[0001] 本申请是申请日为2005年5月30日，原始中国申请号为200580011615.3，分案申请号为201110228888.0、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

[0002] 发明背景。发明领域

[0003] 本发明涉及选择和利用乳酸菌以改进用于哺育婴儿的母乳。

[0004] 相关技术的说明过敏性疾病的卫生学认为，在工业化世界中的环境变化将导致在幼年与微生物的接触减少从而导致在生长表皮出现过敏性疾病，例如特应性湿疹、过敏性鼻膜炎、和哮喘。一个这样的环境变化被认为是由于卫生条件、生活标准、饮食习惯等的改善而导致食入的各种天然微生物种类的变化。这导致我们自然肠菌群组成的变化 (《过敏与临床免疫期刊》, 
2001; 108: 516-520) 并且也改变了哺乳母亲的母乳成分。这样的变化与普遍的各种类型的过敏反应相关联。还有报道说，大家庭中较后出生的婴儿比其那些出生早的兄弟姐妹（家中的第一个）患上过敏反应的危险性要小。这也暗示着母亲的母乳随着怀孕的次数而“改进”。

[0005] 人乳中包含在免疫系统很重要的各种成分, 例如巨噬细胞、免疫球蛋白、或抗生素蛋白, 其被认为能使母乳哺育的后代的胃肠道和呼吸道避免感染和发炎。此外，其它潜在的免疫调节因子的存在 (例如，寡糖复合物、生长因子、酶、激素、或细胞因子) 已经被讨论过。人乳中这些有益的特性加上高营养获得性和低抗原浓度是目前儿科专家认为母乳是婴儿最好的食物的生理学基础，尤其对那些具有过敏反应史的家庭。

[0006] 因此, 已经知道母乳包含一系列能够对婴儿的过敏反应发展造成潜在影响的细胞因子和趋化因子。此前已有报道说调节过敏性反应的成分, 例如细胞因子、趋化因子、和粘附分子，被隐藏在哺乳期的各个阶段乳液中(S Rudloff 等, 过敏反应 1999,54,206-211)。细胞因子或趋化因子对于母乳哺育的婴儿可能是有益的也可能是不利的。

[0007] 还已经知道，由动物乳汁传递的细胞因子具有通过后代GI 通道仍存活的能力。例如，假定断奶之前的存活是由于通过母乳传递的TGF-beta-1的结果，那么在断奶之后纯合TGF-beta-1-敲除小鼠死于普遍的炎症疾病(Kulkarni AB 等, Am J Pathology 1993; 143, 3-9)。TGF-beta以各种方式通过肠并保持活性。IL-10也可以这样的方式保持活性，从而由母乳传递来的IL-10到达GI通道，并能潜在地产生有益的抗炎效果。

[0008] 而且, Hawkes JS 等(Lipids 2001 Oct 36: 1179-81) 报道说，长链多聚不饱和脂肪酸与包括细胞因子生产在内的免疫调节的各方面相关。这一研究的目的是为了调查母亲饮食补充富含二十二碳六烯酸 (DHA)的金枪鱼油的效果，其在一定浓度下在母乳中可以转变成生长因子 beta 1 (TGF-beta-1) 和TGF-beta-2。在这项随机的饮食干预试验中,婴儿的母亲日常补充2000 mg油，其包含空白对照剂（placebo） (n = 40)，或300 mg DHA (n = 40)，或者600 mg DHA (n = 40)。在母乳和淋巴液中DHA 的升高与饮食中DHA成正比。在乳液DHA 状态、TGF-beta-1水平、以及TGF-beta-2 水平之间彼此无关联。

[0009] IL-10是一种已被广泛讨论和接受的抗炎症细胞因子。这暗示着其在婴儿的GI通道中具有抗炎症效果。这对于母乳哺育的婴儿是有好处的，通常认为母乳在某种程度上帮助婴儿抗炎，婴儿在生命早期不应该对肠道中的病原体/感染过度反应。而且，动物数据指出在乳液中IL-10可能有利于后代。一个澳大利亚研究小组观察了一个动物模型，其中观察了对蜱的过敏反应。对于蜱的皮肤刺痛检测(SPT) 阴性的动物具有 IL-10和IL-4产物，具有IL-10减弱了的IgE (过敏性应答) 而动物没有出现过敏反应。在过敏性 SPT +ve (组氨酸) 动物中, 只产生了IL-4而没有IL-10产物。因此IgE 没有被降低而过敏反应发生了。因此 IL-10 减弱IgE作用引发的过敏反应并且可以防止过敏反应发生。

