ステビオールグリコシドの酵素的修飾方法、それによって得られる修飾ステビオールグリコシド、およびそれらの甘味料としての使用

本発明は概して、ステビオールグリコシドの製造に関する。特に、本発明は、新規ステビオールグリコシドへのステビオールグリコシドの酵素的修飾方法、およびその甘味料としての使用に関する。

甘味料は、食品、飲料および菓子産業において最も一般的に使用される成分としてよく知られている。甘味料は、製造中またはスタンドアローン使用のために、例えば、適切に希釈された場合または卓上用甘味料として、最終食品に組み込まれ得る。甘味料には、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜などの天然甘味料、ならびにアスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなどの人工甘味料が含まれる。

ハーブ植物ステビア・レバウジアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bertoni)の葉、キク科(Asteraceae)[キク科雑草(compositae)]科の根粒性多年草は、ステビオールグリコシドである天然の甘味化合物の高品種を含む(Brandle et al. 1998)。ステビオシド(乾燥葉5−10%w/w)とレバウジオシドA(2−4%w/w乾燥葉)が最も豊富で、それらはスクロース(0.4%水溶液)より約200〜300倍甘い。したがって、それらは、スクロースおよび人工(合成)甘味料のための「バイオ」代替物と考えられ得る(Geuns 2003; Goyal et al. 2010; Puri et al. 2011)。

甘味に加えて、高用量および通常の消費量における、いくつかのステビオールグリコシドは、抗酸化剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、胃腸保護剤(下痢止め剤)のような多様な薬理学的性質を有し、それらは、腎機能、血圧、および血糖値に正の効果があるようである(Chatsudthipong and Muanprasat 2009; Madan et al. 2010; Brahmachari et al. 2011; Lemus−Mondaca et al. 2012; Shivanna et al. 2013)。それらは、肥満、糖尿病、高血圧、フェニルケトン尿症、心臓病および虫歯に苦しむ人々にとって有益であり得る (Yadav and Guleria 2012)。ステビオールグリコシドは非カロリーであり、発がん性ではなく、遺伝毒性ではなく、ヒトの生殖/発生毒性に関係しない(European Food Safety Authority, 2010)。

構造的に、ステビオールグリコシドは、アグリコンとしてエント−13−ヒドロキシカウル−16−エン−19−酸を有するが、炭水化物組成物とは異なる(図1参照)。

13−tert−水酸基のグルコース単位数と19−カルボキシル基のグルコース単位数との比は、甘味およびステビオールグリコシドの味の質との関係を有するようである(Darise et al. 1984)。例えば、レバウジオシドAはステビオシドより苦味が少ない。ステビオシドの酵素的グルコシル化研究は、グリコシド結合特異性がステビオールグリコシドの官能特性にも影響を及ぼすことを示している。Fukunagaら(1989)は、C−13位でのステビオシドのモノ−およびジ−(α1→4)−グルコシル化の両方が、甘味の強度および品質の両方において顕著な改善を伴う生成物を与えることを見出した。しかしながら、C−19位でのモノ−およびジ−(α1→4)−グリコシル化の両方は、苦味のある後味を増加させ、より低い甘味強度をもたらした(Fukunaga et al. 1989)。一方、C−19位のグルコース単位のC−6ヒドロキシル基へのα−結合グルコースの結合は、味の質において顕著な改善をもたらした(Lobov et al. 1991)。明らかに、グリコシド結合のアノメリック性は、甘さおよび苦さ味覚に大きな影響を与えないが、いくつかの最近の研究は、19−O−グルコシル部分に1つおよび2つのβ−結合グルコース単位をそれぞれ余分に有する、レバウジオシドDおよびレバウジオシドM、両レバウジオシドA誘導体は、両方ともレバウジオシドAおよび多くの他のステビオールグリコシドよりも望ましい味プロファイルを有する(Hellfritsch et al. 2012;特許文献1、特許文献2;Prakash et al. 2014)。レバウジオシドAと比較して、レバウジオシドDは甘味が増し、水および炭酸飲料系での苦味を減少させた。レバウジオシドMは、レバウジオシドAと比べて苦味が減少したが、水溶液中の類似の甘味強度を示した。酸性化した水では、レバウジオシドAと比較して、苦味の減少およびより高い甘味が認められた(Prakash et al. 2014)。更に、ステビオシドのC−19位のグルコース単位のC−2ヒドロキシル基への(α1→2)−または(β1→2)−(レバウジオシドE)結合グルコースの結合は、ステビオシドの感覚刺激生成物を改善し、同様の甘味を有するが苦味を低減した化合物を生成した(Ye et al. 2013)。

ステビア甘味料の商業化の成功の主な欠点は、そのわずかな苦味と渋み(特にステビオシド)である。これらの望ましくない特性は、ステビオールグリコシドのグリコシル部分を修飾することによって低減または排除することができる。

ステビオールグリコシドの化学修飾は、これらの化合物の味の質を改善する目的で行われてきた。例えば、ステビオシドおよびレバウジオシドAは、(ソジオスルホ)プロピル[(CH₂)₃SO₃Na]部分による19−O−グルコシル残基の置換によって改善され得る(DuBois et al. 1981; DuBois and Stephenson 1985)。更に、ステビオシドのいくつかの類似体は、別の単糖(例えば、β−D−Xyl、α−L−Ara、α−D−Man、またはα−L−Rha)のC−19−O−β−D−グルコシル部分を置換すること、あるいは単糖(α−L−Rhaまたはα−L−Qui)を有するC−19β−D−グルコシル部分の伸長によって合成されている。しかしながら、選択的保護−脱保護合成戦略において多段階配列の必要性のために、ステビオールグリコシドを修飾するための化学的方法の適用は実用的でないと一般に考えられている。更に、有機溶媒および金属塩の使用は、食品産業において得られた誘導体の降心に問題を引き起こす。これらの問題を克服するために、生物触媒の代替物がより好ましく、「グリーン」ケミストリーの目的にも好ましい。

有望な手順は、酵素的なトランスグリコシル化の反応にステビオールグリコシドを供することであり、それによって分子に新しい単糖残基を導入する。単糖残基の数、位置およびアノマー性(anomericity)に依存して、化合物の味の質および効力は変化する。

味を改善するために、UDP−グルコシルトランスフェラーゼ(UGTアーゼ)(特許文献3、特許文献2)およびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(CGTアーゼ)の間で、異なる酵素システムを用いてステビオールグリコシドの炭水化物部分の酵素的修飾を行った(Darise et al 1984; Li et al 2013;特許文献4)。UGTaseは、高い位置特異性を有する効率的な酵素であり、α−またはβ−結合グルコースの特定の位置への転移を触媒する。しかしながら、UGTaseは、グリコシル供与体として高価なヌクレオチド活性化糖を必要とするため、工業的用途にはそれほど魅力的ではない。CGTaseは、カップリングおよび不均化反応を触媒し、グルコース残基をデンプンまたはシクロデキストリンから受容体分子に転移させる。分子間のトランスグルコシル化反応は、CGTase酵素の受容体特異性のために、ステビオールグリコシドの非還元末端グルコース残基のC−4−ヒドロキシル基でのみ起こると予想される。しばしば高収率が得られるが、CGTaseは、ほとんどC−13およびC−19にα−D−グルコシル伸長を有する化合物の混合物であるステビオールグリコシドを生成するC−13/C−19レジオ特異性が低い。更に、CGTase酵素によって導入された(α1→4)結合は、唾液中に存在するデンプン分解酵素によってヒトの口腔内で急速に加水分解され、それによりステビオールグリコシドのカロリー含量を増加させる。したがって、(α1→6)および(α1→3)結合のようなα−アミラーゼ耐性グリコシド結合の導入は、低カロリー食品およびゼロカロリー食品に対する消費者の要求に答えるので、より望ましい。

米国特許出願公開第2013/00771521号明細書

国際公開第2014/122227号

国際公開第2013/176738号(A9)

米国特許出願公開第2014/0227421号明細書

したがって、本発明者らは、酵素的に修飾されたステビオールグリコシドを提供するための新規な手段および方法を目指した。特に、彼らは、非修飾ステビオールグリコシドと比較して、減少した苦味および/またはより高い甘味を示す化合物を産生する酵素的方法を開発することに着手した。好ましくは、該方法は工業規模で経済的に魅力的であり、好ましくはグリコシル供与体として高価なヌクレオチド活性化糖を必要としない。

