一种定位缓释微囊益生菌及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201610064261.9 | 申请日 | 2016-01-29 | 公开(公告)号 | CN105595359A | 公开(公告)日 | 2016-05-25 |
| 申请人 | 江苏微康生物科技有限公司; | 发明人 | 方曙光; 姜甜; 陈珂可; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 技术领域，尤其涉及一种 定位 缓释微囊 益生菌 及其制备方法；本发明的定位缓释微囊益生菌，由内至外依次包括菌体层、酸性包埋 吸附 层、以及复合离子层；菌体层包括益生菌和 益生元 ，酸性包埋吸附层包括酸性物质，复合离子层包括 碱 性物质；本发明的制备方法，通过将益生菌菌种活化后培养，生长至稳定期终止 发酵 ，离心后收集菌体，在菌体中加入益生元得到菌悬液，将菌悬液与酸性物质成比例混合搅拌后，再与碱性物质成比例混合搅拌，得到双层微囊菌液，将双层微囊菌液冻干处理制得；本发明的定位缓释微囊益生菌及其制备方法，有效保护益生菌，在目标位点释放益生菌菌体，使益生菌免受在食用过程中胃酸、胆汁盐、酶等外界因素影响。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种定位缓释微囊益生菌，其特征在于：由内至外依次包括菌体层、酸性包埋吸附层、以及复合离子层；所述菌体层包括益生菌和益生元，所述酸性包埋吸附层包括酸性物质，所述复合离子层包括碱性物质。 |
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| 说明书全文 | 一种定位缓释微囊益生菌及其制备方法技术领域背景技术[0002] 定位缓释微囊益生菌是微生态行业领先的益生菌保护、肠道定植和繁殖的技术。所谓微囊技术，就是利用天然的或者合成的高分子包囊材料，将固体的、液体的、甚至是气体的微小囊核物质包覆形成直径在1～5000μm范围内(通常是在5～400μm之间)的一种具有半透性或密封囊膜的微型胶囊技术，能保护囊心不被外界环境所影响。微胶囊的囊膜既可以是单层，也可以是双层或者是多层结构，而囊膜所包覆的囊核心物质既可以是单核的，也可以是多核的。微囊技术中包囊材料的选取，通常需根据具体产品的具体要求而定，既要求包囊材料能够在囊心物质上形成一层具有粘附力的薄膜，而且还要求使包囊材料不与囊心物质发生化学反应，同时还要考虑到产品的渗透性、吸湿性、稳定性、溶解性以及澄清度等因素。目前在食品加工业中所选用的包囊材料主要是以水溶性的胶类、淀粉、酪蛋白、海藻酸盐和纤维素衍生物，例如阿拉伯胶、海藻酸盐、羧甲基纤维素和酪蛋白钠等为主。 [0003] 益生菌是活的微生物制剂，能够改善宿主的肠道微生态平衡。寄居在人体肠道内的益生菌能抑制有害微生物和食物中病原微生物如沙门氏菌等的生长。益生菌在肠道内通过产生酸、细菌素及竞争肠道黏膜的受体和提高机体免疫力来发挥功效。将益生菌用定位缓释微囊技术包埋在壁材内，也可以降低外界环境对细胞的损伤，并能将益生菌在肠道高效定位释放和繁殖。然而如何最大限度地保护益生菌，在目标位点释放益生菌菌体，使益生菌免受在食用过程中胃酸、胆汁盐、酶等外界因素的影响，成为定位缓释微囊益生菌技术的难题。 发明内容[0004] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种有效保护益生菌，在目标位点释放益生菌菌体，使益生菌免受在食用过程中胃酸、胆汁盐、酶等外界因素影响的定位缓释微囊益生菌及其制备方法。 [0005] 本发明第一方面提供一种定位缓释微囊益生菌，由内至外依次包括菌体层、酸性包埋吸附层、以及复合离子层；所述菌体层包括益生菌和益生元，所述酸性包埋吸附层包括酸性物质，所述复合离子层包括碱性物质。 [0006] 应当说明的是，益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。本发明中所指的益生菌，应当包括但不局限于婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌中的一种或多种。 [0007] 本发明中所指的定位缓释微囊益生菌，其通过人体胃液时，微囊益生菌外层的碱性物质能中和胃酸，保护益生菌不受胃酸损伤，到达人体肠道时，微囊益生菌酸性包埋吸附层中的酸性物质能中和胆汁盐等肠道碱性环境，释放高活性的益生菌，并将益生菌定植于肠道上皮细胞，在益生元的作用下，益生菌得以选择性的大量繁殖，促进肠道有益菌生长。 [0008] 应当说明的是，益生元(Prebiotics)是一种膳食补充剂，通过选择性的刺激一种或少数种菌落中细菌的生长与活性，而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分。成功的益生元应是在通过上消化道时，大部分不被消化而能被肠道菌群所发酵的。最重要的是它只是刺激有益菌群的生长，而不是有潜在致病性或腐败活性的有害细菌。 [0009] 通常认为，益生元给益生菌提供“食物”，能够被肠道内有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖。如双歧因子，即为促进肠内双歧杆菌生长的益生元。而异麦芽低聚糖和低聚果糖是益生元中最为优异的代表。 [0010] 进一步的，本发明中所指的所述益生元包括低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖和异麦芽低聚糖中的一种或多种。 [0011] 进一步的，所述益生元以质量分数计包括20-30％的低聚半乳糖、10-30％的低聚果糖、20-40％的低聚木糖、以及20-35％的异麦芽低聚糖；其中，低聚半乳糖采用质量分数为70％的粉状制剂，低聚果糖采用质量分数为95％的粉状制剂。 [0013] 应当说明的是，所述酸性包埋吸附层，其作用在于中和肠道的碱性环境，并定位缓释益生元和益生菌，凡是能够实现上述功能的酸性物质和粘合剂，均应落入本发明的保护范围，而并不局限于氨基酸、脂肪酸、淀粉和环糊精；其中，氨基酸和脂肪酸的作用在于提供酸性离子以中和碱性环境，淀粉或环糊精的作用在于粘合酸性物质以形成酸性包埋吸附层、并乳化包埋其中的益生元和益生菌。 [0015] 应当说明的是，所述复合离子层中的碱性物质，其作用在于微囊益生菌经过胃部时，中和胃酸以防止胃酸进入微囊核心降低益生菌活性。凡是能够实现这一功能的碱性物质，均应落入本发明的保护范围；在具体使用过程中，该碱性物质应当满足，对于胃肠道内表皮细胞不会造成损伤，有效中和胃酸，同时复合离子层的厚度满足足以中和胃酸，同时当微囊进入肠道碱性环境时，又可以释放内部的酸性包埋吸附层。 [0016] 本发明第二方面提供一种定位缓释微囊益生菌制备方法，包括以下步骤： [0017] S1、菌体制备：将益生菌菌种活化后培养，生长至稳定期终止发酵，离心后收集菌体； [0018] S2、菌悬液制备：在菌体中加入益生元得到菌悬液； [0019] S3、酸性包埋吸附层制备：将菌悬液与含酸性物质的包埋剂成比例混合搅拌，得到单层微囊菌液； [0020] S4、复合离子层制备：将单层微囊菌液与碱性物质成比例混合搅拌，得到双层微囊菌液； [0021] S5、菌粉制备：将双层微囊菌液冻干处理制得。 [0022] 进一步的，所述益生菌包括婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌中的一种或多种。 [0023] 进一步的，所述益生元包括低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖和异麦芽低聚糖中的一种或多种。 [0024] 进一步的，所述益生元以质量分数计包括20-30％的低聚半乳糖、10-30％的低聚果糖、20-40％的低聚木糖、以及20-35％的异麦芽低聚糖。 [0025] 进一步的，所述包埋剂包括酸性物质和粘合剂，所述酸性物质包括氨基酸和脂肪酸，所述粘合剂包括淀粉和环糊精中的一种或两种。 [0026] 具体的，所述步骤S3中，菌悬液与包埋剂的混合比例为1:1-1:5。 [0027] 进一步的，所述碱性物质包括碳酸钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、氯化钙中的一种或多种。 [0028] 具体的，所述步骤S4中，单层微囊菌液与碱性物质的混合比例为1:1-1:3。 [0029] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明制得的定位缓释微囊益生菌冻干粉能很好的耐受胃酸、胆汁盐的影响，并能快速高效定植于肠道上皮细胞和大量繁殖，促进肠道有益菌生长，为益生菌制剂产品的开发和在食品、医药、保健品等行业的应用提供了高效冻干粉制备技术。 