改善肠道小型生物群的合益素

发明领域

本发明涉及向剖宫产术分娩的婴儿施用特定的合益素混合物，即，益 生菌(probiotic)和寡糖，其能够促进早期的双歧杆菌促进性(bifidogenic) 肠道小型生物群。

发明的背景

婴儿出生前的胃肠道一般认为是无菌的。在出生的正常过程中，婴儿 的胃肠道遭遇来自母亲的消化道、皮肤和环境的细菌，并且这些细菌开始 建群。健康、阴道分娩、母乳喂养的2-4周大婴儿的粪便小型生物群可作 为此年龄段最优化的小型生物群，其中双歧杆菌属物种占优势地位，带有 一些乳杆菌属物种和更少量诸如脆弱拟杆菌(Bacteriodes fragilis)等的拟 杆菌属物种，而没有诸如梭状芽孢杆菌属(Clostridia)等潜在病原菌。在 大约两岁完全断奶以后，开始建立类似成年人模式的肠道小型生物群模式。

应注意的是，在健康、阴道分娩、母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌属物 种形成小型生物群的基础，占婴儿肠道中全部细菌的60-90％。母乳喂养也 促进了肠道屏障的发育，与占优势地位的双歧杆菌属物种一起增强了所摄 取营养的吸收并因此增强其利用。

Gronlund等已经研究了剖宫产术出生的健康婴儿的粪便小型生物群， 并将其与阴道分娩出生的婴儿对照组比较。他们得出结论：剖宫产术分娩 出生的婴儿的肠道菌群可被扰乱至出生后六个月。他们特别注意到在剖宫 产术组中双歧杆菌属物种和乳杆菌属物种的建群水平分别只在一个月和十 天后达到阴道分娩组的建群水平(Gronlund等人，“Fecal Microflora in Heathy Infants Born by Different Methods of Delivery：Permanent Changes in Intestinal Flora After Cesarean Delivery”，Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition，28：19-25)。

其它工作已经提示上述延迟的/异常的建群对婴儿的后续发育可具有 特定的影响，并且已经将这些效果与肠道菌群的差异相联系。例如， Laubereau等人发现，剖宫产术出生的婴儿具有比阴道分娩的婴儿更大的 腹泻风险(Laubereau等人，Caesarean Section and gastrointestinal symptoms，atopic dermatitis and sensitisation during the first year of life″， Arch Dis Child 2004；89：993-997)。Negele等人发现，直到2周岁，剖宫 产分娩都是喘鸣和对食物过敏原的过敏性敏化的额外风险因子(Negele等 人，″Mode of delivery and development of atopic disease during the first 2 years of life″Pediatr Allergy Immunol 2004：15：48-54)。还提示系统性低 度炎症和亚优化肠道小型生物群还可涉及肥胖的发展(Fantuzzi G. ″Adipose tissue，adipokines，and inflammation″J Allergy Clin Immunol. 2005；l 15：911-919，；Backhed F，Ding H，Wang T等人，″The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage″Proc Natl Acad Sci USA.2004；101：15718-15723)。

对所有的婴儿都建议使用母乳。但是，在某些情况下，由于医学原因 母乳喂养不足或不成功，或者母亲选择不进行母乳喂养。针对这些情况目 前已经开发了婴儿配方乳。

最近，已发现人们如果摄取某些菌株的话，这些菌株会呈现有价值的 性质，这已引起了相当的重视。具体来说，已发现乳杆菌属和双歧杆菌属 的特定菌株能够在肠道建群，降低病原菌贴附肠上皮的能力，具有免疫调 节效应并且能够协助维持健康状态。有时候这样的细菌被称为益生菌，并 且已经提出将适宜的益生菌加入到婴儿配方乳中。

已经进行了广泛的研究来鉴定新型益生菌株。例如，EP 0 199 535、 EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0577903和WO 00/53200公开了乳杆菌 属和双歧杆菌属的特定菌株及其有益效果。

近期，表达了对于向作为最初六个月龄婴儿的单一营养物源的婴儿配 方乳(formula)添加益生菌的一些关注。这些关注总结在营养学ESPGHAN 协会的名为“Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants”的医学类 文献中(Journal of Paediatric  Gastroenterology and  Nutrition， 38：365-374)。