[0010] TGF-beta-2 (转移生长因子)也是一种被广泛讨论的生长因子/细胞因子。其来源包括例如血小板，其产生毫克数量的TGF-beta/千克。该因子及其同源物 (见以下) 也能从其它组织(微克 TGF/kg) 中分离出来并且在脾脏和骨组织中占优势。人乳中也包含该因子并且其合成也是通过例如巨噬细胞(TGF-beta-1)、淋巴细胞(TGF-beta-1)、内皮细胞(TGF-beta-1)、角质形成细胞(TGF-beta-2)、粒层细胞 (TGF-beta-2)、软骨(TGF-beta-1)、成胶质细胞瘤细胞 (TGF-beta-2)、白血病细胞 (TGF- beta-1 )。

[0011] 依赖于细胞类型和条件, TGF-beta的分泌可以由一系列不同的刺激因子诱导包括类固醇、视黄醛衍生物、EGF (表皮生长因子)、NGF、淋巴细胞活化剂、维生素D3、和 IL1。TGF-beta的合成可以被EGF、FGF (成纤维细胞生长因子)、地塞米松、钙、视黄醛衍生物和卵泡刺激激素抑制。TGF-beta 还影响其自身基因的表达而这可能在伤口愈合中是重要的。
TGF-beta存在至少五种同源物，已知为TGF-beta-1、TGF-beta-2、TGF-beta-3、TGF-beta-4、TGF-beta-5，而与TGF-alpha无关。这些同源物的氨基酸显示出70－80％的同源性。TGF-beta-1是普遍形式并且几乎无处不在，而其他同源物只在更加局限的光谱的细胞和组织中表达。从不同种类中分离出来的同源物在进化上很接近并且具有98％的相同序列。成年人、猪、猿猴和牛的TGF-beta-1是相同的而与鼠的TGF-beta-1在一个氨基酸位置上有所不同。
人和鸡的TGF-beta-1也是相同的。

[0012] 还有报道称转移生长因子beta (TGF-beta) 家族的成员是多效细胞因子，在组织形态建成和生长中扮演关键角色(Ingman WV, Bioessays 2002 Oct 24:904-14)。TGF-beta-1、TGF-beta-2和TGF-beta-3在哺乳动物生殖组织中含量丰富，其中发育和循环重建持续至出生后和成人期。TGF- beta的潜在角色在性腺和第二性器官发育、精子发生和卵巢功能、怀孕的免疫调节、胚胎移植和胎盘发育中被确认。

[0013] Rautava 等在 Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 38:378-388, April 2004中认为TGF-beta-2和IL-10表现出了在IL-10生产中与TGF-beta-2 的协同作用。

[0014] 乳腺炎是乳房的一种炎症，其通常以触痛和红斑及某些时候发热为特征，并且与TGF-beta-2相关。在乳腺炎期间，乳腺泡细胞的紧密连接被打开，该过程伴随着钠、炎症细胞、以及炎症和免疫调节剂在母乳中的升高。乳腺炎通常是单侧的，并且在母乳哺育的最初几周最常出现。在工业化国家，乳腺炎通常被认为是一种低发病率的问题，受影响的妇女通常由助产士或护士治疗。而经过对美国、芬兰和澳大利亚哺乳妇女大规模长时间的调查发现乳腺炎比以前认为的要更加普遍 (Semba R., Annals of the New York Academy of Sciences. November 2000;918:156-62)，认为大约有20- 33% 的妇女可能发展为临床上明显的乳腺炎。而哺乳妇女中亚临床乳腺炎的数量甚至就更多。

[0015] 而且最近发现乳腺炎与母乳中更高的人免疫缺陷病毒 (HIV)量以及更高的母婴传播HIV风险相关联 (Semba, R.D., N. Kumwenda, T. E. Taha, 等1999. Mastitis and immunological factors in breast milk of human Immunodeficiency virus-infected women. J. Hum. Lact. 15 (4)：301-306)。

[0016] 母乳中的TGF-beta-2大部分是上皮起源的，即使它由许多其它细胞合成，包括 B-细胞和T-细胞。因此TGF-beta-2水平的提高可能是亚临床乳腺发炎的一种调节剂或一种结果。在母乳中钠和钾的比率 (Na/K比) 据说是一种公知的感染和亚临床乳腺发炎的预测因子。

[0017] 而且，Kalliomaki 等在 J Allergy Clin Immunol. 1999 Dec; 104 (6):1251-7中认为初乳中的TGF-beta可以防止在整个母乳哺育期间过敏性疾病的发生并提高人体中特异IgA 的产量。

