用于改进母乳哺育以减少过敏反应危险性的方法

发明领域

本发明涉及选择和利用乳酸菌以改进用于哺育婴儿的母乳。

相关技术的说明

过敏性疾病的卫生学认为，在工业化世界中的环境变化将导致在 幼年与微生物的接触减少从而导致在生长表皮出现过敏性疾病，例如 特应性湿疹、过敏性鼻膜炎、和哮喘。一个这样的环境变化被认为是 由于卫生条件、生活标准、饮食习惯等的改善而导致食入的各种天然 微生物种类的变化。这导致我们自然肠菌群组成的变化(《过敏与临 床免疫期刊》，2001；108：516-520)并且也改变了哺乳母亲的母乳成 分。这样的变化与普遍的各种类型的过敏反应相关联。还有报道说， 大家庭中较后出生的婴儿比其那些出生早的兄弟姐妹(家中的第一 个)患上过敏反应的危险性要小。这也暗示着母亲的母乳随着怀孕的 次数而“改进”。

人乳中包含在免疫系统很重要的各种成分，例如巨噬细胞、免疫 球蛋白、或抗生素蛋白，其被认为能使母乳哺育的后代的胃肠道和呼 吸道避免感染和发炎。此外，其它潜在的免疫调节因子的存在(例如， 寡糖复合物、生长因子、酶、激素、或细胞因子)已经被讨论过。人 乳中这些有益的特性加上高营养获得性和低抗原浓度是目前儿科专 家认为母乳是婴儿最好的食物的生理学基础，尤其对那些具有过敏反 应史的家庭。

因此，已经知道母乳包含一系列能够对婴儿的过敏反应发展造 成潜在影响的细胞因子和趋化因子。此前已有报道说调节过敏性反应 的成分，例如细胞因子、趋化因子、和粘附分子，被隐藏在哺乳期的 各个阶段乳液中(S Rudloff等，过敏反应1999，54，206-211)。细胞因子 或趋化因子对于母乳哺育的婴儿可能是有益的也可能是不利的。

还已经知道，由动物乳汁传递的细胞因子具有通过后代GI通道 仍存活的能力。例如，假定断奶之前的存活是由于通过母乳传递的 TGF-beta-1的结果，那么在断奶之后纯合TGF-beta-1-敲除小鼠死于 普遍的炎症疾病(Kulkarni AB等，Am J Pathology 1993；143，3-9)。 TGF-beta以各种方式通过肠并保持活性。IL-10也可以这样的方式保 持活性，从而由母乳传递来的IL-10到达GI通道，并能潜在地产生 有益的抗炎效果。

而且，Hawkes JS等(Lipids 2001 Oct 36：1179-81)报道说，长链多 聚不饱和脂肪酸与包括细胞因子生产在内的免疫调节的各方面相关。 这一研究的目的是为了调查母亲饮食补充富含二十二碳六烯酸 (DHA)的金枪鱼油的效果，其在一定浓度下在母乳中可以转变成生长 因子beta 1(TGF-beta-1)和TGF-beta-2。在这项随机的饮食干预试验 中，婴儿的母亲日常补充2000mg油，其包含空白对照剂(placebo)(n ＝40)，或300mg DHA(n＝40)，或者600mg DHA(n＝40)。在母乳 和淋巴液中DHA的升高与饮食中DHA成正比。在乳液DHA状态、 TGF-beta-1水平、以及TGF-beta-2水平之间彼此无关联。

IL-10是一种已被广泛讨论和接受的抗炎症细胞因子。这暗示着 其在婴儿的GI通道中具有抗炎症效果。这对于母乳哺育的婴儿是有 好处的，通常认为母乳在某种程度上帮助婴儿抗炎，婴儿在生命早期 不应该对肠道中的病原体/感染过度反应。而且，动物数据指出在乳 液中IL-10可能有利于后代。一个澳大利亚研究小组观察了一个动物 模型，其中观察了对蜱的过敏反应。对于蜱的皮肤刺痛检测(SPT)阴 性的动物具有IL-10和IL-4产物，具有IL-10减弱了的IgE(过敏性 应答)而动物没有出现过敏反应。在过敏性SPT+ve(组氨酸)动物 中，只产生了IL-4而没有IL-10产物。因此IgE没有被降低而过敏反 应发生了。因此IL-10减弱IgE作用引发的过敏反应并且可以防止 过敏反应发生。