この目的のために、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)のような、酵素の大部分のメンバーが一般に安全と認められる(GRAS)というステータスを有する、種々の乳酸桿菌(lactobacilli)のグルカンスクラーゼ酵素およびフルクタンスクラーゼ酵素のグルコシル化潜在性をスクリーニングした。グルカンスクラーゼは細胞外酵素であり、これは乳酸菌においてのみ起こることが報告されている。それらは、安価な供与体基質スクロースからα−グルカンポリマーを合成する。グルカンスクラーゼ酵素に依存して、種々のグリコシド結合(の混合)、すなわち(α1→2)−、(α1→3)−、(α1→4)−および(α1→6)結合がそのグルカン生成物に導入される(Leemhuis et al. 2013)。グルカンスクラーゼ酵素によって使用されるグルコシル供与体基質スクロースの低コストは、それらの工業的用途にとって大きな利点である。最も重要なことに、グルカンスクラーゼ酵素によって導入された(α1→2)−、(α1→3)−および(α1→6)結合は、唾液中に存在するアミロリシス酵素によって口腔内で加水分解されない。種々のラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株からの種々の産物特異性を有する野生型および変異体グルカンスクラーゼおよびフルクタンスクラーゼ酵素からなる100を超える酵素を、ステビオールグリコシドレバウジオシドAをグルコシル化する能力についてスクリーニングした。セミ分取NP−HPLCによりレバウジオシドAグルコシドを単離し、その構造をMALDI−TOF質量分析および1D/2D ¹H/¹³C NMR分光法により解明した。新しいレバウジオシドAグルコシドの味覚属性を決定するために官能評価を行った。

驚くべきことに、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180由来のグルカンスクラーゼGTF180(GenBankアクセッション番号AY697430)のみがレバウジオシドAをグルコシル化することができたことが判明した。レバウジオシドAグルコシル化生成物のNMR構造分析は、GTF180が、C−19β−結合グルコース残基においてのみ特異的にレバウジオシドAをグルコシル化することを示した。興味深いことに、いくつかのGTF180点変異体は、レバウジオシドAに対してより高いトランスグルコシル化活性を示した。1つの変異体Q1140Eは、約96%のレバウジオシドA変換率を示した。ステビオシドの修飾に関しても同様の結果が観察された。

したがって、一実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシド基質をグルコース供与体およびラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180株のグルカンスクラーゼGTF180、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の存在下でインキュベートすることを含む、修飾ステビオールグリコシドを酵素的に提供する方法を提供する。

私たちの知るところでは、グルカンスクラーゼを用いたステビオシドのグルコシル化に関する唯一の報告がある。Musaらは、ステビオシドの生物変換におけるロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)SK24.002からのアルテルナンスクラーゼによる酵素修飾が、ステビオシドの苦味を完全にまたは部分的に除去することを報告している。最適化された反応条件では、ステビオシドで43.7%の最大トランスグルコシル化収率が達成された。1〜3個のα−グルコース単位が結合したステビオシドグリコシドが得られた。フォローアップ研究では、生成物の構造が、13−{[α−D−グルコピラノシル−(1→3)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−α−D−グルコピラノシル−(1→3)−β−D−グルコピラノシル−(1→2)−β−D−グルコピラノシル]オキシ}エント−カウル−16−エン−19−酸β−D−グルコピラノシルエステルであると特徴づけられた(Musa et al. 2014)。したがって、Musaらの方法は、異なる酵素を使用し、より低い収率を示し、C−19位ではなくC−13位で異なるタイプの修飾、すなわちα−グルコシル化をもたらす。

本発明の一実施形態では、ステビオールグリコシドは、C−19β−結合グルコース残基において少なくとも1つのα−グルコース残基により修飾される。例えば、ステビオールグリコシドには、(α1→6)、(α1→3)グリコシド結合、またはそれらの組み合わせを介して1つ以上のグルコースが備わる。特定の態様では、修飾は、(α1→6)グリコシド結合(β−イソマルトース)または(α1→3)グリコシド結合(β−ニゲロース)を介した1つのグルコースの付加を含む(図5A)。別の特定の態様では、修飾は、β結合グルコースにおける(α1→6)グリコシド結合を介したグルコシルグルコース単位の付加を含む。単位内では、グルコース残基は(α1→6)グリコシド結合(イソマルトース)または(α1→3)グリコシド結合(ニゲロース)(図5Bおよび5C)を介して結合することができる。

ステビオールグリコシドは、複数の位置で修飾され得る。例えば、ステビオールアグリコンのC−13位および/またはC−19位(複数可)で修飾が起こり得る。レバウジオシドDおよびレバウジオシドMの魅力的な味覚特徴の観点から、ステビオールグリコシドは、好ましくは、少なくともステビオールグリコシドのC−19位で修飾されている。

より好ましくは、修飾ステビオールグリコシドは、ステビオールグリコシドのC−19位でのみ修飾される。例えば、一実施形態では、本発明は、ステビオールアグリコンのC−19位においてのみ単一のグルコース残基により修飾された修飾ステビオールグリコシドの酵素的生産方法を提供する。一実施形態では、修飾は、C−19β結合グルコース残基における単一の(α1→6)グルコースの付加を含む。

ステビオールグリコシド基質は、いかなるタイプのものであってもよい。例えば、それは、ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドA、レバウジオシドC、レバウジオシドD、レバウジオシドEを含むレバウジオシドおよびズルコシド化合物からなる群から選択される。一実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、ステビオールグルコシドのC−19位に少なくとも1つの単糖部分を有する。

特定の一実施形態では、ステビオールグリコシド基質はレバウジオシドである。本発明者らは、C−19位でのレバウジオシドAのα−グルコシル化が、レバウジオシドDおよびレバウジオシドMよりも類似またはより良好な味プロファイルを有するレバウジオシドDおよびレバウジオシドMアノマー異性体を生じることができると仮定した。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、レバウジオシドA[13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシルエステル]の酵素的修飾方法を提供する。

別の特定の実施形態では、ステビオールグリコシド基質はステビオシドであり、最も豊富で最も苦い味の1つである、ステビア抽出物に存在するステビオールグリコシドである。

典型的には、乾燥重量に基づき、ステビアの葉に見られる4つの主要なステビオールグリコシドは、ズルコシドA(0.3%)、レバウジオシドC(0.6−1.0%)、レバウジオシドA(2−4%)およびステビオシド(5−10%)である。ステビア抽出物において合理的な量で同定される他のグリコシドは、レバウジオシドB、D、E、およびF、ステビオールビオシドおよびルブソシドを含む。これらの中でも、現在、商業的規模では、ステビオシドおよびレバウジオシドAのみが入手可能である。

ステビオールグリコシドは、典型的には水または有機溶媒抽出のいずれかを含む当該技術分野で公知の方法を用いて葉から抽出することができる。超臨界流体抽出法および水蒸気蒸留法もまた記載されている。超臨界CO₂、膜技術、および水、またはメタノールおよびエタノールなどの有機溶媒を使用するステビア・レバウジアナ(Stevia rebaudiana)からのジテルペン甘味グリコシドの回収方法も使用することができる。

米国特許出願公開第2014/343262号明細書は、以下の工程を含む、ステビオールグリコシドを精製する方法を開示する:a.吸着されたステビオールグリコシドを有する少なくとも1つのカラムを提供するために、吸着樹脂を充填した複数のカラムを含むマルチカラムシステムにステビオールグリコシドの溶液を通す工程、およびb.ステビオールグリコシドを吸着した少なくとも1つのカラムからの低含量のレバウジオシドX(米国特許出願公開第2014/0227421号明細書; Prakash et al 2014)を有する画分を溶出して、ステビオールグリコシドを含む溶出溶液を提供する工程。

レバウジオシドAは一般的に≦80%の純度で入手可能である。主な不純物は、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドD、ズルコシドA、レバウジオシドFおよび他のステビオールグリコシドを含む。多くの研究は、高い回収率での高純度のレバウジオシドAの回収に焦点を当てていた。米国特許第5,962,678号明細書は、80%純度のレバウジオシドAを得るために無水メタノール溶液を用いてレバウジオシドAを再結晶化することを開示している。無水メタノールで再結晶を何度も繰り返すことにより、レバウジオシドAの純度を95%以上に高めることができる。米国特許出願公開第2006/0083838号明細書は、エタノールと4〜15%の水とを含む溶媒による再結晶によるレバウジオシドAの精製を開示している。特願昭第55−23756号は、水性エタノール(>70%)からの結晶化によりレバウジオシドAおよびステビオシドを精製して純度80%のレバウジオシドAを得る方法を開示している。米国特許出願公開第2007/0082103号明細書は、エタノール水溶液からの再結晶化によってレバウジオシドAを精製する方法を開示しており、粗レバウジオシド(60%)からの2段階再結晶により97%収率で少なくとも純度98%のレバウジオシドAが生成される。米国特許第8,791,253号明細書は、単一の再結晶化工程のみを使用して、実質的に純粋なレバウジオシドA組成物を提供する。

