Production and use of bacterial histamine

本発明は、ヒスタミンを産生する特定のプロバイオティック乳酸菌を選択する方法、及び宿主にとって有益な効果を送達するためのこのような株の使用に関する。

国連の食糧農業機関は、プロバイオティクスを、「適量で投与されると宿主に健康利益を付与する生きた微生物」と定義している。 今日、いくつかの異なる細菌、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌株及びビフィズス菌株などの乳酸産生菌が、プロバイオティクスとして用いられている。

乳酸産生菌は、ヒト又は動物の健康に対するそれらの有益な効果のために用いられるだけでなく、発酵工程のために、食品業界においてもまた広く用いられている。 プロバイオティクスの有効性は、株特異的であり、各株は、異なる機構を介して宿主の健康に寄与しうる。 プロバイオティクスは、病原菌の増殖を防止又は阻害することも可能であり、病原菌による病原性因子の産生を抑制することも可能であり、炎症促進性の様式又は抗炎症性の様式で免疫反応を調節することも可能である。 プロバイオティック乳酸産生菌であるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）の異なる株の使用は、乳児疝痛の改善、湿疹の緩和、労働疾病のエピソードの軽減、及びピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染の抑制に有望な療法である。 Ｌ． ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）は、ヒト消化管の常在生物と考えられており、例えば、胃体、胃前庭部、十二指腸、及び回腸の粘膜に存在する。 例えば、米国特許第５，４３９，６７８号、同第５，４５８，８７５号、同第５，５３４，２５３号、同第５，８３７，２３８号、及び同第５，８４９，２８９号を参照されたい。

Ｌ． ロイテリ細胞は、グリセロールの存在下、嫌気条件下で増殖させると、ロイテリン（β−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）として知られる抗微生物物質を産生する。

宿主とその微生物との間の関係は複雑であり、一部の細菌については、この宿主：微生物関係が、多年にわたる共進化を通じて発生してきた。 これはとりわけ、ラクトバチルス・ロイテリについて成り立つと考えられる。 消化管微生物とヒト宿主との間の相互関係についてのわれわれの知識はその幼年期にあるが、消化管の微生物叢が、消化管及び免疫系の発生、栄養摂取において不可欠の役割を果たしており、消化管の微生物叢と脳との間では、新たな連関が確立されつつあることが既に鋭く意識されている。 正常な消化管の微生物叢の攪乱である腸内毒素症は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）など、局所的な消化管環境に影響を及ぼす疾患過程、並びにメタボリック症候群など、消化管に対して遠位の部位における疾患過程を含め、広範にわたる疾患過程に関与している。 消化管の微生物叢内には、大きな治療的可能性が存在し、異なる疾患過程を防止及び／又は処置するために、微生物コミュニティーを変化させる将来の目標に向かって探求が重ねられている。

したがって、最も適切なプロバイオティック株を選択し、これらを用いて、このような発症に対抗しうるように、宿主の健康に影響を及ぼす特定の疾患又は他の状況と関連する、微生物とヒトとの間のこのような特定の相互作用を理解することが必要とされている。

本明細書における本発明は、哺乳動物、とりわけ、ヒトにおいてヒスタミンを局所的に産生させる特定の方法を提供し、ヒスタミンの局所的産生には、ある特定の乳酸菌株を選択することによる、哺乳動物の体内のＧＩ管、尿生殖器（ＧＵ）管、口腔、肺及び気道、皮膚などにおける産生が含まれるがこれらに限定されない。 細菌は、ある特定のアミノ酸及び／又は糖と併せて送達する場合もあり、別個に投与する場合もあり、活性部位に既に存在する場合もある。

本発明の主要目的は、哺乳動物の体内のＧＩ管、ＧＵ管、口腔、肺及び気道、皮膚などを含めた多様な部位においてヒスタミンを局所的に産生しうる株を選択することである。

前記株を含有する生成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。

細菌の投与を、ヒスチジン、又はヒスチジンを含有する食物若しくは組成物の投与と組み合わせて、ヒスタミンの局所的生成を確保することが、本発明のさらなる目的である。

したがって、本発明は、プロバイオティクスとして有用な乳酸菌細胞及び治療において有用な乳酸菌細胞を選択するための新たな方法に関する。 この新たな方法は、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能な乳酸菌株についてのスクリーニング及び選択を伴う。 驚くべきことに、本方法により選択された乳酸菌株は、プロバイオティクスとして有用であり、治療においても有用であり、特に、ヒスタミンの局所的産生を介して抗炎症効果をもたらすのに有用である。 本明細書の別の箇所で論じる通り、かつては、健康に対する認知された危険性、例えば、潜在的な毒性作用のために、食品におけるヒスタミン産生菌の存在は能動的に回避されていたので、細菌のこれらの効果は驚くべきものである。 したがって、ヒスタミンの局所的産生が可能な乳酸菌の哺乳動物への投与、又は、活性ヒスチジンオペロン及びヒスタミンを産生する能力の存在に基づく、ヒスタミンのこのような局所的産生能についての乳酸菌のスクリーニング及び選択は、この教示に対して実際直観に反する。 実際、プロバイオティクスがヒスタミンを産生すると報告されたことはかつてなかった。

したがって、その最も広範な範囲において、本発明は、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生での使用のための乳酸菌株を選択する方法であって、細菌を活性ヒスチジンオペロンの存在についてスクリーニングするステップと、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能な株を選択するステップとを含む方法を提供する。

ヒスチジンオペロンは、３つの遺伝子（ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子、ヒスチジンピルボイルデカルボキシラーゼＡ型（ＨｄｃＡ）遺伝子、及びヒスチジンピルボイルデカルボキシラーゼＢ型（ＨｄｃＢ）遺伝子）を含む。 これらの遺伝子の各々の活性が、本発明にとって重要であると考えられる。 したがって、本発明のスクリーニング法では、候補細菌を３つの遺伝子全ての存在について評価し、３つの遺伝子全てについて陽性の株を選択する。 任意の適切な方法は、３つの遺伝子全ての存在を検出するために用いることができ、例えば、ＰＣＲなどの遺伝学的方法を用いることができる。 良好なレベルのヒスタミンの産生はまた、３つの遺伝子全ての存在及び活性ヒスチジンオペロンの存在の指標でもありうる。 したがって、本発明の選択法はまた、ヒスタミン産生が可能な株を選択するステップも伴う。 ヒスタミンの産生レベルが高い株が好ましい。 したがって、好ましい実施形態では、株を、２００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルで、好ましくは２５０ｐｇ／ｍｌを超えるレベルで、又はより好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ超えるレベルで、例えば、３５０、４００、４５０、又は５００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルでヒスタミンを産生するその能力について選択する。 このような値は一般に、培養物中の株の上清中で測定されるヒスタミンの値を指す。

当業者には、ヒスタミン産生のレベルを測定する適切な方法がよく知られているであろう。 本明細書では、質量分析法、より具体的には、３連の四重極質量分析が例示され、好ましい。 しかし、同様に、ＥＬＩＳＡ又はイムノアッセイも、ヒスタミンの産生を評価し、定量化するのに用いることができる。 したがって、本発明の一部の実施形態では、選択法が、候補株により産生されるヒスタミンの量又はレベルを検出するステップを伴うであろう。 本発明の方法により選択される株の、下流における使用のために、ヒスタミン産生株を選択又は分離した後、他の実施形態は、このような株を培養するか若しくは増殖させるか、又はおそらく、このような株を将来の使用のために保存するさらなるステップを伴うであろう。

このようなさらなるステップ（そして、実際、本発明の方法の選択ステップ）は一般に、ヒスタミンの産生を支援する適切な培養培地中で実行することが必要である。 好ましい培養培地は、前記株によるヒスタミンの産生を支援する適切な炭素供給源を含有する。 特に好ましい実施形態では、培地が、グルコースを炭素供給源として含み、好ましくはスクロースを含有しないか、又はスクロースを、少なくとも株によるヒスタミンの産生をそれほどは損なわないレベルに限り含むであろう。 また、ヒスチジン若しくはヒスチジン類似体も、場合によって、他のアミノ酸の供給源と併せて供給することができる。

好ましい実施形態では、前記株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）の株である。

本発明の方法を用いて適切な株が選択されたら、次いで、この株を、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生のために用いることができる。 したがって、前記株はまた、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生も可能でなければならない。

したがって、本発明のさらなる態様は、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生での使用のための、本発明の選択法により得ることが可能な乳酸菌株の細胞を含む生成物であって、前記乳酸菌株が、活性のヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能である生成物を提供する。 本明細書の別の箇所で概括される通り、好ましい使用は、炎症状態の処置及び／若しくは予防、又は局所的なヒスタミンの産生から利益を得る状態若しくは疾患の処置及び／若しくは予防においてなされる。 例えば、このようなヒスタミンの局所的産生は、抗炎症効果を結果としてもたらしうる。

本発明の代替的な実施形態は、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生での使用のためのヒスタミンの産生が可能な乳酸菌株であって、活性ヒスチジンオペロンを有する乳酸菌株を提供する。 この株の好ましい特色及びその使用については、本明細書の別の箇所で記載される。

また、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生のための処置方法であって、本発明の選択法により得ることが可能な乳酸菌株の細胞を含む生成物の、前記哺乳動物への、前記哺乳動物においてヒスタミンの局所的産生を可能とするのに有効な量での投与、又は活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能な乳酸菌株の、前記哺乳動物への、前記哺乳動物においてヒスタミンの局所的産生を可能とするのに有効な量での投与を含む方法も提供される。 この株の好ましい特色及びその治療的使用については、本明細書の別の箇所で記載される。

本発明ではまた、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生での使用のための組成物又は医薬の製造における、本発明の選択法により得ることが可能な乳酸菌株の細胞を含む生成物の使用であって、前記乳酸菌株が、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能である使用も提供される。 代替的な実施形態は、哺乳動物におけるヒスタミンの局所的産生での使用のための組成物又は医薬の製造における、活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能な乳酸菌株の使用を提供する。 この株の好ましい特色及びその治療的使用については、本明細書の別の箇所で記載される。

ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分内のヒスタミンの定量化を示す図である。 ３連の四重極質量分析を用いて、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分の選り抜きの範囲内に存在するヒスタミンを定量化した。 ＴＮＦ阻害性画分は、全ての被験画分中で最高量のヒスタミンを有した。

精製ヒスタミン及びＬ． ロイテリ６４７５に由来するヒスタミンが、ヒスタミンＨ

_２受容体を介してＴＮＦの産生を阻害することを示す図である。 Ａ． 精製ヒスタミンは、ＴＮＦの産生を著明に阻害したが、この効果は特異的Ｈ

_２受容体アンタゴニストにより用量依存的に遮断される。 ６４７５株から分泌された因子（ヒスタミンを含めた）を含有する条件付け培地（又は上清）は、ＴＮＦの産生を著明に阻害したが、この効果は特異的Ｈ

_２受容体アンタゴニストにより部分的に遮断される。 Ｎ＝３、

^＊培地対照と比較したｐ値＜０．０５、

^＊＊ヒスタミンと比較したｐ値＜０．０５、

^＊＊＊ ＡＴＣＣ ６４７５条件付け培地（ＣＭ）と比較したｐ値＜０．０５。

精製ヒスタミン及びＬ． ロイテリ６４７５に由来するヒスタミンが、ヒスタミンＨ

_２受容体を介してＴＮＦの産生を阻害することを示す図である。 Ｂ． ヒスタミンを含有する、６４７５株に由来する細胞ペレット洗浄液が、ＴＮＦの産生を抑制し、この効果は特異的Ｈ

_２受容体アンタゴニストにより部分的に遮断された。 比較的純粋なヒスタミンを含有する画分Ｂ３も、ＴＮＦの産生を阻害したが、この効果は特異的Ｈ

_２受容体アンタゴニストにより完全に遮断された。 Ｎ＝３、

^＊培地対照と比較したｐ値＜０．０５、

^＊＊ ＡＴＣＣ ６４７５株細胞ペレット洗浄液（ＣＰ）と比較したｐ値＜０．０５、

^＊＊＊画分Ｂ３と比較したｐ値＜０．０５。

ヒスチジンオペロンが、Ｌ． ロイテリ６４７５のＴＮＦ阻害性の表現型にとって重要であることを示す図である。 図３Ａは、ヒスチジンオペロンが、ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子、ｈｄｃＡ遺伝子、及びｈｄｃＢ遺伝子という３つの遺伝子からなることを示す図である。 図３Ｂは、ヒスチジンオペロン内のいずれか１つの遺伝子における突然変異が、Ｌ． ロイテリ６４７５によるＴＮＦ抑制の部分的な喪失を結果としてもたらすことを示す図である。 Ｎ＝９、

^＊培地対照と比較したｐ値＜０．０５、

^＊＊ ＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５株と比較したｐ値＜０．０５。

Ｌ． ロイテリ６４７５が、ＴＮＢＳ感作により誘導される体重減少を著明に軽減したことを示す図である。 図は、２つの独立する実験に由来するデータを表す（

^＊ ｐ＜０．０５、

^＊＊ ｐ＜０．０１、

^＊＊＊ ｐ＜０．００１）。

Ｌ． ロイテリ６４７５が、ＴＮＢＳ感作により誘導される肉眼的結腸損傷を著明に減殺したことを示す図である。 図は、２つの独立する実験に由来するデータを表す（

^＊ ｐ＜０．０５、

^＊＊＊ ｐ＜０．００１）。

Ｌ． ロイテリ６４７５が、ＴＮＢＳ感作により誘導されるＳＡＡ濃度を著明に低減したことを示す図である。 図は、２つの独立する実験に由来するデータを表す（

^＊ ｐ＜０．０５、

^＊＊＊ ｐ＜０．００１）。

ｈｄｃＡ突然変異体が、大腸炎を緩和する能力を減殺したことを示す図である。 図は、２つの独立する実験に由来するデータを表す（

^＊ ｐ＜０．０５、

^＊＊ ｐ＜０．０１）。

ｈｄｃＡ突然変異体が、大腸炎を緩和する能力を減殺したことを示す図である。 図は、２つの独立する実験に由来するデータを表す（

^＊ ｐ＜０．０１、

^＊＊ ｐ＜０．００１）。

本発明者らは、本明細書において、ラクトバチルス・ロイテリのある特定の株を含め、選択された乳酸菌群が、特定の増殖条件下でヒスタミンを局所的に産生し、このような産生されたヒスタミンが、例えば、炎症の軽減、ある特定のがんの軽減などにより宿主に利益をもたらすことを見出した。

ヒスタミン ヒスタミンとは、局所的免疫反応のほか、消化管における生理学的機能の調節、及び神経伝達物質としての作用を含め、哺乳動物の健康に関連する複数の過程に関与する有機窒素化合物である。 外来の病原菌に対する免疫反応の一部として、ヒスタミンは、好塩基球及びマスト細胞により産生される。 ヒスタミンは、酵素であるＬ−ヒスチジンデカルボキシラーゼにより触媒される反応である、アミノ酸ヒスチジンの脱カルボキシル化に由来しうる。

細菌は、真核生物において見出されるヒスチジンデカルボキシラーゼ酵素とは非類縁のヒスチジンデカルボキシラーゼ酵素を用いて、ヒスタミン産生が可能である。 今日まで、このようなある特定の細菌株によるヒスタミンの産生は、ヒトにとって可能な利益ではなく、健康に対する危険性として見られてきた。 例えば、非感染性の食物媒介性疾患の形態であるサバ中毒は、腐敗した食物中、特に、魚類中の細菌によるヒスタミンの産生に起因する。 発酵食物及び発酵飲料は、発酵性細菌又は酵母によりなされた同様の転換に起因する少量のヒスタミンを天然で含有する。 上述の研究から予測されうる通り、選択された細菌からのある特定の制御された量のヒスタミンの送達は、驚くべきことに、有害な作用ではなく有益な効果をもたらす。

ヒスタミン受容体は、それらの内因性リガンドとしてのヒスタミンを伴うＧタンパク質共役受容体のクラスである。 Ｈ _１受容体（Ｈ１Ｒ）、Ｈ _２受容体（Ｈ２Ｒ）、Ｈ _３受容体（Ｈ３Ｒ）、及びＨ _４受容体（Ｈ４Ｒ）という、４つのヒスタミン受容体が知られている。

Ｖａｎｎｉｅｒら（「ヒスタミンは、ヒスタミンＨ _２受容体を介して、腫瘍壊死因子αの遺伝子発現及び合成を抑制する（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｓｕｐｒｅｓｓｅｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α ｖｉａ Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｈ _２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、１９９１年７月１日；１７４（１）：２８１〜４）は、末梢血単核細胞におけるＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−αの合成が、ヒスタミンにより抑制されることを示したが、マスト細胞からのヒスタミンの放出が、Ｈ _２受容体保有細胞における局所的なサイトカインの合成を抑制することにより、炎症反応及び免疫反応の程度を制限しうることもさらに示唆している。

ヒスタミンの抗炎症性活性は、ヒスタミンが、一過性の表面ＴＮＦＲ１の喪失、ＴＮＦＲ１シェディングの増大、及びＴＮＦＲ１分子の、培養されたヒト内皮細胞内のゴルジ装置からの移動を引き起こすことを示す、Ｗａｎｇら（「ヒスタミンは、細胞表面及びゴルジ装置貯蔵プールからのＴＮＦ受容体のシェディングを刺激することにより、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のシグナル伝達をアンタゴナイズする（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｏｏｌ）」；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２４）：２１７５１〜２１７６０）により既に開示されている。 免疫障害マウスへと移植されたヒト皮膚へのヒスタミンの注射は、ＴＮＦＲ１のシェディングを引き起こし、ＴＮＦを媒介する内皮接着分子の誘導を減殺した。

Ｖａｎｎｉｅｒら及びＷａｎｇらは、ヒスタミン産生菌株をプロバイオティクスとして用いることについても、抗炎症効果など、宿主にとってのある特定の健康利益を確保するために、どのようにして、これらの菌株を、それらのヒスタミン産生能に基づき選択するかについても言及しなかった。

ヒスタミンジヒドロクロリドの医薬グレード形態であるＣｅｐｌｅｎｅは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された患者における再発を防止するために用いられている。 Ｃｅｐｌｅｎｅは、ＡＭＬの寛解後段階、すなわち、患者が初期の化学療法完了した時期に、低用量の免疫活性化サイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に投与される。 研究は、Ｃｅｐｌｅｎｅ／ＩＬ−２が、白血病性細胞の、免疫を媒介する殺滅を誘導しうることを示した。 皮下注射である処置は、在宅の患者により、３週間のサイクルで、１８カ月間にわたり施される。 Ｃｅｐｌｅｎｅの副作用には、一過性の紅潮及び頭痛が含まれる。 患者が、必要な場合に、皮下注射の代わりに、局所的に産生されるヒスタミンを施されれば有利であろうが、この送達戦略は、細菌由来のヒスタミンを、本発明に従い選択される株を用いて、患者へと投与することにより達成することができる。

グラム陰性菌が、例えば、不適切な温度の後の生の魚類及び食肉においてヒスタミンを形成し、グラム陽性菌が、チーズ、ソーセージ、味噌、醤油、ビール、及びワインなど、発酵食物のヒスタミンによる腐敗を引き起こすことは、既に知られている。 食物中のヒスタミン産生菌の同定は、困難であった。