TGF-beta-2(转移生长因子)也是一种被广泛讨论的生长因子/细 胞因子。其来源包括例如血小板，其产生毫克数量的TGF-beta/千克。 该因子及其同源物(见以下)也能从其它组织(微克TGF/kg)中分离 出来并且在脾脏和骨组织中占优势。人乳中也包含该因子并且其合成 也是通过例如巨噬细胞(TGF-beta-1)、淋巴细胞(TGF-beta-1)、内皮细 胞(TGF-beta-1)、角质形成细胞(TGF-beta-2)、粒层细胞(TGF-beta-2)、 软骨(TGF-beta-1)、成胶质细胞瘤细胞(TGF-beta-2)、白血病细胞 (TGF-beta-1)。

依赖于细胞类型和条件，TGF-beta的分泌可以由一系列不同的刺 激因子诱导包括类固醇、视黄醛衍生物、EGF(表皮生长因子)、NGF、 淋巴细胞活化剂、维生素D3、和IL1。TGF-beta的合成可以被EGF、 FGF(成纤维细胞生长因子)、地塞米松、钙、视黄醛衍生物和卵泡刺 激激素抑制。TGF-beta还影响其自身基因的表达而这可能在伤口愈 合中是重要的。TGF-beta存在至少五种同源物，已知为TGF-beta-1、 TGF-beta-2、TGF-beta-3、TGF-beta-4、TGF-beta-5，而与TGF-alpha 无关。这些同源物的氨基酸显示出70-80％的同源性。TGF-beta-1 是普遍形式并且几乎无处不在，而其他同源物只在更加局限的光谱的 细胞和组织中表达。从不同种类中分离出来的同源物在进化上很接近 并且具有98％的相同序列。成年人、猪、猿猴和牛的TGF-beta-1是 相同的而与鼠的TGF-beta-1在一个氨基酸位置上有所不同。人和鸡 的TGF-beta-1也是相同的。

还有报道称转移生长因子beta(TGF-beta)家族的成员是多效细 胞因子，在组织形态建成和生长中扮演关键角色(Ingman WV， Bioessays 2002 Oct 24：904-14)。TGF-beta-1、TGF-beta-2和TGF-beta-3 在哺乳动物生殖组织中含量丰富，其中发育和循环重建持续至出生后 和成人期。TGF-beta的潜在角色在性腺和第二性器官发育、精子发 生和卵巢功能、怀孕的免疫调节、胚胎移植和胎盘发育中被确认。

Rautava等在Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 38：378-388，April 2004中认为TGF-beta-2和IL-10表现出了在IL-10 生产中与TGF-beta-2的协同作用。

乳腺炎是乳房的一种炎症，其通常以触痛和红斑及某些时候发热 为特征，并且与TGF-beta-2相关。在乳腺炎期间，乳腺泡细胞的紧 密连接被打开，该过程伴随着钠、炎症细胞、以及炎症和免疫调节剂 在母乳中的升高。乳腺炎通常是单侧的，并且在母乳哺育的最初几周 最常出现。在工业化国家，乳腺炎通常被认为是一种低发病率的问题， 受影响的妇女通常由助产士或护士治疗。而经过对美国、芬兰和澳大 利亚哺乳妇女大规模长时间的调查发现乳腺炎比以前认为的要更加 普遍(Semba R.，Annals of the New York Academy of Sciences. November 2000；918：156-62)，认为大约有20-33％的妇女可能发展为 临床上明显的乳腺炎。而哺乳妇女中亚临床乳腺炎的数量甚至就更 多。

而且最近发现乳腺炎与母乳中更高的人免疫缺陷病毒(HIV)量 以及更高的母婴传播HIV风险相关联(Semba，R.D.，N.Kumwenda，T. E.Taha，等1999.Mastitis and immunological factors in breast milk of human Immunodeficiency virus-infected women.J.Hum.Lact.15(4)： 301-306)。

母乳中的TGF-beta-2大部分是上皮起源的，即使它由许多其它 细胞合成，包括B-细胞和T-细胞。因此TGF-beta-2水平的提高可能 是亚临床乳腺发炎的一种调节剂或一种结果。在母乳中钠和钾的比率 (Na/K比)据说是一种公知的感染和亚临床乳腺发炎的预测因子。

而且，Kalliomaki等在J Allergy Clin Immunol.1999 Dec；104 (6)：1251-7中认为初乳中的TGF-beta可以防止在整个母乳哺育期间过 敏性疾病的发生并提高人体中特异IgA的产量。

