[0001] 本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种牛用复合型合生元微生态制剂及其制备方法。

[0002] 微生态制剂的出现是由于人们生活水平的提高，人们逐渐认识到抗生素长期添加于饲料中可通过食物链对人类的健康造成危害。目前，我国合生元微生态制剂在动物的生产中的应用研究还较少，畜牧业动物食用添加剂中微生态制剂的使用情况还较少，人们对微生态制剂适用添加比较模糊，即混淆有针对性的添加对象，导致动物生长的效果往往低于预期效果。微生态制剂的研究应用克服了长期使用抗生素给养殖业造成的种种弊端，对发展绿色饲料添加剂具有广阔的应用前景，己被农业部列为二十一世纪重点推广技术项目。这意味着对微生态制剂的研究、推广符合我国可持续发展的总体要求。在文献“康峰，卢胜明，张海峰，安立刚，胡建武.功能性寡糖及其作用机理.实验动物科学.2011(28).”中，指出微生态制剂中的功能性寡糖是一种安全的、无毒副作用的新型绿色环保添加剂，能够改善动物肠道内的微生态环境，促进有益菌群生长，抑制病原菌的繁殖，提高动物免疫力，从而促进动物健康生长。在文献范自营.功能性低聚糖在畜牧生产中的应用.粮食与饲料工业，2000(11):32-33.”中，作者指出低聚寡糖作为抗生素的优良替代品，对于牛的生产，在提高其抗病力，降低料肉比、提高产奶率和增重方面等具有较好作用。

[0003] 现有技术的缺陷是微生态制剂中菌株的稳定性没有得到很好的保证，投给菌必须以活菌的形式通过胃到达肠道代谢，并定居在肠道内培殖，这对一般的孢子形式的细菌来说是不易做到的。再者微生态制剂没有针对性的添加对象，国内对微生态制剂的应用还不够充分，推广度不够，被养殖户接受的程度不高为了解决滥用抗生素导致越来越多的致病菌产生抗药性，药物残留，降低牛肉、牛奶产品品质以及由于食物链累积对人类身体健康带来的严重影响，生产替代抗生素的微生态制剂。

[0004] 本发明的目的在于提供一种牛用复合型合生元微生态制剂及其制备方法，旨在解决目前动物用合生元微生态制剂吸收利用率低，应用效果差的问题。

[0005] 本发明是这样实现的，一种牛用复合型合生元微生态制剂，该牛用复合型合生元微生态制剂按重量组分为牛胃肠道益生菌、低聚糖；牛胃肠道益生菌按重量比组分由鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌+乳酸杆菌和双歧杆菌组成(标准菌株均购自北京北纳创联生物技术研究院)；

[0006] 牛胃肠道益生菌为0.2-1.5g/kg，益生菌营养物质为0.5-8g/kg，低聚糖为0.1-9g/kg。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种所述牛用复合型合生元微生态制剂的制备方法，所述牛用复合型合生元微生态制剂的制备方法，具体包括：

[0008] 步骤一、从牛的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

[0009] 步骤二、利用牛肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高牛从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在牛肠道中的提高能量的获取和储存、提高牛从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质牛胃肠道益生菌；

[0010] 步骤三、在人工模拟的牛胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，选取得到1株鼠李糖乳杆菌、1株枯草芽孢杆菌、3株乳酸杆菌和1株双歧杆菌；

