及营养和医药领域。本发明提供了用于诱导或增强饱腹感和饱食以及用于 治疗 或 预防 肥胖、超重和超重相关 疾病 的组合物、细菌菌株和方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于诱导或增强饱腹感和/或饱食的感觉的组合物，包含至少一种细菌菌株或从培养所述细菌菌株获得的无细胞培养基，所述菌株属于乳酸菌(LAB)，并且其中所述细菌菌株或所述无细胞培养基在利用细胞系STC-1的体外细胞系测定中刺激缩胆囊素(CCK)的产生。 |
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| 说明书全文 | 用于诱导饱腹感和/或饱食的益生菌发明领域 [0001] 本发明涉及营养领域，特别涉及新益生菌株、包含至少一种新益生菌株或者包含可从至少一种这些菌株的培养基(特别是发酵培养基)获得的无细胞培养基的组合物以及用于制备和/或使用这类组合物和/或菌株和/或无细胞培养基的方法。所述组合物适合用于诱导饱腹感和/或饱食，因此，该组合物适合用于导致体重减轻和/或预防和/或治疗体重增加和超重相关的疾病，例如肥胖和相关的心脏疾病。 [0002] 发明背景 [0003] 已知诸如FabulessTM(DSM)和PinnoThinTM(Lipid Nutrition)的天然脂肪制剂在消化时具有饱食效果。PinnoThin含有源自红松果树(Korean pinenut tree)((阔叶红松)Pinus koraiensis)的种子的多不饱和脂肪酸皮诺敛酸(pinolenic acid)，该多不饱和脂肪酸增强食欲抑制激素(胰高血糖素样肽-1)GLP-1和缩胆囊素(CCK)的表达。这些激素与饱腹感、饱食的现象有关。(参考文献：C.de Graaf et al，Am.J.Clin Nutr(2004)79：TM 946-61)。Fabuless 含有棕榈油和燕麦油，并且在消化时，身体在相对晚期的消化过程中，识别相对高水平的未消化的脂肪，从而抑制或延迟饥饿信号。 [0004] 因此，诸如脂肪的某些大量营养物增强了饱腹感激素的分泌，例如CCK和GLP-1。CCK在脂肪和蛋白的存在下，在十二指肠中被释放。肠L-细胞对碳水化合物和脂肪作出反应而释放GLP-1，尽管中枢神经系统也可以刺激GLP-1的分泌。激素GLP-1和蛋白肽Y(PYY)(这两者都是由小肠和大肠的肠内分泌L-细胞分泌的)可以在“回肠中断”机制中起作用，并且与胃肠分泌和活动性的控制有关。激素生长激素释放肽是在胃的底部产生的，并且其合成能够被碳水化合物所抑制，从而减少饥饿感。 [0005] WO2007/043933描述了三种公知的益生菌株(干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)F 19-LMG P-17806；嗜酸乳杆菌(Lactobscillusacidophilus)NCFB 1748和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Bb12 DSM10140)在影响脂肪代谢和肥胖中的用途。基于设计为鉴定调节饱腹感和/或饱食的菌株的功能性测定没有鉴定这些公知的益生菌株，但是该菌株看起来由于它们对体重减轻的作用而被选择，所述体重减轻为与胆固醇降低有关的人体试验中的次级参数。此外，向酸化乳中添加所述菌株，即，向最终测试产品中添加，而不让发酵发生。而且，本发明涉及菌株，该菌株直接调节饱腹感激素水平的诱导，因此非常有效地增强进食(consumption)后的饱腹感和/或饱食。 [0006] 本领域仍需鉴定能够导致摄食量或采食量的显著减少、并且有效地明显减少摄食量或采食量的LAB和LAB衍生的代谢产物。这些LAB、LAB衍生的代谢产物和包含LAB、LAB衍生的代谢产物的组合物能够用于治疗和/或预防体重增加、肥胖、超重相关的疾病(心脏疾病、中风、糖尿病等)并且使得体重减轻。 [0007] 定义 [0008] “乳酸菌”(LAB)和“产乳酸菌”在本文中互换地使用，并且意指产生乳酸或其它有机酸(例如，丙酸)作为发酵终产物的益生细菌，例如但不限于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的细菌。 [0009] “益生菌”或“益生菌株”意指细菌的菌株，其被个体消化时对宿主具有有益的作用并且通常被认为对人是安全的(GRAS)。 [0010] “上清液”是通过诸如过滤或离心的技术，从培养基(例如优选的发酵液)除去细菌细胞后可获得的无细胞培养基。可以在使用前将该上清液分级或浓缩。此后，“上清液”将等同地称为“无细胞培养基”。 [0011] “发酵培养基”和“发酵液”在本文中互换地使用，并且取决于上下文意指向其中添加所述细菌菌株的培养基(即，没有菌株的培养基)或通过添加的细菌发酵期间和/或之后的培养基(肉汤)(即，包括发酵产物)。从上下文将清楚该术语的含义。 [0012] 本文的“个体”意指人或非人的动物，特别是脊椎动物。 [0013] “调节食物摄入”或“减少食物摄入”意指由于饱腹感和/或饱食而显著地减少食物的摄入。 [0014] “饱腹感”或“增强的饱腹感”意指进食后延长的满足(fullness)感和至下一次进食前延长的时间段。 [0015] “饱食”或“增强的饱食”意指由于提早的满足感而提早结束的进食。 [0016] “饱腹感有关的激素”或“饱腹感激素”意指当诱导或抑制时，对饱腹感和/或饱食有作用的激素，例如但不限于CCK和/或GLP-1、铃蟾肽、促生长素抑制素、胰岛素、瘦蛋白、葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)、生长激素释放肽、肽YY(PYY)、肠抑素。 [0017] “激素诱导”意指诸如GLP-1和/或CCK水平的胃肠激素合成的诱导(刺激)，其能够在血浆和/或在体外细胞系测定中进行测量。 [0018] “激素抑制”意指诸如生长激素释放肽水平的胃肠激素合成的减少，其能够在血浆和/或在体外细胞系测定中进行测量。 [0019] “体外细胞系”和“体外细胞系测定”意指使用能够产生诸如CCK和/或GLP-1的胃肠激素的细胞系培养物、特别是哺乳动物细胞系来鉴定益生菌株和/或确定益生菌株导致激素诱导和/或抑制的能力的功能性。 [0020] “代谢”是发生在活细胞中的化学反应。“代谢产物”是代谢所产生的分子，在本文中包括在分解代谢反应(产生能量的反应)和合成代谢反应(利用能量的反应)中产生的代谢产物。因此，代谢产物还包括细胞培养基(例如，无细胞培养基)中的化合物，例如培养基/生长培养基/生长环境的一种或多种组分的降解产物或细菌细胞合成的特定组分。 [0021] “百分比”或“平均”通常意指重量平均百分比，除非另外指明或清楚地表明了另一基础。 [0022] 术语“包括”被解释为指明所述部分、步骤或组分的存在，但是不排除一种或多种额外部分、步骤或组分的存在。 [0023] 术语“a(冠词)”或“an(冠词)”不限制为一种/个，而是被解释为至少一种/个。 [0024] 发明详述 [0025] 本发明人发现，体外细胞系测定能够有效地用于鉴定和/或分离在人和/或哺乳动物个体中显著地诱导饱腹感和/或饱食的(益生)细菌菌株。通过在体外细胞系测定中筛选能够刺激诸如CCK和/或GLP-1的胃肠饱腹感激素产生的菌株，能够鉴定能够诱导诸如CCK和/或GLP-1的胃肠饱腹感激素产生的菌株。