Products for preserving lyophilized lactic acid bacteria mixed with powder for oral rehydration solution

本発明は、全般的に水分に感受性の製品の包装に関し、したがってそのような製品の保存寿命の延長に関する。 より具体的には本発明は経口補水液（ｏｒａｌ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＯＲＳ）粉末と混合した凍結乾燥乳酸菌の保存寿命の延長に関する。 製品は２種の乾燥剤を含むパッケージである。 すなわち、１つの乾燥剤はホイル材料中に一体化されており、第２の乾燥剤は無水ＯＲＳである。 本発明は、そのような製品を製造する方法にも関する。

プロバイオティックスとは宿主の腸内微生物バランスを改善することにより、宿主に有益な影響を及ぼす生菌サプリメント食品である。 今日では、多くの異なる細菌がプロバイオティクスとして用いられている。 たとえば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）やビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する菌株のような乳酸産生菌である。 乳酸産生菌は、ヒトや動物の健康に対する有益な効果のために用いられるのみならず、食品工業での発酵プロセスにも広く使用されている。 通常、これらの目的のために市販されている微生物は、低水分環境中の凍結乾燥粉末として製剤化されている。

そのような凍結乾燥微生物製剤を適用する際に直面する一般的問題は、細胞の限られた保存安定性である。 たとえば、時間とともに微生物の生存能力は減少し、この活性の損失を補うためには高い用量が必要となる。

アルミホイルを微生物保存用の包装材料として利用すること、最も好ましくは、凍結乾燥乳酸菌の水分や酸素への曝露を減らすための包装材料として、当該区画の外側の一表面にプラスチック層を有するホイル、たとえばポリエチレンラミネートアルミホイルを利用することが知られている。

従来のパッケージの防湿バリアは、水分がパッケージの内部に移動するのを制限するのに役立ち得るが、水分分子のいくらかはパッケージになおも進入して、その中に含まれる製品に悪影響を与える可能性がある。 さらに、バリア材料が水分子のパッケージへの透過を制限するのに効果的であるときでも、パッケージのある種の特性が、たとえばヒートシールされたパッケージの端部に沿って、水分子が透過するのを許す可能性がある。 また、凍結乾燥された微生物を包装するその時が、水分吸収を考えると特に弱点となる。

パッケージ内を特に低い水分レベル、又は実質的には水分が存在しないレベルに維持するための解決策の１つは、乾燥材料の小袋をパッケージの内部空間に組み入れて、パッケージの上部空間から水分を除去することである。 小袋に入った乾燥材料は通常粉末又は顆粒状であり、小袋から漏れたり、そうでなければこぼれたりしてパッケージ内にある製品（単数又は複数）を汚染する可能性がある。 市販されている乾燥剤を摂取することは、たとえば下痢に悩まされている人たちには適切でない。 それどころか、悪影響を及ぼし得る。 しかしながらこの問題は、小袋内の乾燥剤の目的が消費されることにある本発明により解決される。

典型的な乾燥材料は、水分子を材料の孔隙内に結合する、分子篩などの「物理的」乾燥材料である。 通常、物理的乾燥材料は、すべての湿度レベルで水を吸収するが、物理的乾燥材料の間隙が満たされてしまうと水を吸収しなくなろう。 したがって物理的乾燥材料は、高湿度レベルでは無効になる可能性がある。

乾燥材料の別のタイプは塩などの水和物形成剤である。 乾燥材料として利用できる代表的な塩は、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化アンモニウム、炭酸カリウム、硫酸カリウムアルミニウム、塩化マグネシウム、硫酸二アンモニウム、硝酸ナトリウム、塩化カルシウム、及び硫酸カルシウムであるが、他にも多くのものが知られている。 これらの材料の乾燥能力はパッケージ内の相対湿度により大きく左右される。 一般的に水和物形成剤は、相対湿度が第１水和物が形成される値に達するまでは水を全く取り込まない。 たとえば塩化カルシウムの場合、第１水和物は相対湿度（ＲＨ）が約２％未満で形成される。 その時水は、水和物形成塩により第１水和物が完全に形成されるまで、その塩により取り込まれる。 相対湿度が第２水和物が形成される第２のレベルに達するまでは、水は塩によりそれ以上取り込まれることはない。 このプロセスは、この剤が形成する水和物の数まで続くが、その時点で当該物質が溶解し始め、飽和溶液が形成される。 この飽和溶液は次いで水を取り込み続けるであろう。

これらの塩は、パッケージの上部空間中に含まれ得るある量の気体から水分子を除去するのに有効となり得るが、この塩は塩内だけに水分子を結合するので、水分子は容易にパッケージの中に逃げ戻る可能性がある。 これはブリージングとして知られ、パッケージの内部で潮解（水滴と液化）を引き起こし得る。 通常これは、塩が飽和に達し、且つパッケージの温度が高くなるか又はパッケージの圧力が低下する場合に起こり得るが、こうした場合はパッケージの出荷又は保管の際に起こることがある。