本発明の方法におけるステビオールグリコシド基質の濃度は、例えば、基質の種類、所望の修飾等によって異なる。典型的には、反応混合物は、少なくとも20mM、好ましくは少なくとも30mM、より好ましくは少なくとも50mM、例えば60、70、80、90〜100mMの修飾されるステビオールグリコシドを含む。最大濃度は、とりわけ、水性反応媒体中の基質溶解度に依存する。例えば、基質として50〜100mMのレバウジオシドAまたはステビオシドを用いて良好な結果が得られた。

本発明の方法は、グルコース供与体としてスクロースを使用する。スクロースは安価で広く入手可能である。スクロースが少なくとも50mM、好ましくは少なくとも100mM、より好ましくは少なくとも500mMの濃度で使用される場合、良好な結果が得られた。例えば、反応混合物は、少なくとも500mM、600mM、700mM、800mM、900mMまたは1Mスクロースを含む。2Mまたは3Mまでのより高い濃度を使用することもできる。グルコース供与体は、反応の開始時にその総量で添加され得る。いくつかの実施形態では、バッチ法式でスクロースを添加することが有利である。例えば、スクロースは、バッチ方式で、例えば、開始時に、1.5時間後および3時間後に、少なくとも1μM、より好ましくは少なくとも2μMの最終量まで添加される。

反応は、典型的には約20〜70℃の温度、3〜7のpH範囲で実施される。好ましくは、約37℃の温度が使用される。

反応は、所望の量の修飾ステビオールグリコシドが生成されるまで進行させる。典型的には、インキュベーションは、約1時間〜一晩にわたり実施される。

当業者は、所与の反応条件下で所望の程度の酵素修飾を得るために使用されるGTF180グルカンスクラーゼ酵素の量を決定することができるであろう。例えば、1〜50U/mLを使用することができる。好ましくは、少なくとも3U/mLが使用される。経済的理由から、35U/mLまで使用することが有利であり得る。一実施形態では、5〜30U/mLが使用される。1単位(U)の酵素は、25mMの酢酸ナトリウム(pH4.7)、1mMのCaCl₂、および37℃での1Mのスクロースを含む反応混合物中で1分間当たり1μmolの単糖を生成するのに必要な酵素の量として定義される。

一実施形態では、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株180由来の野生型GTF180グルカンスクラーゼが使用される(GenBankアクセッション番号AY697430)。別の実施形態では、変異体GTF180グルカンスクラーゼが使用される。本明細書中で使用される場合、変異体GTF180グルカンスクラーゼは、野生型アミノ酸配列と比較して、1つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および/またはアミノ酸挿入を含む酵素を指す。

好ましい実施形態では、本発明によるステビオールグリコシドの酵素的修飾のためのGTF180変異体は、S1137、Q1140、L981および/またはW1065(GenBank配列AY697430に基づくナンバリング)位に置換変異体を含む。好ましくは、変異体は非保存的置換、すなわち天然アミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸変化をもたらす変異体である。例えば、前記変異体は、以下のアミノ酸置換の1つ以上を有する:S1137Y、Q1140E、L981A、W1065L/E/Q/F。

別の実施形態では、変異体GTF180は、欠失変異体または切断型変異体であり、少なくとも10アミノ酸のストレッチがN−および/またはC−末端から除去される。一態様では、切断型変異体は、N末端可変ドメインが欠失している残基742−1772を含むGTF180−ΔNである。例えば、GTF180全長野生型タンパク質の117kDaのN末端切断型(741残基)断片であるGTF180−ΔNで良好な結果が得られた。GTF180−ΔNは完全に活性であり、全長酵素と同様のサイズおよび結合分布を有するα−グルカンポリマーを産生する(Kralj et al. 2004a)。レバウジオシドAグルコシル化生成物のNMR構造分析は、GTF180−ΔNが、C−19β−結合グルコース残基においてのみ特異的にレバウジオシドAをグルコシル化することを示した。興味深いことに、いくつかのGTF180−ΔN置換変異体は、レバウジオシドAに対してGTF180−ΔNよりもはるかに高いトランスグルコシル化活性を示した。1つの変異体Q1140Eは、GTF180−ΔNによる約55%のレバウジオシドA変換と比較して約96%のレバウジオシドA変換を示した(図3および図4)。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、例えばQ1140、S1137、L981および/またはW1065の位置に、1つ以上のアミノ酸置換を有するGTF180−ΔNを用いる。具体的な例示的変異体酵素には、GTF180−ΔNQ1140E、GTF180−ΔNQ1140F、GTF180−ΔNQ1140N、GTF180−ΔNQ1140Y、GTF180−ΔNQ1140R、GTF180−ΔNS1137Y、GTF180−ΔN L981A、GTF180−ΔNW1065L、GTF180−ΔNW1065E、GTF180−ΔNW1065QおよびGTF180−ΔNW1065Fを含む。

別の態様では、切断変異体は、N末端可変ドメインおよびN末端ドメインV断片(最初の793個のN末端アミノ酸に対応する)と、ドメインVC末端断片(最後の136個のC末端アミノ酸に対応する)が欠失して(Meng et al. 2015a)、アミノ酸794−1636からなるGTF180変異体との両方をもたらすGTF180−ΔNΔVである。「触媒コア」と見なすことができるこのGTF180−ΔNΔV切断変異体は、全長GTF180野生型と比較して約50%のサイズの減少を有し、完全に活性であり、GTF180野生型と同様のグリコシド結合分布を生成するが、高分子量の多糖類合成においては、著しく害される。

本発明の切断変異体は、例えばその触媒特性を改善するために付加的な置換変異体(複数可)を更に含んでいてもよい。一実施形態では、変異体はGTF180−ΔNΔVであり、更に位置(複数可)S1137、Q1140、L981および/またはW1065において置換変異体を含む。例えば、前記変異体は、以下のアミノ酸置換の1つ以上を有する:S1137Y、Q1140E、L981A、W1065L/E/Q/F。具体的な例示的変異体酵素には、GTF180−ΔNΔVQ1140E、GTF180−ΔNΔVQ1140F、GTF180−ΔNΔVQ1140N、GTF180−ΔNΔVQ1140R GTF180−ΔNΔVQ1140Y、GTF180−ΔNΔVS1137Y、GTF180−ΔNΔVL981A、GTF180−ΔNΔVW1065L、GTF180−ΔNΔVW1065E、GTF180−ΔNΔVW1065QおよびGTF180−ΔNΔVW1065Fを含む。

変異GTF180グルカンスクラーゼは、例えば、Van Leeuwenらにより説明され、それは、GTF180−ΔN酵素の特定のアミノ酸残基の変異誘発を報告し、スクロースから修飾されたエキソポリサッカライド(mEPS)を産生する12の変異体酵素を産生した(van Leeuwen et al. 2009)。本発明者らは、GTF180−ΔNの単一変異体のうちの2つであるQ1140EおよびS1137Yが、GTF180−ΔNよりもレバウジオシドAに対するトランスグルコシル化活性がはるかに高く、GTF180−ΔNによる約55%レバウジオシドA変換と比べて、それぞれ約96%および約73%のレバウジオシドA変換を示すことを見出した(図3および図4)。変異体Q1140Eは主としてモノ−α−グルコシル化レバウジオシドAを産生したが、GTF180−ΔNおよび変異体S1137Yは少なくとも8までのDPを有する複数のα−グルコシル化形態を産生した。α−グルコシル化生成物のNMR構造解析は、GTF180−ΔNおよび変異体Q1140EおよびS1137Yが、C−19位においてのみ特異的にレバウジオシドAをグルコシル化することを示した。3つの酵素は、C−19β−結合グルコースにおいて専ら(α1→6)結合グルコースでレバウジオシドAをグルコシル化し、RebAG1を生成した。GTF180−ΔNおよび変異体S1137Yのジ−グルコシル化レバウジオシドA生成物は、末端α−グルコース残基において結合した(α1→3)結合グルコース(約75%)または別の(α1→6)結合グルコース(約25%)による両方のRebAG1の伸長であった。したがって、特に好ましい変異体は、GTF180−ΔNのQ1140EおよびS1137Yを含む。