[0018] 而且，人体和其他哺乳动物体的各种不同部分被许多不同种类的细菌所居住，包括很多不同种类的乳酸杆菌。这样的细菌很多时候与它们的宿主共生，给与宿主各种有益的作用，目前已知是不同的并且取决于实际的菌株。例如，不同的乳酸菌菌株，即，罗伊乳酸杆菌SD2112，具有特异的抗原，或位于其表面，或通过细菌释放于母亲的胃肠道中。例如，在Valeur 等, AEM, 70, 1176-1181(2004 ) 的数据中显示食入的罗伊乳酸杆菌 SD2112 可以影响健康人回肠中CD4+ T-伴侣细胞的水平。这样的观察也在哺乳动物种类和禽类中完成，其显示这可能是肠菌群和宿主之间的一个功能信号系统。通过所谓的肠-乳腺联系, 来自活性菌株的抗原被保持活性运输到淋巴区域，即派尔淋巴集结（Peyer's patches），在GI通道的上皮之下。在上皮抗原-特异性的B-cells从GI通道经过循环而移动身体内其它粘膜包括唾液和乳腺的之后，上皮抗原-特异性的 B-cells 随后被激活。这些细胞上特异分子的表达被认为引导它们粘附在这些组织上。一旦在乳腺中，这些免疫细胞随后就引发其它过程从而确定局部所产生的细胞因子的水平。通过肠-乳腺联系的这种类型的信号被证明促进母乳中IgA的分泌并且还非常可能应用于细胞因子的产生。

[0019] 较早的时候有人建议(Laiho 等, Pediatric Research 53:642-647, 2003)所观察到的母乳中营养和炎症因子之间的关系显示通过对母亲的饮食进行干涉有可能影响母乳的免疫学特性。同一研究小组注意到患有过敏性疾病的母亲与没有患病的母亲相比，乳液中的TGF-beta-2浓度较低。在他们手中检测了 IL-10，只是在低水平并且频率自然，在患病和不患病的母亲乳液中没有不同。这说明对过敏性疾病的抵抗主要是通过诱导TGF-beta-2 和 IL-10的口服耐受量, 而且尤其是母乳中TGF-beta-2 可能在过敏性疾病的防治中扮演关键角色。然而， Weiner H.在 Microbes and Infection, Volume 3, Issue 11, September 2001, pages 947-954中报道说，由于通过口服抗原所产生的调节T细胞是在一种特异性抗原中被触发的，但是在一种非特异性抗原中会被抑制，当它们在靶器官中遇到食入的自身抗原时会调节旁路抑制。因此，粘膜耐受量可以被用于治疗在自然状态因不具有自身免疫而产生的发炎。

[0020] 不同的乳酸杆菌种类，包括罗伊乳酸杆菌, 已被用于所谓生物制剂的形成，意味着将存活的和有益的微生物提供给一种动物, 包括人。罗伊乳酸杆菌是动物胃肠道中最常见的居民之一，通常发现在肠中，偶尔见于包括人的生殖道、母乳和健康动物口腔中。已知它具有抗菌活性。例如，参见美国专利Nos. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, 和 5,849,289。当 罗伊乳酸杆菌细胞在甘油存在的情况下生活在厌氧条件时, 它们所产生的抗生素物质被称为罗伊素(B-羟基-丙醛)。

[0021] 较早已有报道说乳酸菌被用于防止和治疗各种类型的过敏反应例如可参见如下专利或专利申请，Stadler等人的EP 1239032 公开了新的重组菌株，Clancy等的 WO01/37865 公开了通过乳酸杆菌降低IgE的量。

[0022] 因此，本发明的目的之一是提供经过选择的乳酸菌和其成分，用于改进哺育婴儿的母乳，和进行这种选择的方法。更具体地说，本发明的目的是提高在母乳中抗炎症细胞因子IL-10 的水平以减少哺育婴儿发生过敏反应的危险性，同时减少母乳中TGF-beta-2 的量以减少哺乳的母亲发生乳腺炎的危险性。