不作为对本发明的限制，据信所述菌株通过在体内刺激胃肠饱腹感激素的产生(之前摄取合适量的包含一种或多种这类菌株的组合物和/或合适量的从培养一种或多种这类菌株获得的/可获得的无细胞培养基、特别是从在发酵条件下培养所述菌株获得/可获得的无细胞培养基)，来诱导(或者显著增强或刺激)饱腹感和/或饱食的感觉。 [0026] 本发明的筛选方法 [0027] 在一实施方案中，提供了用于鉴定和/或分离能够诱导或增强饱腹感和/或饱食的细菌的方法，该方法包括下述步骤： [0028] (a)在培养基上培养一种或多种细菌菌株， [0029] (b)收集(a)的细菌细胞和/或细菌细胞与培养基和/或无细胞培养基，[0030] (c)向哺乳动物细胞系培养物中添加该细菌细胞和/或细菌细胞与培养基和/或无细胞培养基， [0031] (d)在(c)的添加后，分析该细胞系所产生的饱腹感激素(例如，GLP-1和/或CCK)的量，并且 [0032] (e)鉴定与对照(未处理的哺乳动物细胞系、用对照样品处理的哺乳动物细胞系，例如只有缓冲液或没有细菌的另一培养基)相比，用细菌细胞和/或细菌细胞与培养基和/或无细胞培养基处理后，(直接地或通过培养基或存在于培养基中的代谢产物间接地)产生了(优选显著地)较大量的饱腹感激素(例如，GLP-1和/或CCK)的细菌菌株，以及[0033] (f)任选地，将所鉴定的细菌菌株和/或细菌细胞与培养基和/或从培养所鉴定的菌株获得的/可获得的无细胞培养基，用于制备用于减少食物摄入、诱导和/或增强饱腹感和/或饱食、治疗或预防肥胖和/或用于导致体重减轻的组合物。 [0034] 在步骤(a)中可以使用任何细菌菌株，但是优选菌株是益生菌株，更优选地使用属于LAB的菌株。优选地，所述培养基优选是其上能够发生生长和/或发酵的培养基(发酵培养基)，例如基于乳制品或基于乳的培养基(例如，脱脂乳等)，或植物来源的“乳”(例如，豆奶)，尽管其它培养基也是合适的。因此，允许产生诸如乳酸和/或其它有机酸的发酵产物的基质应当是可用的。培养条件(发酵时间)应当允许发酵过程发生，即，如本领域所公知的，相应地选择孵育时间和温度等。通常的发酵时间是几小时至几天。由于有机酸的产生，发酵期间的pH下降。任选地，可以在发酵末期调整pH，例如通过另外添加的一种或多种有机酸(例如，乳酸)或pH缓冲物质。任选地，可以向所述发酵培养基补充益生素、蛋白水解产物(例如，酪蛋白氨基酸)、蛋白胨、矿物质、维生素、酵母提取物等。 [0035] 在步骤(b)中收集所述细菌细胞和/或培养基与细菌细胞。能够通过例如离心和/或过滤和/或浓缩来进行收集，并且能够在处理哺乳动物细胞系培养物的合适缓冲液中再悬浮所述细胞(和/或培养基与细胞)(在步骤(c)中)。优选地，将所述细菌细胞稀释至合适的浓度，例如对哺乳动物细胞系本身没有负作用的浓度。稀释系列能够用于检测最合适的细胞浓度(CFU)。可以在使用前任选地洗涤所述细菌细胞(例如，除去全部培养基)，但是在一实施方案中，优选地，在收集后和再悬浮前或与哺乳动物细胞系接触前，不洗涤收集的细菌细胞。因此，在一实施方案中，将所述细胞收集(例如，通过离心和/或过滤和/或浓缩)，并直接用于制备悬浮液或稀释液，然后使该细胞与哺乳动物细胞系接触。 [0036] 可选择地，将通过例如通过离心或过滤而除去(全部或基本上全部)细菌细胞获得的无细胞培养基或其获得的一种或多种部分收集并用于(c)中。为了鉴定所述无细胞培养基的哪种组分(例如，哪种代谢产物)能够刺激饱腹感激素的产生(例如，GLP-1和/或CCK的产生)，可以使用该无细胞培养基的部分纯化的或基本上纯化的部分。然后能够将保留饱腹感激素诱导活性的部分最终用于鉴定一种或多种具有饱腹感激素诱导活性的具体组分。 [0037] 另一替代选择是使用细菌细胞和培养基(例如，发酵液)本身的组合，其任选地经浓缩或稀释。 [0038] 在步骤(c)中，进行体外测定来检测所述细菌细胞和/或细菌细胞与培养基和/或无细胞培养基(或其部分)是否对培养中生长的哺乳动物细胞具有饱腹感激素诱导作用。本领域中能够使用的许多哺乳动物细胞系是可用的。在优选的实施方案中，例如，如McLaughlin et al.(1998)J Physiol513：11-18所述或如下述出版物所述，所用的细胞系是STC-1(来自转基因小鼠的小肠的内分泌肿瘤的原肠内分泌细胞)： [0039] Gevrey et al.Diabetologia(2004)47：926-936；Cordier-Bussat et al.Endocrinology 138：1137-1144(1997)；Hira et al.J.Biol.Chem.(2004)279(25)26082-26089；Kazmi et al.J.Physiol(2003)，553：759-773；Trinh et al.Diabetes(2003)52：425-433；Benson et al.J.Physiol.(2002)538：121-131；Wang et al.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol(2002)282：16-22；Cordier-Bussat et al.Diabetes(1998)47：1038-1045。 [0040] 其它合适的细胞系包括例如，细胞系GLUTag(来自转基因小鼠的大肠的肠内分泌肿瘤细胞系)(参见，Brubaker et al.Endocrinology(1998)139：4108-4114，1998；Reimann et al.Diabetologia(2004)47：1592-1601；Reimann et al.J Physiol(2005)563：161-175；Reimann et al.J Physiol(2005)569)：761-772；Anini et al.Diabetes.(2003)52：252-259； 和 Reimann et al.Diabetes(2002)51：2757-63，)、NCI-H716(人肠细胞 系)(参见，Anini et al.Endocrinology(2003)144：3244-3250； Cao et al.Endocrinology(2003)144：2025-2033；Anini et al.Diabetes(2003)52： 252-259；Reimer et al.Endocrinology(2001)142：4522-4528)、FRIC( 大 鼠 胎 儿 肠细 胞 系 )( 参 见，Brubaker et al.Endocrinology.(1991)129：3351-8；和 Anini et al.Endocrinology(2002)143：2420-2426)、分离的犬L-细胞(参见，Damholt etal.Endocrinology(1998)139：2085-2091)、Caco-2细胞(参见，Hyae GyeongCheon Biochem Pharmacol.(2005)70：22-29)以及其它。技术人员能够鉴定能够产生一种或多种饱腹感激素的合适细胞系，例如GLP-1和/或CCK(基础水平和/或诱导后)。 [0041] 能够以各种方式进行步骤(d)。例如，能够利用例如ELISA(即，利用基于抗体的筛选来检测蛋白)或其它方法来鉴定和任选地定量如GLP-1和/或CCK蛋白(或“肽”，其在本文中互换地使用来意指氨基酸链)的激素。可选择地，能够利用本领域已知的方法来分析基因表达(mRNA转录)，所述方法例如定量RT-PCR或其它分子生物学方法。人GLP-1肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1(hdeferhaeg tftsdvssyl egqaakefia wlvkgrg)，参见GenBank登录号P01275。