GTF180−ΔN変異体L981AおよびW1065L/E/Q/F(Meng et al. 2015b)は、レバウジオシドAをα−グルコシル化することができるが、重合(すなわち、オリゴ糖およびグルカン形成)活性をほとんど示さない。これは、下流の処理、単糖、二糖、オリゴ糖およびグルカンからの伸長レバウジオシドA生成物の精製の間の明確な利点である。最も重要な副反応であるα−グルカン合成を排除することにより、より高いグリコシル化収率がレバウジオシドAについて得られた。200mMスクロースにおいて、および1.5時間のインキュベーション時間で、これらの変異体は、レバウジオシドA上のGTF180−ΔNおよび変異体Q1140EおよびS1137Yと同等またはそれ以上のトランスグルコシル化活性を有する。レバウジオシドAを受容体分子として観察すると、変異体Q1140Eもステビオシドを主にモノ−α−グルコシル化生成物に変換した。したがって、一実施形態では、変異体酵素は変異体L981Aおよび/またはW1065L、W1065E、W1065Q、W1065Fを含む。

また、ステビオールグリコシドの感覚刺激特性を増強または改善するために、例えば、甘味を完全に増強するために、または苦味および/もしくはステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドAもしくはステビオシドの後味を部分的に除去するために、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180株のグルカンスクラーゼGTF180、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の使用が本明細書において提供される。

レバウジオシドAを修飾するのに有用な置換変異体のスクリーニングにおいて、レバウジオシドAをα−グルコシル化することができない不活性変異体または酵素を含む反応混合物が、レバウジオシドAの経時的な漸進的沈殿によりに濁ったことが観察された一方で、レバウジオシドAをα−グリコシル化することができる活性酵素を含むものは透明のままであった。理論に縛られることを望むものではないが、レバウジオシドAにグルコース部分を付加すると、その溶解性が増大する。この現象は、好ましくは最終レバウジオシドA濃度が最低50mMの場合には約6時間のインキュベーション後、最終レバウジオシドA濃度が最低30mMの場合には約16時間インキュベーション後に、反応混合物の外観を評価することによって活性変異体の迅速な選択を可能にする。例えば、反応がマイクロタイタープレートまたは他のタイプの透明容器で行われる場合、更なる特徴付けのために1つ以上の変異体を同定するには単なる目視検査のみで十分であり得る。

したがって、本発明はまた、ステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドAまたはステビオシドを修飾することができるグルカンスクラーゼを同定する方法であって、該方法は、 a)ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株180のGTF180の変異体のパネルを生成する工程、 b)ステビオールグリコシドのグリコシル化を可能にする条件下で、水性反応混合物中のグルコース供与体の存在下で、各変異体をステビオールグリコシドとインキュベートする工程、及び c)少なくとも部分的に反応混合物が濁るのを防ぐ能力を決定することにより、ステビオールグリコシドを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180のGTF180の少なくとも1つの変異体を選択する工程、 d)任意に、修飾ステビオールグリコシドの構造を更に決定すると共に、ステビオールグリコシドのC−19位を修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180の変異体GTF180を選択する工程、を含む。

好ましくは、変異体パネルは、N末端可変ドメイン(GTF180−ΔN)ならびに/またはNおよびC末端ドメインV断片(GTF180−ΔNΔV)を欠く切断型変異体のような、切断型GTF180酵素から出発して調製される。

一実施形態では、変異体パネルは、異なる置換変異体、好ましくは非保存的置換変異体を含む。例えば、スクリーニング方法は、Q1140位に異なる(非保存的)アミノ酸置換を有するGTF180(切断型)変異体のパネルを作製し、ステビオールグリコシドα−グルコシル化についてQ1140変異体を全て試験することを含む。本明細書の以下の図8を参照。

本発明の更なる態様は、本発明による方法によって得ることができる修飾ステロイドグリコシドに関する。一実施形態では、ステビオールグリコシドは、少なくとも1つのグルコース残基で修飾される。特定の態様では、修飾は、(α1→6)グリコシド結合(β−イソマルトース)を介して1つのグルコースの付加を含む(図5A)。別の特定の態様では、修飾は、β結合グルコースにおける(α1→6)グリコシド結合を介したグルコシルグルコース単位の付加を含む。単位内では、グルコース残基は(α1→6)グリコシド結合(イソマルトース)または(α1→3)グリコシド結合(ニゲロース)(図5Bおよび5C)を介して結合することができる。

本発明は、好ましくは、ステビオールグリコシドのC−19位で修飾されたステビオールグリコシドを提供する。より好ましくは、修飾ステビオールグリコシドは、ステビオールグリコシドのC−19位でのみ修飾される。例えば、一実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシドのC−19位で単一のα−グルコース残基でのみ修飾された修飾ステビオールグリコシドを提供する。一実施形態では、C−19位は、単一の(α1→6)結合グルコースで修飾される。

本発明の例示的な修飾ステビオールグリコシドは、 (i)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル(図5A) (ii)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル(図5B) (iii)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→3)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル(図5C)からなる群から選択される。

レバウジオシドAの19−O−グルコシル部分における(α1→6)グルコシル化のレバウジオシドAの甘味および苦味に対する効果を測定するために、新規レバウジオシドAグルコシドの1つ、つまり、(i)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステルをレバウジオシドAと比較して味の評価を行った。このために、ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた12人の試験者に、0から5の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、スコア0は甘味/苦味を示さない、5は非常に甘い/非常に苦いことを示す。新規レバウジオシドAグルコシドがレバウジオシドAと比較してより自然な甘味を増大させかつ苦味を減少させたことを示す明確な傾向が観察された(図7)。

また、低血糖甘味料としての本発明による修飾ステビオールグリコシドの使用、および場合によっては他の食用成分、甘味料および/または甘味増強剤と組み合わせた、有効量の修飾ステビオールグリコシドを消耗品に含めることを含む、消耗品を甘味化する方法が提供される。

更なる態様は、本明細書で提供される少なくとも1つの修飾ステビオールグリコシドを含む甘味組成物に関する。特定の実施形態では、甘味料組成物は、調理に使用されるか、または消費者によって飲料または他の食品に添加されるのに適した卓上甘味料である。そのような甘味料組成物は、包装してバルクで販売され得る。あるいは、特定の実施形態では、甘味料組成物は、消費者によって使用されるときに開封される一回分のパケットに包装される。特定の実施形態による甘味組成物の少なくとも1つの他の食用成分は、風味料、例えば、閾値知覚レベルでもしくはそれ未満もしくはわずかにそれを上回っている風味料、または消費者が容易に知覚できる量の風味料、流動剤、着色料、甘味料組成物が使用される飲料および他の食品中の取り扱いの容易さおよび/または改善された口当たりを提供する増量剤、ならびに/または他の適切な成分、またはそれらの任意の2つ以上の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、増量剤(複数可)は、甘味料組成物によって前もってもたらされた甘味を増大させることによって、改善された甘味プロファイルを提供することができる。特定の実施形態では、少なくとも1つの他の食用成分は、エリスリトール、D−タガトース、および/またはD−プシコースであり、例えば、これらの成分の2つ以上の組み合わせが、甘味料組成物に含まれ、組み合わせは、例えば、エリスリトールおよびD−タガトース、またはエリスリトールおよびD−プシコース、またはD−タガトースおよびD−プシコースである。

また、本発明による少なくとも1つの修飾ステビオールグリコシドを含み、任意に他の甘味料および/または甘味増強剤と組み合わされた消耗品も提供される。例えば、消耗品は、飲料、食料品、口腔ケア製品、たばこ製品、医薬品および栄養補助製品の群から選択される。

典型的には、食料品は、甘味化量の本発明の修飾ステビオールグリコシドと、少なくとも1つの他の食品成分とを含む。本明細書で使用される場合、「食品成分」という用語は、風味、栄養、色、増量剤、食感または他の口当たり、安定性、酸味度、増粘性、固化防止性等またはこれらの任意の2つ以上の組み合わせを提供するのに適した任意の食用物質を意味する。以下に更に論じるように、本明細書で開示する新規な食品に使用するのに適した典型的な食品成分には、穀物成分、炭酸または非炭酸水、他の甘味料、例えば、甘味化量の少なくとも1つの栄養甘味料、風味料、酸味料、着色料、増量剤などを含む。特定の例示的な(すなわち、非限定的な)実施形態では、食品は、一回分の量で包装される。本開示のこの態様の食品には、例えば、固形食品、ゲル、飲料などが含まれる。