[0023] 本发明的一个目的是在母乳哺育之前或期间通过给予母亲经选择的、特异的乳酸菌株来弥补微生物菌群的不良变化。

[0024] 本发明的另一目的是采用这里所描述的或类似的方法来选择区分受测菌株在相关细胞类型上的特异细胞因子影响，并且用这样的特定乳酸菌株作为母亲的饮食成分，以刺激IL-10在母乳中的产量提高，同时由于降低TGF-beta-2 水平，指示在母乳乳腺和其他组织亚临床发炎水平的降低，因而减少了发生乳腺炎的危险性。乳腺炎和亚临床乳腺炎被认为妨碍母乳哺育而不利于婴儿，而通过本发明的方法提供所选择的乳酸杆菌可以改进母亲的健康并使她们能哺育更长时间。

[0025] 本发明的又一目的是提供包含所述菌株、突变体、代谢体或其成分的产品，包括制剂，用于给动物包括人的服用。

[0026] 其它目的和优点将通过以下说明和权利要求而更加清楚。

[0027] 发明概述本发明包括乳酸杆菌, 及其成分, 其特性经过选择以改进用于哺育婴儿的母乳，更精确的说是提高抗炎症细胞因子 IL-10在母乳中的水平从而减少所哺育婴儿发生过敏反应的危险性，同时降低诱因并因此降低TGF-beta-2在母乳中的量，这意味着降低了哺乳的母亲发生乳腺炎的危险性，从而提高了哺乳能力和为幼儿提供最佳保护和最佳生长。这里，本发明还包括选择这样的乳酸杆菌菌株的方法。本发明还包括一种在调配油产品中保存活的乳酸杆菌，作为活性成分平均分送的新方法。

[0028] 本发明的其它目的和优点将通过以下说明内容和权利要求而更加清楚。

[0029] 附图简要说明图1是可用于制造本发明的产品的制造工艺流程图。

[0030] 发明详细说明和优选实施例本发明提供了一种产品用于改进哺育婴儿的母乳，更准确地说，提供了一种产品以提高抗炎症细胞因子 IL-10在母乳中的水平，并且降低被哺育婴儿发生过敏反应的危险性，同时减少触发细胞信号物质（TGF）产生的原因因子也就是 TGF-beta-2在乳液中的量，从而降低哺乳的母亲发生乳腺炎的危险性。与本发明相关的TGF-beta-2的降低被认为是一种消耗所选择的乳酸菌产生的抗炎效果，意味着在最近日常摄入细菌的乳酸菌组中亚临床乳腺炎降低。这里本发明所选择的菌株的一个例子是罗伊乳酸杆菌SD2112 (ATCC 55730)。

[0031] 在临床试验中，在导致本发明的研究中，在分析中仅仅有三种因子与母亲初乳中IL-10的水平相关：a) 采用或不采用所选择的乳酸菌 治疗；b) 母亲以前所生的孩子的数量；以及 c) 以前怀孕的次数。因此，母亲怀孕次数或婴儿数量越多，她的初乳中IL- 10 就越多。在分娩以前给予怀孕母亲4周的特异选择的乳酸菌也能提高初乳中IL- 10 的水平而不要求以前怀过孕。

[0032] 已知在某种情况下提高 IL-10的系统表达还可防止I型糖尿病，因此根据本发明所选择的菌株也可用于该目的。

[0033] 这里所用的选择方法中，用于诱导母乳中IL-10，并显示TGF-beta-2降低的最佳菌株, 是采用一个已建立的鼠模型和传统分析方法来选择的。其它类似在乳液中检测细胞因子产物的方法也可采用。其细节将通过例子而被更清楚的理解。本发明的产品优选包含所选择菌株的存活细胞；但是，如果这样细胞的分离的代谢体或部分对菌株存活细胞的活性是可靠的，本发明的产品可以包括这样的代谢体或部分于存活细胞之外或替代它。本发明的产品可以是妇女使用的任何产品，例如油滴产品、食品、片剂、胶囊、粉囊、以及类似物。特别适用于本发明的产品包括一种油滴 (如实施例3) ，其有助于维持活性成份稳定较长时间。乳酸杆菌细胞可以被用于油的成分中以提高细菌的稳定性, 见于例子Gehrman 等的U.S.专利4518696。但是在目前乳酸菌在油和脂肪中存在的形式中我们没有发现包含如这里例子所提到的重要步骤，即在成形前通过真空的方式干燥油以提高细菌培养基的稳定性。