小鼠的同系物与人的肽相同，参见GenBankP55095。大鼠CCK蛋白前体的登录号是P01355(SEQ ID NO：2，mkcgvclcvv mavlaagala qpvvpveavd pmeqraeeap rrqlravlrp dseprarlgallaryiqqvr kapsgrmsvl knlqgldpsh risdrdymgw mdfgrrsaed yeyps)并且小鼠的登录号是P09240(SEQ ID NO：3，mksgvclcvv mavlaagala qpvvpaeatdpveqraeeap rrqlravlrp dreprarlga llaryiqqvr kapsgrmsvl knlqsldpshrisdrdymgw mdfgrrsaed yeyps)。 [0042] 因此蛋白和cDNA序列在本领域都是可用的，能够检测所述蛋白(或其同系物，例如包括与SEQ ID NO：1、2或3的至少80％、90％、95％、98％或更高的氨基酸序列一致性的蛋白，所述一致性的确定利用例如，诸如EmbossWin的程序“needle”或“water”的双序列比对(pairwisealignment)，并且空位开放罚分10.0，空位延伸罚分0.5，利用Blosum62取代矩阵)的抗体和检测诸如GLP-1和/或CCK蛋白的饱腹感激素的相对或绝对水平的方法也是可用的。还参见上文关于合适的哺乳动物细胞系的参考文献，该参考文献还测量了用例如蛋白胨、脂肪酸或其它试剂刺激后的GLP-1和/或CCK的释放。 [0043] 将处理后产生的诸如GLP-1和/或CCK转录物(mRNA或相应的cDNA)的饱腹感激素和/或蛋白的相对或绝对量与合适的对照进行比较，来确定所述处理是否诱导了转录和蛋白的产生。合适的对照包括，例如，i)未处理的哺乳动物细胞(用于测定例如，GLP-1和/或CCK的基础水平)，ii)用缺乏所述细菌细胞和/或缺乏所述细菌细胞与培养基和/或缺乏所述无细胞培养基的缓冲液处理的哺乳动物细胞，或者iii)用对照培养基(例如，用例如乳酸酸化的脱脂乳)处理的哺乳动物细胞。 [0044] 任选地，步骤(e)使用统计学分析来鉴定这些细菌菌株，与对照相比，该菌株导致(直接或通过培养基间接地，例如，通过存在于培养基中的一种或多种代谢产物)显著增加的诸如GLP-1和/或CCK的一种或多种饱腹感激素的产生。本文的“显著增加”意指至少1.5x的所述对照中产生的量，优选至少2x、3x、4x、5x、6x或更多所述对照中产生的量。 [0045] 若需要，能够重复各种步骤。例如，可以使用两种或更多种细菌细胞培养物和/或细菌细胞与培养基和/或无细胞培养基(或其各种部分)的混合物来检测该混合物的饱腹感激素诱导活性。此外，可以在处理后检测不同的哺乳动物细胞系的如GLP-1和/或CCK的饱腹感激素的诱导。 [0046] 通过上文的方法获得的菌株也是本发明的实施方案，包含一种或多种这类菌株(具有或不具有培养基，例如发酵培养基)的组合物和/或包含一种或多种诸如发酵培养基(或其部分)的这类菌株的无细胞培养基(或其部分)的组合物也是本发明的实施方案。 [0047] 步骤(f)是任选的，并且使用所鉴定的细菌菌株和/或细菌细胞与培养基和/或从培养所鉴定的菌株获得/可获得的无细胞培养基来制备组合物。开始，可以制备包含这些中的一种或多种的组合物，并将该组合物饲喂给诸如大鼠的动物来验证体内的饱腹感和/或饱食诱导作用，优选地，随后进行人体试验。优选地，在摄取后减少摄食量/采食量。与对照食物/喂食相比，所述作用可以被视为提早的进食终止和/或进食/饲喂之间更长的间隔。所述作用还被视为有下一次进食欲望前延长的时间段。与对照食物/喂食组合物相比，利用包含所述细菌和/或包含所述细菌与培养基和/或包含无细胞培养基(优选作为发酵结果的培养基)的食物/喂食组合物的延长时间段的食物摄取/饲喂也可以导致较轻的体重。 [0048] 在人个体中，还能够利用如本领域公知的，例如直观模拟量表(VisualAnalogue Scale，VAS)(参见例如Luscombe-Marsh et al.，Am.J.Clin.Nutr.(2005)81：762-772或Moran et al.，J.Clin.Endocrinol.Metabol.(2005)90：5205-5211)来评价在所述组合物的摄取前和所述组合物的摄取后某些时间间隔时的主观评定(例如，主观饥饿、满足、饱腹感、食欲等)。询问个体以在极端(例如，饥饿或不饥饿)之间的每级做标记，来表明他们在那个时间的感觉。然后定量从基线的评定的变化。 [0049] 本发明的菌株和培养基 [0050] 在一实施方案中，本发明提供人和/或动物个体给药(例如，摄取)后，能够刺激饱腹感和/或饱食的(益生)菌株。 [0051] 优选地，所用的细菌菌株是产乳酸或产诸如丙酸的其它有机酸的益生菌，并且优选地属于乳杆菌属。双歧杆菌属或丙酸杆菌属的细菌也是优选的。所述细菌应当是食品等级的，即，它们在被人或动物个体摄取时，应当被考虑为无害的。应当理解，非食品等级的细菌，例如被修饰从而在被个体摄取时不再有害的病原菌也被包括在本发明的范围内。 [0052] 优选地，所述菌株属于乳杆菌属。该乳杆菌属菌株可以属于下述物种：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、戴尔布吕克氏乳杆菌(L.delbrueckii)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、米酒乳杆菌(L.sakei)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、旧金山乳杆菌(L.sanfransiscensis)、食果糖乳杆菌(L.fructivorans)、高加索酸奶乳杆菌(L.kefiri)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、类植物乳杆菌(L.paraplantarum)、高加索酸奶粒乳杆菌(L.kefirgranum)、类高加索酸奶乳杆菌(L.parakefir)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、胚芽乳杆菌(L.plantarum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、木糖乳杆菌(L.xylosus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)等。优选的物种是戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii ssp bulgaricus)、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、食果糖乳杆菌、唾液乳杆菌、弯曲乳杆菌和米酒乳杆菌等。 [0053] 能够生物化学地或通过DNA测序(例如，保守区域)或通过诸如脉冲场凝胶电泳的本领域已知的方法来确定微生物的物种身份。通常，如果细菌菌株在16S rRNA区域中表现出至少97％的核酸序列一致性(例如，通过例如，利用默认参数的程序GAP或BESTFIT的最佳比对时)，则它们属于相同的物种。 [0054] 所述细菌菌株能够在体外细胞系测定和/或在个体体内刺激诸如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和/或缩胆囊素(CCK)的饱腹感激素的产生和/或释放。