具体实施方式[0031] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 [0032] 实施例1：定位缓释微囊婴儿双歧杆菌及其制备 [0033] 将筛选出的婴儿双歧杆菌接种至10％的牛奶管中37℃活化培养24h，再转接至三角瓶中扩培培养12h，OD600>2.5后接种至发酵罐培养基中37℃培养10h，培养基组成为乳糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、玉米浆0.8％、麦芽汁0.5％、半胱氨酸盐酸盐0.06％、吐温- 800.5％、柠檬酸氢二铵0.06％。在发酵过程中流加NaOH碱液调节Ph4.5进行高密度发酵，当生长至稳定期前期即OD600大约等于7时降温终止发酵，再经过管式离心机离心20min收集菌体，菌泥中添加由25％低聚半乳糖、15％低聚果糖、30％低聚木糖和30％异麦芽低聚糖制成的保护剂，乳化包埋15min，得菌悬液。 [0034] 菌悬液与酸性包埋吸附层以1:3的比例混合，常温下以200rpm/min搅拌20min。酸性包埋吸附层由氨基酸、脂肪酸和淀粉组成。再以1:2.5的比例与复合离子层混合，常温下200rpm/min搅拌20min，复合离子层由0.5％碳酸钙、0.3％氢氧化镁和0.1％碳酸氢钠组成。 [0036] 制得的婴儿双歧杆菌定位缓释微囊菌粉具有良好的定位缓释能力和繁殖能力。模拟肠道实验设计方案：稀盐酸酸化至pH2.5的模拟胃液，作用2h；氢氧化钠调节pH8.0的模拟肠液，作用12h；接种至MRS培养基培养12h，活菌计数。将定位缓释微囊婴儿双歧杆菌和未进行定位缓释微囊益生菌进行对比，体外模拟实验情况如下， [0037]实验组 活菌数cfu/ml 定位缓释微囊婴儿双歧杆菌 2.5*1010 未定位缓释微囊婴儿双歧杆菌 3.7*109 [0038] 定位缓释微囊婴儿双歧杆菌菌粉在模拟肠道环境作用下，活菌数明显高于未进行定位缓释微囊化的，说明其耐胃酸、耐胆汁碱和吸附繁殖能力有显著效果。 [0039] 实施例2：定位缓释微囊长双歧杆菌及其制备 [0040] 将筛选出的长双歧杆菌接种至10％的牛奶管中37℃活化培养24h，再转接至三角瓶中扩培培养12h，OD600>2.5后接种至发酵罐培养基中37℃培养10h，培养基组成为乳糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨1％、玉米浆0.8％、麦芽汁0.5％、半胱氨酸盐酸盐0.06％、吐温- 800.5％、柠檬酸氢二铵0.06％。在发酵过程中流加NaOH碱液调节Ph4.5进行高密度发酵，当生长至稳定期前期即OD600大约等于7时降温终止发酵，再经过管式离心机离心20min收集菌体，菌泥中添加由30％低聚半乳糖、10％低聚果糖、25％低聚木糖和35％异麦芽低聚糖制成的保护剂，乳化包埋15min，得菌悬液。 [0041] 菌悬液与酸性包埋吸附层以1:5的比例混合，常温下以200rpm/min搅拌20min。酸性包埋吸附层由氨基酸、脂肪酸和淀粉组成。再以1:3的比例与复合离子层混合，常温下200rpm/min搅拌20min，复合离子层由0.5％碳酸钙、0.3％氢氧化镁和0.1％碳酸氢钠组成。 [0042] 上述菌悬液在-80℃的环境中预冻3h，再在冷阱温度为-50℃下，真空度为5-15pa下干燥40-60h，制得长双歧杆菌定位缓释微囊菌粉。 [0043] 制得的长双歧杆菌定位缓释微囊菌粉具有良好的定位缓释能力和繁殖能力。模拟肠道实验设计方案：稀盐酸酸化至pH2.5的模拟胃液，作用2h；氢氧化钠调节pH8.0的模拟肠液，作用12h；接种至MRS培养基培养12h，活菌计数。将定位缓释微囊长双歧杆菌和未进行定位缓释微囊益生菌进行对比，体外模拟实验情况如下， [0044]实验组 活菌数cfu/ml 定位缓释微囊长双歧杆菌 4.3*1010 未定位缓释微囊长双歧杆菌 3.4*109 [0045] 定位缓释微囊长双歧杆菌菌粉在模拟肠道环境作用下，活菌数明显高于未进行定位缓释微囊化的，说明其耐胃酸、耐胆汁碱和吸附繁殖能力有显著效果。 [0046] 实施例3：定位缓释微囊嗜酸乳杆菌及其制备 [0047] 将筛选出的嗜酸乳杆菌接种至10％的牛奶管中37℃活化培养24h，再转接至三角瓶中扩培培养10h，OD600>2.0后接种至发酵罐培养基中37℃培养6h，培养基组成为葡萄糖糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，牛肉浸粉1.0％，乙酸钠0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.06％，吐温-800.5％，柠檬酸氢二铵0.06％。在发酵过程中流加NaOH碱液调节Ph5.5进行高密度发酵，当生长至稳定期前期即OD600大约等于10时降温终止发酵，再经过管式离心机离心20min收集菌体，菌泥中添加由30％低聚半乳糖、20％低聚果糖、25％低聚木糖和25％异麦芽低聚糖制成的保护剂，乳化包埋15min，得菌悬液。 [0048] 菌悬液与酸性包埋吸附层以1:2的比例混合，常温下以200rpm/min搅拌20min。酸性包埋吸附层由氨基酸、脂肪酸和环糊精组成。再以1:2的比例与复合离子层混合，常温下200rpm/min搅拌20min，复合离子层由0.1％碳酸钙、0.3％氢氧化镁和0.03％氯化钙组成。 [0049] 上述菌悬液在-80℃的环境中预冻3h，再在冷阱温度为-50℃下，真空度为5-15pa下干燥40-60h，制得嗜酸乳杆菌定位缓释微囊菌粉。 [0050] 制得的嗜酸乳杆菌定位缓释微囊菌粉具有良好的定位缓释能力和繁殖能力。模拟肠道实验设计方案：稀盐酸酸化至pH2.5的模拟胃液，作用2h；氢氧化钠调节pH8.0的模拟肠液，作用12h；接种至MRS培养基培养12h，活菌计数。将定位缓释微囊嗜酸乳杆菌和未进行定位缓释微囊益生菌进行对比，体外模拟实验情况如下， [0051]实验组 活菌数cfu/ml 定位缓释微囊嗜酸乳杆菌 5.2*1010 未定位缓释微囊嗜酸乳杆菌 1.1*109 [0052] 定位缓释微囊嗜酸乳杆菌菌粉在模拟肠道环境作用下，活菌数明显高于未进行定位缓释微囊化的，说明其耐胃酸、耐胆汁碱和吸附繁殖能力有显著效果。 [0053] 实施例4：定位缓释微囊植物乳杆菌及其制备 [0054] 将筛选出的植物乳杆菌接种至10％的牛奶管中37℃活化培养24h，再转接至三角瓶中扩培培养10h，OD600>2.0后接种至发酵罐培养基中37℃培养6h，培养基组成为葡萄糖糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，牛肉浸粉1.0％，乙酸钠0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.06％，吐温-800.5％，柠檬酸氢二铵0.06％。在发酵过程中流加NaOH碱液调节Ph5.5进行高密度发酵，当生长至稳定期前期即OD600大约等于10时降温终止发酵，再经过管式离心机离心20min收集菌体，菌泥中添加由20％低聚半乳糖、30％低聚果糖、30％低聚木糖和20％异麦芽低聚糖制成的保护剂，乳化包埋15min，得菌悬液。 [0055] 菌悬液与酸性包埋吸附层以1:1的比例混合，常温下以200rpm/min搅拌20min。酸性包埋吸附层由氨基酸、脂肪酸和环糊精组成。再以1:1的比例与复合离子层混合，常温下200rpm/min搅拌20min，复合离子层由0.1％碳酸钙、0.3％氢氧化镁和0.03％氯化钙组成。 [0056] 上述菌悬液在-80℃的环境中预冻3h，再在冷阱温度为-50℃下，真空度为5-15pa下干燥40-60h，制得植物乳杆菌定位缓释微囊菌粉。 [0057] 制得的植物乳杆菌定位缓释微囊菌粉具有良好的定位缓释能力和繁殖能力。模拟肠道实验设计方案：稀盐酸酸化至pH2.5的模拟胃液，作用2h；氢氧化钠调节pH8.0的模拟肠液，作用12h；接种至MRS培养基培养12h，活菌计数。将定位缓释微囊植物乳杆菌和未进行定位缓释微囊益生菌进行对比，体外模拟实验情况如下， [0058]实验组 活菌数cfu/ml 定位缓释微囊植物乳杆菌 1.5*1010 未定位缓释微囊植物乳杆菌 4.6*109 [0059] 定位缓释微囊植物乳杆菌菌粉在模拟肠道环境作用下，活菌数明显高于未进行定位缓释微囊化的，说明其耐胃酸、耐胆汁碱和吸附繁殖能力有显著效果。 [0060] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 |
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