[0034] 本发明产品中为达到效果所需要的所选择乳酸杆菌细胞的浓度取决于食物的类型和被摄取的食物量 (或在口腔中使用一种非食物咀嚼治疗产品的时间)，但是产品的日常摄入量通常优选等于大约 105-108 CFU (菌落形成单位)或更多。数量达到大约1010-1011 CFU 是可能的，并且能被用于提高效果而不会影响产品的感官特性 (其味道或气味)。当产品是一种酸乳或其他乳酸发酵产品时，生产产品的乳酸发酵菌株优选是标准培养基 (例如, 在酸乳中S. thermophilus 和L. bulgaricus)。重要的是根据本发明所选择的菌株具有预期的细胞因子效应，与产品中所用的任何标准培养基相容，因而所采用的每个菌株重要特性是不被其他其它菌株的使用所影响。这能通过本领域已知的筛选检测而确定。用于本发明的菌株可以在产品发酵之前或之后加入，水平大约为酸乳形式每天106-108 CFU 或如上讨论的更多。

[0035] 优选地，本发明产品不包括其它抗细菌成分, 至少没有抑制或杀伤所选择的乳酸杆菌菌株、或代谢体或其成分的物质、或影响其活性的物质。

[0036] 乳酸杆菌菌株或代谢体或其成分，可以以本领域公知的方式加入混合到原料中以配制特定类型的产品。在采用细胞并且如果制备所选择的食物或本发明的其它产品时，需要一个加热步骤，乳酸杆菌菌株应该在加热之后被加入。一旦所选择的乳酸杆菌细胞位于产品中，优选的是不要将产品加热至60-70 ℃或以上至一个较长时间。

[0037] 本发明的特征将结合以下例子得到更清楚的理解，其不是对本发明的限制。

[0038] 实施例 1：选择菌株的方法根据本发明所采用的乳酸杆菌菌株的选择方法可以通过以下步骤进行：
评价用于选择菌株的乳酸杆菌细胞在人乳液中刺激的IL-10的产量和TGF-beta-2 的减少量
这是选择方法的一个例子；本领域的技术人员可以对该方法作出一定变换和替代，而不脱离本发明的范围。

[0039] 材料和方法动物：51只无菌的 BALB/c 小鼠 (雄性和雌性) 从 Wisconsin University, USA购买。小鼠被装入无菌塑料薄膜运载箱中。15只小鼠被转移入3个 隔离箱中 (隔离箱 # 2, 
3, 和 4)。两笼每个包含2雄和4雌的被放置在隔离箱 #1 (繁殖)中。

[0040] 动物处理小鼠被放置在无菌可伸缩薄膜隔离箱中(Class Biologically Clean, Ltd , Madison, WI, USA)。 隔离箱采用含有0.1 % Naconal (Stepan Co. , Rocksport, IL. USA)的2% 过氧乙酸 (FMC Corporation, Philadelphia, PA, USA) 溶液灭菌。5至6只小鼠被放置在过氧乙酸灭菌的带有不锈钢丝盖子的聚苯乙烯笼中。同样性别的小鼠被放置在每个笼中。小鼠采用热压消毒的啮齿类饲料Agway rodent chow 3500 (Agway, Granville, Creedmoore, NC, USA) 喂养。食物、水和垫褥均被高热高压消毒。食物和垫褥在不锈钢圆筒中高热高压消毒然后无菌转移入隔离箱。瓶装的可触发水高热高压消毒然后在放入隔离箱时用过氧乙酸灭菌。所有小鼠随意接受食物和水。食物和水的水平每天进行检查。垫褥一个星期更换一次。动物被维持在一个 12 小时的白天/黑夜循环中。室内温度和相对湿度每天进行检查。

[0041] 细菌乳酸菌的检测采用生物化学和分子生物学技术进行鉴定和定性。乳酸杆菌首先在10 ml 的Man-Rogosa-Sharp (MRS) 培养基 ( BBL, Cockeysville, MD)中生长，在 37℃中孵育18小时然后转移至90 ml 的MRS中, 在 37º C中孵育18小时 然后转移至1000 ml的MRS中。在 37º C中孵育18小时，培养基在一台冰冻离心机(SORVALL RC2-B, SORVALL, Norwalk, CN, USA)中以3000 rpm旋转 10分钟，弃除上清液，采用无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗沉淀两次，以3000 rpm 离心10分钟。每个菌株的沉淀采用30 ml 的PBS再悬浮。
培养基被放置在 1.2-ml 冷冻管中并且存放在-70 ºC 直至使用。在将细菌提供给小鼠之前，检查培养基的纯度和浓度。乳酸杆菌悬浮液连续的 1/10 稀释液被培养在具有1.5％琼脂的MRS 培养基平板上并且在包含厌氧产物(Anaero Gen: Oxoid Ltd., Wake Road, Basingstoke, Hampshire, England, GB)的厌氧罐中 (GasPaK:BBL, Cockeysville, MD, USA) 在 37º C孵育48小时。检查培养基的克隆形态和罗伊素产量。