[0011] 步骤四、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量；

[0012] 步骤五、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；

[0013] 步骤六、将添加复合酸化剂后的6株益生菌与质量比5％的益生元进行结合，配制出牛用复合型合生元微生态制剂。

[0014] 进一步，步骤三筛选最佳的菌株中优选：1株鼠李糖乳杆菌、1株枯草芽孢杆菌、3株乳酸杆菌和1株双歧杆菌。

[0015] 进一步，步骤四中各类低聚糖为：木寡糖、寡甘露糖、果寡糖、低聚异麦芽糖；

[0016] 各类低聚糖最佳添加量优选木寡糖0.05-5g/kg、寡甘露糖0.25-2g/kg、果寡糖0.02-2g/kg、低聚异麦芽糖0.5-3g/kg；

[0017] 营养物质：各占比例为0.001％-2％的Vc、VE、锌、碘、铬、NaHCO3、KHCO3、钩藤、氯化钠、胆汁盐、山楂和麦芽。

[0018] 本发明的牛用复合型合生元微生态制剂，能避免单独使用益生菌产品的弱点，相辅相成，扬长避短，促进了外源性益生菌在牛肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的生长和繁殖，从而达到促进动物健康的目的，减少了动物食用抗生素对牛肉质的影响，更加健康安全，无公害，不仅可以促进动物生长，还能提高饲料的转化率、增加肉类品质和提高食品的安全质量，根据各类益生菌选择出合适的益生元，解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。附图说明

[0019] 图1是本发明实施例提供的牛用复合型合生元微生态制剂的制备方法流程图。

[0020] 为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：

[0021] 本发明实施例提供的牛用复合型合生元微生态制剂的制备方法，首先分别在不同的环境下筛选出牛胃肠道益生菌，通过对筛选出的牛胃肠道益生菌的功能和生物学特性比较，并且在模拟肠道环境下比较益生菌的活菌数变化，筛选出最佳的菌株，将各类低聚糖含量进行测定，选择出最佳添加量，将牛胃肠道益生菌和低聚糖混合制成复合型合生元微生态制剂。

[0022] 如图1所示，本发明实施例提供的牛用复合型合生元微生态制剂的制备方法具体包括：

[0023] S101、从牛的养殖场内的土壤、喂养饲料槽、胃肠道区域分离筛选出鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌，将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选益生菌；

[0024] S102、利用牛肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出具有能提高能量的获取和储存、提高牛从日粮中获取能量的能力的优质益生菌，利用益生菌在牛肠道中的提高能量的获取和储存、提高牛从日粮中获取能量的能力，根据微生物技术指标筛选优质牛胃肠道益生菌；

[0025] S103、在人工模拟的牛胃肠道液中培养初步筛选后的益生菌，测定各类益生菌的活菌数，繁殖代数，进行更进一步的筛选，最终选取得到1株鼠李糖乳杆菌、1株枯草芽孢杆菌、3株乳酸杆菌和1株双歧杆菌；

[0026] S104、根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖组成的益生元，得出各类低聚糖的最佳添加量为木寡糖0.05-5g/kg、寡甘露糖0.25-2g/kg，果寡糖0.02-2g/kg，低聚异麦芽糖0.5-3g/kg；