ラクトバチルス・ロイテリもまた、以前からヒスタミンの産生と関連づけられており、Ｃａｓａｓら（「プロバイオティクス概念の検証：ラクトバチルス・ロイテリは、ヒト及び動物における疾患に対する広域スペクトルの防御を付与する（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｃｏｎｃｅｐｔ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ）」；２０００、ＩＳＳＮ ０８９１−０６０Ｘ）は、Ｓｔｒａｕｂら（Ｚ Ｌｅｂｅｎｓｍ Ｕｎｔｅｒｓ Ｆｏｒｓｃｈ（１９９５）２０１：７９〜８２）によるＬ． ロイテリの２つの株が、Ｌ−ヒスチジンからカルボキシル基を除去して、ヒスタミンを形成することが示されたことを報告し、食物を発酵させるためにこのような株を用いること、及びプロバイオティクスとしてこのような株を用いることに対して警告している。

Ｔｒｉｐら（「ピルボイル依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼの成熟を触媒する新規の酵素であるＨｄｃＢ（ＨｄｃＢ，ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖｏｙｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）７９（４）、８６１〜８７１）は、ヒスタミン産生グラム陽性菌における、ヒスチジン脱カルボキシル化遺伝子座の３種類の遺伝子構成に言及している。 最大の群は、Ｌ． ヒルガルディー（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）０００６、Ｌ． ブーフナー乳酸桿菌（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）Ｂ３０１、Ｌ． ロイテリＦ２７５、及びＴ． ハロフィルス（Ｔ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）を含めた乳酸菌において見出される。 ラクトバチルス・ヒルガルディー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）０００６は、Ｌｕｃａｓら（「ラクトバチルス・ヒルガルディー ０００６内の不安定性プラスミドにおいてコードされるヒスタミン産生経路（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｏｎ ａｎ Ｕｎｓｔａｂｌｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ ０００６）」；ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００５年３月、７１巻、３号、１４１７〜１４２４ページ）により実施された研究において、ヒスタミンを産生することが示されており、さらに、ヒスタミンが、望ましくない細菌の増殖中に、複数の生成物内で出現する夾雑物であることも言われている。 Ｌｕｃａｓらは、ワイン用乳酸菌のコレクションのスクリーニングを実施して、ワインのグラム陽性菌ヒスタミン産生経路に関与する遺伝子を同定した。

ブーフナー乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）のヒスタミン産生株は、ヒスタミン中毒の発生に関与したスイス製チーズから分離されている（Ｓｕｍｍｅｒら、「ヒスタミン産生ブーフナー乳酸桿菌の、食物中毒発生に関与したスイスチーズからの分離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ｆｒｏｍ Ｓｗｉｓｓ ｃｈｅｅｓｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ａ ｆｏｏｄ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｏｕｔｂｒｅａｋ）」；Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５年）、５０巻、４号、１０９４〜１０９６ページ）。

Ｃａｌｌｅｓ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚら（「ストレプトコッカス・サーモフィルスのヒスタミン生合成遺伝子のクラスターについての配列決定及び転写解析：ｈｄｃＡの示差的発現に影響する因子（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ：Ｆａｃｔｏｒｓ Ｔｈａｔ Ａｆｆｅｃｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｄｃＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」；ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２０１０年９月、７６巻、１８号、６２３１〜６２３８ページ）は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）のヒスタミン産生株である、ヨーグルト及びある特定のチーズ品種を作製するために用いられる好熱性スターター菌について記載している。 Ｃａｌｌｅｓ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚらは、ヒスチジンからカルボキシル基を除去する能力を伴う株が存在すれば、消費前の製造中又は保管中に産生されたヒスタミンを含有する生成物が結果としてもたらされうること、及び、このことが、発酵乳製品の製造においてヒスタミン陰性株だけを用いることの重要性の基礎であることもさらに示している。

一部のラクトバチルス属が、ヒスタミンを産生しうることは既に知られているにせよ、ヒスタミンを産生する能力が、その宿主にとってのある特定の健康利益、例えば、ある特定のラクトバチルス属株の抗炎症特性を確保するための鍵となる因子であることは必ずしも知られてない。

先行技術からは、これを、ある特定のラクトバチルス属のプロバイオティック株をスクリーニング及び選択するために用いうることも知られていないか又は明白でない。

マスト細胞 マスト細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）（また、マスト細胞（ｍａｓｔｏｃｙｔｅ）及び肥満細胞としても知られている）とは、複数種類の組織の常在細胞であり、ヒスタミン及びヘパリンに富む多くの顆粒を含有する。 アレルギー及びアナフィラキシーにおけるそれらの役割で最もよく知られているが、マスト細胞はまた、例えば創傷の治癒及び病原菌に対する防護にも緊密に関与して、重要な防御的役割も果たしている。

マスト細胞は、大半の組織、特徴的には、周囲血管及び周囲神経に存在し、とりわけ、皮膚、肺及び消化管の粘膜のほか、口腔、結膜、及び鼻腔など、外界と内部環境との間の境界付近において顕在する。

アレルギー反応において、マスト細胞は、アレルゲンが、既にマスト細胞と会合しているＩｇＥに結合するまで不活性を維持する。 他の膜活性化イベントは、その後の脱顆粒化のためにマスト細胞をプライミングする場合もあり、ＦｃｅＲＩによるシグナル伝達と相乗的に作用する場合もある。 このような顆粒化に由来するヒスタミンは、後毛細管細静脈を拡張させ、その内皮を活性化させ、血管の透過性を増大させる。 ヒスタミンの放出は、局所的浮腫（腫脹）、温熱、赤み、及び他の炎症性細胞の放出部位への誘引をもたらす。 ヒスタミンの放出はまた、神経末端も刺激する（掻痒又は疼痛をもたらす）。 ヒスタミン放出の皮膚的徴候は、「発赤及び膨疹」反応である。 蚊に刺された直後の突起及び赤みは、この反応の好例であり、これは、アレルゲンによるマスト細胞の感作の数秒間後に生じる。 マスト細胞の他の生理学的活性は、それほどよく理解されてはいない。 いくつかの証拠が、マスト細胞は、生得免疫において極めて根本的な役割を果たしうる−マスト細胞は、広範にわたる重要なサイトカイン及びＴＮＦαなど、他の炎症性メディエーターを産出することが可能であり、マスト細胞は、広範なクラスの病原菌を認識することに関与すると考えられる複数の「パターン認識受容体」を発現させ、マスト細胞を伴わないマウスは、多様な感染症に対する感受性がはるかに大きいと考えられることを示唆している。

食物中の細菌性ヒスタミンの毒性、及び発酵生成物中のヒスタミン産生株を回避することが推奨されているという事実を考慮すると（Ｃａｌｌｅｓ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚら、「ストレプトコッカス・サーモフィルスのヒスタミン生合成遺伝子のクラスターについての配列決定及び転写解析：ｈｄｃＡの示差的発現に影響する因子（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ：Ｆａｃｔｏｒｓ Ｔｈａｔ Ａｆｆｅｃｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｄｃＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」；ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＯＧＹ、２０１０年９月、７６巻、１８号、６２３１〜６２３８ページにおけるさらなる例を参照されたい）、ある特定の選択されたラクトバチルス属株を、多様な疾患の処置及び／又は予防におけるヒスタミンの局所的産生のために用いることが明白であると考えることはできない。

マスト細胞など、ある特定の哺乳動物の固有の細胞型についてもそうであるように、宿主とその微生物との間の関係は複雑である。 この宿主−微生物関係は、多年にわたる共進化を通じて発生してきており、これには、微生物による多様な代謝物であって、宿主に栄養的利益、免疫的利益などをもたらし、特定の受容体又は他の過程の完全又は部分アンタゴニスト、アゴニスト、脱感作剤などとして作用しうる代謝物の産生が含まれる。 したがってまた、最も適切なプロバイオティック株を選択し、これらを用いて、このような発症に対抗しうるように、宿主の健康に影響を及ぼす特定の疾患又は他の状況と関連する、微生物とヒトとの間のこのような特定の相互作用を理解することも必要とされている。

本明細書において、本発明者らは、ラクトバチルス・ロイテリのある特定の株を含め、選択された乳酸菌群が、特定の増殖条件下でヒスタミンを局所的に産生することを見出した。 そして、このような局所的に産生されるヒスタミンが、かつての考えとは異なり、炎症の軽減、ある特定のがんの軽減などを含め、複数の様式で宿主に利益をもたらすことも見出した。

本発明の別の目的は、シンバイオティクスの生成物を得るために、前記株を含有する生成物を、特定の炭素供給源と併せて提供することである。

他の目的及び利点は、以下の開示及び付属の特許請求の範囲からより完全に明らかとなるであろう。

本方法に従い選択された乳酸菌株を、哺乳動物へと投与する結果として、複数の理由で有益でありうるヒスタミンが局所的に産生されるであろう。

本発明の主要目的は、良好な抗炎症効果を確保する乳酸菌株を選択する方法を提供することである。 ヒスチジンオペロン及びヒスタミンの産生は、ある特定の乳酸菌の抗炎症能にとって不可欠であるので、これらの株が、炎症状態を処置及び／又は予防するために用いられれば好ましいであろう。 これらの株は、大腸炎、ＩＢＤ、ＩＢＳ、憩室症、歯肉炎、膣炎などが含まれるがこれらに限定されない、哺乳動物体内のＧＩ管、ＧＵ管、口腔、肺及び気道、皮膚などにおける炎症性過程を処置及び／又は予防するために用いうることが好ましい。 Ｈ２受容体を介するヒスタミンは、ＴＮＦ−アルファの遺伝子発現を低減しうることが既に知られている。 さらに、マスト細胞も、広範にわたる重要なサイトカイン及びＴＮＦ−アルファなど、他の炎症性メディエーターを産出することが可能である。 しかしこれまでのところ、ヒスチジンオペロン、及びこのような選択された株による局所的ヒスタミンの産生が宿主にとって有益でありえ、例えば、選択されたＬ． ロイテリ株の抗炎症能において鍵となる因子であることは知られていない。 これまでは、ヒスタミンを要請する処置において、本方法に従い選択されたＬ． ロイテリを用いることも知られていなかった。