而且，人体和其他哺乳动物体的各种不同部分被许多不同种类的 细菌所居住，包括很多不同种类的乳酸杆菌。这样的细菌很多时候与 它们的宿主共生，给与宿主各种有益的作用，目前已知是不同的并且 取决于实际的菌株。例如，不同的乳酸菌菌株，即，罗伊乳酸杆菌 SD2112，具有特异的抗原，或位于其表面，或通过细菌释放于母亲 的胃肠道中。例如，在Valeur等，AEM，70，1176-1181(2004)的数据 中显示食入的罗伊乳酸杆菌SD2112可以影响健康人回肠中CD4+ T-伴侣细胞的水平。这样的观察也在哺乳动物种类和禽类中完成，其 显示这可能是肠菌群和宿主之间的一个功能信号系统。通过所谓的肠 -乳腺联系，来自活性菌株的抗原被保持活性运输到淋巴区域，即派尔 淋巴集结(Peyer′s patches)，在GI通道的上皮之下。在上皮抗原-特 异性的B-cells从GI通道经过循环而移动身体内其它粘膜包括唾液和 乳腺的之后，上皮抗原-特异性的B-cells随后被激活。这些细胞上特 异分子的表达被认为引导它们粘附在这些组织上。一旦在乳腺中，这 些免疫细胞随后就引发其它过程从而确定局部所产生的细胞因子的 水平。通过肠-乳腺联系的这种类型的信号被证明促进母乳中IgA的 分泌并且还非常可能应用于细胞因子的产生。

较早的时候有人建议(Laiho等，Pediatric Research 53：642-647， 2003)所观察到的母乳中营养和炎症因子之间的关系显示通过对母亲 的饮食进行干涉有可能影响母乳的免疫学特性。同一研究小组注意到 患有过敏性疾病的母亲与没有患病的母亲相比，乳液中的TGF-beta-2 浓度较低。在他们手中检测了IL-10，只是在低水平并且频率自然， 在患病和不患病的母亲乳液中没有不同。这说明对过敏性疾病的抵抗 主要是通过诱导TGF-beta-2和IL-10的口服耐受量，而且尤其是母 乳中TGF-beta-2可能在过敏性疾病的防治中扮演关键角色。然而， Weiner H.在Microbes and Infection，Volume 3，Issue 11，September 2001，pages 947-954中报道说，由于通过口服抗原所产生的调节T细 胞是在一种特异性抗原中被触发的，但是在一种非特异性抗原中会被 抑制，当它们在靶器官中遇到食入的自身抗原时会调节旁路抑制。因 此，粘膜耐受量可以被用于治疗在自然状态因不具有自身免疫而产生 的发炎。

不同的乳酸杆菌种类，包括罗伊乳酸杆菌，已被用于所谓生物制 剂的形成，意味着将存活的和有益的微生物提供给一种动物，包括 人。罗伊乳酸杆菌是动物胃肠道中最常见的居民之一，通常发现在肠 中，偶尔见于包括人的生殖道、母乳和健康动物口腔中。已知它具有 抗菌活性。例如，参见美国专利Nos.5,439,678，5,458,875，5,534,253， 5,837,238，和5,849,289。当罗伊乳酸杆菌细胞在甘油存在的情况下 生活在厌氧条件时，它们所产生的抗生素物质被称为罗伊素(B-羟基- 丙醛)。

较早已有报道说乳酸菌被用于防止和治疗各种类型的过敏反应 例如可参见如下专利或专利申请，Stadler等人的EP 1239032公开了 新的重组菌株，Clancy等的WO01/37865公开了通过乳酸杆菌降低 IgE的量。

因此，本发明的目的之一是提供经过选择的乳酸菌和其成分，用 于改进哺育婴儿的母乳，和进行这种选择的方法。更具体地说，本发 明的目的是提高在母乳中抗炎症细胞因子IL-10的水平以减少哺育 婴儿发生过敏反应的危险性，同时减少母乳中TGF-beta-2的量以减 少哺乳的母亲发生乳腺炎的危险性。