適切な甘味料および甘味増強剤の例には、スクロース、フルクトース、グルコース、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ、キシロース,アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、アセスルフェームカリウム、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、およびそれらの混合物;トリロバチン、ヘスペレチンジヒドロカルコングルコシド、ナリンジンジヒドロカルコン、モグロシドVを含むモグロシド、羅漢郭抽出物、ルブソシド、ルブス抽出物、グリシフィリン、イソモグロシドV、モグロシドIV、シアメノシドI、ネオモグロシド、ムクロジオシドIib(mukurozioside Iib)、(+)−ヘルナンズルチン、4β−ヒドロキシヘルナンズルチン、バイユノシド、フロミソシドI、ブリオドコシド、ブリオシドブリオノシド、アブルソシドA〜E、シクロカリオシドA、シクロカリオシドI、アルビジアサポニンA−E、グリチルリチン、アラボグリシルリチン、ペリアアンドリン1−V、プテロカリオシドAおよびB、オスラジン、ポリポドシドAおよびB、テロスモシドA8−18、フィロズルチン、ハンキオシドE(Huangqioside E)ネオアスチルビン(neoastilbin)、モナチン、3−アセトキシ−5,7−ジヒドロキシ−4’−メトキシフラバノン、2R,3R−(+)−3−アセトキシ−5,7,4’−トリヒドロキシフラバノン、(2R,3R)−ジヒドロケルセチン3−O−アセテート、ジヒドロケルセチン3−O−アセテート4−メチルエーテル、ブラゼイン、クルクリン、マビンリン、モネリン、ネオクリン、ペンタジン、タウマチン、およびそれらの組み合わせを含む。上記の化合物のいくつかは、甘味増強剤および甘味料として知られている。甘味増強剤として使用される場合、それらは通常、甘味検出閾値未満で使用される。

飲料には、例えば、ジュース飲料(例えば、1つ以上の果汁および/または1つ以上の野菜ジュースを含む飲料)、水分補給飲料、炭酸飲料(CSD)、冷凍飲料、凍結炭酸飲料、ダイエットまたは他の減カロリー飲料などを含む。これらのカテゴリー間に重複があることは、当業者には認識されるであろう。本明細書で使用される場合、「減カロリー飲料」とは、フルカロリーバージョン(通常は以前市販されていた完全カロリーバージョン)と比較して飲料を提供する8オンス当たり少なくとも25%のカロリーを減少させた飲料を意味し、(例えば、甘味料の実質的に全てが、スクロース、HFCSなどの栄養甘味料に由来する)。少なくとも特定の実施形態では、低カロリー飲料は、完全カロリーバージョンと比較して提供する8オンスあたり約50%のカロリーを減少させる。本明細書で使用する「低カロリー飲料」は、飲料と比較して提供する8オンスあたり40カロリー未満である。本明細書で使用される場合、「ゼロカロリー」または「ダイエット」は、1回の提供当たり、例えば、飲料の8オンスあたり5カロリー未満を意味する。

別の態様によれば、水、および少なくとも1つの酸を含む酸味料構成成分、少なくとも1つの風味成分を含む風味構成成分、甘味化量の修飾ステビオールグルコシドを含む甘味料構成成分、ならびに任意で甘味化量の1つ以上の他の甘味料を含む飲料製品が提供される。この態様による飲料製品の特定の例示的な実施形態では、飲料製品は、3.0より高く4.0より低いpHを有するすぐに飲める飲料である。そのようなすぐに飲める飲料は、例えば、水分補給飲料(スポーツ飲料とも呼ばれ、電解質を加えたもの)であってもよい。他の例示的な実施形態では、すぐに飲める飲料は、炭酸飲料、例えば減カロリーまたはダイエットコーラ飲料である。この態様による飲料製品の特定の例示的な実施形態では、飲料製品は、例えば、炭酸水又は非炭酸水で1:5の割合で希釈してすぐに飲める飲料を製造するのに適したシロップである。

特定の実施形態によれば、本発明の修飾ステビオールグリコシドは、消耗品の全甘味料の少なくとも10%を提供し、例えば、ダイエットコーラシロップ、すぐに飲めるダイエットコーラ飲料、別の飲料製品、または本開示に従った別の食品を提供する。特定の実施形態によれば、それは全甘味料の少なくとも20%、または全甘味料の少なくとも30%、または全甘味料の少なくとも40%、または全甘味料の少なくとも半分、または全甘味料の少なくとも60%または少なくとも70%、または全甘味料の少なくとも80%、または全甘味料の少なくとも90%を提供する。任意に、それぞれの追加の甘味料成分は有機甘味料である。任意に、それぞれの甘味料成分は天然甘味料である。任意に、それぞれの甘味料成分はステビオールグリコシドである。任意に、それぞれの成分は、有機および/または天然の成分であり、従って、カロリー低減(例えば、ダイエット)炭酸コーラ飲料製品は対応して有機および/または天然の飲料製品である。

好ましくは、消耗品は、図5に示すものから選択される少なくとも1つの修飾レバウジオシドAを含む。

例えば、飲料は、約30ppm〜約750ppm(例えば、約50ppm〜350ppm)の濃度の修飾レバウジオシドAを含み得る。しかしながら、追加される量は、主に所望の甘味のレベルに依存し、他の成分の存在に依存し得る。例えば、果汁は糖を含み、したがって甘味のレベルに寄与する。一実施形態では、修飾レバウジオシドAは、風味付けされた飲料に追加される唯一の甘味料である。別の実施形態において、修飾レバウジオシドAは、他の甘味料および/または甘味増強剤と組み合わせることができる。好ましい実施形態において、修飾レバウジオシドAは、モグロシドVのようなモグロシドと組み合わされる。

ステビオシド、レバウジオシドAおよびB、およびステビオールビオシドの化学構造。[Glc1]など、NMR割り当てのためのグルコース残基の表示。

0.12mg/mLの精製酵素を用いたトランスグルコシル化(黒棒)および加水分解(斜線棒)活性に対するレバウジオシドAおよびスクロース濃度の影響:(A)GTF180−ΔN、(B)GTF180−ΔN変異体S1137Yおよび(C)GTF180−ΔN変異体Q1140E。

10U/mL GTF180−ΔN(WT)、変異体S1137Y、ならびに50mMレバウジオシドA(*)および1Mスクロース(**=RebAG1)を有する変異体Q1140Eの4時間のインキュベーションのNP−HPLC生成物プロファイル。

10U/mLの酵素を用いたレバウジオシドA利用(破線)およびα−グルコシル化(実線)によるRebAG1形成の時間経過:(A)GTF180−ΔN、(B)GTF180−ΔN変異体S1137Yおよび(C)GTF180−ΔN変異体Q1140Eはそれぞれ、55%、73%および96%の転換率を示した。

GTF180−ΔNおよび変異体GTF180−ΔNS1137YおよびGTF180−ΔNQ1140Eによって産生される修飾レバウジオシドAグルコシドの構造:(A)RebAG1=13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル

GTF180−ΔNおよび変異体GTF180−ΔNS1137YおよびGTF180−ΔNQ1140Eによって産生される修飾レバウジオシドAグルコシドの構造:(B)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル

GTF180−ΔNおよび変異体GTF180−ΔNS1137YおよびGTF180−ΔNQ1140Eによって産生される修飾レバウジオシドAグルコシドの構造:(C)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→3)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル

334KでD

₂Oに記録されたGTF180−ΔN(a)および変異体Q1140E(b)およびS1137Y(c)のRebAG1生成物の500MHz

¹H NMRスペクトル。

50mMステビオシドおよび50mMレバウジオシドAと100mMスクロースとの1時間のインキュベーションで、20U/mlのQ1140E有りおよび無しで、1MのNaOHによるアルカリ鹸化の前後で得られた生成物のTLC分析。

いくつかの甘味料の官能評価(n=12):ステビオシド(250mg/L)、レバウジオシドA(300mg/L)、RebAG1(350mg/mL)、およびスクロース(60g/L)。評価された味覚属性は、甘味(ハッチングされた棒)および苦味(実線)であった。スコア0=甘くない/苦くない、スコア5=非常に甘い/非常に苦い。

GTF180−ΔNΔV(Q)、GTF180−ΔNΔVQ1140アミノ酸置換変異体Q1140G/S/I/V/W/D/M/C/E/L/K/T/P/R/F/N/Y、またはGTF180−ΔNQ1140E(E*)での50mMのレバウジオシドAおよび200mMスクロースの2時間のインキュベーションで得られた生成物のTLC分析。

ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180由来のグルカンスクラーゼGTF180のアミノ酸配列。パネル(A)全長タンパク質。

ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180由来のグルカンスクラーゼGTF180のアミノ酸配列。パネル(B)N末端切断型変異体GTF180−ΔN。

ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180由来のグルカンスクラーゼGTF180のアミノ酸配列。パネル(C)N末端切断型およびドメインV切断型変異体GTF180−ΔNΔV。