在体外细胞系测定中，能够如上文所述地检测诱导饱腹感激素(例如，GLP-1和/或CCK)产生的能力。在人或哺乳动物的体内试验中，能够通过测量给药或摄取所述菌株或包含本发明的一种或多种菌株和/或本发明的无细胞培养基(或其部分)的组合物前和之后的一个或多个时间点时的这些蛋白的血浆水平，来比较诸如GLP-1和/或CCK的饱腹感激素的产生/诱导。如上文所述，所述菌株的特征在于，它们能够(直接或通过培养基间接地)导致相对于对照处理和/或基础水平产生的显著增加的激素产生、特别是GLP-1和/或CCK的产生。 [0055] 当然，所述菌株的特征还在于它们对个体的饱腹感和/或饱食作用。因此，能够利用标准方法来使一种或多种菌株生长并收获。可选择地，能够使用无细胞培养基，其可以包含一种或多种饱腹感调节代谢产物。能够在诸如缓冲液、水、食材(例如，脱脂乳等)的合适介质中制备所述细菌细胞和/或所述无细胞培养基(或其部分)的各种稀释液，来制备测试组合物。能够利用优选地允许进行合适的统计学分析的实验设置(例如，双盲、安慰剂对照试验)来向测试动物和/或人个体给药这些测试组合物(优选口服)。能够通过评分例如下一次进食前的满足的时间段来确定所述测试组合物对饱腹感的作用。如果满足感的时间段显著地长于对照，例如，至少长1％、2％、3％、5％、10％、20％或更长，则观察到了饱腹感作用。另外或可选择地，能够通过测量进食含有活性成分(例如该测试组合物)的产品后某时间段(例如4小时)后的进食期间消耗的食物的量(直到达到令人愉快的满足感)来确定所述饱腹感作用。如果消耗的热量比食用不含所述活性成分的对照产品后消耗的热量低至少1％、2％、3％、4％、5％或10％或15％(或更高的值)，则观察到了饱腹感作用。 [0056] 能够通过评分进食终止的时间点来确定对饱食的作用。如果进食终止时消耗的热量显著地低于对照中消耗的热量，例如至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％或更多，则观察到了饱食作用。在更长的时间段内(例如，1、2、3、4、5周或更长)，还可以评分与对照饮食相比的体重减轻或体重变化。与对照个体相比，给予了规律量的测试组合物(例如，每天一次、每天两次或更多)的个体的体重优选地被显著地控制了(减轻或较少地增加)。 [0057] 在优选的实施方案中，提供了下述的菌株(及其复制物或衍生物)和包含这些中的一种或多种的组合物和/或包含从生长这些中的一种或多种(例如，在发酵条件下)获得/可获得的培养基的组合物：荷兰CampinaNederland BV在皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureauvoor Schimmelcultures)(CBS，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，TheNetherlands)，于2007年7月5日保藏的嗜酸乳杆菌MUH 41、戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH 192、干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus casei ssp paracasei)MUH 142、戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH 190，并且指定的保藏号是CBS 121540(嗜酸乳杆菌MUH 41)、CBS 121543(戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH192)、CBS 121541(干酪乳杆菌副干酪亚种MUH 142)和CBS 121542(戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH 190)；Rhodia Chimie，France在美国典型微生物保藏中心(American Type Culture Collection)，于2002年11月15日保藏为PTA-4797的嗜酸乳杆菌NCFM； Rhodia Chimie，France在美国典型微生物保藏中心，于2002年11月15日保藏为PTA-4800的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)33；Danisco Niebüll GmbH在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and ZellkulturenGmbH)于 2003年7月23日保藏为DSM 15794的唾液乳杆菌1502，DaniscoNiebüll GmbH在德国微生物菌种保藏中心于2003年7月23日保藏为DSM 15793的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)853；以及Danisco A/S在在德国微生物菌种保藏中心，于2003年9月2日保藏为DSM 15889的米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)570。这些菌株和/或它们的衍生物和/或它们的复制物(和/或从培养这些而可获得的培养基)适合用于制备减少摄食量/采食量的组合物。 [0058] 应当理解，本发明包括本发明的所述保藏的菌株或任何其它菌株的复制物和/或衍生物。术语“复制物”意指生物学物质，其代表所述材料基本上未被修饰的拷贝，例如通过微生物生长产生的材料，所述生长例如培养基中细菌的生长。术语“衍生物”意指从生物学材料创造的物质，其被实质上修饰而具有新的性质，例如，通过遗传材料中可遗传的改变所导致的那些。如本领域中公知的，这些变化能够自发地发生或者是应用的化学和/或物理试剂(例如，诱变剂)和/或重组DNA技术的结果。当涉及“衍生”自其它菌株的菌株时，应当理解，既包括了该菌株的“复制物”又包括了该菌株的“衍生物”，只要所述衍生的菌株仍然保留减少摄食量/采食量的作用。 [0059] 在一实施方案中，所述菌株不是选自干酪乳杆菌F19-LMG P-17806、嗜酸乳杆菌NCFB 1748和乳双歧杆菌Bb-12 DSM 10140的菌株。 [0060] 本发明的组合物 [0061] 本发明还提供包含饱食和/饱腹感诱导量的一种或多种细菌菌株和/或细菌细胞与优选地发酵后的培养基和/或其衍生的无细胞培养基的组合物。 [0062] 当本文中涉及“上清液”或“培养上清液”或“无细胞培养基”，应当清楚，优选地，繁殖(生长/培养)了此处优选乳酸菌的细菌的培养基意指发酵培养基，但是在例如发酵后，再次从该培养基中除去了全部(100％)或基本上全部(＞90％，优选地＞95％或＞99％)细菌。因此，这个定义包括无细胞培养基(即，例如，通过离心、过滤或其它方式从其中除去了全部或基本上全部所述菌株的细菌细胞的培养基)或这类无细胞培养基的部分。任选地，可以以杀死任何潜在地残留的细菌细胞的方式处理所述无细胞培养基。 [0063] 本发明的各种发酵培养基是适合的，例如(但不限于)，首先例如生长了所述菌株的工业培养基，并且该工业培养基被直接使用或浓缩(例如，干燥)后使用或添加至其它食物基质或产品(例如酸乳和/或奶)后使用，其次或乳或基于乳或包含乳的培养基，如添加了维生素和/或蛋白胨和/或矿物质的乳，其中所述菌株单独地或与其它LAB联合地生长，并且该培养基被直接地使用或浓缩(例如，干燥)后使用或与其它食物基质或产品(例如水果制品)组合后使用。 [0064] 可选择地，可以使用细菌细胞或细菌细胞与培养基(例如，所述发酵液)或这种包含细胞的培养基(即，具有所述菌株的培养基)的部分。所述细胞或所述包含细胞的培养基还可以包含所述菌株的活的或存活的细菌细胞和/或死的或未存活的细菌细胞。因此，可以通过，但不限于加热或超声处理以杀死所述菌株的部分或全部细菌来处理所述培养基。 [0065] 本文还包括了冷冻干燥的或冷冻的细菌和/或无细胞培养基(其可以被浓缩)。 [0066] 包含一种或多种细菌菌株本身和/或细菌细胞与培养基和/或一种或多种无细胞培养基(或其部分)的组合物包括药物组合物、完全的食品组合物或饲料组合物、食品或饲料补充剂、营养组合物等。可以在所述组合物的制备过程中的任何时间添加所述菌株(本身或与培养基)和/或无细胞培养基，例如，可以在制备过程的开始向食物基质中添加它们，或者可以向最终食物产品中添加它们。“食物”意指液体、固体或半固体饮食组合物，特别是全食物组合物(食物替代物)，其不需要额外的营养摄入或者食物补充剂组合物。食物补充剂组合物不完全地代替其它方式的营养摄入。优选实施方案的食物组合物和食物补充剂组合物是发酵的乳制品或基于乳品的产品，其被优选地给药或肠内摄取，优选每天口服一次或多次。 [0067] 可选择地，食物组合物和/或食物补充剂组合物可以是非乳制品或乳品非发酵的产品(例如，非发酵的乳或另外的食物培养基中的菌株或无细胞培养基)。 [0068] 在另一实施方案中，能够将菌株或无细胞培养基包囊并分散于食物(例如，在乳中)或非食物培养基中。 [0069] 能够利用本发明的细菌在制备过程中直接制备发酵的乳制品，其通过例如，利用本身已知的方法向食物基质中添加。在这些方法中，除了常用的微生物以外，还可以使用本发明的菌株和/或本发明的菌株可以代替常用的微生物的一个或多个或部分。例如，在诸如酸乳或基于酸乳的饮料的发酵乳制品的制备中，可以将本发明的细菌添加至促酵物培养物或用作促酵物培养物的部分，或者可以在这种发酵期间合适地添加本发明的细菌。任选地，可以在制备过程的晚期灭活或杀死所述细菌。 [0070] 发酵的乳制品包括基于乳的产品，例如(但不限于)甜品、酸乳、酸乳饮品、凝乳酪(quark)、牛乳汽酒(kefir)、基于发酵乳的饮品、酪乳、奶酪、调料、低脂涂抹食品、新鲜奶酪、基于大豆的饮品、冰激凌等。非发酵的乳制品可以包括冰激凌、营养棒(nutritional bar)和调料等。非乳制品可以包括粉末冲泡饮料(powdered beverage)和营养棒等。可以利用已知的方法来制备所述产品，例如向诸如已知的脱脂乳或乳或基于乳的组合物和发酵物的食品基质中添加有效量的所述菌株和/或所述无细胞培养基。可以向其中添加所述细菌细胞和/或所述无细胞培养基(包含所述细菌细胞和/或所述无细胞培养基的组合物)的其它食物基质是肉、肉替代物或植物基质。 [0071] 所述组合物可以是固体、半固体或液体的。所述组合物可以是食物产品或食物补充剂的形式，例如，片剂、凝胶、粉末、胶囊、饮品、棒等的形式。 [0072] 所述组合物包含有效量的细菌细胞和/或无细胞培养基，从而所述有效量是适合实现饱腹感和/或饱食作用(与给药方案联合)的量。该有效量可以变化，但是能够容易6 6 12 地被技术人员确定。合适的范围包括每天至少约1x10cfu，优选每天约1x10-1x10 cfu(菌 7 11 8 10 落形成单位)，更优选约1x10-1x10 cfu/天，更优选约1x10-5x10 cfu/天，最优选 9 10 1x10-2x10 cfu/天，和/或从培养物生长至所述水平的无细胞培养基(浓缩的或非浓缩的)。 [0073] 应当理解，营养组合物优选地包含适合人和/或动物食用的碳水化合物和/或蛋白质和/或脂类。所述组合物可以含有或不含有其它生物活性成分，例如其它(益生)菌株和支持该益生菌株的益生素。在优选的实施方案中，所述食物组合物或饲料组合物的热量低，即，该食物组合物或饲料组合物适合减食疗法或减轻体重或体重控制。优选地，该组合物包含少量的脂肪或不含脂肪。该组合物还包含少量的蛋白质和/或碳水化合物，或不含蛋白质和/或碳水化合物。 [0074] 食物补充剂可以包含一种或多种载体、稳定剂、益生素等。当利用所述菌株的活的或存活的细胞时，该细胞可以以包囊的形式存在从而保护该细胞免受胃的伤害。例如，所述组合物可以是包装于能够溶解于水、果汁、乳或其它饮料中的小药囊中的粉末的形式。 [0075] 合适剂量的细菌菌株和/或无细胞培养基还可以用于制备用于、肥胖、超重和超重相关的疾病的治疗、疗法或预防的药物组合物。药物组合物通常用于肠(例如，口服)或鼻/吸入给药。除了本发明的菌株以外，药物组合物通常包含药物载体。优选形式取决于给药和(治疗)应用的预期模式。所述药物载体能够是适合将所述菌株递送至诸如个体的肠的期望体腔的、任何相容的无毒物质。例如，无菌水或惰性固体可以用作所述载体，该载体通常补充了药物可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等。药物组合物还可以包含另外的生物活性或药物活性成分。 [0076] 食物组合物、食物补充剂组合物、营养组合物或药物组合物是诸如所述菌株的稳定的悬浮液的液体形式的，或者诸如粉末的固体形式的，或者半固体形式或无细胞培养基形式的。例如，对于口服给药，能够以诸如胶囊剂、片剂和粉剂的固体剂型给药所述菌株或无细胞培养基，或者以诸如酏剂、糖浆和悬浮液的液体剂型给药所述菌株或无细胞培养基。能够将所述菌株或无细胞培养基与无活性成分和粉末载体共同包囊在明胶胶囊中，所述载体例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。所述组合物可以包含另外的组分，例如蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、其它生物活性或药物活性化合物、载体、稳定剂、调味剂、其它益生菌株、益生素等。 [0077] 本发明还提供了容器，该容器包含如上文所述的本发明的组合物。这种容器可以是装有1-100、和诸如1、5、10、20、30、40、50、100的1至100的每个单个值或更多剂量的包装，其以片剂、胶囊剂、粉剂、安瓿剂、小药囊等形式。同样地，包装可以装有1至200、1至500或更多的剂量。当共给药不同的菌株和/或无细胞培养基(包含不同菌株和/或无细胞培养基的组合物)时，应当理解，容器可以含有每种包含菌株和/或无细胞培养基的组合物的单独剂量。优选地，该容器包括在其外面表明所述组合物的有益效果或健康效果的书面标签。例如，所述容器可以表明，所述组合物“用于减食疗法”、“用于体重减轻”、“用于体重控制”等。所述容器可以是纸板、玻璃、塑料、金属等的。如果所述组合物是液体或粉末形式，则所述容器还可以包括适合给药所述组合物的工具。另外，所述容器可以包括用途的书面指导。 [0078] 本发明的用途 [0079] 本文提供了本发明的一种或多种菌株、衍生自这些菌株的一种或多种无细胞培养基和/或包含这些的组合物，在制备用于治疗、控制和/或预防肥胖、超重和超重相关疾病的药物和/或营养(食物或食物补充剂)组合物中的用途。 [0080] 此外，本文提供了本发明的一种或多种菌株、衍生自这些菌株的一种或多种无细胞培养基和/或包含这些的组合物，在制备用于减少食物摄入和/或用于增强饱腹感和/或饱食的药物和/或营养(食物或食物补充剂)组合物中的用途。 [0081] 下文的非限制性实施例描述了本发明的用途和方法。除非另外指明，本发明的实施将使用分子生物学、药学、免疫学、病毒学、微生物学或生物化学的标准常规方法。