[0027] S105、向加入低聚糖后的益生菌中按照质量比0.1％-0.5％加入由3份重量的乳酸、1份重量的柠檬酸、1份延胡索酸组成的复合酸化剂；

[0028] S106、将添加复合酸化剂后的6株益生菌与质量比5％的益生元进行结合，配制出牛用复合型合生元微生态制剂。

[0029] 在本发的实施例中利用牛胃肠道微生物与糖代谢、维生素的关系，筛选出提高牛能从日粮中获取能量的优质益生菌，利用优质益生菌在牛胃肠道中的提高能量的获取和储存的能力，再根据微生物技术指标选育益生菌；1.在选择性培养基上分离益生菌，然后对所选的每株细菌逐一进行耐酸、耐胆盐、耐消化酶等的生理特性检测，最后进行益生菌其他特性实验。2.先在动物消化道内取少量内容物，并进行稀释，于厌氧状态下，在MRS培养基中进行富集培养，获得可作为益生菌种的细菌，然后再通过梯度培养，逐渐增加培养基的酸度(pH为3.0左右)及胆汁盐浓度，选出具有耐酸和耐胆汁特性的菌株，再根据益生菌特性的要求，在培养基中添加其他的抑制剂或病原菌，筛选出长势良好并能抑杀病原菌的菌株，最后再对该菌株进行革兰氏染色、触酶等形态和生化鉴定，并确定其种属。筛选优质牛胃肠道益生菌；3.筛选及测定将分离得到的益生菌进行生物学特性、功能的比较以及安全性的鉴定，并进行体外益生效果评价，初步筛选优质益生菌；1)乳杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)：分别取胃﹑十二指肠﹑肥肠﹑空肠﹑盲肠内容物一定量于50mL厌氧稀释液中﹑搅拌﹑作10倍系列稀释，分别取3个稀释度各0.1mL涂布LBS平板，37-38℃，厌氧罐培养。用接种环从平板上挑取各种类型菌落进行革兰氏染色镜检，对具有典型乳杆菌形态特征的菌落进行筛选。在LBS平板上培养48-72h观察到的直径在0.5mm-2mm，白色﹑圆形﹑表面光滑湿润﹑边缘整齐﹑凸起的菌落即为乳杆菌。2)双歧杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)：分别取胃﹑十二指肠﹑肥肠﹑空肠﹑盲肠内容物一定量溶于100mL改良MRS培养基，富集培养24h，取1mL梯度稀释，涂布于平板上，在厌氧条件下培养48h，用接种环挑取蓝色菌落纯化3次，得到双歧杆菌，挑取严格厌氧的菌株进行革兰氏染色，镜检观察菌体颜色﹑大小﹑形状等是否符合双歧杆菌属的基本特征。3)枯草芽孢杆菌(以从动物胃肠道筛选为例)分别取胃﹑十二指肠﹑肥肠﹑空肠﹑盲肠内容物一定量于50mL厌氧稀释液中﹑搅拌﹑作10倍系列稀释，分别取3个稀释度各0.1mL涂布LBS平板，37℃培养48h-72h，用接种环挑取疑是菌落，先进行复红简单染色观察，再进行革兰氏染色和芽孢染色，挑取枯草芽孢杆菌菌落进行纯培养，并于斜面保存，再进行过氧化氢酶测定，即将各分离株接种于LB固体培养基斜面上，37℃培养

[0030] 18h-24h，取一干净载玻片，在上面滴一滴10％的H2O2，挑取一环培养好的菌苔，在H2O2中涂抹，若有气泡，则为阳性，反之为阴性。4)鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG)LGG为革兰阳性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖；在厌氧情况下能很好生长，在有CO2存在的情况下也能生长。LGG在LBS番茄汁琼脂和MRS琼脂培养基中生长呈现特定的形态学特征，这使其易于辨认，在这两种培养基中LGG呈大的、奶油白色、不透明菌落，且散发奶油味。其具体分离鉴定步骤参加1)乳杆菌(以养殖场附近的土壤为例)：

[0031] (1)土壤的采集处理

[0032] 采用五点取样法从养殖场附近的土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。

[0033] (2)土壤中菌种的分离

[0034] 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。称取1g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28℃，12h，180rpm摇床富集培养。取1mL富集培养液，分别进行五个梯度稀释(1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000)，再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1mL稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面(注意不能使培养基表面破裂)，将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度(一般为25℃或28℃)的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/mL的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。

[0035] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

[0036] 实施例1：从养殖场附近的土壤初步筛选芽孢杆菌类益生菌。

[0037] 第一步：含芽孢杆菌土壤样品的采集。选择大型养殖场附近的土壤为采集目的地，随机选择3-5个小区，每个小区取20-50g原始土壤，装入已灭菌的自封袋中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

[0038] 第二步：芽孢杆菌的分离。在无菌条件下，在土壤样品加入到富集培养液，形成菌落，再将菌种接种到中加入无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

[0039] 第三步：芽孢杆菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的益生菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯菌落，斜面接种保存备用；

[0040] 第四步：芽孢杆菌的鉴别。将分离纯化后的芽孢杆菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定的等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

[0041] 实施例2：从动物肠道中初步筛选乳杆菌、双歧杆菌益生菌。

[0042] 第一步：含益生菌样品的采集。选择各个大型屠宰场为样品采集目的地，随机切取不同健康现杀动物的肠道组织，装入已灭菌的自封袋中，并快速带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

[0043] 第二步：益生菌的富集、分离。在无菌条件下，将肠道组织样品内表面物质加入到富集培养液中培养，形成菌落，再将菌种接种到加入无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