炎症状態を処置及び／又は予防するのに好ましい生成物及び株は、ラクトバチルス・ロイテリ、特に、ラクトバチルス・ロイテリ６４７５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５）である。 本発明の他の実施形態では、用いられる株が、ラクトバチルス・ロイテリ６４７５（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５）ではなない。

本明細書で規定される、本発明の株、生成物、及び組成物の治療的使用は一般に、関連する疾患又は疾患の症状の軽減又は緩和を結果としてもたらし、例えば、哺乳動物における炎症レベルの著明な軽減を結果としてもたらしうる。 例えば、局所的に産生されるヒスタミンは、腸の内皮細胞のほか、免疫細胞におけるＨ _２受容体を活性化して、例えば、炎症促進性サイトカインの阻害を介して、宿主の粘膜免疫を抑制している可能性がある。 したがって、本発明は、活性部位における食物成分（ヒスチジン）のヒスタミンへの転換、及び宿主免疫反応（例えば、消化管における）の局所的調節を可能とする。 本発明により提供されるこのようなヒスタミンの局所的産生は、とりわけ、認知された毒性作用及び健康に対する危険性のために、このような経口摂取が推奨されていない事実を踏まえるなら、例えば、ヒスタミンの経口摂取又は他の投与形態を上回る現実的な利点をもたらしうることを見て取ることができる。

特に、腸の炎症性疾患に関する場合、本発明の株、生成物、及び組成物の治療的使用は、例えば、ウォレススコアなどの標準的な方法により測定される潰瘍化及び腸の損傷（例えば、結腸損傷）の著明な軽減、体重減少の著明な低減、又は腸、例えば、結腸の炎症の著明な軽減を結果としてもたらし得る。

このような疾患又はその症状の軽減又は緩和は、任意の適切なアッセイにより測定することができる。 疾患又は症状の軽減又は緩和は、好ましくは＜０．０５の確率値で、統計学的に有意であることが好ましい。 このような疾患又は症状の軽減又は緩和は一般に、適切な対照の個体又は集団、例えば、健常な哺乳動物若しくは未処置の哺乳動物又はプラセボで処置された哺乳動物と比較して決定される。

株の適切な投与方式及び処方などは、ヒスタミンの局所的産生が所望される部位に応じて選択される。 好ましい投与方式は、経口投与方式であるが、一部の処置には、皮膚、直腸、膣、若しくは歯茎への局所投与の外用形態若しくは他の一部の形態が同様に適切であるか、又は静脈内注射若しくは筋内注射が適切であろう。

本明細書の例は、大腸炎を処置するための本発明の株の使用及びそれらの適切な用量を明示するが、これは、本発明に従い処置しうる炎症状態の一例に過ぎず、本明細書で規定される、本発明の適切な用量の株、生成物、及び組成物は、処置される疾患、対象の投与方式及び処方に応じて選択しうることが察知されるであろう。

ヒスチジンを含む食物混合物を用いて、ヒスチジンの存在を確保し、これにより、細菌の有効性を増大させることができる。 ヒスチジンは、単独で投与することもでき、細菌と併せて投与することもできる。

細菌によるヒスチジンの供給を確保する１つの可能性は、ヒスチジンに富む食物であって、ダイズタンパク質、チーズ、鶏卵、鶏肉、及び豚肉が含まれるがこれらに限定されない食物を摂取することである。

細菌中のヒスチジンオペロンは、ｐＨが低いか又はエネルギー供給源を制限した条件下で増殖能を改善することが示されている（Ｃａｌｌｅｓ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚら）が、ヒスチジンオペロンは、ある特定のＬ． ロイテリ株の抗炎症性の特色とは関連していない。

本方法に従い選択される株を、がん治療において用いることが、本発明の別の目的である。 ＩＬ−２と組み合わせたヒスタミンは、ＡＭＬを処置するために用いられている。 本発明の株を用いることにより、ＩＬ−２と組み合わせてＡＭＬを処置するために用いうるヒスタミンの局所的な産生が結果としてもたらされるであろう。

本発明の別の目的は、選択された株を用いて、食物アレルギー、他のアレルギー反応、又は他の自己免疫疾患を軽減することである。 全身におけるヒスタミンの増大は、既に知られている通り、マスト細胞の顆粒化によるアレルギーの帰結である。 本発明に従い選択された株をレシピエントへと投与する場合、局所的に産生されるヒスタミンは、アレルギー又は他の自己免疫疾患を軽減する脱感作効果をもたらすであろう。

また、ヒスタミン産生乳酸菌株を用いて、旅行者下痢の危険性を軽減することも本発明の目的である。 ヒスタミン遮断剤で処置された患者は、旅行者下痢を患う危険性を増大させるが、この危険性の増大は、本方法に従い選択される乳酸菌を投与することにより中和されうるであろう。

本発明のさらに別の目的は、ＭＳの処置において選択された株を用いることである。 ヒスタミンは、ＭＳのための新たな処置を開発するのに重要な分子であることが提起されており、本発明に従い選択される株は、患者にヒスタミンをもたらすであろう。

本発明のさらに別の目的は、ヒスタミン産生菌を、皮膚において利用可能なヒスチジン及びヒスチジン類似体を用いる、皮膚に対する抗炎症処置として用いることである。 ヒスチジンは、皮膚がＵＶ照射を介して産生するウロカニン酸の基質であるので、ウロカニン酸は、皮膚に対する抗炎症特性を有する。

このような選択された株を用いて、ＥＲＫ１／２の活性化を阻害することが別の目的である。

本発明の別の目的は、ＴＮＦアルファを阻害することである。

本発明の別の目的は、炎症を、局所的に又は全身において軽減することである。

本発明の別の目的は、ＥＲＫ１／２を阻害することにより、シナプス小胞の開口放出を増強することである。

本発明の別の目的は、ＥＲＫ１／２を阻害することにより、ヒト胚性幹細胞の自己再生を促進することである。

本発明の別の目的は、ＥＲＫ１／２を阻害することにより、マクロファージＡＢＣＡ１の発現及びコレステロールの流出を誘導することである。

本発明の別の目的は、ＥＲＫ１／２を阻害することにより、心肥大及び心不全を軽減することである。

本発明の別の目的は、白血病（例えば、ＡＭＬ）又は悪性黒色腫を含めたある特定のがんの増殖を軽減することである。 したがって、このようながんは、本発明の株、生成物、及び組成物を用いれば処置されうる好ましい疾患である。

本発明の別の目的は、選択された株を用いて、ある特定の条件下において、例えば、ＧＵ管のＣＮＳとの相互作用における神経伝達物質を産生させることであり、また、局所的疼痛時の神経シグナル伝達における神経伝達物質としてのヒスタミンを産生させることでもある。 この神経伝達物質としての役割は、腸の運動性に対する効果（便秘又は下痢を処置するための）、及び消化管における疼痛シグナル伝達へと拡張することができる。

選択されたＬＡＢは、ヒスタミンを産生し、内臓の痛覚及び腸内神経系におけるシグナル伝達に影響するので、本発明の別の目的は、選択された株を、消化管−脳軸に影響を及ぼすために用いることである。 したがって、本発明を、局所的なヒスタミンの産生から利益を得る任意の疾患の処置及び／若しくは予防、又はヒスタミンの局所投与により処置しうる任意の疾患の処置及び／若しくは予防のために用いうることを見て取ることができる。

前記株を含有する生成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。

ヒスタミン産生株の特異的な刺激を介して効果を増強するシンバイオティクスの生成物を有するために、特定の炭素供給源と併せて、前記株を含有する生成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。

ヒスチジン類似体又はヒスチジンを含有する生成物若しくは組成物を含め、ヒスチジンと併せて、前記株を含む生成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。 このような混合物は、内容物を下部ＧＩ管において放出するための保護カプセルにより経口投与して、作用部位におけるヒスチジン及び細菌の両方の存続を確保することが好ましい。

前記株の投与を、ヒスチジンに富む食餌と組み合わせることが、本発明のさらなる目的である。

本発明のなおさらなる態様は、本明細書の別の箇所で規定される治療的使用であって、少なくとも１つのさらなる治療剤又は栄養剤の投与をさらに含む使用のための生成物を提供する。 このような実施形態では、さらなる治療剤が、対象の疾患の処置において有用な任意のさらなる薬剤であることが可能であり、例えば、さらなる抗炎症剤、又は、例えば、ケモカイン若しくはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）などの免疫療法剤である。

好ましい実施形態では、前記さらなる薬剤が、ヒスチジン若しくはヒスチジン類似体、細菌株によるヒスタミンの産生を支援する適切な炭素供給源、又はこれらの組合せを含む。

前記さらなる薬剤は、本発明の株と併せて投与することもでき、個別に投与することもできる。 加えて、前記さらなる薬剤は、本発明の株と同時に投与することもでき、異なる時点において投与することもできる。 適切な投与レジーム及び投与回数は、さらなる対象の薬剤に応じて、当業者が容易に決定することができる。

本発明はまた、
（ｉ）活性ヒスチジンオペロンを有し、ヒスタミン産生が可能である、本発明の選択法により得ることが可能な乳酸菌株（又は、本明細書で別段に規定される通り、ヒスタミンを産生することが可能な乳酸菌株）と、
（ｉｉ）前記株によるヒスタミンの産生を支援する適切な炭素供給源、ヒスチジン又はヒスチジン類似体の供給源、及びこれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの付加的な成分とを含む組成物も提供する。

本明細書で記載される本発明の生成物、組成物、及び使用では、前記ヒスチジン若しくはヒスチジン類似体が、ヒスチジン若しくはヒスチジン類似体を含有する食品若しくは栄養補助食品の形態にあるか、又は前記炭素供給源が、グルコースを含むことが好ましい。 前記炭素供給源は、スクロースを含まないか、又はスクロースを、少なくとも株によるヒスタミンの産生をそれほどは損なわないレベルに限り含むことが好ましい。 場合によってまた、他のアミノ酸の供給源も提供されうる。