本发明的一个目的是在母乳哺育之前或期间通过给予母亲经选 择的、特异的乳酸菌株来弥补微生物菌群的不良变化。

本发明的另一目的是采用这里所描述的或类似的方法来选择区 分受测菌株在相关细胞类型上的特异细胞因子影响，并且用这样的特 定乳酸菌株作为母亲的饮食成分，以刺激IL-10在母乳中的产量提高， 同时由于降低TGF-beta-2水平，指示在母乳乳腺和其他组织亚临床 发炎水平的降低，因而减少了发生乳腺炎的危险性。乳腺炎和亚临床 乳腺炎被认为妨碍母乳哺育而不利于婴儿，而通过本发明的方法提供 所选择的乳酸杆菌可以改进母亲的健康并使她们能哺育更长时间。

本发明的又一目的是提供包含所述菌株、突变体、代谢体或其成 分的产品，包括制剂，用于给动物包括人的服用。

其它目的和优点将通过以下说明和权利要求而更加清楚。

发明概述

本发明包括乳酸杆菌，及其成分，其特性经过选择以改进用于哺 育婴儿的母乳，更精确的说是提高抗炎症细胞因子IL-10在母乳中的 水平从而减少所哺育婴儿发生过敏反应的危险性，同时降低诱因并因 此降低TGF-beta-2在母乳中的量，这意味着降低了哺乳的母亲发生 乳腺炎的危险性，从而提高了哺乳能力和为幼儿提供最佳保护和最佳 生长。这里，本发明还包括选择这样的乳酸杆菌菌株的方法。本发明 还包括一种在调配油产品中保存活的乳酸杆菌，作为活性成分平均分 送的新方法。

本发明的其它目的和优点将通过以下说明内容和权利要求而更 加清楚。

附图简要说明

图1是可用于制造本发明的产品的制造工艺流程图。

发明详细说明和优选实施例

本发明提供了一种产品用于改进哺育婴儿的母乳，更准确地说， 提供了一种产品以提高抗炎症细胞因子IL-10在母乳中的水平，并且 降低被哺育婴儿发生过敏反应的危险性，同时减少触发细胞信号物质 (TGF)产生的原因因子也就是TGF-beta-2在乳液中的量，从而降 低哺乳的母亲发生乳腺炎的危险性。与本发明相关的TGF-beta-2的 降低被认为是一种消耗所选择的乳酸菌产生的抗炎效果，意味着在最 近日常摄入细菌的乳酸菌组中亚临床乳腺炎降低。这里本发明所选择 的菌株的一个例子是罗伊乳酸杆菌SD2112(ATCC 55730)。

在临床试验中，在导致本发明的研究中，在分析中仅仅有三种因 子与母亲初乳中IL-10的水平相关：a)采用或不采用所选择的乳酸菌 治疗；b)母亲以前所生的孩子的数量；以及c)以前怀孕的次数。因 此，母亲怀孕次数或婴儿数量越多，她的初乳中IL-10就越多。在 分娩以前给予怀孕母亲4周的特异选择的乳酸菌也能提高初乳中IL- 10的水平而不要求以前怀过孕。

已知在某种情况下提高IL-10的系统表达还可防止I型糖尿病， 因此根据本发明所选择的菌株也可用于该目的。

这里所用的选择方法中，用于诱导母乳中IL-10，并显示 TGF-beta-2降低的最佳菌株，是采用一个已建立的鼠模型和传统分析 方法来选择的。其它类似在乳液中检测细胞因子产物的方法也可采 用。其细节将通过例子而被更清楚的理解。本发明的产品优选包含所 选择菌株的存活细胞；但是，如果这样细胞的分离的代谢体或部分对 菌株存活细胞的活性是可靠的，本发明的产品可以包括这样的代谢体 或部分于存活细胞之外或替代它。本发明的产品可以是妇女使用的任 何产品，例如油滴产品、食品、片剂、胶囊、粉囊、以及类似物。特 别适用于本发明的产品包括一种油滴(如实施例3)，其有助于维持 活性成份稳定较长时间。乳酸杆菌细胞可以被用于油的成分中以提高 细菌的稳定性，见于例子Gehrman等的U.S.专利4518696。但是在目 前乳酸菌在油和脂肪中存在的形式中我们没有发现包含如这里例子 所提到的重要步骤，即在成形前通过真空的方式干燥油以提高细菌培 养基的稳定性。