[0042] 检测处理(在本实施例中)对照
菌株: 罗伊乳酸杆菌 SD2112, ATCC 55730.
菌株: 乳酸杆菌 4000
菌株: 乳酸杆菌 4020
实施例 2：乳酸杆菌克隆的确定
在小鼠被放入隔离箱中之后一天, 取自每个笼中小鼠的粪便样本被检测微生物的存在。从11:00 am 至7: 00 pm小鼠被禁止饮水。这段时期之后，1.2 ml 的乳酸菌悬浮液被加入到含有200 ml水的瓶中并提供给小鼠。隔离箱 #2中的小鼠接受罗伊乳酸杆菌SD2112。加入水中的悬浮液含油2.0 x1010 cfu/ml 的罗伊乳酸杆菌SD2112。隔离箱 #4 中的小鼠接收乳酸杆菌 4000 菌株，而隔离箱 #5中的小鼠接收乳酸杆菌 4020 菌株。加入到每瓶水中的乳酸菌悬浮液含有 3.0 x 1010cfu/ml。隔离箱 #3中的小鼠仅仅接受水(对照)。来自每个隔离箱中的小鼠 (笼组)的粪便样本(10小球) 每周取一次，以检测乳酸菌克隆及可能的其他微生物污染。

[0043] 采用改变了的schaedler菌群"常规化"克隆形成之后的6天，采用检测菌株开始的小鼠使用改变了的schaedler菌群“常规化”。接收改变了的 Schaedler's菌群的C3H小鼠购买自Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY, USA)。两只小鼠被放置在每个隔离箱中并且立即取走粪便样本以检测受测菌株的存在。对照小鼠和带有受测菌株克隆化的小鼠被禁水过夜。第二天将C3H小鼠的
10个粪球放入每瓶饮用水中，悬浮在水中，并提供给小鼠。该程序连续进行3天。来自 BALB/c和C3H 小鼠的粪便在一个月中每周获取一次以检查改变了的Schaedler菌群克隆情况和存在受测菌株。

[0044] 评估受测菌株形成单克隆之后45天，并且"常规化"之后30天，每个处理小组中的5只小鼠被安乐死，并且动物样本分离脾脏和T-淋巴细胞，并且测定细胞因子。

[0045] 制备脾脏细胞：脾脏被灭菌取出并放置在冷的PBS + 0.5% 牛血清白蛋白(BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)+ 0.1 % 叠氮化钠 (NaN3) (Sigma)中。 来自脾脏的单细胞悬浮液通过用5 ml 的 RPMI-1640 培养基 (Sigma) + 0.1 mg/ml of 庆大霉素 (Sigma)灌注它而获得。细胞悬浮液被转移入15ml 无菌锥形管中，并且在一台冰冻离心机中以 2000 rpm离心10分钟。倒出上清液将每管中的血红细胞通过将细胞再悬浮于 0.5 ml PBS 1X中裂解，然后加入9 ml蒸馏水，充分混合，并且最终快速加入1 ml 的PBS 
10X 并充分混合。悬浮液如上被离心随后去除上清液而将细胞再悬浮于5 ml的RPMI-1640 完全培养基中。悬浮液的样本在显微镜下检查，并且如果有不是细胞的颗粒存在，悬浮液通过一个无菌尼龙布过滤并且再次离心。小球再悬浮于5 ml 的 RPMI-1640 完全培养基中，洗两次，最后再悬浮于 5 ml 的完全培养基中。细胞活力通过台酚蓝 (Sigma) 排除法测定。20μl细胞悬浮液稀释于380μl 的0.1% 台酚蓝溶液(1:20 稀释) 中并且采用血细胞计数器计数。细胞悬浮液的浓度在完全的RPMI-1640中被调整至1.0 x 106 cells/ml。

[0046] 细胞培养: 细胞被培养在无菌 96 孔平底组织培养板上(Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)，采用RPMI-1640 完全培养基，存在或不存在 (不刺激) 诱导试剂，例如Concavalin A (5μg/ml)、来自鼠伤寒沙门氏菌LPS (1g/ml)、佛波醇 12-豆蔻酸-13-醋酸 (PMA; l0 ng/ml)、离子霉素 (I; 0.5μg/ml)、以及热灭活的罗伊乳酸杆菌(4.5 mg 蛋白/ml)。含有 1.0 x 105 细胞的100μl细胞悬浮液和 50μl热灭活的罗伊乳酸杆菌(4.5 mg 蛋白/ml) 被加入到每孔中。每组重复5遍。细胞培养基在 5% C02大气中
37℃中带有促细胞分裂剂孵育48 小时，而带有罗伊乳酸杆菌孵育96 小时。从5孔中收集上清液，聚集并且储存在- 70º C 直至用于细胞因子检测。