代替的な実施形態では、（ｉ）部で規定された株を、対象の疾患の処置において有用なさらなる成分、すなわち、さらなる治療剤、例えば、さらなる抗炎症剤、又は、例えば、ケモカイン若しくはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）などの免疫療法剤と組み合わせることができる。

ラクトバチルス・ロイテリとは、天然ではヒト及び動物の消化管に棲息するヘテロ発酵性乳酸菌種である。 特定のプロバイオティックＬ． ロイテリ株が、ヒトＴＮＦαの産生を強力に抑制するのに対し、他のプロバイオティックＬ． ロイテリ株は、ヒトＴＮＦαの産生を増強する。

本明細書の本発明は、活性化ヒト骨髄細胞に対するそれらの効果を顕示した、プロバイオティックＬ． ロイテリ６４７５株及び他の株の機構研究により可能となっている。 Ｌ． ロイテリの代謝物は、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣを用いて分離し、ヒスタミンは、ＮＭＲ分光分析及び質量分析により同定した。 ３連の四重極ＭＳによるヒスタミンの定量化は、グルコースベースの最小培地中で増殖させると、Ｌ． ロイテリ６４７５株が、比較的高濃度のヒスタミンを産生することを明らかにした。 以前のトランスクリプトミクス研究は、Ｌ． ロイテリヒスチジンオペロン内の２つの遺伝子が、６４７５株によるＴＮＦの阻害において役割を果たしうることを示唆した。 これらの遺伝子を標的とする突然変異誘発は、ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子、ＨｄｃＡ遺伝子、及びＨｄｃＢ遺伝子という、各ヒスチジンオペロン内の遺伝子が、６４７５株のＴＮＦ阻害性の表現型にとって重要であることを明らかにした。 機構研究は、ヒスタミンが、Ｈ _２受容体を介するがＨ _１受容体は介さないシグナル伝達を介して、ＴＮＦを阻害していることを裏付けた。 Ｈ _２受容体を介するシグナル伝達は、ＰＫＡを活性化させる細胞内ｃＡＭＰを増大させる。 ＰＫＡ活性は、ヒスタミンによるＴＮＦ抑制のために必要である。 ヒスタミンは、ＭＥＫ−ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を遮断する。

ヒスタミンは、アレルギー及びアナフィラキシーにおけるその炎症促進効果でよく知られているが、複数の研究は、ヒスタミンの抗炎症機能を裏付けている。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ヒスタミンが、ＬＰＳで刺激されたヒト単球及びヒトマクロファージからの、炎症促進性サイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−１２、及びＴＮＦの産生を阻害することが可能であり、この効果は、Ｈ _２受容体アンタゴニストにより拮抗されることを示した。 加えて、ヒスタミンは、Ｈ _２受容体を介して、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の産生も刺激しうる。 Ｈ _２受容体を介するシグナル伝達は、ヒト単球の表面におけるＬＰＳの認識に関与する受容体である、ＣＤ１４受容体の発現の減少を結果としてもたらす。 また、ＴＮＦ受容体も、ヒスタミンにより影響される。 Ｈ _１受容体を介するシグナル伝達は、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２の両方のシェディングを誘導する。 また、ｉｎ ｖｉｖｏ研究も、ヒスタミンについて抗炎症性の役割を明らかにしている。 特異的Ｈ _２受容体アゴニストであるジマプリットによる処置は、内毒素ショック（ＬＰＳ感作）及び肝炎（ＬＰＳにガラクトサミンを加えた感作）のマウスモデルにおける血漿ＴＮＦレベルを低減した。 ヒスタミンは、ＬＰＳ誘導性の肝臓損傷マウスモデルにおいて防御的であり、これらの効果は、Ｈ _２受容体ノックアウトマウスにおいて弱められた。 消化管では、ヒスタミンが、細菌感染に対して防御する一助となりうる。 パイエル板内のＨ _２受容体を介するシグナル伝達は、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）による感染を防止する一助となる。

ヒスタミンの効果は、標的細胞上におけるヒスタミン受容体の発現により決定することができる。 Ｔ細胞では、ヒスタミンの効果が、どのヒスタミン受容体が活性化されるのかに依存する。

Ｈ _１受容体を介するシグナル伝達により、ヒスタミンは、Ｔ _Ｈ １型の応答を増強するが、Ｈ _２受容体を介するＴ _Ｈ １応答及びＴ _Ｈ ２応答はいずれも抑制する。 ヒト消化管におけるヒスタミン受容体の発現を観察する研究を実施した。 被験細胞型の多くは、複数のヒスタミン受容体を発現させた。 例えば、マクロファージを含めた免疫細胞は、Ｈ _１受容体及びＨ _２受容体を高度に発現させ、Ｈ _４受容体の低度の発現を顕示した。 マスト細胞及びヒスタミンの増大は、ＩＢＳと関連する内臓の過敏性に関与した。 結腸粘膜の神経支配に近いマスト細胞の数及び活性の増大は、腹部痛覚の亢進を結果としてもたらしうる。 マスト細胞安定化剤であるケトチフェンによる研究は、ＩＢＳを伴う患者における疼痛閾値の上昇、ＩＢＳ症状の減少を裏付けたが、直腸生検組織内のマスト細胞の数又は活性（ヒスタミン及びトリプターゼの放出により決定される）の変化は裏付けなかった。 ＩＢＳの改善におけるケトチフェンの効果は、マスト細胞を安定化させた結果ではなく、Ｈ _１受容体アンタゴニストとしてのその他の役割に帰せられうるであろう。 Ｈ _１受容体の活性化が、炎症促進性応答と関連するならば、ケトチフェンによるその活性の遮断は、マスト細胞又はＬ． ロイテリなどの消化管の微生物叢のいずれかにより産生されたヒスタミンが、Ｈ _２受容体だけを介してシグナル伝達することを可能にする。 本発明者らが裏付けた通り、Ｈ _２受容体を介するシグナル伝達は、ＴＮＦの産生を抑制することが可能であり、抗炎症効果を引き起こしうる。 このケトチフェン機構は、Ｈ１受容体アンタゴニストをＬ． ロイテリ株の一般的なプロバイオティクスの効果と組み合わせる新たな療法のために用いることができる。

さらに、増殖培地の炭素の供給源を、グルコースからスクロースへと変化させることも、選択された株、例えば、Ｌ． ロイテリ６４７５株のＴＮＦ阻害性の表現型を抑制するのに十分である。 加えて、スクロースによる増殖条件に伴い、ヒスチジンオペロン内の３つの遺伝子全ての著明な下方調節も観察された。

ヒスタミンの、選択されたプロバイオティックラクトバチルス属株により産生される抗炎症性化合物としての同定は、このような株についての治療的適用を決定する一助となるであろう。 機構研究は、ＴＨＰ−１細胞上におけるＨ _２受容体のヒスタミンによる活性化と、ＥＲＫ活性化の抑制とを連関させた。 ＥＲＫの活性化は、ＴＮＦの産生に加えて、多くの細胞機能に関与している。 ＥＲＫの活性化は、増殖、腫瘍形成、分化、及び細胞の生存に関与している。 結果は、Ｌ． ロイテリ６４７５などの選択された株について、ＥＲＫ活性化の阻害を介して炎症、細胞増殖、及びアポトーシスを抑制することによる、がんに対する防御における役割を示唆する。 加えて、ヒスタミンは、既知の神経伝達物質でもある。 選択された株によるヒスタミンの産生は、腸内の神経系におけるシグナル伝達に影響を及ぼす可能性があることから、疼痛の知覚及び消化管の運動性に影響しうる。 作用部位におけるヒスタミンの産生を確保するためには、ヒスチジンを伴う細菌を供給することが有利でありうる。 ヒスチジンは、細菌と併せて投与することもでき、単独で投与することもでき、ヒスチジンに富む食餌も同様に、ヒスタミンの産生を増大させうる。

本発明は、ある特定の乳酸菌株、このような株を選択する方法、及びこのような株を含む生成物を提供する。 細菌は、ヒスチジンオペロンについてのスクリーニングを用いて選択するが、驚くべきことに、活性ヒスチジンオペロンの存在は、乳酸菌株の免疫調節特性など、多様な有益な効果にとって不可欠であることが示されている。

読者には、本発明の他の目的及び利点が明白となろうし、これらの目的及び利点は、本発明の範囲内にあることが意図される。

以下の非限定的な例を参照しながら、本発明をさらに記載することにする。

（例１）
選択された乳酸菌によるヒスタミンの産生細菌株及び培養条件 本研究において用いられる全ての細菌株を、表１に記載する。 ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５とは、フィンランド人の母乳に由来する分離株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡから入手可能）である。 本開示の全体において、Ｌ． ロイテリ株であるＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５、ＡＴＣＣ ６４７５ ＪＰ５７７、ＡＴＣＣ ６４７５ １２２９、ＡＴＣＣ ６４７５ １２３０、及びＡＴＣＣ ６４７５ １２３１を、それぞれ、６４７５株、ＪＰ５７７株、１２２９株、１２３０株、及び１２３１株と称することにする。 Ｌ． ロイテリ株は、ｄｅＭａｎ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｓｈａｒｐｅ培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中、嫌気条件下で１６〜１８時間にわたり培養し、２Ｌの半合成培地であるＬＤＭＩＩＩ（ＯＤ _６００が０．１へと調整された）へと接種したが、これについては、既に記載されている。 炭素供給源は、グルコース、ＬＤＭＩＩＩＧ又はスクロース、ＬＤＭＩＩＩＳであった。 培養物は、１０％のＣＯ _２ 、１０％のＨ _２ 、及び８０％のＮ _２の混合物を供給された嫌気性のワークステーション（ＭＡＣＳ ＭＧ−５００；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）内、３７℃で２４時間にわたり増殖させた。 異なる時点において試料を採取して、ＯＤ _６００を測定することにより、増殖を追跡した。 定常期（２４時間後）において、細胞を、２Ｌの培養物からペレット化させた（４０００×ｇで１０分間）。 細胞ペレット及び細菌細胞を含まない上清を、−２０℃で保存してから、ＨＰＬＣによる分離及びＴＮＦ阻害バイオアッセイにおける試験のためにさらに処理した。