向食品中添加益生元是促进结肠中有益细菌的数量和/或活性增长的 另一种方法。益生元是不易消化的食品成分，其通过选择性的刺激结肠中 一种或有限数量的细菌的生长和/或活性来有益的影响宿主，从而增进宿主 健康。此类成分是不易消化的，因为其在胃或小肠中不能被分解和吸收， 从而可以完整的通过并到达结肠，在此处由有益细菌选择性的进行发酵。 益生元的例子包括某些寡糖，例如果寡糖(FOS)和半乳寡糖(GOS)。

已知人乳比大多数其它动物乳含有更大量的不能消化的寡糖。事实上， 不能消化的寡糖代表了母乳中第三大固体成分(在乳糖和脂类之后)，初 乳中存在的浓度是12-15g/l，成熟乳汁中以5-8g/l存在。人乳寡糖非常耐受 酶水解，表明这些寡糖可以显示出与其热量值不直接相关的关键性功能。

由于对人乳的组成已经有更好的了解，已经建议将益生元添加到婴儿 配方乳中。多种补充了益生元例如果寡糖和半乳寡糖混合物的婴儿配方乳 是可商购的。但是，此类混合物只是粗略的近似人乳中的寡糖混合物。在 人乳中已经检测到超过100种不同的寡糖成分，其中一些至今尚未在动物 乳例如牛奶中检测到，或仅检测到少量。仅以非常小的量存在与牛奶和初 乳中或者完全不存在的人乳寡糖的实例是唾液酸化和岩藻糖基化的寡糖。

对生产婴儿配方乳的持续呼声还已经建议婴儿配方乳既含有益生菌又 含有益生元，其尽可能的复制接近人乳的组成和效果。例如在WO 2005/000748中，建议在婴儿配方乳中补充短双歧杆菌菌株、半乳寡糖和果 寡糖(菊粉)的混合物。它声称，被描述为合益素的该混合物，调节婴儿 结肠中的双歧杆菌种群，使补充配方乳适合更“婴儿样”的群体消费，即， 更少的链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假链状双歧杆菌(c)和 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)物种，而更多的婴儿双岐杆菌 (Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和长双歧杆 菌(Bifidobacterium longum)物种。还陈述了混合物可用于预防和治疗免疫 病况。

肠道小型生物群在以下作用中扮演了重要的角色，所述作用即将不消 化的寡糖和多糖水解为可吸收的单糖，以及通过直接作用于绒毛上皮激活 脂蛋白脂肪酶。此外，近日还证实人乳不仅含有寡糖，还含有双歧杆菌。 同时，基因组研究已经有力的显示，母乳喂养的婴儿的肠道中存在的双歧 杆菌，例如长双歧杆菌，是特别装备以利用母乳寡糖作为营养物的。长双 歧杆菌还适应大肠内的环境，其中进行着从可缓慢吸收的碳水化合物收获 能量。

简而言之，出现了越来越多的证据提示，在生命早期建立正确的肠道 小型生物群对后续的健康发展是重要的。同时，剖宫产分娩的比例持续增 高，在一些国家达到了总出生的70％。因此很明显存在这样的需求，即提 供一种方式来促进在非自然出生的婴儿中快速建立适当的肠道小型生物 群。考虑到目前的实践是向接受电子剖宫产分娩的孕妇常规施用预防剂量 的抗生素，因而上述需求是特别迫切的。

发明概述

如上所述，在健康的、阴道分娩且乳汁喂养的婴儿中，双歧杆菌构成 了小型生物群的基础，占婴儿肠道总细菌的60-90％。在此类婴儿中主要发 现的双歧杆菌种是短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。 本发明人已经令人惊讶的发现，将特定乳杆菌亚种，即鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)的益生菌株，与寡糖混合物的共同施用，协 同的促进剖宫产术分娩的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的 发育，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖， 20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡 糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和 Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖选自Galβ1，6Gal、 Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、 Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