実験セクション 以下のセクションは、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株180のグルカンスクラーゼGTF180−ΔNおよびその誘導された単一アミノ酸置換変異体が、α−グルコシル化レバウジオシドAに有利に使用されることを例示する。GTF180−ΔNおよび誘導された変異体酵素は、唾液中に存在するデンプン分解酵素による加水分解に対して耐性である(α1→6)および(α1→3)グリコシド結合を導入して、C−19位に特異的にレバウジオシドAをグルコシル化する。いくつかのGTF180−ΔN変異体は、GTF180−ΔNよりもレバウジオシドAに対してはるかに高いトランスグルコシル化活性を示した。興味深いことに、1つの変異体Q1140Eは、レバウジオシドAのほぼ100%の変換を示し、レバウジオシドAのC−19位でほとんどが単一の(α1→6)−グルコースに結合した。

生成された新規レバウジオシドAグルコシドは、非常に興味深く、C−19β−結合グルコースにおいて特異的に1つおよび2つの(α1→6)結合グルコース単位を運ぶ。モノ−α−グルコシル化レバウジオシドA生成物、RebAG1は、レバウジオシドAと比較して、より天然の甘味を増大させ、かつ苦味を減少させる。本発明のこれらの改良された新規ステビオールグリコシドは、機能性食品成分として非常に興味深い。

材料および方法 ステビオールグリコシド基質 レバウジオシドA(2)およびステビオシド(1)はSigma Aldrichから購入した。

グルカンスクラーゼ酵素 全てのグルカンスクラーゼおよびフルクタンスクラーゼ酵素は、Meng et al (2014)に記載されているように製造され、Kralj et al (2004b)に記載されているように精製された。GTF180−ΔNは、117kDaのGTF180全長タンパク質のN末端切断型(741残基)断片である(Kralj et al. 2004a)。GTF180酵素のアミノ酸794−1636からなる切断型変異体GTF180−ΔNΔVの構築物は、Meng et al. (2015a)に記載され、GTF180−ΔN変異体酵素はvan Leeuwen et al. (2009)、Meng et al. (2015a)、及びMeng et al. (2015b)によって生成された。切断型変異体GTF180−ΔNΔVにおけるアミノ酸置換は、Meng et al. (2015b)に記載されているように生成された。

酵素活性アッセイ 酵素活性アッセイは、25mM酢酸ナトリウム(pH4.7);1mMのCaCl₂;37℃で0.12mg/mLの精製したGTF180−ΔN酵素またはGTF180−ΔN変異体酵素中の50mMレバウジオシドAの有無にかかわらず、100mMおよび1000mMスクロースで実施した。100μLのサンプルを30秒ごとに4分間採取し、20μLの1000mMであるNaOHと共に30分間インキュベートすることにより反応を直ちに停止させた。前述のように、不活性化サンプルを脱イオン水で2倍に希釈し、ヘキソキナーゼおよびグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ/ホスホグルコースイソメラーゼアッセイ(Roche)を用いたNADPの還元をモニターすることにより、10μLの希釈サンプルからグルコースおよびフルクトース濃度を酵素的に測定した(Mayer 1987)。スクロースからのグルコースおよびフルクトースの放出の定量的決定は、グルカンスクラーゼ酵素の活性の推定を可能にした(van Geel−Schutten et al. 1999)。フルクトース放出は、全酵素活性に対応し、グルコース放出は、加水分解活性に対応する。トランスグリコシル化活性は、全活性から加水分解活性を差し引くことによって得ることができる。1単位(U)の酵素は、25mMの酢酸ナトリウム(pH4.7)、1mMのCaCl₂、および37℃での1000mMのスクロースを含む反応混合物中で1分間当たり1μmolの単糖を生成するのに必要な酵素の量として定義される。

ステビオールグリコシドの酵素的グリコシル化 インキュベーション反応は、25mMの酢酸ナトリウム(pH4.7)、1mMのCaCl₂、50〜1000mMのスクロース、50〜100mMのステビオールグリコシド、および2〜30U/mLの精製したGTF180−ΔN酵素またはGTF180−ΔN変異体酵素中で37℃で15分〜24時間行った。熱不活性化(100℃で15分間)により反応を停止させた。不活性化サンプルから250uLを1000mlの10mMであるカテコール(内部標準)と混合し、続いてStrata−X 33u Polymeric Reversed Phaseカラム(Phenomenex)を用いた固相抽出によって精製した。HPLC分析のために、20μLの精製サンプルを、Luna10μmNH2クロマトグラフィーカラム(250mm×4.6mm;Phenomenex)に注入した。反応構成成分を勾配溶出条件下で1mL/分の流速で分離し、70%溶媒Aの2分間のアイソクラティックステップから開始し、続いて9分間にわたる70〜55%溶媒Aの直線勾配(溶媒A=アセトニトリル;溶媒B=0.025%酢酸)を行った。レバウジオシドAおよびモノ−α−グルコシル化レバウジオシドA生成物の濃度は、対応する1.56〜50mMの較正曲線を用いてNP−HPLCで測定した。全てのデータは、カテコールを内部標準として標準化した。反応の標準偏差は5%未満であった。Enduranceオートサンプラー(Spark Holland、The Netherlands)を備えたUltiMate 3000クロマトグラフィーシステム(ThermoFischer Scientific、Amsterdam、the Netherlands)上で全てのNP−HPLC分析を実施した。

α−グルコシル化レバウジオシドA生成物の定量的合成 GTF180−ΔNおよびその誘導された変異体を用いたα−グルコシル化レバウジオシドA生成物の定量的合成のために、5mL、25mMの酢酸ナトリウム(pH4.7)、1mMのCaCl₂、50mMのステビオールグリコシド中で、合計2,000mMのスクロースに対する、1000mM当量のスクロース供与体の2つのバッチ(t=0および3時間)と共に、37℃で10U/mLの酵素を用いて24時間インキュベートした。Strata−X 33uポリマー逆相カラム(Phenomenex)を用いた固相抽出によって、インキュベーション混合物から生成物を精製した。生成物をLuna10μmNH₂セミ分取クロマトグラフィーカラム(250mm×10mm、Phenomenex)上で分離し、流速4.6mL/分で手動で回収し、80%溶媒Aの2分間のアイソクラティックステップから開始して、80分〜50%の溶媒Aの38分にわたる直線勾配(溶媒A=アセトニトリル;溶媒B=0.025%酢酸)が続いた。集めた画分の溶媒を窒素ガスの気流下で蒸発させ、乾燥した材料を脱イオン水に溶解した。

薄層クロマトグラフィー n−ブタノール:酢酸:水=2:1:1で展開したTLCシート(Merck Kieselgel 60 F254、20×20cm)上にサンプルをスポットした。スポットは、オルシノール/硫酸染色によって視覚化し、標準化合物の同時分析と比較した。

アルカリ鹸化 19−O結合グリコシル部分を放出させるために、4mgの各ステビオールグリコシド生成物を1MのNaOH(1mL)に溶解し、80℃で2.5時間加熱した。

質量分析 窒素レーザー(337nm、3nsのパルス幅)を備えたAxima(商標)質量分析計(Shimadzu Kratos Inc.,Manchester,UK)を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF−MS)実験を行った。陽イオンモードスペクトルは、5000FWHMの分解能および450nsの遅延抽出で反射モードを使用して記録した。加速電圧は19kVであり、グリッド電圧は75.2%であった。ミラー電圧比は1.12であり、取得質量範囲は200−6000Daであった。マトリックス溶液として70%ACN中の1μL、10%の2,5−ジヒドロキシ安息香酸と1μLのサンプル溶液を混合することによってサンプルを調製した。

NMR分光法 解像度が向上した1D/2D 500MHz 1H NMRスペクトルは、Bruker DRX−500スペクトロメータ(Bijvoet Center, Department of NMR Spectroscopy, Utrecht University)のD₂Oで334Kのプローブ温度で記録した。データ収集および処理はBruker Topspin 2.1で行った。分析前に、中間凍結乾燥したD₂O(99.9原子%D、Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, MA)中でサンプルを2回交換し、次いで0.6mLのD₂Oに溶解した。重水素水信号(4.40ppmでのHOD)の抑制は、1D NMR実験にWEFT(水除去フーリエ変換)パルスシーケンスを適用し、2D実験で緩和遅延の間に1秒の事前飽和を適用することによって達成された。2D TOCSYスペクトルは、40〜200m秒のスピンロック時間を有するMLEV−17(Levitt et al (1982)によって考案された複合パルス)混合シーケンスを使用して記録した。2D ROESYスペクトルは、200m秒の混合時間で標準Bruker XWINNMRソフトウェアを用いて記録した。搬送周波数は、スピンロック中のTOCSY転送を最小にするために、スペクトルのダウンフィールドエッジで設定した。¹H FIDの取得中にデカップリングすることなく、自然の豊富な2D ¹³C−¹H HSQC実験(¹H周波数500.0821MHz、¹³C周波数125.7552MHz)を記録した。スペクトルの分解能向上は、1Dスペクトルのローレンツ−ガウス変換、または2Dスペクトルに対してπ/(2.3)シフトした二乗ベル関数位相を用いた乗算によって行われ、必要に応じて5次の多項式ベースライン補正を行った。化学シフト(δ)は、内部アセトン(¹Hではδ2.225、¹³Cではδ31.07)を基準としてppmで表される。