細胞系及び試薬 ３７℃、５％のＣＯ _２ 、ＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）及び熱不活化ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で維持されたＴＨＰ−１細胞（ヒト単球様細胞系；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施した。 ＭＥＫ１／２抗体、ホスホ−ＭＥＫ１／２抗体、ＥＲＫ１／２抗体、及びホスホ−ＥＲＫ１／２抗体、並びにＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手し、β−アクチン抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手した。 他の全ての試薬は、別段に言明されない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。

ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣによる細胞壁会合因子の分離 ＬＤＭＩＩＩＧ又はＬＤＭＩＩＩＳ中で増殖させた６４７５株に由来する細胞ペレット（７ｇ）を、氷冷した５０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３０ｍＬで洗浄した。 細胞懸濁液を、４℃、４０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。 上清は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜によるフィルター（０．４５μｍの小孔サイズ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を介して濾過し、凍結乾燥させ、０．１％のギ酸１０ｍＬ中に再懸濁させた。 再懸濁させた試料は、ｕｌｔｒａｃｅｌ−３膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いる、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルターユニットで、サイズにより画分化した。 濾過物（９ｍＬ）を、高速真空化装置により乾燥させて１ｍＬまで減量し、０．７５ｍＬを、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣのために用いた。 試料を、１００％のアセトニトリルで溶解させてから、１００〜０％のアセトニトリルによる勾配、０．１％のギ酸と共にＰｏｌｙＬＣ Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌカラム上を流過させた。 試料を、チューブ１本当たり１０ｍＬ／分で２５分間にわたり流過させ、２５の画分（Ａ１〜Ｃ１）を回収した。 各画分に由来する３ミリリットルずつを凍結乾燥させ、３ｍＬの０．１％の酢酸中に再懸濁させ、ＴＮＦ阻害バイオアッセイにおける試験のために再度凍結乾燥させた。

ＴＮＦ阻害バイオアッセイ及びＴＮＦ ＥＬＩＳＡ
２４時間にわたるＬＤＭＩＩＩによる培養物からの細菌の上清（１０ｍＬ）を、上記の通りに、ＰＶＤＦ膜によるフィルター（０．２２μｍの小孔サイズ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてフィルター滅菌し、サイズにより画分化した。 ＜３ｋＤａの濾過物１ミリリットルを、高速真空化装置により乾燥させて、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。 これらの加工された上清試料を、条件付け培地と称する。 全ての上清は、容量により、ＯＤ _６００ ＝１．０へと標準化した。 ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣによる分離に由来する凍結乾燥画分は、１０ｍｇ／ｍＬの重炭酸アンモニウム４００μＬ中に再懸濁させ、高速真空化装置により乾燥させて、４００μＬのＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。 条件付け培地及び細胞ペレット洗浄液画分を、単球様細胞においてＴＮＦの産生を調節するそれらの能力について調べた。 略述すると、既に記載されている通りに、１００ｎｇ／ｍＬのＰａｍ _３ Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ×３ＨＣｌ（ＥＭＣ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することにより、ＴＨＰ−１細胞（約５×１０ ^４個の細胞）を刺激してＴＮＦを産生させた。 阻害剤（Ｈ _２受容体アンタゴニストであるラニチジン及びシメチジン（１０ ^−４ 〜１０ ^−６ Ｍ）、Ｈ _１受容体アンタゴニストであるインドメタシン（１０ ^−５ 〜１０ ^−６ Ｍ）、ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６（１０μＭ）、及びＰＫＡ阻害剤であるＨ８９（Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド）（１０ ^−５ Ｍ））を、ＴＨＰ−１細胞へと添加した後、Ｌ． ロイテリ条件付け培地若しくは細胞ペレット洗浄液画分（５％ｖ／ｖ）、ヒスタミン（１０ ^−５ Ｍ）、又はジブチリルｃＡＭＰ（１０ ^−３ 〜１０ ^−７ Ｍ）を添加した。 プレートは、３７℃及び５％のＣＯ _２で３．５時間にわたりインキュベートした。 ＴＨＰ−１細胞をペレット化させ（３０００×ｇ、５分間、４℃）、製造元（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の指示書に従い定量的ＥＬＩＳＡを用いて、ＴＨＰ−１細胞上清中のＴＮＦ量を決定した。

親水性相互作用液体クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ）を用いて、Ｌ． ロイテリ６４７５ ＴＮＦ阻害性化合物（単数又は複数）を分離した 細菌の細胞ペレットを洗浄して、細胞表面と弱く会合する化合物を除去した。 細胞ペレット洗浄液の成分を、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣを用いて、疎水性に基づき分離し、結果として得られる２５の画分を、ＴＮＦ阻害性化合物の保持について調べた。 唯一の炭素供給源としてのグルコースを伴う最小培地中で増殖させたＬ． ロイテリ６４７５は、３つの別個のＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分（Ｂ３、Ｂ５、及びＢ６；データは示さない）中に保持されたＴＮＦ阻害因子を産生する。 スクロースを唯一の炭素供給源として増殖させたＬ． ロイテリ６４７５は、ＴＮＦ阻害性の表現型を喪失し、陰性対照として用いられた。 ６４７５株スクロース細胞ペレット洗浄液に由来するＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分のうちのいずれも、著明なＴＮＦの阻害を顕示しなかった（データは示さない）。

ヒスタミンは、ＴＮＦ阻害性のＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分内で、ＮＭＲ分光分析及び質量分析により同定した ＴＮＦ阻害性のＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分Ｂ３を^１ Ｈ ＮＭＲにより解析し、近傍の非ＴＮＦ阻害性の画分Ｂ４と比較した。 画分Ｂ３中では、７．０〜７．５ｐｐｍの間で化学シフトを伴う固有の一連のピークであって、芳香族化合物に特徴的なピークが観察されたが、画分Ｂ４中では観察されなかった（データは示さない）。 この芳香族化合物クラスターを、その成分を同定するために、異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）二次元（２Ｄ）ＮＭＲでさらに解析した。 これらの芳香族化合物は、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスタミン、及び同定不可能であった１つの化合物からなった。 トリプトファン及びフェニルアラニンが細菌増殖培地の成分であるのに対し、ヒスタミンは、細菌増殖培地の成分ではない。 これらの結果は、付加的な２Ｄ ＮＭＲ法である全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）を用いて確認した。 ヒスタミンとは、乳酸菌を含めた一部の発酵性細菌により、ヒスチジンデカルボキシラーゼを介してヒスチジンから産生される生体アミンである。 ヒスタミンはまた、エレクトロスプレー飛行時間質量分析（ＥＳＩ ＴＯＦ ＭＳ）を用いて、画分Ｂ３内でも同定した。 ヒスタミンは、ＭＳ／ＭＳ解析におけるそのフラグメンテーションパターンに基づき、共有結合的には修飾されない。 スクロース培地中で増殖させたＬ． ロイテリ６４７５の対応するＢ３画分についてのＥＳＩ ＴＯＦ ＭＳによる解析は、ヒスタミンを明示しなかった。 グルコース培地中で増殖させたＬ． ロイテリ６４７５は、ＴＮＦ阻害性のＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分中に存在するヒスタミンを産生する。

ヒスタミンは、選り抜きのＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分中で、３連の四重極質量分析を用いて定量化した ３連の四重極質量分析とは、低分子化合物を定量化する、確立された高感度の方法である。 ヒスタミンは、Ｌ． ロイテリ６４７５グルコース（Ｂ２−Ｂ７）及びＬ． ロイテリ６４７５スクロース（Ｂ２−Ｂ９）のほか、細菌の培養物上清に由来する、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分の選り抜きの範囲内で定量化した。 高レベルのヒスタミン（＞３００ｎｇ／ｍＬ）は、ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣ画分がＴＮＦを阻害する能力と相関した（図１）。 低レベルのヒスタミンは、６４７５スクロースに由来する画分を含め、大半の被験画分内で測定された（図１）。 ＴＮＦの産生を阻害するヒスタミンの能力は、濃度依存性であると考えられる。

合成ヒスタミン及びＬ． ロイテリ６４７５により産生されるヒスタミンは、ＴＮＦの産生を、Ｈ _２受容体を介して阻害する ヒスタミンは、ＴＬＲ２で活性化されたヒト単球様細胞（ＴＨＰ−１）からのＴＮＦの産生を著明に阻害しうる（図４Ａ）。 ヒスタミンは、４つの異なるヒスタミン受容体を介してシグナル伝達しうるが、単球様細胞は、高レベルのＨ _１及びＨ _２受容体だけを発現させる。 先行研究では、ヒスタミンのＴＮＦの産生に対する、Ｈ _２受容体を介する効果が示されている。 Ｈ _１受容体特異的アンタゴニスト及びＨ _２受容体特異的アンタゴニストを用いて、どの受容体が、ヒスタミンのＴＨＰ−１細胞に対する効果を媒介しているのかを決定した。 Ｈ _２受容体特異的アンタゴニストであるラニチジン及びシメチジンは、ヒスタミンによるＴＮＦ阻害を、濃度依存的に遮断することが可能であった（図２Ａ）。 Ｈ _２受容体特異的抗体によるフローサイトメトリー解析は、ＴＨＰ−１細胞が、Ｈ _２受容体を高度に発現させることを明らかにした（データは示さない）。 Ｈ _１受容体特異的アンタゴニストであるインドメタシンは、ヒスタミンによるＴＮＦ阻害に対して効果を及ぼさなかった（図２Ａ）。 ヒスタミンは、ＴＬＲ２で活性化されたＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦの産生を、Ｈ _２受容体を介するシグナル伝達を介して遮断する。 ヒスタミンを含有するＬ． ロイテリ６４７５条件付け培地は、ＴＮＦを、培地対照と比較して著明に阻害し、この効果は、Ｈ _２受容体アンタゴニストにより部分的に遮断されるが、Ｈ _１受容体アンタゴニストによっては遮断されない（図２Ａ）。 ＴＮＦ抑制の部分的な遮断は、６４７５条件付け培地中に存在するヒスタミンが、Ｈ _２受容体を介してシグナル伝達していることを示すが、また、代替的な機構を介して作用する他のＴＮＦ阻害因子が条件付け培地中に存在しうることも示す。 また、６４７５株のヒスタミンを含有する細胞ペレット洗浄液も、ＴＮＦの産生を抑制する（図２Ｂ）。 ６４７５条件付け培地について見た通り、Ｈ _２受容体アンタゴニストが、６４７５細胞ペレット洗浄液の効果を部分的に遮断する（図２Ｂ）ことから、複数のイムノモジュリンが、画分化されていない細胞ペレット洗浄液中に存在することが示唆される。 高量の精製ヒスタミンを含有するＴＮＦ阻害性画分Ｂ３の効果は、Ｈ _２受容体アンタゴニストを添加することにより完全に遮断された。 （図２Ｂ）。