[0047] 细胞因子定量: 上清液中的细胞因子 (IL-10, TGF-beta-2)采用鼠的 QuantikineTMM 试剂盒 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 按照制造商推荐的程序通过ELISA进行检测。

[0048] 结果细胞因子为免疫系统蛋白，其为生物应答调节剂。它们协同抗体和T细胞免疫系统相互作用，并且放大免疫反应。 细胞因子包括由巨噬细胞合成的单核因子和活化的T 淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK) 产生的淋巴因子。

[0049] 罗伊乳酸杆菌SD2112 受测菌株显示出比来自菌株 4000, 4020 或对照小鼠细胞更高的 (P<0.05) IL-10浓度。而且 TGF-beta-2水平高于 SD2112 菌株。这个菌株是根据本发明选择的。

[0050] b.确定由乳酸杆菌菌株在人乳中刺激的IL-10的产量和TGF-beta-2的减少量这个例子证实所选择的菌株在体内给出了预期的效果。测得罗伊乳酸杆菌, ATCC55730 (可从The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA获得)检测。受测乳酸杆菌菌株生长在MRS 培养液 (Difco)中, 通过以1000 x g离心而在指数生长期收集，采用磷酸盐缓冲液 (PBS; pH 6.8) 清洗两次并用相同的缓冲液再悬浮。之后将培养物加入到油滴产品中，按照以下例子3的方法。

[0051] 该项研究是双盲的，空白对照剂对照存活确定了在过敏反应中所选择乳酸菌的潜在性能，实施于Jönköping，Motala 和Norrköping县立医院的儿科, 以及 University Hospital in Linköping, Sweden。

[0052] 来自具有过敏性疾病历史的家族的怀孕妇女在研究前的4个星期随机口服接收罗8
伊乳酸杆菌 SD2112, ATCC 55730, 每天剂量为 1x10 CFU 或空白对照剂。过敏性疾病的历史由一名有经验的护士通过电话调查确认。总之，从2001 年1月至2003年4月232个家族被包括在实验中，并且平等的随机分成实验组和空白对照剂组。

[0053] 通过收集所有用过的研究产品的瓶子来评价配合程度并随后评估她们的坚持程度。 方法本研究包括初乳, 取自分娩后头3天，以及成熟乳，取自分娩后一个月，来自109名母亲。采用一个手工的吸乳泵收集母乳样本进入无菌塑料管并且储存在-70ºC 直至分析。

[0054] 融化之后，母乳样本被离心以去除脂肪和细胞碎片 (Bottcher, 2000)。剩余物一部分立即被用于分析IL-10浓度而其余被存放在-70℃并随后被用于分析TNF-α、IL4、TGF-beta-1、TGF-beta-2、可溶 CD14(sCD14)、全部IgA、分泌型 IgA (sIgA)，以及钠和钾。

[0055] TGF-beta-1、TGF-beta-2 和CD14 (可溶CD14)的水平采用商业化的ELISA 试剂盒 (R&D Systems, Abingdon, UK) 根据制造商推荐的方法进行分析。TGF-beta-1 和TGF-beta-2 的分析在酸处理潜在的TGF-beta前体之后进行, 如较早所述(Bottcher 2000)。IL-10 和 TNF-α的水平采用商业化的ELISA试剂盒 (CLB PeliPair reagent set, Amsterdam, the Netherlands) 根据制造商推荐的方法进行测定。检测低限对于TGF-beta-1 和TGF-beta-2为62.5 pg/mL，对于CD14为250 pg/mL，对于IL-10为2.3 pg/mL，对于TNF-α为7.8 pg/mL。

[0056] IgA 和IgA的总量采用较早所述的ELISA (Bottcher 2002)检测。 检测低限是31.2 ng/mL 对于这两种检测。钠和钾的水平在Linköping University Hospital的临床化学系根据标准路线进行检测 (离子选择电极)。血清中对应于吸入的过敏原的IgE 水平采用 UniCap® Pharmacia CAP SystemTMPhadiatop® (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)进行分析。