因此，本发明提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物在生产药 物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于促进剖宫产术分 娩的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的发育，其中，所述寡 糖混合物包括5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种 中性寡糖，以及5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖 选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性 寡糖选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

本发明还提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物在生产药物或 治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于降低在剖宫产术分娩 的婴儿中后来出现过敏反应的风险，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％ 的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％ 的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自 GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖 选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

在另一个方面，本发明提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物 在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于预防或 治疗剖宫产术分娩的婴儿的腹泻，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％的 至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％ 的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自 GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖 选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

本发明延展至促进剖宫产术分娩的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道 小型生物群的发育的方法，包括向剖宫产术出生的婴儿和具有相同需要的 婴儿提供治疗量的鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物，其中，所述寡 糖混合物包括5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种 中性寡糖，以及5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖 选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性 寡糖选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

本发明还延展至减少由剖宫产术分娩的婴儿将随后发展过敏反应的风 险的风发，包括向剖宫产术出生的婴儿和具有相同需要的婴儿提供治疗的 鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物，其中，所述寡糖混合物包括 5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及 5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自 GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖 选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

本发明还延展至预防或治疗剖宫产术分娩的婴儿的腹泻的方法，包括 向剖宫产术出生的婴儿和具有相同需要的婴儿提供治疗量的鼠李糖乳杆菌 的益生菌株与寡糖混合物，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％的至少一 种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的至少 一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和 Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖选自Galβ1，6Gal、 Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、 Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。

不希望受限于理论，本发明人认为，向剖宫产术出生的婴儿施用鼠李 糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物，以尚未完全了解的一些方式引发婴儿 的胃肠道，使其有利于由通常在健康的、阴道分娩婴儿的胃肠道中发现的 双歧杆菌的那些物种进行的随后的建群，其中，所述寡糖混合物包括 5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及 5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自 GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖 选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。认为该有利的建群降低了 腹泻发作的风险，所述腹泻例如已经显示出影响剖宫产术分娩的婴儿。还 认为有利的建群降低了后续出现过敏反应的风险，例如表现为喘鸣和/或对 食物过敏原的敏化(sensitisation)。

应该注意，此类治疗的目标或效果不是促进益生的鼠李糖乳杆菌自身 的建群，而是促进用其他种的建群，从而实现与健康的、母乳喂养的、阴 道分娩婴儿的肠道中发现的相当的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群。

附图的简要说明

图1显示了在治疗的第14天，用人类婴儿小型生物群管饲的限菌小鼠 的粪便和样品中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和产气荚膜 梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)计数；和

图2显示了在治疗的第14天，用人类婴儿小型生物群管饲的限菌小鼠 的粪便样品中的短双歧杆菌和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)计数；

发明的详细说明

在本说明书中，下列术语具有下列含义：

“早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群”是指至多12月龄的婴儿的肠 道小型生物群，其中双歧杆菌属占优势地位，例如短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和长 双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，并排除诸如梭状芽孢杆菌属 (Clostridia)和链球菌(Streptococci)等可估计的菌群，这种早期双歧杆菌 促进性肠道小型生物群与同龄的阴道分娩且母乳喂养的婴儿中发现的相 当。

“婴儿”是指12个月以下的孩子；

“益生元(prebiotic)”是指一种不可消化的食品成分，其通过选择性 刺激一种或限制数量的细菌在结肠中的生长和/或活性来对宿主产生有益 影响，从而改善宿主健康(Gibson and Roberfroid“Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota：Introducing the Concept of Prebiotics”J. Nutr 125：1401-1412)。

“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态有有益效果的微生物细胞制品 或微生物细胞成分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics： how should they be defined”Trends Food Sci Technol.1999：10107-10)；

如无特殊说明，所有提及的百分数都是重量百分数。

合适的益生鼠李糖乳杆菌菌株包括除可从芬兰Valio Oy等处获得的商 标为LGG的鼠李糖乳杆菌ATCC 53103，和鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724。合适的每日剂量是10e5至10e11菌落形成单位(cfu)，更优选的 10e7至10e10cfu。