本发明产品中为达到效果所需要的所选择乳酸杆菌细胞的浓度 取决于食物的类型和被摄取的食物量(或在口腔中使用一种非食物 咀嚼治疗产品的时间)，但是产品的日常摄入量通常优选等于大约 105-108CFU(菌落形成单位)或更多。数量达到大约1010-1011CFU是 可能的，并且能被用于提高效果而不会影响产品的感官特性(其味道 或气味)。当产品是一种酸乳或其他乳酸发酵产品时，生产产品的乳 酸发酵菌株优选是标准培养基(例如，在酸乳中S.thermophilus和L. bulgaricus)。重要的是根据本发明所选择的菌株具有预期的细胞因子 效应，与产品中所用的任何标准培养基相容，因而所采用的每个菌株 重要特性是不被其他其它菌株的使用所影响。这能通过本领域已知的 筛选检测而确定。用于本发明的菌株可以在产品发酵之前或之后加 入，水平大约为酸乳形式每天106-108CFU或如上讨论的更多。

优选地，本发明产品不包括其它抗细菌成分，至少没有抑制或杀 伤所选择的乳酸杆菌菌株、或代谢体或其成分的物质、或影响其活性 的物质。

乳酸杆菌菌株或代谢体或其成分，可以以本领域公知的方式加入 混合到原料中以配制特定类型的产品。在采用细胞并且如果制备所选 择的食物或本发明的其它产品时，需要一个加热步骤，乳酸杆菌菌株 应该在加热之后被加入。一旦所选择的乳酸杆菌细胞位于产品中，优 选的是不要将产品加热至60-70℃或以上至一个较长时间。

本发明的特征将结合以下例子得到更清楚的理解，其不是对本发 明的限制。

实施例1：选择菌株的方法

根据本发明所采用的乳酸杆菌菌株的选择方法可以通过以下步 骤进行：

评价用于选择菌株的乳酸杆菌细胞在人乳液中刺激的IL-10的产 量和TGF-beta-2的减少量

这是选择方法的一个例子；本领域的技术人员可以对该方法作出 一定变换和替代，而不脱离本发明的范围。

材料和方法

动物：51只无菌的BALB/c小鼠(雄性和雌性)从Wisconsin University，USA购买。小鼠被装入无菌塑料薄膜运载箱中。15只小 鼠被转移入3个隔离箱中(隔离箱#2，3，和4)。两笼每个包含2 雄和4雌的被放置在隔离箱#1(繁殖)中。

动物处理

小鼠被放置在无菌可伸缩薄膜隔离箱中(Class Biologically Clean， Ltd，Madison，WI，USA)。隔离箱采用含有0.1％Naconal(Stepan Co.， Rocksport，IL.USA)的2％过氧乙酸(FMC Corporation，Philadelphia， PA，USA)溶液灭菌。5至6只小鼠被放置在过氧乙酸灭菌的带有不 锈钢丝盖子的聚苯乙烯笼中。同样性别的小鼠被放置在每个笼中。小 鼠采用热压消毒的啮齿类饲料Agway rodent chow 3500(Agway， Granville，Creedmoore，NC，USA)喂养。食物、水和垫褥均被高热高 压消毒。食物和垫褥在不锈钢圆筒中高热高压消毒然后无菌转移入隔 离箱。瓶装的可触发水高热高压消毒然后在放入隔离箱时用过氧乙酸 灭菌。所有小鼠随意接受食物和水。食物和水的水平每天进行检查。 垫褥一个星期更换一次。动物被维持在一个12小时的白天/黑夜循 环中。室内温度和相对湿度每天进行检查。

细菌

乳酸菌的检测采用生物化学和分子生物学技术进行鉴定和定性。 乳酸杆菌首先在10ml的Man-Rogosa-Sharp(MRS)培养基(BBL， Cockeysville，MD)中生长，在37℃中孵育18小时然后转移至90ml 的MRS中，在37℃中孵育18小时然后转移至1000ml的MRS中。 在37℃中孵育18小时，培养基在一台冰冻离心机(SORVALL RC2-B， SORVALL，Norwalk，CN，USA)中以3000rpm旋转10分钟，弃除上 清液，采用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗沉淀两次，以3000rpm离 心10分钟。每个菌株的沉淀采用30ml的PBS再悬浮。培养基被放 置在1.2-ml冷冻管中并且存放在-70℃直至使用。在将细菌提供给 小鼠之前，检查培养基的纯度和浓度。乳酸杆菌悬浮液连续的1/10 稀释液被培养在具有1.5％琼脂的MRS培养基平板上并且在包含厌 氧产物(Anaero Gen：Oxoid Ltd.，Wake Road，Basingstoke，Hampshire， England，GB)的厌氧罐中(GasPaK：BBL，Cockeysville，MD，USA)在 37℃孵育48小时。检查培养基的克隆形态和罗伊素产量。

检测处理(在本实施例中)。

对照

菌株：罗伊乳酸杆菌SD2112，ATCC 55730.