下述文献中描述了这些技术：Sambrook andRussell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition(分子克隆：实验室手册，第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，inVolumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994)Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols(最新分子生物方法，最新方法)，USA andRemington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)，Microbiology：A Laboratory Manual(6thEdition)(微生物学：实验室手册(第6版))by James Cappuccino，LaboratoryMethods in Food Microbiology(3rd edition)(食品微生物学试验方法(第3版))by W.Harrigan(Author)Academic Press，所有的文献在此处通过引用被并入。实施例 [0082] 1.材料与方法 [0083] 1.196孔板中哺乳动物细胞系的制备 [0084] 在37℃和补充了5％CO2的空气气氛下，使细胞系STC-1在含有青霉素/链霉素和小牛血清的D-MEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)中生长3天至4天，直到该细胞系达到约85％的密度(每孔约500000个细胞)。将培养基除去，并将该细胞用200μl HBSS(Hanks’缓冲盐溶液)/孔洗涤。 [0085] 1.2用于体外哺乳动物细胞系测定的测试样品的制备 [0086] 使细菌菌株(参见下文)新鲜地生长于MRS培养基(Mann-Rogosa-Sharpe)中，并测定CFU(菌落形成单位)。通过离心，从所述生长培养基分离所述细菌菌株，来制备用于STC-1刺激测定的无细胞培养基。用HBSS将所述无细胞培养基1∶10地稀释，并用于STC-1刺激测定。 [0087] 利用不同的细菌菌株(参见下文)，将添加了0.5％的酪蛋白氨基酸(酸水解的酪蛋白；Becton Dickinson and Company)(以刺激细菌生长)的脱脂乳在37℃下发酵至细胞7 9 数为5x10CFU/mL至5x10CFU/mL。 [0088] 发酵时间随菌株变化，并且在达到稳定期前为约15h至约48h。 [0089] 当所述发酵乳的pH至少达到5.5时，使用所述发酵乳，然后 [0090] 1.用乳酸将pH调整至4.35，离心以使细胞成团并使蛋白凝结。将上清液收集、冷冻并保存在-80℃至用于STC-1细胞培养刺激。在用STC-1细胞培养物孵育前，将该上清液在HBSS缓冲液中稀释10倍。这种类型试验中的对照是用乳酸酸化至pH为4.35的乳或HBSS缓冲液本身。 [0091] 2.将不同最终pH的发酵乳离心以使细胞成团和并使蛋白凝结，将上清液收集、冷冻并保存在-80℃至用于STC-1细胞培养刺激。在用STC-1细胞孵育前，将该上清液在HBSS缓冲液中稀释10倍。 [0092] 将STC-1细胞培养物与发酵乳的上清液孵育后分泌的CCK水平与酸化至相当的pH的对照乳和/或HBSS缓冲液本身刺激的分泌的CCK水平比较。 [0093] 1.3STC-1细胞系培养物的CCK刺激和分泌的测试 [0094] 为了鉴定和/或分离能够刺激(通过细菌细胞或通过无细胞培养基)胃肠饱腹感激素的产生的(益生)细菌，使用了体外细胞系测定。 [0095] 向96孔板中的每个孔添加200μl的测试溶液(即，200000个细胞，因为该浓度是不给STC-1细胞或HBSS中的细菌细胞培养物上清液带来不利影响的最高浓度)，并在37℃下和5％CO2的存在下孵育2h。通过每孔的显微镜观察来检查用各种测试稀释液孵育后的STC-1细胞的“健康”状态。 [0096] 孵育后，将该测试板以1200rpm离心3min来避免所述测试样品中漂浮细胞的存在。通过可商购的ELISA试剂盒(Nuclilab，Ede，TheNetherlands)来测定所述测试样品中的CCK水平。 [0097] 所用的菌株 [0098] 使用了下述9种菌株： [0099] 嗜酸乳杆菌MUH 41(CBS 121540) [0100] 戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH 192(CBS 121543) [0101] 干酪乳杆菌副干酪亚种MUH 142(CBS 121541) [0102] 戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH 190(CBS 121542) [0103] 唾液乳杆菌1502(DSM 15794) [0104] 嗜酸乳杆菌NCFM(PTA-4797) [0105] 米酒乳杆菌570(DSM 15889) [0106] 唾液乳杆菌Ls-33(PTA-4800) [0107] 弯曲乳杆菌853(DSM 15793) [0108] 2.结果和讨论 [0109] 2.1发酵乳上清液(无细胞培养基) [0110] 将干酪乳杆菌副干酪亚种142、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)190、保加利亚乳杆菌192、嗜酸乳杆菌41、唾液乳杆菌1502、唾液乳杆菌Ls-33和嗜酸乳杆菌NCFM的上清液的pH调整至4.35，与对照乳(用乳酸酸化至pH 4.35)相比，这些上清液被刺激了更高的CCK分泌(表1)。 [0111] 表1：暴露于pH被调整至4.35的发酵乳上清液的STC-1细胞的CCK分泌[0112]基础分泌的CCK分泌％ 对照的CCK分泌％(用乳 菌株的上清液 (HBSS) 酸将乳酸化至pH 4.35) 干酪乳杆菌副干酪亚种 530 217 142 保加利亚乳杆菌190 663 271 保加利亚乳杆菌192 525 215 嗜酸乳杆菌41 807 203 唾液乳杆菌1502 624 157 嗜酸乳杆菌NCFM 976 245 唾液乳杆菌Ls-33 240 190 [0113] 以单份制备的样品 [0114] 相同菌株的上清液(但是不调整pH)也刺激了高于该pH下预期对照值的CCK分泌(表2)。 [0115] 表2：暴露于标出的pH(未用乳酸修正)的发酵乳上清液的STC-1细胞的CCK分泌 [0116]菌株 生长培养基 pH CCK(ng/mL) 保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus 乳 5.12 0.214 bulgaricus)192 嗜酸乳杆菌41 添加了酪蛋白氨基酸的乳 4.36 0.171 干酪乳杆菌副干酪亚 乳 4.56 0.146 种142 保加利亚乳杆菌190 乳 4.73 0.133 唾液乳杆菌1502 添加了酪蛋白氨基酸的乳 4.40 0.182 嗜酸乳杆菌NCFM 添加了酪蛋白氨基酸的乳 4.72 0.144 [0117] 用乳酸盐酸化的乳中的pH依赖性：CCK＝0,0836*pH-0,3002 [0118] 表3：通过生长于添加了酪蛋白氨基酸的乳中的LAB的上清液诱导的CCK。值是三个单独实验的平均值。 [0119]平均CCK 基础分泌的％(HBSS) (ng/ml) 对照乳(用乳酸酸化至 0.085 128％ pH 4.35) 保加利亚乳杆菌192 0.104 155％ 嗜酸乳杆菌41 0.194 290％ 唾液乳杆菌1502 0.155 231％ 嗜酸乳杆菌NCFM 0.150 225％ [0120] 利用MRS作为发酵培养基来代替类似测定中的乳获得了类似的结果。 [0121] 2.2培养于MRS中的米酒乳杆菌570和弯曲乳杆菌853的无细胞培养基 [0122] 表4中的数据表明，与HBSS和MRS相比，米酒乳杆菌570和弯曲乳杆菌853的无细胞培养基都强烈地刺激了CCK的分泌。 [0123] 表4：通过米酒乳杆菌570和弯曲乳杆菌853的无细胞培养基诱导的CCK(来自重复的结果) [0124]基础分泌的CCK MRS的CCK分泌 菌株 生长培养基 分泌％(HBSS) ％ 米酒乳杆菌570 MRS 410 195 弯曲乳杆菌853 MRS 300 140 [0125] 结论： [0126] 全部9种菌株的上清液(无细胞培养基)刺激了STC-1细胞中CCK的产生和分泌。 [0127] 3.人的验证实验 [0128] 在人的个体交叉试验中，以随机、双盲、安慰剂对照的方式评价了诸如嗜酸乳杆菌41的饱腹感诱导乳杆菌菌株的作用。30名志愿者(女性，年龄20至59岁，BMI 24-29kg/ 2 m)参与了这个试验。在两个时候研究每个个体，时间间隔为1周。要求所述个体在测试日的前一天晚上20:00开始禁食。 [0129] 按下述方法制备测试产品：将含有0.5％乳蛋白水解产物(DMVInternational)的脱脂乳加热至95℃，保持5min并冷却至37℃。然后将该脱脂乳用冷冻干燥的嗜酸乳杆菌8 MUH41(10cfu/ml)接种。在37℃下发酵，至pH到达5.4。添加含糖和柠檬酸的10％的草莓制剂，并添加另外的糖浆至糖的终浓度为7％，pH为4.4。将所述制剂冷却至4℃并保存在 350ml的密封烧杯中。利用葡糖酸-δ-内酯酸化含有蛋白水解产物的乳来制备安慰剂，后处理与所述测试产物相同。 [0130] 参加人(15个使用安慰剂，15个使用测试产品)在9:00h服用1烧杯酸乳。利用直观模拟量表(VAS)来测量饥饿和饱腹感分数。在12:00时，提供烤宽面条(lasagna)食物，并且要求该参加人进食至舒服地满足。与使用安慰剂的参加人相比，使用测试产品的参加人报告了较低的饥饿感并食用了较少的烤宽面条。 [0131] 对诸如嗜酸乳杆菌NCFM和唾液乳杆菌1502的其它所述菌株进行了类似的实验。 [0132] 4.基于发酵乳的产品 [0133] 4.1.用单一菌株嗜酸乳杆菌MUH41制备的产品 [0134] 参见上文的第3部分，人的验证。 [0135] 4.2.用干酪乳杆菌副干酪亚种MUH142制备的产品 [0136] 将含有0.5％乳蛋白水解产物(DMV International)的脱脂乳(加热至95℃并冷8 却至37℃后)用冷冻干燥的干酪乳杆菌副干酪亚种MUH142(10cfu/ml)接种。在37℃下发酵至pH到达5.3。添加乳酸至pH为4.4。将这种制剂以1∶1的比率与可商购的水果 0％脂肪酸乳(用乙酰舒泛和阿斯巴甜作为增甜剂)(Campina Optimel Peach)混合。 [0137] 用其它所述的单独菌株制备了类似的产品。 [0138] 4.3.戴尔布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种MUH192与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的共发酵 [0139] 在37℃下，在技术人员已知的乳清渗透物培养基上，从MUH 192制备促酵物。在pH 4.5下收获细胞，并通过离心将其浓缩20-50倍。在液氮中使浓缩的细胞悬浮液堆积(palletize)，并在使用后将其保存在低于-40℃的温度下。从乳和奶粉制成酸乳以获得5％的蛋白含量，在冷却至37℃的发酵温度前，将该酸乳在95℃下加热5分钟。将这种乳用可商购的、推荐剂量的嗜热链球菌菌株和制备的MUH192(0.05％)联合接种，然后在37℃下发酵。在pH为4.5时，将发酵停止，在20℃下，将发酵物组织(structure)并装入合适的包装中。能够通过上文所述的平板计数技术来验证所述菌株的最终细胞计数。 [0140] 用其它所述的单独菌株制备了类似的产物。 [0141] 4.4.用嗜酸乳杆菌MUH41制备的酸乳 [0142] 在37℃下，在碱性乳清渗透物培养基上，从MUH41制备促酵物。在pH 4.5下收获细胞，并通过离心将其浓缩20-50倍。在液氮中使浓缩的细胞悬浮液堆积，并在使用后将其保存在低于-40℃的温度下。从乳和奶粉制成酸乳以获得5％的蛋白含量，在冷却至37℃的发酵温度前，将该酸乳在95℃下加热5分钟。将这种乳用可商购的、推荐剂量的酸乳促酵物(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌)和制备的MUH41(0.05％)联合接种，然后在37℃下发酵。在pH为4.5时，将发酵停止，在20℃下，将发酵物组织并装入合适的包装中。 [0143] 用其它所述的菌株制备了类似或等同的乳制品，例如，用嗜酸乳杆菌NCFM和/或唾液乳杆菌1502。 [0144] 5.产品中的稳定性 [0145] 评价了酸乳类产物环境中的选择的乳杆菌菌株在冷藏条件下的存活率。 [0146] 使乳杆菌预培养物在MRS中过夜生长。将用于制备酸乳类产品的蛋白酶阳性嗜热链球菌培养物在于115℃下处理10分钟的乳中过夜预培养。以0.1％的密度接种嗜热链球菌预培养物，以及1％接种量的已冷却至37℃的巴氏消毒(85℃下5分钟)的脱脂乳(从奶粉制备)中的乳杆菌预培养物。将接种的培养物等分成每份100ml。将脱脂乳培养物在37℃下生长15小时，然后用无菌移液管搅拌，冷却至4℃并保存于冰箱中(4-6℃)。通过MRS-琼脂板上的每毫升菌落形成单位计数来测定乳杆菌培养物的密度，测量时间是生长和冷却后直接测量(时间点0)，和在冰箱中保存2、8、15和28天后。除了存活细胞的密度以外，还在相同的时间点测量了该酸乳类产物的pH。 [0147] 所述结果通常地揭示了不同乳杆菌菌株之间的明显差异。然而，MUH41、MUH142、MUH190、MUH192、嗜酸乳杆菌NCFM、唾液乳杆菌1502、唾液乳杆菌Ls 33、弯曲乳杆菌853和米酒乳杆菌570在冷藏中表现出非常好的存活率。这些菌株随时间的存活力看起来是稳定的，并且在4周的冷藏时间段里没有显著的减少或增加(多于一个对数单位)。 [0148] ATCC [0149] 10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209 电话：703-365-2700传真：703-365-2745 [0151] 国际表 [0152] 根据第7.3条出具的微生物保藏证明以及 [0154] 致：(保藏人或代理人名称及地址) [0155] Rhodia Inc [0156] Gregory Leyer收 [0157] 2802 Walton Commons West [0158] Madsion，WI 53718 [0159] 代表Rhodia Chimie，France而保藏 [0160] 保藏人标识号： 专利保藏指定[0161] 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)：NCFM PTA-4797 [0162] 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)：Lbc81 PTA-4798 [0163] 胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：Lp-115 PTA-4799 [0164] 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)：Ls-33 PTA-4800 [0165] 两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)：Bb-02 PTA-4801 [0166] 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)：Bi-07 PTA-4802 [0167] 所述保藏附有：以上说明的__科学性描述__建议的分类描述。