レバウジオシドAの新規α−グルコシル化生成物の官能評価 レバウジオシドA(350mg/L)の新規α−グルコシル化生成物をスクロース(60g/L)、レバウジオシドA(300mg/L)、ステビオシド(250mg/L)と比較した味覚の評価を行った。ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた12人の試験者に、0から5の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、0は甘味/苦味を示さない、5は非常に甘い/非常に苦いことを示す。

結果 レバウジオシドAのα−グルコシル化のためのグルカンおよびフルクタンサクラーゼ酵素のスクリーニング 主にラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)由来の100以上のグルカンおよびフルクタンスクラーゼ野生型および変異体酵素を、レバウジオシドAα−グルコシル化についてスクリーニングした。このために、酵素を50mMのレバウジオシドA(図1)および1000mMのスクロース中で3時間インキュベートした。反応混合物のHPLCおよびTLC分析は、GTF180−ΔN酵素およびGTF180−ΔNの変異体酵素のみがレバウジオシドAをグリコシル化し得ることを示した(表1)。興味深いことに、移行状態安定化残基D1136(van Leeuwen et al. 2009)に近い単一のアミノ酸置換である2つの単一のGTF180−ΔN変異体S1137YおよびQ1140Eは、レバウジオシドAに対するGTF180−ΔNよりも優れたトランスグルコシル化活性を示した。また、GTF180−ΔN変異体L981AおよびW1065L(Meng et al. 2015b)は、レバウジオシドA(表1)をα−グルコシル化することができたが、重合(すなわち、スクロースからのオリゴ糖およびグルカン形成)活性はほとんど示されなかった(データを示していない)。これは、下流の処理、単糖、二糖、オリゴ糖およびグルカンからのα−グルコシル化レバウジオシドA生成物の精製の間の明確な利点である。α−グルカン合成を排除することにより、最も重要な副反応である、より高いグリコシル化収率がレバウジオシドAについて得られた。より低いスクロース濃度(200mM)では、これらの変異体は、GTF180−ΔNならびに変異体S1137YおよびQ1140EよりもレバウジオシドAと同等またはそれより高いトランスグルコシル化活性を有していた(データを示していない)。

レバウジオシドAのグルコシル化に対する反応条件を最適化するために、GTF180−ΔNならびに変異体S1137YおよびQ1140Eのトランスグルコシル化活性に対するレバウジオシドAおよびスクロースの効果を測定した。このために、50mMレバウジオシドAの有無にかかわらず、100mMおよび1000mMのスクロースで酵素活性アッセイを実施した。3つの酵素は全て、低スクロース濃度でより加水分解した(図2)。両方の変異体酵素は100mMスクロースでほぼ完全に加水分解した。しかし、50mMレバウジオシドAを反応に添加した場合、またはスクロース濃度を1000mMに増加させた場合、3つの酵素全てのトランスグルコシル化活性が顕著に増加し、1Mのスクロースおよび50mMのレバウジオシドAで最高の全活性および最も高いトランスグルコシル化対加水分解比を示した。これらの反応条件は、GTF180−ΔNならびに変異体S1137YおよびQ1140EによるレバウジオシドAのα−グルコシル化をより詳細に追跡するために用いられた。

50mMのレバウジオシドA、1000mMのスクロース、および10U/mL酵素を使用した場合、GTF180−ΔNによる約55%と比較して、変異体S1137YおよびQ1140Eはそれぞれ約73%および約96%のレバウジオシドAをグルコシル化した(図4)。驚くべきことに、変異体Q1140Eは、主にモノグルコシル化レバウジオシドA(RebAG1)を産生し、50mMのレバウジオシドAから約35mMのRebAG1を産生した(図3および図4)。変異体S1137Yは、GTF180−ΔN酵素(約13mM)と同様の量のRebAG1を産生したが(図3)、より多い量の複合グリコシドを合成した(図3)。

試験した全てのグルカンおよびフルクタンスクラーゼ酵素から、変異体GTF180−ΔNQ1140Eは最も高いレバウジオシドAグルコシル化活性を示し、主にレバウジオシドAのモノグルコシル化を示した。したがって、変異体Q1140E/A/Hに加えて、変異体GTF180−ΔNΔVにおいて位置Q1140における更なるアミノ酸置換も生じ、レバウジオシドAグルコシル化について試験された(図8)。このために、1mg/mlの酵素を緩衝液(25mMの酢酸ナトリウム(pH4.7)、1mMのCaCl₂)中の50mMのレバウジオシドAおよび200mMのスクロースと共に37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション混合物をTLCで分析した(図8)。これらの条件下で、いくつかのQ1140置換変異体(例えばQ1140F/N/Yの場合)は、変異体Q1140Eよりも高いレバウジオシドAグルコシル化を示したが、後者はまだ最高のモノ−グルコシル化収率を有していた。いくつかの変異体(例えば、Q1140D)は、レバウジオシドAグルコシル化に対してわずかに負の効果を有した。興味深いことに、変異体Q1140Rはスクロースに対してほとんど活性を示さなかったが、レバウジオシドAのグルコシル化は変異体の影響をほとんど受けなかった。スクロースは主にレバウジオシドAのグルコシル化に使用され、オリゴ糖形成などの副反応には使用されなかったようである。

GTF180−ΔNならびにGTF180−ΔN変異体S1137YおよびQ1140Eによって産生されるレバウジオシドAグルコシドのα−グルコシル化生成物の単離および特徴付け レバウジオシドA(図1)の分子構造を見ると、総14個の遊離ヒドロキシル基を有する4つのGlcp残基(Glc1、Glc2、Glc3およびGlc4)があり、これらはトランスグルコシル化の受容体として作用することができる。

GTF180−ΔNは、スクロースをオリゴ糖および多糖に変換し、(α1→3)−および(α1→6)−結合におけるGlcp残基のトランスグルコシル化を触媒し(van Leeuwen et al. 2008)、Glc残基の最初の結合のためにレバウジオシドAに存在する3つの潜在的(1→3)部位および4つの潜在的(1→6)部位が存在する。

構造的特徴付けのレバウジオシドAグルコシドのα−グルコシル化生成物を単離するために、50mMのレバウジオシドAおよび1000mMのスクロースを含む10U/mL酵素と共にインキュベーションを行った。3時間後、1000mMの過剰のスクロースを反応混合物に添加し、更に21時間インキュベーションした。セミ分取NP−HPLCを用いて反応混合物からグルコシドを単離した。興味深いことに、モノ−α−グルコシル化生成物のNMR構造分析およびメチル化分析は、C−19β結合グルコースにおいてのみ、GTF180−ΔNならびに変異体S1137YおよびQ1140Eが特異的にレバウジオシドAをグルコシル化し、(α1→6)結合グルコース(100%)を結合して、RebAG1を産生する(図5Aも参照のこと)ことを示した。

GTF180−ΔNおよび変異体S1137Yのジ−グルコシル化レバウジオシドA生成物は、(α1→3)結合グルコース(約75%)(図5C)または別の(α1→6)結合グルコース(約25%)によるRebAG1の構造の両線状伸長であった(図5B)。図5Dのパネル(a)、(b)および(c)は、それぞれGTF180−ΔN、GTF180−ΔNQ1140EおよびGTF180−ΔNS1137Yによって産生されたRebAG1の500MHz ¹H NMRスペクトルを示す。

レバウジオシドAのC−19β−グルコシル部分のみに生じるGTF180−ΔNによるトランスグルコシル化による過剰のGlcp残基の導入が起こったことを確認するために、単離された画分をアルカリ鹸化に付して、19−カルボキシル−グルコシルエステル結合を特異的に加水分解した(図1および図6)。TLC、MALDI−TOF−MS(m/z826[M+H]⁺)およびNMR分光法により、同一の生成物をレバウジオシドAおよびレバウジオシドAのα−グルコシル化生成物から得た。ここで、レバウジオシドAは、C−19において完全なグルコシル部分を欠いている。得られた構造体は、レバウジオシドB(3)(図1)として知られている。