加えて塩により、パッケージ中に含まれ得る水分感受性製品を保護するのに必要なレベルまで、パッケージ内の水分レベルが下げられないこともある。 塩は異なる水和レベルを有するので、通常湿度レベルは、水和レベルが変化するまでは、ある一定レベルに留まり低下しないこともある。 これらの塩は、パッケージの上部空間内の湿度をある一定レベルに維持するのに利用し得る。 たとえば、ある種の製品にとっては、パッケージの上部空間内の水分又は湿度がある一定レベルに維持されることが必要となり得る。 製品のための上部空間の湿度制御は、適切な水和物形成剤を組み入れることにより操作できる。

食塩（ＮａＣｌ）や臭化カリウム（ＫＢｒ）のような水和物を形成しない乾燥材料もまた使用できる。 たとえば食塩は相対湿度が約７５％より低いと水を吸収しない。 相対湿度が７５％に達すると飽和溶液が形成され、これが水を吸収し続ける。

別のタイプの乾燥剤は化学的乾燥剤技術を用いる。 化学的乾燥材料は、通常すべての湿度レベルで水を吸収し、高い相対湿度レベルで水を取り込み続けよう。 米国特許出願第２００７０１６０７８９Ａ１号は、プラスチックポリマーの柔軟性のある多層包装用ホイルであって、１つの層内に化学的乾燥材料が組み込まれているホイルを記載している。 このホイルは好ましくは、超低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、線状低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン及び高密度ポリエチレンからなる群から選択されるポリエチレンである。 本発明は酸化カルシウム（好適）、酸化マグネシウム、酸化バリウム、酸化ストロンチウム、酸化アルミニウム、部分水和酸化アルミニウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化アンモニウム、炭酸カリウム、硫酸カリウムアルミニウム、塩化マグネシウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、臭化カリウム、分子篩、クレイのような乾燥剤、又は本発明にとって有用な他のいかなる乾燥材料も利用する。

経口補水療法（ＯＲＴ）は、下痢に伴う脱水症状のための簡単、安価、効果的な治療法である。 ＯＲＴは経口投与される塩と糖の溶液からなり、これは経口補水溶液（ＯＲＳ）、経口補水処方（ＯＲＦ）とも呼ばれる。 ＯＲＴは世界中で使用されているが、開発途上国において最も重要であり、そこではＯＲＴは、下痢による死（５歳未満の子供の第２の主要死因である）から何百万人もの子供を救っている。

経口補水液中の乳酸菌を投与してその有効性を評価する試験がいくつか行われている。 例を挙げると、あらゆる原因による急性発症下痢患者に経口補水液中のラクトバチルスＧＧを投与してその有効性を評価する多施設試験を行った。 その結果、ラクトバチルスＧＧを含有する経口補水液を急性下痢の子供たちに投与することは、安全であり、下痢の期間が短くなり、経過が長引く可能性が減り、退院が早まることが示された（Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ． ２０００ Ｊａｎ；３０（１）：５４−６０）。 しかし既に述べたように、問題は、凍結乾燥乳酸菌が周囲温度で生存能力を劇的に失うことなく相当の保存寿命を有するためには、粉末母材中の水分活性が低い（普通α _ｗ ＜０．２）ことを必要とすることである。

経口補水液粉末が極端に吸湿性（周囲環境から水分子を吸引する能力）なため、凍結乾燥乳酸菌をＯＲＳ粉末と混合して、周囲条件での保存中により長い期間細菌の生存能力を保つことはこれまでできなかった。 プロバイオティク生菌培養物の保存品質が一定しないと、急性水様性下痢の患者に投与される製剤中の用量と活性が予想外に減少するが、これは特に発展途上国において解決するのが難しい技術上の問題である。

保存の観点から、本発明では、なんらかの塩混合物が、凍結乾燥ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）と混合された場合、パッケージ内で首尾よく乾燥剤として働けるかどうかを評価するために、ある方法を試験した。 パッケージは、ＵＳ２００７０１６０７８９Ａ１に記載されているホイル材料から作製した。 驚いたことに、無水ＯＲＳと混合した凍結乾燥Ｌ． ロイテリ培養物は、３０℃で少なくとも１２カ月の保存寿命に到達することに成功した。 このことは、より低温では保存時間が長くなることを意味することが知られている。 このタイプの有利な保存安定性データはこれまで記載されていない。 本発明者らが知る限り、世界中のどこにもこのような製品は市販されていない。