[0044] 第三步：益生菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的益生菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯菌落，斜面接种保存备用；

[0045] 第四步：益生菌的鉴别。将分离纯化后的乳杆菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定的等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

[0046] 实施例3：从自然发酵的泡菜中分离鼠李糖乳杆菌。

[0047] 第一步：自然发酵的泡菜的选择。选择农家自行起发的泡菜为采集目的地，选择用作泡菜酸水作为样品30-50mL，装入已灭菌的自封袋中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用；

[0048] 第二步：鼠李糖乳杆菌的富集、初步分离。在无菌条件下，将酸水样品加入到富集培养液中，形成菌落，再将菌种接种到无菌生理盐水制成菌悬液，再用10序列递减法稀释成不同的浓度梯度，将不同的溶度梯度样品进行平板菌落计数，每个稀释度做3个平行，由此制成的平板放入保温箱中培养24-72h；

[0049] 第三步：鼠李糖乳杆菌的分离纯化。在无菌条件下，将经过鉴别后的鼠李糖乳杆菌用接种环接种于无菌生理盐水中，制成菌悬液，再接种于平板上，培养后观察，循环操作，直到获得纯种鼠李糖乳杆菌形成的菌落，斜面接种保存备用；

[0050] 第四步：鼠李糖乳杆菌的鉴别。将分离纯化后的鼠李糖乳杆菌进行形态观察，生理生化特性测定和16S rDNA序列测定的等方法，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的。

[0051] 实施例4：益生菌菌株的进一步筛选。

[0052] 第一步：分别将初步筛选的益生菌进行功能试验测定，例如将新培养的益生菌接种到不同浓度的胆盐培养基中，测定胆盐耐受性；在低pH的环境下培养益生菌3-5天，然后判断益生菌耐酸程度；

[0053] 第二步：在人工模拟胃肠道的微生态环境中培养初步筛选后的益生菌，对各类益生菌的存活率，繁殖代数进行测定，筛选出生长状况较好的益生菌；

[0054] 第三步：以上各项测定合格的益生菌为最终筛选的益生菌，最终得到1株鼠李糖乳杆菌、3株乳杆菌、1株双歧杆菌和1株枯草芽孢杆菌；

[0055] 实施例5：复合型合生元微生态制剂的制备。

[0056] 第一步：根据益生菌的种类、各类益生元的功能特性以及与相应益生菌的利用程度选择由低聚糖和酸化剂组成的益生元，可选择的低聚糖为木寡糖、寡甘露糖，果寡糖，低聚异麦芽糖等，酸化剂使用由乳酸、柠檬酸、延胡索酸等物质组成的复合酸化剂[0057] 第二步：测试各类低聚糖的添加量，各类低聚糖的添加量为木寡糖0.05-5g/kg，寡甘露糖0.5-2g/kg，果寡糖0.01-3g/kg，低聚异麦芽糖0.01-2g/kg。添加由乳酸、柠檬酸、延胡索酸等物质组成的复合酸化剂0.1％-0.5％；

[0058] 第三步：将五种益生菌和选择出的益生元有机结合起来，再加入有益于有利于益生菌生长的营养物质，制成复合型合生元微生态制剂；

[0059] 第四步：最后制成的产品添加到动物食用料中进行动物实验，根据实验动物的增重量、饲料消耗量和料肉比等来判断实验动物的生产性能情况。

[0060] 本发明的牛用复合型合生元微生态制剂能避免单独使用益生菌产品的弱点，相辅相成，扬长避短，促进了外源性益生菌在牛肠道的定植，并且选择性刺激多种益生菌的生长和繁殖，从而达到促进动物健康的目的，减少了动物食用抗生素对牛肉质的影响，更加健康安全，无公害，不仅可以促进动物生长，还能提高饲料的转化率、增加肉类品质和提高食品的安全质量，根据各类益生菌选择出合适的益生元，解决了由传统的抗生素而带来的药物残留、产生抗药性、动物肠道微生态平衡遭到破坏及降低肉制品质量等食品安全与质量问题。

[0061] 以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。