益生的鼠李糖乳杆菌与寡糖混合物共同施用，所述寡糖混合物包括 5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及 5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自 GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖 选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、 Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和 Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自 NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。此类寡糖混合物更详细的 描述在WO2007/090894中，其内容通过引用整合到本文中，并在后文中称 为“上述寡糖混合物”。术语共同施用既包括同时施用益生的鼠李糖乳杆 菌和寡糖混合物，又包括先后施用鼠李糖乳杆菌和寡糖混合物。

优选上述寡糖混合物包含10-70wt％的特定N-乙酰化寡糖、20-80wt％ 的特定中性寡糖和10-50wt％的特定唾液酸化的(sialylated)寡糖。更优 选的混合物包含15-40wt％的N-乙酰化寡糖，40-60wt％的其他中性寡糖和 15-30wt％的唾液酸化的寡糖。特别优选的混合物是30wt％的N-乙酰化寡 糖、50wt％的中性寡糖和20wt％的唾液酸化的寡糖。

可选地，上述寡糖混合物可适宜包含5-20wt％的特定N-乙酰化寡糖、 60-90wt％的特定中性寡糖和5-30wt％的特定唾液酸化的寡糖。

上述寡糖混合物可以从一种或多种动物乳制备。该乳可以来自任何哺 乳动物，特别是牛、山羊、水牛、马、大象、骆驼或绵羊。

可选的可以通过购买和混合单个组分来制备上述寡糖混合物。例如， 合成的半乳寡糖，例如商标为和的Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、 Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc及其混合物是可 商购的。其它寡糖供应商是Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbHKyowa Hakko Kogyo公司。可选的，可以使用特定的糖基转移酶例 如半乳糖基转移酶来生产中性寡糖。

可以通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰基-葡萄糖和/或 N-乙酰基半乳糖的作用来制备N-乙酰化寡糖。相同的，N-乙酰基-半乳糖 基转移酶和/或N-乙酰基-糖基转移酶也可以用于该目的。还可以通过使用 不同的酶(重组的或天然的)的发酵技术和/或微生物发酵来生产N-乙酰化 寡糖。在后一种情况下，微生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可 以被改造为生产不同的底物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养 物。可以从DP＝1起始的任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始 N-乙酰化寡糖形成。另一个选择是从游离或与寡糖(例如，乳酮糖)结合 的己酮糖(例如，果糖)化学转换为N-乙酰己糖胺或含有寡糖的N-乙酰 己糖胺，如Wrodnigg，T.M.；Stutz，A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed. 38：827-828中描述的。

可以通过色谱或过滤技术从天然来源例如动物乳中分离唾液酸化的寡 糖3’唾液酸-乳糖和6’唾液酸-乳糖。可选的，可以通过使用特定的唾液酸 转移酶的生物技术来生产它们，所述生物技术或者是通过基于酶的发酵技 术(重组的或天然的酶)或者是通过微生物发酵技术。在后一种情况下， 微生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可以被改造为生产不同的底 物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养物。可以从DP＝1起始的 任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始唾液酸寡糖形成。

其它益生菌可以与益生的鼠李糖乳杆菌一起施用。可以使用具有已确 立的益生特征的任何乳酸菌或双歧杆菌。合适的益生乳酸菌包括可从 Biogaia获得的路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC55730或类干酪 乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-2116。

合适的益生双歧杆菌菌株包括乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis) CNCM I-3446，由丹麦的Christian Hansen公司等以商标Bb 12销售；长 双歧杆菌ATCC BAA-999，由日本的Morinaga Milk Industry Co.Ltd以 商标BB536出售；由Danisco以商标Bb-03出售的短双歧杆菌菌株；由 Morinaga以商标M-16V出售的短双歧杆菌菌株；和由Institut Rosell (Lallemand)以商标R0070出售的短双歧杆菌菌株。可以使用乳酸菌和 双歧杆菌的混合物。

优选的在分娩后立即向婴儿施用益生的鼠李糖乳杆菌和上述寡糖混合 物，及其后至少在婴儿生命的前2个月施用。更优选的，持续施用直到婴 儿达到6月龄。可以以婴儿配方乳方便的施用益生的鼠李糖乳杆菌和上述 寡糖混合物。