（例２）
ヒスタミンを産生する株の選択ヒスタミン産生菌の同定／選択 被験株及びおそらく選択される株は、嫌気条件下のｄｅＭａｎ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｓｈａｒｐｅ培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中で１６〜１８時間にわたり培養し、２Ｌの半合成培地であるＬＤＭＩＩＩ（ＯＤ _６００が０．１へと調整された）へと接種した。 炭素供給源は、ＬＤＭＩＩＩＧがグルコースであった。 各培養物は、１０％のＣＯ _２ 、１０％のＨ _２ 、及び８０％のＮ _２の混合物を供給された嫌気性のワークステーション（ＭＡＣＳ ＭＧ−５００；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）内、３７℃で２４時間にわたり増殖させた。 異なる時点において試料を採取して、ＯＤ _６００を測定することにより、増殖を追跡した。 定常期（２４時間後）において、細胞を、リアルタイムＰＣＲを用いて、ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子、ＨｄｃＡ遺伝子、及びＨｄｃＢ遺伝子という３つの遺伝子の存在について調べる解析のためにサンプリングした。

３つの遺伝子が陽性の株については、産生されたヒスタミンのレベルを、３連の四重極質量分析により決定する。 ヒスタミンの産生が最高度である（＞２５０ｐｇ／ｍｌ）株を選択する。 ヒスタミンの産生はまた、ＥＬＩＳＡ又はイムノアッセイによって評価及び定量化することもできる。

（例３）
免疫調節の実証ヒスチジンオペロンはＬ． ロイテリ６４７５のＴＮＦ阻害性の表現型に寄与する オペロンの一部であると考えられる３つの遺伝子が、Ｌ． ロイテリ６４７５によるヒスタミンの産生に関与している。 これらの遺伝子は、ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子、ヒスチジンピルボイルデカルボキシラーゼＡ型（ＨｄｃＡ）遺伝子、及びＨｄｃＢ遺伝子（図３Ａ）である。 先行するトランスクリプトミクス研究は、ヒスチジン／ヒスタミン対向輸送体遺伝子及びＨｄｃＡ遺伝子が、６４７５株のＴＮＦ阻害性の表現型にとって潜在的に重要であることを示唆した。 スクロース培地中で増殖させた６４７５株では、３つの遺伝子全てが、グルコース培地中で増殖させた６４７５株と比較して強く下方調節される（ＴＮＦの阻害を喪失する）（表２）。 加えて、ＴＮＦ阻害を喪失する２つの突然変異体では、オペロン内の少なくとも１つの遺伝子が、下方調節される（表２）。 これらの突然変異体は、既に精査されており、それらの遺伝子産物はＴＮＦ阻害特性を有さなかったが、これらの遺伝子は６４７５株の抗炎症性表現型にとって重要であると考えられた。 これに対し、ＴＮＦの阻害を喪失しない２つの突然変異体は、ヒスチジンオペロン内の遺伝子のうちのいずれの下方調節も顕示しなかった（表２）。 これらの３つの遺伝子の各々では、未成熟の終止コドンを、遺伝子配列へと挿入することにより突然変異を施した（１２２９株、１２３０株、及び１２３１株）。 陰性対照として用いられるように、非類縁遺伝子であるリファンピシン耐性遺伝子にもまた、突然変異を施した（ＪＰ５７７株）。 ヒスチジンオペロン内の遺伝子のうちのただ１つにおける突然変異も、野生型株と比較したＴＮＦ阻害の部分的な喪失を引き起こすのに十分であった（図３Ｂ）ことから、これらの遺伝子のうちの１つずつが、Ｌ． ロイテリ６４７５のＴＮＦ阻害性の表現型にとって重要であることが示唆される。 活性の部分的な喪失は、他の活性イムノモジュリンが、Ｌ． ロイテリ６４７５によりやはり産生されつつあることを示唆する。

ＥＲＫ１／２の活性化はＴＬＲ２で刺激された単球様細胞によるＴＮＦの産生にとって不可欠である ＥＲＫ１／２は、上流のＭＡＰＫＫ、ＭＥＫ１／２に由来するリン酸化により活性化され、ＴＮＦの産生にとって重要であることが既に示されている。 ＴＨＰ−１細胞を、変化させた時間にわたり、特異的ＭＥＫ１／２阻害剤であるＵ０１２６で処置して、ＥＲＫ１／２の活性化を抑制してから、ＴＬＲ２アゴニストによる刺激を行った。 Ｕ０１２６による３０分間にわたる処置は、ＴＮＦの産生を防止するのに十分であった（データは示さない）。 ＥＲＫ１／２は、ＴＬＲ２の刺激後に活性化され、本発明者らのモデル系においてＴＮＦの産生を刺激するのに重要である。

Ｈ _２受容体を刺激すると、細胞内のｃＡＭＰが結果として増大する Ｈ _２受容体とは、アデニル酸シクラーゼを活性化させ、細胞内ｃＡＭＰを増大させうる、Ｇタンパク質連結受容体である。 ＴＮＦを、ｃＡＭＰ及びｃＡＭＰ類似体により、転写レベルで阻害することができる。 ＴＨＰ−１細胞は、Ｈ _２受容体アンタゴニストを伴うか又は伴わない培地対照、６４７５株上清、又はヒスタミンの存在下、ＴＬＲ２アゴニストで刺激し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを測定した。 Ｌ． ロイテリ６４７５株上清は、少量ではあるが著明なｃＡＭＰの増大を引き起こした（データは示さない）。 Ｈ _２アンタゴニストによる処理は、この効果を遮断した。 ｃＡＭＰの増大はまた、ヒスタミン処置によっても見られ、その効果も、Ｈ _２アンタゴニストにより遮断された（データは示さない）。 ｃＡＭＰの合成類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｃＡＭＰ）を、ＴＬＲ２で刺激されたＴＨＰ−１細胞へと添加し、ＴＮＦの産生に対する効果をモニタリングした。 ｄｃＡＭＰ（１０ ^−５ 〜１０ ^−３ Ｍ）の添加は、ＴＮＦの産生を阻害するのに十分であった（データは示さない）。 ヒスタミンＨ _２受容体を刺激すると、ｃＡＭＰが結果として増大し、これにより、下流における活性化単球様細胞内のＴＮＦの産生が遮断されうる。

タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性は、Ｌ． ロイテリ６４７５株、ヒスタミン及びｄｃＡＭＰによるＴＮＦ阻害にとって重要である ｃＡＭＰの濃度の増大は、ＰＫＡを活性化させる可能性があり、その後、下流におけるＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害しうる。 ＰＫＡ活性が、６４７５株により産生されるヒスタミンによるＴＮＦ抑制にとって重要であったのかどうかを決定するために、活性化ＴＨＰ−１細胞を、６４７５株上清、画分Ｂ３、ヒスタミン、又は濃度を変化させるｄｃＡＭＰの存在下、特異的なＰＫＡ阻害剤であるＨ８９で処理した。 Ｈ８９の添加は、これらの通常はＴＮＦ阻害性である化合物の全てによるＴＮＦの阻害を部分的に遮断した（データは示さない）。 ＰＫＡ活性は、ヒスタミン及びｄｃＡＭＰによるＴＮＦの抑制にとって重要である。

Ｈ _２受容体を介するシグナル伝達は、ＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２の活性化を遮断する 先行研究は、ＰＫＡがＲａｓ／ＲａｆによるＭＥＫの活性化を阻害することが可能であり、その後、ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害しうることを裏付けた。 活性化ＴＨＰ−１細胞の、６４７５株上清、ヒスタミン、又はＵ０１２６による処置は、ＭＥＫ１／２及び下流におけるＥＲＫ１／２の両方のリン酸化を、培地対照と比較して遮断する（データは示さない）。 Ｈ _２受容体アンタゴニストによる処理は、ＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２の両方の活性化を回復させる（データは示さない）。 処置選択肢のうちのいずれによっても、ＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２のタンパク質レベルには差違が認められなかった。 ６４７５株に由来するヒスタミンは、ＭＥＫ及び下流におけるＥＲＫの活性化を阻害して、ＴＬＲ２で刺激された骨髄細胞からのＴＮＦの産生を結果として減少させる。