菌株：乳酸杆菌4000

菌株：乳酸杆菌4020

乳酸杆菌克隆的确定

在小鼠被放入隔离箱中之后一天，取自每个笼中小鼠的粪便样 本被检测微生物的存在。从11:00am至7:00pm小鼠被禁止饮水。 这段时期之后，1.2ml的乳酸菌悬浮液被加入到含有200ml水的瓶 中并提供给小鼠。隔离箱#2中的小鼠接受罗伊乳酸杆菌SD2112。 加入水中的悬浮液含油2.0×1010cfu/ml的罗伊乳酸杆菌SD2112。隔 离箱#4中的小鼠接收乳酸杆菌4000菌株，而隔离箱#5中的小鼠 接收乳酸杆菌4020菌株。加入到每瓶水中的乳酸菌悬浮液含有3.0 ×1010cfu/ml。隔离箱#3中的小鼠仅仅接受水(对照)。来自每个隔离 箱中的小鼠(笼组)的粪便样本(10小球)每周取一次，以检测乳酸菌 克隆及可能的其他微生物污染。

采用改变了的schaedler菌群″常规化″

克隆形成之后的6天，采用检测菌株开始的小鼠使用改变了的 schaedler菌群“常规化”。接收改变了的Schaedler′s菌群的C3H小鼠 购买自Taconic Farms，Inc.(Germantown，NY，USA)。两只小鼠被放置在 每个隔离箱中并且立即取走粪便样本以检测受测菌株的存在。对照小 鼠和带有受测菌株克隆化的小鼠被禁水过夜。第二天将C3H小鼠的 10个粪球放入每瓶饮用水中，悬浮在水中，并提供给小鼠。该程序连 续进行3天。来自BALB/c和C3H小鼠的粪便在一个月中每周获取 一次以检查改变了的Schaedler菌群克隆情况和存在受测菌株。

评估

受测菌株形成单克隆之后45天，并且″常规化″之后30天，每个 处理小组中的5只小鼠被安乐死，并且动物样本分离脾脏和T-淋巴细 胞，并且测定细胞因子。

制备脾脏细胞：脾脏被灭菌取出并放置在冷的PBS+0.5％牛血 清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO，USA)+0.1％叠 氮化钠(NaN3)(Sigma)中。来自脾脏的单细胞悬浮液通过用5ml的 RPMI-1640培养基(Sigma)+0.1mg/ml of庆大霉素(Sigma)灌注它 而获得。细胞悬浮液被转移入15ml无菌锥形管中，并且在一台冰冻 离心机中以2000rpm离心10分钟。倒出上清液将每管中的血红细胞 通过将细胞再悬浮于0.5ml PBS 1X中裂解，然后加入9ml蒸馏水， 充分混合，并且最终快速加入1ml的PBS 10X并充分混合。悬浮液 如上被离心随后去除上清液而将细胞再悬浮于5ml的RPMI-1640完 全培养基中。悬浮液的样本在显微镜下检查，并且如果有不是细胞的 颗粒存在，悬浮液通过一个无菌尼龙布过滤并且再次离心。小球再悬 浮于5ml的RPMI-1640完全培养基中，洗两次，最后再悬浮于5ml 的完全培养基中。细胞活力通过台酚蓝(Sigma)排除法测定。20μl 细胞悬浮液稀释于380μl的0.1％台酚蓝溶液(1∶20稀释)中并且采 用血细胞计数器计数。细胞悬浮液的浓度在完全的RPMI-1640中被 调整至1.0×106cells/ml。

细胞培养：细胞被培养在无菌96孔平底组织培养板上 (Fisherbrand，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)，采用RPMI-1640 完全培养基，存在或不存在(不刺激)诱导试剂，例如Concavalin A (5μg/ml)、来自鼠伤寒沙门氏菌LPS(1g/ml)、佛波醇12-豆蔻酸-13- 醋酸(PMA；10ng/ml)、离子霉素(I；0.5μg/ml)、以及热灭活的罗伊乳 酸杆菌(4.5mg蛋白/ml)。含有1.0×105细胞的100μl细胞悬浮液和 50μl热灭活的罗伊乳酸杆菌(4.5mg蛋白/ml)被加入到每孔中。每组 重复5遍。细胞培养基在5％CO2大气中37℃中带有促细胞分裂剂孵 育48小时，而带有罗伊乳酸杆菌孵育96小时。从5孔中收集上清 液，聚集并且储存在-70℃直至用于细胞因子检测。