根据本发明所使用的婴儿配方乳可以以不超过2.0g/100kcal，优选 1.8-2.0g/100kcal的量包含蛋白质源。相信蛋白质类型对于本发明并不关键， 只要满足必需氨基酸的最小需求量并且能够保证满意的生长即可，但是， 优选其中超过50wt％的蛋白质源是乳清。所以，可以使用基于乳清、酪蛋 白及其混合物的蛋白质源，和基于大豆的蛋白质源。就乳清蛋白质来说， 蛋白质源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，而且可包括以任何所需比 例存在的α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。

蛋白质可以是完整的或水解的或完整和水解蛋白质的混合物。优选提 供部分水解的蛋白质(水解度2-20％)，例如对于相信有发生牛奶过敏反 应风险的婴儿。如果需要水解的蛋白质，可以根据需要如本领域已知进行 水解过程。例如，乳清蛋白质水解物可以通过在一个或多个步骤中酶水解 乳清组分来制备。如果用作起始材料的乳清组分基本不含乳糖，那么发现 蛋白质在水解过程中会遇到非常少的赖氨酸阻断(lysine blockage)。这使 得赖氨酸阻断的程度从总赖氨酸的大约15wt％降低至少于赖氨酸的约 10wt％；例如大约7wt％的赖氨酸，这大大提高了蛋白质源的营养质量。

该婴儿配方乳可包含碳水化合物源。可以使用任何常规用于婴儿配方 乳中的碳水化合物源，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉及其混合物， 但是优选的碳水化合物源为乳糖。优选该碳水化合物源贡献该配方乳总能 量的35-65％之间。

该婴儿配方乳可包含脂类源。脂类源可以是适用于婴儿配方乳的任何 脂或脂肪。优选脂肪源包括棕榈油酸甘油酯、高油酸葵花籽油和高油酸红 花油。如可以加入含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的小 量油类，例如鱼油或微生物油一样，也可以加入必需脂肪酸亚油酸和α-亚 麻酸。总的来说，优选脂肪含量例如贡献该配方乳总能量的30-55％。优选 脂肪源中n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比例为大约5∶1至大约15∶1，例如大 约8∶1至大约10∶1。

该婴儿配方乳也可以以营养显著量包含认为对于日常饮食必须的所有 维生素和矿物质。已经确定了对某些维生素和矿物质的最低需求。任选地 存在于婴儿配方乳中的矿物质、维生素和其他营养物质的例子包括维生素 A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素 K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、尼克酸、生物素、泛酸、胆碱、 钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸、 和L-肉碱。矿物质通常以盐的形式加入。特定矿物质和其他维生素的存在 和量根据所针对的婴儿人群改变。

根据需要，该婴儿配方乳可包含乳化剂和稳定剂，例如大豆卵磷脂、 甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯等等。

优选该婴儿配方乳含有上述寡糖混合物，含量为每升重构的配方乳中 0.2-5克，优选1-2克/升。

该婴儿配方乳可任选地包含具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、 核苷酸、核苷等。

上述的婴儿配方乳和营养配方乳都可以以任何适宜的方式制备。例如， 可以通过将蛋白质、碳水化合物源和脂肪源以合适比例共混制备。此时， 如果使用，可以包括乳化剂。此时，可以加入维生素和矿物质，但是通常 后加入，以避免热降解。任何亲脂维生素、乳化剂等可在共混前溶解入脂 肪源中。然后，将水，优选经过反渗透的水混合进入，以形成液体混合物。 水温适宜为大约50至大约80℃，以协助上述成分的分散。可用可商购的 液化剂形成上述液体混合物。然后将该液体混合物均质化；例如在两阶段 中均质化。

然后可热处理液体混合物以减少细菌的携带，例如通过快速加热液体 混合物至大约80至大约150℃大约5秒至大约5分钟。这可以通过蒸汽注 入、高压灭菌或热交换器进行，例如平板热交换器。

然后，可以将液体混合物冷却至大约60-大约85℃，例如通过瞬时冷 却。然后再次将液体混合物均质化，例如在两个阶段中均质化，第一阶段 大约10MPa-大约30MPa，第二阶段大约2MPa至大约10MPa。然后均质 化的混合物可以进一步冷却，以加入任何热敏感的成分，例如维生素和矿 物质。此时可以适宜调节均质化混合物的pH值和固体含量。