要約すると、いかなる形態のパッケージ中でも、凍結乾燥乳酸菌をＯＲＳ粉末と混合して、周囲条件での保存中に、より長い期間細菌の生存能力をなおも保つことは不可能であった。 この問題の解決は、本発明により２種の異なる乾燥剤を用いて２段階で水分を除去することにより解決される。 第１の乾燥剤は、乾燥剤として働き、包装する際に微生物を取り囲む無水ＯＲＳであり、第２の乾燥剤は、ホイル中にあり、保存中に生じる可能性のある水分を吸収する。 無水ＯＲＳを用いる場合、無水ＯＲＳは、経口補水液としての目的を果たすと同時に、除去する必要のない乾燥剤としても機能する。

本発明は、水分に感受性の製品を包装し、その結果としてそのような製品の保存寿命を延長する、より具体的には経口補水液（ＯＲＳ）粉末と混合した凍結乾燥乳酸菌の保存寿命を延長する方法を提供する。 パッケージは２種の乾燥剤を有する。 すなわち、ここで１つの乾燥剤はホイル材料中に一体化されており、第２の乾燥剤は無水ＯＲＳである。

本発明の第１の目的は、経口補水液（ＯＲＳ）粉末と混合した凍結乾燥乳酸菌の保存寿命を延長する製品を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、凍結乾燥乳酸菌の保存のために２段階で水分を除去する２種の乾燥剤を有するパッケージを提供することである。

もう１つの目的は、２種の乾燥剤を有する小袋を提供することである。 すなわち、一方の乾燥剤は、ＵＳ２００７０１６０７８９Ａ１に記載のホイル材料中に一体化され、他方の乾燥剤は、小袋内に制限なく存在し、製品を取り囲んでいる無水ＯＲＳである。

本発明の他の目的及び利点は読者にとって自明となろうが、これらの目的及び利点は本発明の範囲に入ることを意図している。

異なる乾燥剤との＋３０℃におけるラクトバチルス・ロイテリの生存能力を月単位で１２カ月まで示すグラフである。 １）Ｌ． ロイテリ＋乾燥剤入りホイル２）Ｌ． ロイテリ＋乾燥剤入りホイル＋無水ＯＲＳ３）Ｌ． ロイテリ＋乾燥剤入りホイル＋非無水ＯＲＳ４）Ｌ． ロイテリ＋乾燥剤のないホイル＋無水ＯＲＳ５）Ｌ． ロイテリ＋乾燥剤のないホイル＋非無水ＯＲＳ

本発明の方法及び装置は、水分に感受性の製品の包装、その結果そのような製品の保存寿命の延長、より具体的には経口補水液（ＯＲＳ）粉末と混合した凍結乾燥乳酸菌の保存寿命の延長を提供する。 パッケージは２種の乾燥剤を有する。 すなわち、１つの乾燥剤はアルミホイル中に一体化され、第２の乾燥剤は無水ＯＲＳである。 好ましくはホイルはアルミニウム製であり、ポリエチレンやラッカーといった適切な保護コーティングを有する。 その理由は、アルミホイルは今までに最もよく知られている防湿バリアであり、本明細書で論じている製品は水分に非常に感受性であるからである。 パッケージのバリア特性のテストは、当技術分野で知られているように行う（Ａｌｌｉｎｓｏｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２２１巻、１〜２号、２００１年６月１９日、４９−５ページ）。

本明細書で使用する場合の「無水ＯＲＳ」という用語は、ＯＲＳ粉末の各成分が無水品質である、すなわち水を含まないことを意味する。 各成分は無水形態で購入でき、又は当技術分野で知られている方法で無水にすることもできる。

本発明の目標は、凍結乾燥乳酸菌を以下のように生存させることのできる方法及び装置を提供することである。 すなわち＋３０℃付近で保存した際の１２カ月の終わりに、少なくとも１０Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｇ（５×１０Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｇで開始した場合）が存在すること、この温度と出発点において、好ましくは少なくとも１０Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｇ、最も良には１０Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｇが存在することである。 この安定性は、製品を＋２５℃で１８カ月保存した場合には最大でも損失が同量である、温度がさらに低い場合には損失が低下することに相当することが知られている。 このことは、＋２５℃における１８カ月の目標として、少なくとも１０Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｇ（５×１０Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｇで開始した場合）が存在すること、同じ温度と出発点において、好ましくは少なくとも１０Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｇ、最も良には１０Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｇが存在することを意味することになろう。

本発明の特徴は、以下の実施例を参照することにより、より明確に理解されようが、これらの実施例は本発明を限定するものと見なすべきではない。

（例１）
試験したパラメータ 実施例において、本発明の方法は、加速試験として３０℃で、少なくとも１２カ月の保存寿命に到達することを目的として、小袋中でＯＲＳ溶液塩を凍結乾燥Ｌ． ロイテリと混合できるかどうかを評価するために試験する。 加速試験は、より低い温度では保存時間がより長くなることを意味することが知られている。 新しい製造方法は、ＵＳ２００７０１６０７８９Ａ１に記載の乾燥剤を有する新規のホイル材料の使用を含む。