细胞因子定量：上清液中的细胞因子(IL-10，TGF-beta-2)采用鼠 的QuantikineTMM试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA) 按照制造商推荐的程序通过ELISA进行检测。

结果

细胞因子为免疫系统蛋白，其为生物应答调节剂。它们协同抗体 和T细胞免疫系统相互作用，并且放大免疫反应。细胞因子包括由 巨噬细胞合成的单核因子和活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK) 产生的淋巴因子。

罗伊乳酸杆菌SD2112受测菌株显示出比来自菌株4000，4020 或对照小鼠细胞更高的(P＜0.05)IL-10浓度。而且TGF-beta-2水平 高于SD2112菌株。这个菌株是根据本发明选择的。

b.确定由乳酸杆菌菌株在人乳中刺激的IL-10的产量和 TGF-beta-2的减少量

这个例子证实所选择的菌株在体内给出了预期的效果。测得罗伊 乳酸杆菌，ATCC55730(可从The American Type Culture Collection， Manassas，VA，USA获得)检测。受测乳酸杆菌菌株生长在MRS培养 液(Difco)中，通过以1000x g离心而在指数生长期收集，采用磷酸 盐缓冲液(PBS；pH 6.8)清洗两次并用相同的缓冲液再悬浮。之后将 培养物加入到油滴产品中，按照以下例子3的方法。

该项研究是双盲的，空白对照剂对照存活确定了在过敏反应中所 选择乳酸菌的潜在性能，实施于Jnkping，Motala和Norrkping县 立医院的儿科，以及University Hospital in Linkping，Sweden。

来自具有过敏性疾病历史的家族的怀孕妇女在研究前的4个星 期随机口服接收罗伊乳酸杆菌SD2112，ATCC 55730，每天剂量为 1×108CFU或空白对照剂。过敏性疾病的历史由一名有经验的护士通 过电话调查确认。总之，从2001年1月至2003年4月232个家族 被包括在实验中，并且平等的随机分成实验组和空白对照剂组。

通过收集所有用过的研究产品的瓶子来评价配合程度并随后评 估她们的坚持程度。

方法

本研究包括初乳，取自分娩后头3天，以及成熟乳，取自分娩后 一个月，来自109名母亲。采用一个手工的吸乳泵收集母乳样本进入 无菌塑料管并且储存在-70℃直至分析。

融化之后，母乳样本被离心以去除脂肪和细胞碎片(Bottcher， 2000)。剩余物一部分立即被用于分析IL-10浓度而其余被存放在 -70℃并随后被用于分析TNF-α、IL4、TGF-beta-1、TGF-beta-2、可 溶CD14(sCD14)、全部IgA、分泌型IgA(sIgA)，以及钠和钾。

TGF-beta-1、TGF-beta-2和CD14(可溶CD14)的水平采用商业化 的ELISA试剂盒(R&D Systems，Abingdon，UK)根据制造商推荐的 方法进行分析。TGF-beta-1和TGF-beta-2的分析在酸处理潜在的 TGF-beta前体之后进行，如较早所述(Bottcher 2000)。IL-10和TNF-α 的水平采用商业化的ELISA试剂盒(CLB PeliPair reagent set， Amsterdam，the Netherlands)根据制造商推荐的方法进行测定。检测 低限对于TGF-beta-1和TGF-beta-2为62.5pg/mL，对于CD14为250 pg/mL，对于IL-10为2.3pg/mL，对于TNF-α为7.8pg/mL。

IgA和IgA的总量采用较早所述的ELISA(Bottcher 2002)检测。 检测低限是31.2ng/mL对于这两种检测。钠和钾的水平在Linkping University Hospital的临床化学系根据标准路线进行检测(离子选择 电极)。血清中对应于吸入的过敏原的IgE水平采用UniCap Pharmacia CAP SystemTM Phadiatop(Pharmacia Diagnostics，Uppsala， Sweden)进行分析。

统计分析

计算研究小组的大小是假定罗伊乳酸杆菌小组与空白对照剂小 组相比80％的比率足以显示临床真实差异。计算的基础是假定临床 出现过敏反应或湿疹的发生率在空白对照剂小组中为40％而在实验 小组中可减少一半。能算出每组所需要的对象为91个而半途而废的 频率估计为25％。通过外面的公司完成了随机列表并以4为字区大小 对每个中心分层抽样。需要登记的对象总数是基于以上的计算，包括 预期的半途而废率和字区大小，结果为每组116名妇女和他们的后 代。