将均质化的混合物转移至适宜的干燥装置中，例如喷雾干燥器或冻干 机中，变成粉末。这些粉末应该具有少于大约5wt％的含湿量。

可以根据任何合适的方法培养益生的鼠李糖乳杆菌，并制备其，以用 于添加到营养配方乳或婴儿配方乳中，例如通过冷冻干燥或喷雾干燥。可 选的，从芬兰Valio Oy购买商标为LGG的鼠李糖乳杆菌ATCC 53103， 其已经被制备成用于向食物产品添加的合适形式，例如营养配方乳或婴儿 配方乳。配方乳添加的益生鼠李糖乳杆菌的量是在10e3至10e12cfu/g粉末 之间，更优选的在10e7至10e12cfu/g粉末之间。

本发明将通过参考下列实施例进行进一步说明：

实施例1

本发明将使用的合适的婴儿配方乳组合物的实例显示如下：

实施例2

该实施例将具有寡糖成分的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724对剖宫产 分娩的限菌小鼠模型建立早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的影响(其 中所述寡糖成分包括N-乙酰化寡糖，中性寡糖和唾液酸化的寡糖(后文称 为CMOS-GOS))，与单独的益生菌和单独的寡糖混合物，以及对照进 行了比较。该模型是剖宫产分娩出生婴儿的合适的动物模型，具有在双歧 杆菌群体方面的亚优化的肠道小型生物群。除了对双歧杆菌群体大小的观 察外，该模型还适合跟踪双歧杆菌作为抗潜在病原菌(如产气荚膜梭状芽 胞杆菌)的屏障的有利效果。

材料和方法

从Charles River Laboratories France购买了无菌的C3H雌性和雄性 小鼠，并在运输隔离器中船运至Nestle研究中心。在控制了无菌状态后， 将动物转移至饲育隔离器中。该研究使用该繁殖群体的雌性后代。动物随 后随机分入4个研究组之一：A，对照餐和对照饮用物；B，补充3％寡糖 混合物的对照餐和对照饮用物；C，对照餐和益生的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724的饮用物；D，补充3％寡糖混合物的对照餐和含有益生的鼠李糖乳 杆菌CGMCC 1.3724的饮用物。

动物保持在2个不同的隔离器中，每笼各5只。组A和B保持在一个 隔离器中，组C和D保持在另一个隔离器中，从而避免与研究后期的鼠李 糖乳杆菌交叉污染。每周以新鲜收集的来自每个笼子的一个动物的粪便来 监控无菌状态。在该期间，用AIN-93基础餐饲喂动物。在7-8周龄时，按 2只动物/笼，重新进行无菌控制，然后每只动物接受管饲单剂量的200μl 人幼儿微生物混合物(HBF)，如表1所述。同一天，饮食改变为AIN-mix (组A和C)或AIN-CMOS-GOS(组B和D)，饮用水改变为含有0.5％ (v/v)MRS的盐水饮用水(组A和B)或含有0.5％(v/v)MRS和终浓 度为2×10e7cfu/ml鼠李糖乳杆菌的盐水饮用水。将该天计为第-1天。第 二天(本文中认为是第0天)，收集各动物的新鲜粪便，然后立即通过平 板计数进行小型生物群分析。

从工业去蛋白化和去矿质的乳清渗透物(Lactoserum France，France) 开始制备了富含牛乳寡糖的样品(CMOS)。简而言之，在配备了电子透 析模块和阴离子-和阳离子-交换器(Lactoserum France)的工业去矿质线 上，将超滤的牛乳乳清渗透物去矿质。然后，将去矿质的乳清渗透物经过 2次连续工业乳糖结晶循环，然后进行喷雾干燥(Lactoserum France)。 将获得的粉末状修饰的母液以30％(w/v)溶解在水中，经过活性炭床然 后是0.22μm滤器(Millipore)过滤进行澄清。将获得的滤液上样至已制 备的Bio-Gel P2(BioRad)柱(50×850mm)上，用流速为2ml/min的20mM 碳酸氢铵(NH4HCO3)运行。收集含有寡糖并在乳糖之前洗脱的级分，混 合并冻干。