GTF180−ΔN変異体Q1140EによるステビオシドのC−19位特異的α−グルコシル化 商業的目的のために、全ステビオールグリコシド葉抽出物の甘味を改善し、苦味を減少させることが望ましい場合がある。ステビオシド(約5〜10%w/w乾燥葉)は最も豊富で最も苦味のあるステビオールグリコシドの1つであるため、我々の目的はステビオシドの味覚を高めることでもあった。したがって、GTF180−ΔNおよび受容体分子としてのステビオシドを有するその誘導された置換変異体を用いたグルコシル化反応も行った。3つの酵素は全てステビオシドをα−グルコシル化することもできた。受容体分子としてのレバウジオシドAを観察すると、変異体Q1140Eはステビオシドを主に単一のモノ−α−グルコシル化生成物に変換した(データ示さず)。GTF180−ΔN変異体Q1140EがステビオシドをC−19位で特異的にグルコシル化するか否かを決定するために、Q1140Eによって産生されたステビオールグルコシドを、1MのNaOHで19−カルボキシル−グルコシルエステル結合をアルカリ鹸化して、C−19部分を特異的に除去した。Q1140Eステビオールグルコシドのアルカリ鹸化によりステビオールビオシド(4)(図1)(すなわち、ステビオシドからC−19部分を除いた)が得られると、グルコシル化はステビオシドのC−19位で特異的に起こった。TLCプレート上で、複数のステビオールグリコシドがQ1140Eを有するステビオシドの1時間のインキュベーションで視認された(図6)。しかし、インキュベーション混合物を1MのNaOHで処理し、ステビオシド陽性対照の鹸化後に生成した生成物と同じ高さで移動した場合には、ただ1つのスポットしか観察されなかった。MALDI−TOF分析により、665.59の分子量が検出され、これはステビオールビオシドのナトリウム付加物に対応する。これらの結果は、GTF180−ΔNQ1140EがまたC−19β結合グルコシル部分においてステビオシドを特異的にα−グルコシル化することを示している。

レバウジオシドAの新規合成α−グルコシル化生成物の味覚評価 レバウジオシドAの19−O−グルコシル部分における(α1→6)グルコシル化が甘味および苦味に及ぼす影響を決定するために、レバウジオシドAの新規α−グルコシル化生成物の1つである、RebAG1をレバウジオシドAと比較して味覚の評価を行った。このために、ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた12人の試験者に、0から5の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、0は甘味/苦味を示さない、5は非常に甘い/非常に苦いことを示す。新規RebAG1がレバウジオシドAと比較してより自然な甘味を増大させかつ苦味を減少させたことを示す明確な傾向が観察された(図7)。

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(付記) (付記1) ステビオールグリコシド基質を、グルコース供与体としてのスクロース、およびラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180株のグルカンスクラーゼGTF180、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の存在下でインキュベートすることを含む、修飾ステビオールグリコシドを酵素的に提供する方法。

(付記2) 前記修飾ステビオールグリコシドが少なくとも1つのグルコース残基で修飾されている、付記1に記載の方法。

(付記3) 前記修飾ステビオールグリコシドが、(α1→6)グリコシド結合、(α1→3)グリコシド結合、またはそれらの組み合わせを介して1つ以上のグルコースで修飾されている、付記1または2に記載の方法。

(付記4) 前記修飾ステビオールグリコシドが、ステビオールグリコシドのC−13位および/またはC−19位において修飾されている、付記1から3のいずれか1つに記載の方法。

(付記5) 前記修飾ステビオールグリコシドがC−19位においてのみ修飾される、付記4に記載の方法。

(付記6) 前記修飾ステビオールグリコシドが、C−19位においてのみ単一のグルコース残基で修飾されている、付記5に記載の方法。

(付記7) 前記ステビオールグリコシド基質がステビオールグリコシドである、付記1〜6のいずれか1つに記載の方法。

(付記8) 前記ステビオールグリコシドが、レバウジオシドA[13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシルエステル]、またはステビオシド(13−{[β−D−グルコピラノシル−(1→2)−β−D−グルコピラノシル]オキシ}エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシルエステル)である、付記7に記載の方法。

(付記9) 前記スクロースは、バッチ方式で、好ましくは最終量が少なくとも1M、より好ましくは少なくとも2Mになるまで添加される、付記1から8のいずれか1つに記載の方法。

(付記10) 前記変異体GTF180グルカンスクラーゼは、S1137、Q1140、L981および/またはW1065においてアミノ酸置換基を含み、好ましくは前記変異体が、S1137Y、Q1140E、L981A、W1065L/E/Q/Fの変異体のうちの1つ以上を有する、付記1から9のいずれか1つに記載の方法。

(付記11) 前記変異体GTF180グルカンスクラーゼは、N末端可変ドメイン断片(GTF180−ΔN)ならびに/またはNおよびC末端ドメインV断片(GTF180−ΔNΔV)を欠く切断型変異体である、付記1から10のいずれか1つに記載の方法。

(付記12) 前記変異体GTF180グルカンスクラーゼは、GTF180−ΔNQ1140E、GTF180−ΔNQ1140F、GTF180−ΔNQ1140N、GTF180−ΔNQ1140Y、GTF180−ΔNS1137Y、GTF180−ΔN L981A、GTF180−ΔN W1065L、GTF180−ΔN W1065E、GTF180−ΔN W1065 QおよびGTF180−ΔN W1065F、GTF180−ΔNΔVQ1140E、GTF180−ΔNΔVQ1140F、GTF180−ΔNΔVQ1140N、GTF180−ΔNΔVQ1140Y、GTF180−ΔNΔVS1137Y、GTF180−ΔNΔV L981A、GTF180−ΔNΔV W1065L、GTF180−ΔNΔV W1065E、GTF180−ΔNΔV W1065 QおよびGTF180−ΔNΔV W1065Fである、付記11に記載の方法。

(付記13) 付記1から12のいずれか1つに記載の方法によって得られる修飾ステビオールグリコシド。

(付記14) (i)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル、 (ii)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→6)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル、および、 (iii)13−({β−D−グルコピラノシル−(1→2)−[β−D−グルコピラノシル−(1→3)−]β−D−グルコピラノシル}オキシ)エント−カウル−16−エン−19−酸α−D−グルコピラノシル−(1→3)−α−D−グルコピラノシル−(1→6)−β−D−グルコピラノシルエステル、 からなる群から選択される、修飾ステビオールグリコシド。

(付記15) 低血糖甘味料としての付記13または14に記載の修飾ステビオールグリコシドの使用。

(付記16) 付記13または14に記載の少なくとも1つの修飾ステビオールグリコシドを含む、甘味組成物。

(付記17) 任意に他の甘味料および/または甘味増強剤と組み合わされた、付記13または14に記載の少なくとも1つの修飾ステビオールグリコシドを含む消耗品。

(付記18) 飲料、食料品、口腔ケア製品、たばこ製品、医薬品および栄養補助製品からなる群から選択される、付記17に記載の消耗品。

(付記19) 任意に他の甘味料および/または甘味増強剤と組み合わせた、付記13または14に記載の有効量の修飾ステアビオールグリコシドを消耗品に含めることを含む、前記消耗品を甘味化する方法。

(付記20) ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180のGTF180、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の、ステビオールグリコシドの感覚刺激特性を増強するための使用であって、好ましくは前記ステビオールグリコシドがレバウジオシドAまたはステビオシドである、使用。

(付記21) ステビオールグリコシドの苦味および/または後味を完全にまたは部分的に除去するための、付記20に記載の使用。

(付記22) a)変異体のパネル、好ましくはラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)株180のGTF180の置換変異体を生成する工程、 b)ステビオールグリコシドのグリコシル化を可能にする条件下で、水性反応混合物中のグルコース供与体の存在下で、各変異体をステビオールグリコシド基質、好ましくはレバウジオシドAとインキュベートする工程、及び c)少なくとも部分的に反応混合物が濁るのを防ぐ能力を決定することにより、ステビオールグリコシドを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180のGTF180の少なくとも1つの変異体を選択する工程、 d)任意に、修飾レバウジオシドAの構造を更に決定すると共に、ステビオールグリコシドのC−19位を修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus reuteri)180の変異体GTF180を選択する工程、 を含む、ステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドAを修飾することができるグルカンスクラーゼを同定する方法。