本国际保藏机构于2002年11月15日收到所述保藏，并且所述保藏已被接受。 [0169] 如果布达佩斯条约成员国专利局证明某人有权收到该菌种，或者如果已出版引用该菌种的美国专利，且美国专利与商标局或本保藏人指示ATCC释放该菌种，那么将可获得该菌种。 [0170] 如果该培养物在所述保藏的有效期内死亡或被破坏，那么您将负有用相同的活培养物代替它们的责任。 [0171] 在自保藏日起至少30年内，或者在最近的样品请求之后5年内，该菌种将被维持，所述时间以较长者为准。美国和其他很多国家都是布达佩斯条约成员国。 [0172] 于2002年11月25日检测以上所引用培养物的存活。在当天，所述培养物是存活的。 [0173] 国际保藏机构：American Type Culture Collection(美国典型微生物保藏中心)，Manassas，VA 20110-2209USA(美国弗吉尼亚) [0174] ATCC授权代表签字： [0175] _________________ 日期：2003年1月3日 [0176] Marie Harris专利专员ATCC专利保藏中心 [0177] 抄送：Laure Berruet [0178] 为专利程序的微生物保藏 [0179] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0180] [0181] 国际表 德国微生物 [0182] Danisco Niebüll GmbH 菌种保藏中心 [0183] Busch-Johannsen Str.1 [0184] 25899 Niebüll [0185] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0186] 根据第7.1条出具的微生物保藏证明 [0187] [0188] 当第6.4条(d)可用时，该日期是要求国际保藏机构状态的日期 [0189] 表DSMZ-BP/4(单页)12/2001 [0190] 为专利程序的微生物保藏 [0191] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0192] [0193] 国际表 德国微生物 [0194] Danisco Niebüll 菌种保藏中心 [0195] Busch-Johannsen Str.1 [0196] 25899Niebüll [0197] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0198] 根据第10.2条出具的存活声明 [0199] [0200] 表明原始保藏的日期，当进行新的保藏或转移时，最近的相关日期(新保藏的日期或转移的日期) [0201] 当涉及第10.2条(a)(ii)和(iii)，意指最近的存活检测 [0202] 用叉标记可用框 [0203] 如果要求信息并且如果检测结果是阴性的，填表 [0204] 表DSMZ-BP/9(单页)12/2001 [0205] 为专利程序的微生物保藏 [0206] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0207] [0208] 国际表 德国微生物 [0209] Danisco Niebüll GmbH 菌种保藏中心 [0210] Busch-Johannsen Str.1 [0211] 25899 Niebüll [0212] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0213] 根据第7.1条出具的微生物保藏证明 [0214] [0215] 当第6.4条(d)可用时，该日期是要求国际保藏机构状态的日期 [0216] 表DSMZ-BP/4(单页)12/2001 [0217] 为专利程序的微生物保藏 [0218] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0219] [0220] 国际表 德国微生物 [0221] Danisco Niebüll GmbH 菌种保藏中心 [0222] Busch-Johannsen Str.1 [0223] 25899 Niebüll [0224] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0225] 根据第10.2条出具的存活声明 [0226] [0227] 表明原始保藏的日期，当进行新的保藏或转移时，最近的相关日期(新保藏的日期或转移的日期) [0228] 当涉及第10.2条(a)(ii)和(iii)，意指最近的存活检测 [0229] 用叉标记可用框 [0230] 如果要求信息并且如果检测结果是阴性的，填表 [0231] 表DSMZ-BP/9(单页)12/2001 [0232] 为专利程序的微生物保藏 [0233] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0234] [0235] 国际表 德国微生物 [0236] Danisco A/S 菌种保藏中心 [0237] Langebrogade 1 [0238] PO Box 17 [0239] DK-101 Copenhagen K [0240] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0241] 根据第7.1条出具的微生物保藏证明 [0242] [0243] 当第6.4条(d)可用时，该日期是要求国际保藏机构状态的日期 [0244] 表DSMZ-BP/4(单页)12/2001 [0245] 为专利程序的微生物保藏 [0246] 取得国际承认的布达佩斯条约 DSMZ [0247] [0248] 国际表 德国微生物 [0249] Danisco A/S 菌种保藏中心 [0250] Langebrogade 1 [0251] PO Box 17 [0252] DK-101 Copenhagen K [0253] 由本页末所识别的国际保藏机构 [0254] 根据第10.2条出具的存活声明 [0255] [0256] 表明原始保藏的日期，当进行新的保藏或转移时，最近的相关日期(新保藏的日期或转移的日期) [0257] 当涉及第10.2条(a)(ii)和(iii)，意指最近的存活检测 [0258] 用叉标记可用框 [0259] 如果要求信息并且如果检测结果是阴性的，填表 [0260] 表DSMZ-BP/9(单页)12/2001 |
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