冻干的寡糖与商购的半乳糖基-寡糖(Vivinal GOS，DOMO Friesland Foods)混合，获得终混合物，其含有约9wt％N-乙酰化寡糖，约85wt％ 中性寡糖和约6wt％唾液酸化的寡糖。将该CMOS-GOS成分掺入到 AIN-93半合成的啮齿类餐中，产生终寡糖含量为3wt％。对照AIN-93餐 补充了葡萄糖和乳糖，来对照通过使用的原料而引入CMOS-GOS餐中的 葡萄糖和乳糖。

从Nestle培养物收集中心(Nestle Culture Collection)制备鼠李糖乳杆 菌。简而言之，将NCC4007重活化，在MRS(Man Rogosa Sharpe)培 养基中生长至约4-5×10e8cfu/ml。然后，在其分散的MRS培养基中离心 来浓缩鼠李糖乳杆菌，并用新鲜的MRS培养基稀释至4×10e9cfu/ml。然 后，将鼠李糖乳杆菌分为1ml等分试样，将其在-80℃冷冻直到使用。各第 1天，将1ml在MRS中的新鲜解冻的等分试样鼠李糖乳杆菌，或1ml MRS (用于无鼠李糖乳杆菌的组)引入隔离器中，溶解在200ml盐水内，等分 为4个饮水瓶。在平均消耗5ml/天/小鼠下，具有益生元的组的每只动物每 天接受约10e8cfu鼠李糖乳杆菌。

在第14天收集粪便样品并平板计数分析。简而言之，对于每只小鼠， 将1个粪便团块在补充了0.05％(w/v)L-半胱氨酸(HCl)的0.5ml Ringer 溶液(Oxoid，UK)中均质化，将不同稀释度的细菌溶液在选择性和半选 择性培养基上涂板，用于计数特定的微生物体：双歧杆菌在Eugom Tomato 培养基，乳杆菌在补充了抗生素(磷霉素(phosphomycine)、磺胺甲噁唑 (sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprime))的MRS培养基，产气 荚膜梭状芽胞杆菌在NN-琼脂培养基上，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在 Drigalski培养基上，以及拟杆菌属(Bacteroides)在Shaedler Neo Vanco培 养基。在37℃有氧条件下孵育平板24小时，用于计数肠杆菌，在厌氧条 件下孵育48小时，用于计数双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌和产气荚膜梭状芽 孢杆菌。

表1-小型生物群组成

  菌株   平板上的菌落表   型   施用浓度   log(cfu/ml)   短双歧杆菌NCC452   (viv4)   白色，大   ＜2   长双歧杆菌NCC572   (viv5)   灰色，小   ＜2   金黄色葡萄球菌   白色，大   7.0

  FSM124(viv3)   表皮葡萄球菌   (Staphylococcus   epidermidis)FSM 115   (viv2)   灰色，小   7.010   大肠杆菌(Escherichia   coli)FSM325(viv1)   8.08   吉氏拟杆菌   (Bacteroides   distasonis)FSM24   (viv20)   5.0   产气荚膜梭状芽孢杆菌   FSMC14(viv19)   ＜5.0

结果

图1显示了在用HBF管饲组A、B、C和D两周后，粪便中的金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)计数。可见虽然在组B和D中，金黄色葡萄球菌的计数降低， 在组C和D中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数降低；但是仅在组D中发现 了两种病原体都显著降低。

图2显示了在用HBF管饲组A、B、C和D两周后，粪便中的短双歧 杆菌和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)计数。可见在组D中，两 种物种(在阴道分娩、乳汁喂养的婴儿中一般占优势的肠道小型生物群) 构成了比其它组更高的小型生物群的比例。总而言之，上述结果表明，益 生的鼠李糖乳杆菌和寡糖混合物在促进双歧杆菌建群，和防止金黄色葡萄 球菌和产气荚膜梭状芽胞杆菌建立显著的群体中显示出协同效应。