行ったアッセイは表１に示す５つの異なるテストパラメータからなる。

（例２）
無水ＯＲＳ粉末中Ｌ． ロイテリのミックスを含む小袋の製造 無水ＯＲＳ粉末は以下のものを含んでいた：
Ｌ． ロイテリ ＤＳＭ１７９３８： ６８．０００ｍｇ／小袋（約１０Ｅ＋１１ＣＦＵ／ｇ）
グルコース（無水）： ３７８１．０００ｍｇ／小袋クエン酸ナトリウム（無水）： ８６６．０００ｍｇ／小袋塩化カリウム： ３７９．０００ｍｇ／小袋塩化ナトリウム： ３６５．０００ｍｇ／小袋硫酸亜鉛； ４，０００ｍｇ／小袋合計 ５４６３．０００ｍｇ／小袋

ブレンドは、周囲温度で乾燥剤を有するアルミホイルバッグ（１０ｃｍ×１２ｃｍ、包装材料ＰＥＴ１２／ＰＥ／ＡＬＵ１２／ＰＥ／ＰＥ＋乾燥剤／ＰＥ、Ａｌｃａｎを使用）に充填した。 充填はＢｉｏＧａｉａ Ｌｕｎｄにある微生物学研究室においてＬＡＦベンチ（Ｈｏｌｔｅｎ Ｌａｍｉｎａｉｒ Ｍｏｄｅｌ Ｓ−２０１０ １．２ Ｈｅｔｏ−Ｈｏｌｔｅｎ Ａ／Ｓ製、デンマーク）内で行った。 各バッグに、５．４６ｇのＯＲＳ粉末（Ｌ．ロイテリを含む）を秤（ＸＰ−６００、Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＧｍｂＨ製、ドイツ）を用いて加えた。 充填したアルミホイルバッグは、次いでホイルシーリング装置（Ｆ４６０／２型、Ｋｅｔｔｅｎｂａｕｍ Ｆｏｌｉｅｎｓｃｈｗｅｉｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ製、ドイツ）を用いてヒートシールした。 アルミホイルは、特にアルミニウムが０．０２５ｍｍより厚く、したがって最も好ましい場合、実際上、水分透過性が全くないので、シールが、この封入容器の敏感な部分であり、このことは、用いるシーリング装置は、漏れの全くない破れないシールができる高品質であり、当技術分野で知られているように十分なものでなければならないことを意味する。 これらのバッグは例２で述べる試験にも用いられた。

（例３）
凍結乾燥Ｌ． ロイテリＤＳＭ１７９３８を経口補水液（ＯＲＳ）粉末中で３０℃、１２カ月間保存した場合の安定性試験 Ｌ． ロイテリＤＳＭ１７９３８粉末商品番号１０１２ ＢｉｏｂＧａｉａ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン（製品規格ＰＳ１３７）の生存能力は、経口補水液粉末（Ｎｏｒｆｏｏｄｓ ＡＢ、スウェーデンより入手）中で評価する。 無水ＯＲＳ粉末は例１に従って作製する。 テストパラメータは表１に従って実施する。 試料は、Ｌｕｎｄ（スウェーデン）にあるＢｉｏＧａｉａ ＡＢにおいて、３０℃／６５％ＲＨの人工気候キャビネット中に保管される。

（例４）
結果は図１に示す。 一体化された乾燥剤と無水ＯＲＳを有するホイル中に保存された微生物（図１のグラフ２）は、意外にもＯＲＳなしで保存された微生物（図１のグラフ１）とほぼ同じ生存能力を示した。

一体化された乾燥剤を有するホイル中に保存された微生物は、保存期間中、乾燥剤なしのホイル中で保存された微生物よりも良好な生存能力を示した。 なぜならばホイル中の乾燥剤が、保存中バッグ内のほとんどすべての水分を吸収するからである。 しかし乾燥剤と非無水ＯＲＳを有するホイルを有するのみでは（図１のグラフ３）十分でないことが示される。 なぜなら生存能力が、一体化された乾燥剤と無水ＯＲＳを有するホイル中に保存された微生物（図１のグラフ２）に比べて低いからである。

結論として、無水ＯＲＳだけでも、一体化された乾燥剤を有するホイルだけでも、製品に十分な保存寿命を与えるのに十分でない。 それら両方を共に含む保存が、保存寿命の終わりに活性目標を達成する。

本発明は特定の実施形態に関して記載したが、数多くの変形形態、変更形態及び実施形態が可能であることが理解されよう。 したがってそのような変形形態、変更形態及び実施形態は、すべて本発明の趣旨及び範囲の内にあると見なすべきである。