伦理学考虑

根据Helsinki法典对人的医学研究的规定，参加者收到一个书面 信息并且签字表示同意。在油中的罗伊乳酸杆菌SD2112受测菌株被 认为是充分讨论过的并且对于幼儿和成人都是安全的食物，因此不会 引发伦理问题。

带有不同检测的研究程序也可见一个小问题，即这个危险人群有 很大比例将会发生过敏反应并且通过过敏反应筛选程序。该研究是由 University Hospital of Linkping的伦理审查委员会同意的。

结果

在研究中，当怀孕妇女在分娩前常规口服罗伊乳酸杆菌菌株 SD2112，四星期时我们检查了对母乳的效果。

母亲分布两组相比是相似的。当母亲日常摄入研究的产品时的星 期数量在两组之间没有不同，至于在一个月内全部母乳哺育。两组之 间的不连续，大到一个月之多，主要是由于对婴儿保护的治疗安排(排 除标准之一)。可见两组之间没有差异。

在罗伊乳酸杆菌受测菌株小组中细胞因子在母乳中的分布由于 抗炎症因子IL-10在初乳中的水平提高而变化(平均值6.61pg/mL[范 围1.15-150])，超过了空白对照剂小组中的母亲(4.78pg/mL[1.15 -150])；p＝0.046。同时看到了TGF-beta-2的水平在罗伊乳酸杆菌 SD2112小组中降低。在罗伊乳酸杆菌小组中TGF-beta-2的水平(平 均值674pg/mL[102.5-2800]比上965pg/mL[211.7-2800])明显 低于空白对照剂小组；p＝0.020。而其他参数的水平在两组中是类似 的。

分娩后4周获得的母乳和不连续日常摄入生物产品的，与空白对 照剂小组相比没有差异。

实施例3制备含有所选择菌株的产品

在这个例子中，制造了一种被称为″罗伊油滴″的产品。该产品是 在油的基础上包含了具有良好稳定性和存活性的罗伊乳酸杆菌 SD2112。产品生产过程中独特的工艺是一个干燥步骤，其用于去除 油中的大部分水分。

本发明这里所用的油是一种纯的食用植物油，优选向日葵油。虽 然一种油，例如一种纯的向日葵油不期望包含水，但是通过将其置于 真空中而干燥油的工艺步骤有一种意想不到的效果，即显著提高了乳 酸杆菌在成品中的稳定性。因此，本发明所用的油应该是尽可能去除 水。虽然以前已经知道这样的培养基的稳定性与成品中水的活性密切 相关，但是不知道的是在真空下干燥油用于使乳酸杆菌稳定化。

制造工艺的说明

优选的制造工艺流程图如图1所示。一个这样的可行工艺的细节 可如下用于本发明。

原料混合

1、在一个Bolz混合器/罐(Alfred BOLZ Apparatebau GmbH， Wangen imAllgau，Germany)混合中链三酸甘油酯(例如，Akomed R， (Karlshamns AB，Karshamn Sweden)和带有二氧化硅的向日葵油(例 如，Akosun，Karlshamns)，以及气相二氧化硅[Cab-o-sil M5P，M5P，卡 博特(Cabot)]。

2、均质化。一台Sine泵和分散器(Sine Pump，Arvada，Colorado) 被连接至Bolz混合器而混合物被均质化。

3、真空干燥。混合物在10mBar真空下在Bolz罐中干燥12 小时。

4、加入罗伊乳酸杆菌。大约20kg干燥过的油混合物被转移至 一个50升的不锈钢容器中。加入罗伊乳酸杆菌粉末(优选冻干的， 所用罗伊乳酸杆菌的数量变化取决于相放在油中的量，但一个例子是 加入0.2kg具有1011CFU/g的培养物)。缓慢混合直至同质。

5、混合。罗伊乳酸杆菌的预混合返回Bolz混合器中进行。

6、排出。悬浮液排出到一个200升的不锈钢容器中，以氮覆盖。 悬浮液维持在容器中直至灌入瓶子。

虽然这里介绍了一定的代表性实施例，但是本领域技术人员可以 作出改变而不脱离本发明的精神或范围。

发明背景