したがって、これらの実験は、Ｈ _２受容体の刺激が、ｃＡＭＰの増大、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化、及びＭＥＫ−ＥＲＫ ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害を結果としてもたらすことを示す。 上記の通り、機構研究を実施して、ヒスタミンのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に対する効果を決定した。 ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路のＭＥＫ特異的阻害剤による阻害は、ＴＮＦの産生を遮断するのに十分である。 活性化ＴＨＰ−１細胞の、６４７５株上清又はヒスタミンによる処置は、細胞内ｃＡＭＰを増大させた。 ｃＡＭＰの増大は、特異的Ｈ _２受容体アンタゴニストであるラニチジンにより遮断された。 ＴＬＲ２で刺激されたＴＨＰ−１細胞の、ｃＡＭＰの合成類似体であるｄｃＡＭＰによる処置は、ＴＮＦの産生を阻害するのに十分である。 ＰＫＡ活性の阻害は、ＴＮＦ阻害性化合物である、６４７５条件付け培地、画分Ｂ３、ヒスタミン、及びｄｃＡＭＰによるあらかじめのＴＮＦ抑制を部分的に遮断する。 活性化ＴＨＰ−１細胞の、６４７５条件付け培地、ヒスタミン、又はＵ０１２６による処置は、ＭＥＫ１／２の活性化を抑制したが、これはラニチジンの存在下で遮断された効果である。 活性化ＴＨＰ−１細胞の、６４７５条件付け培地、ヒスタミン、又はＵ０１２６による処置は、ＥＲＫ１／２の活性化を抑制したが、これもラニチジンの存在下で遮断された効果である。

（例４）
ウェスタンブロットによるＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２の検出 ＴＨＰ−１細胞を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ _３ ＶＯ _４ 、１％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．２％ｖ／ｖのＮａＮ _３ 、並びにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤からなる氷冷溶解緩衝液中で溶解させた。 溶解物を、氷上で３０分間にわたりインキュベートし、１０分間ごとにボルテックスし、１３，０００×ｇ、４℃で１０分間にわたる遠心分離により清明化させた。 タンパク質濃度は、製造元の指示書に従い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＱｕｂｉｔ蛍光光度計を用いて測定した。 等量のタンパク質を、電気泳動ゲルへと投入した。

ＥＲＫ１／２の活性化についての解析は、特異的ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体を用いて実施した。 細胞抽出物を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルへと投入し、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）へと転写した。 膜は、ブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）中、４℃で一晩にわたりブロッキングした。 複数回にわたる洗浄の後、膜を、ブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ）中で希釈されたＥＲＫ１／２特異的抗体、ホスホ−ＥＲＫ１／２特異的抗体、又はβ−アクチン特異的抗体で、室温で１時間にわたりプローブした。 洗浄後、膜を、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共に、室温で１時間にわたりインキュベートし、次いで、ブロットを、化学発光検出を用いて現像した。 ＭＥＫ１／２の活性化についての解析は、一次抗体とのインキュベーションが４℃で一晩にわたることを除き、上記の通りに実施した。

（例５）
ｈｄｃＡ突然変異体は、大腸炎を緩和する能力を減殺する細菌株及び培養 突然変異体は、ＲｅｃＴを媒介するオリゴヌクレオチド組換え操作を用いて発生させた。 ＲｅｃＴを発現するＬ． ロイテリ（ＲＰＲＢ００００株）を用いて、ｒｐｏＢ（遺伝子座タグ：ＨＭＰＲＥＦ０５３６＿０８２８（ＺＰ＿０３９６１５６８））内に突然変異を構築し、ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子クラスターである、ＨＭＰＲＥＦ０５３６＿１２２９（ＺＰ＿０３９６１９６９）、ＨＭＰＲＥＦ０５３６＿１２３０（ＺＰ＿０３９６１９７０）、及びＨＭＰＲＥＦ０５３６＿１２３１（ＺＰ＿０３９６１９７１）内に位置する標的遺伝子を用いて、それぞれ、ＲＰＲＢ３００２株、ＲＰＲＢ３００４株、ＲＰＲＢ３００５株、及びＲＰＲＢ３００６株をもたらした。 突然変異はＰＣＲにより検証し、完全性は配列解析により確認した。

Ｌ． ロイテリＡＴＣＣ ＰＴＡ ６４７５及びヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｈｄｃＡ）の突然変異体は、１０％のＣＯ _２ 、１０％のＨ _２ 、及び８０％のＮ _２の混合物を供給された嫌気性のワークステーション（ＭＡＣＳ ＭＧ−５００；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）内、３７℃のｄｅＭａｎ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｓｈａｒｐｅ培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中で培養した。

Ｌ． ロイテリ細胞の調製及びマウスへの投与 Ｌ． ロイテリ株の各々による単一のコロニーを、１０ｍｌのＭＲＳ培地に接種し、嫌気条件下、３７℃で１８〜２０時間にわたり増殖させた。 ＯＤ６００＝０．０３へと調整された細菌を、４０ｍｌのＭＲＳへと接種して、発酵を開始させ、嫌気条件下、３７℃で５．５時間にわたり増殖させた（ＯＤ６００≒２．５、細菌は、この時点で指数関数期にあった）。 細胞を静かにペレット化させ（２５００×ｇ、ＲＴ、４分間）、２５×１０ ^９ ＣＦＵ／ｍｌの濃度でＭＲＳ中に再懸濁させた。 培地対照としては、滅菌ＭＲＳ培地を用いた。 ８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの各々に、１０日間にわたる馴致の後、調製したての野生型のＬ． ロイテリ６４７５若しくはｈｄｃＡ突然変異体又はＭＲＳ（各回０．２ｍｌずつ）を、経口胃管栄養法により毎日１回７日間にわたり施した。 全てのマウス実験は、承認されたプロトコール（ＡＮ−４１９９；Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの動物施設）に従い実施した。 マウス（４５日齢）は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手し、フィルタートップケージ（ケージ１つ当たり５匹ずつのマウス）内、特定の無病原菌状態下で維持し、蒸留水及びＨａｒｌａｎ ｒｏｄｅｎｔ ｃｈｏｗ ２９１８を自由に摂取させた。 マウスは、異なる群に無作為に分けた。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）による直腸浣腸を用いた急性大腸炎の誘導。 大腸炎は、６回目の胃管栄養の６時間前に誘導した。 定常的なイソフルランの吸入によりマウスに麻酔をかけた。 水中に５％のＴＮＢＳ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を、等容量の絶対エタノールで希釈し、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの用量で直腸内投与した。 浣腸後２分間にわたり、マウスを垂直位置で頭を下にした状態に保ち、浣腸の結腸内における完全な保持を確保した。 手順対照マウスには、ＰＢＳ中５０％のエタノールを施した。 マウスは、ＴＮＢＳ投与の前、及びＴＮＢＳ投与の２日後に体重を測った。 次いで、マウスを屠殺した。 結腸の炎症及び損傷は、体重減少、肉眼によるスコア、及び血清ＳＡＡ濃度により決定した。

肉眼による大腸炎の評価 結腸を回収し、長手方向に切り開き、デジタルカメラにより画像を記録した。 結腸の炎症及び損傷は、ウォレス基準（Ｍｏｒｒｉｓら、１９８９）に従い決定した。 各結腸は、盲検でスコア付けした。 統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて実施した。 クルスカル−ワリス検定を用いて、解析に組み入れられた全ての群間における有意差を検出した。 結果は、中央値及び四分位数による範囲としてまとめた。

全身性炎症マーカーとしての血清アミロイドタンパク質Ａ（ＳＡＡ）の測定 心穿刺により血液試料を回収し、抗凝固処理し、１３，０００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離して、血漿を単離した。 血漿試料中の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）濃度は、製造元の指示書に従い、ＡＬＰＣＯ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。 ＳＡＡとは、大腸炎の重症度と相関する、マウスにおける全身性炎症を示す急性期タンパク質である。

結果Ｌ． ロイテリ６４７５は、マウスを、ＴＮＢＳ誘導性の急性大腸炎に対して防御する Ｌ． ロイテリ６４７５の抗炎症効果を、ＴＮＢＳ誘導性急性大腸炎のマウスモデルにおいて調べた。 経口胃管栄養法により毎日Ｌ． ロイテリ６４７５を施されたマウスを、培地対照を施されたマウスと比較した。 また、ＴＮＢＳの代わりにＰＢＳで感作されたマウスも、大腸炎の陰性対照として研究された。

図４〜６は、２つの独立する実験に由来するデータを表す。 ＴＮＢＳの代わりにＰＢＳを直腸内に施された大腸炎の陰性対照は、体重減少が極めて低度であり（又は体重が増加さえし）、結腸の損傷がまれであり、血清ＳＡＡ濃度が低かった。 ＭＲＳ培地及びＴＮＢＳ／ＥＴＯＨを施された大腸炎陽性マウスは、大幅な体重減少、結腸内の炎症を伴う潰瘍化、及び１ｃｍを超えて広がる主要な損傷部位、並びに血清中ＳＡＡ濃度の著明な上昇を特徴とする重度の大腸炎を発症した。 Ｌ． ロイテリ６４７５の経口胃管栄養法は、体重減少、結腸内の肉眼的炎症、及び血清ＳＡＡ濃度を著明に軽減したことから、Ｌ． ロイテリ６４７５は、大腸炎を著明に緩和したことが示される。

ｈｄｃＡ突然変異体は、大腸炎を緩和する能力を減殺する 本発明者らは、同じマウスモデルを用いて、ヒスチジンデカルボキシラーゼをコードするｈｄｃＡ遺伝子が、Ｌ． ロイテリ６４７５の抗炎症効果に要請されるのかどうかを調べた。 ８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、無作為に３つの群へと分け、これらの群のそれぞれに、野生型のＬ． ロイテリ６４７５若しくはｈｄｃＡ突然変異体又はＭＲＳ培地を施した。 図７及び８は、２つの独立する実験に由来するデータを表す。 ここでもまた、Ｌ． ロイテリ６４７５の経口胃管栄養法は、体重減少及び結腸の損傷を、培地対照群と比較して著明に軽減した。 ｈｄｃＡ突然変異体を施されたマウスは、体重減少及び結腸内の肉眼的炎症を、野生型の細菌を施されたマウスと比較して著明に増大させたことから、ｈｄｃＡ突然変異体は、大腸炎を緩和する能力を減殺させることが示される。