[0057] 统计分析计算研究小组的大小是假定罗伊乳酸杆菌小组与空白对照剂小组相比80％的比率足以显示临床真实差异。计算的基础是假定临床出现过敏反应或湿疹的发生率在空白对照剂小组中为40％而在实验小组中可减少一半。能算出每组所需要的对象为91个而半途而废的频率估计为25%。通过外面的公司完成了随机列表并以4为字区大小对每个中心分层抽样。
需要登记的对象总数是基于以上的计算，包括预期的半途而废率和字区大小，结果为每组
116名妇女和他们的后代。

[0058] 伦理学考虑根据Helsinki 法典对人的医学研究的规定，参加者收到一个书面信息并且签字表示同意。在油中的罗伊乳酸杆菌SD2112 受测菌株被认为是充分讨论过的并且对于幼儿和成人都是安全的食物，因此不会引发伦理问题。

[0059] 带有不同检测的研究程序也可见一个小问题，即这个危险人群有很大比例将会发生过敏反应并且通过过敏反应筛选程序。该研究是由University Hospital of Linköping 的伦理审查委员会同意的。

[0060] 结果在研究中，当怀孕妇女在分娩前常规口服罗伊乳酸杆菌菌株 SD2112，四星期时我们检查了对母乳的效果。

[0061] 母亲分布两组相比是相似的。当母亲日常摄入研究的产品时的星期数量在两组之间没有不同，至于在一个月内全部母乳哺育。两组之间的不连续，大到一个月之多，主要是由于对婴儿保护的治疗安排(排除标准之一)。可见两组之间没有差异。

[0062] 在罗伊乳酸杆菌受测菌株小组中细胞因子在母乳中的分布由于抗炎症因子IL-10在初乳中的水平提高而变化(平均值 6.61 pg/mL [范围 1.15 -150] )，超过了空白对照剂小组中的母亲 (4.78 pg/mL [1.15 -150] )；p = 0.046。同时看到了TGF-beta-2的水平在罗伊乳酸杆菌 SD2112 小组中降低。在罗伊乳酸杆菌小组中TGF-beta-2的水平(平均值 674 pg/mL [102.5 -2800] 比上 965 pg/mL [211.7 -2800] ) 明显低于空白对照剂小组；p = 0.020。而其他参数的水平在两组中是类似的。

[0063] 分娩后4周获得的母乳和不连续日常摄入生物产品的，与空白对照剂小组相比没有差异。

[0064] 实施例3 制备含有所选择菌株的产品在这个例子中, 制造了一种被称为 "罗伊油滴"的产品。该产品是在油的基础上包含了具有良好稳定性和存活性的罗伊乳酸杆菌SD2112。产品生产过程中独特的工艺是一个干燥步骤，其用于去除油中的大部分水分。 本发明这里所用的油是一种纯的食用植物油，优选向日葵油。虽然一种油，例如一种纯的向日葵油不期望包含水，但是通过将其置于真空中而干燥油的工艺步骤有一种意想不到的效果，即显著提高了乳酸杆菌在成品中的稳定性。
因此，本发明所用的油应该是尽可能去除水。虽然以前已经知道这样的培养基的稳定性与成品中水的活性密切相关，但是不知道的是在真空下干燥油用于使乳酸杆菌稳定化。

[0065] 制造工艺的说明优选的制造工艺流程图如图1所示。一个这样的可行工艺的细节可如下用于本发明。

[0066] 原料混合1、在一个Bolz 混合器/罐(Alfred BOLZ Apparatebau GmbH, Wangen imAllgau, Germany)混合中链三酸甘油酯 (例如，Akomed R, (Karlshamns AB, Karshamn Sweden) 和带有二氧化硅的向日葵油 (例如，Akosun, Karlshamns)，以及气相二氧化硅[Cab-o-sil M5P, M5P, 卡博特(Cabot)]。

[0067] 2、均质化。一台 Sine 泵和分散器 (Sine Pump, Arvada, Colorado) 被连接至Bolz混合器而混合物被均质化。

[0068] 3、真空干燥。混合物在10 mBar真空下在 Bolz 罐中干燥 12小时。

[0069] 4、加入罗伊乳酸杆菌。大约20 kg 干燥过的油混合物被转移至一个 50 升的不锈钢容器中。加入罗伊乳酸杆菌粉末（优选冻干的，所用罗伊乳酸杆菌的数量变化取决于相放11
在油中的量，但一个例子是加入0.2 kg 具有10 CFU /g的培养物）。缓慢混合直至同质。

[0070] 5、混合。罗伊乳酸杆菌的预混合返回Bolz 混合器中进行。

[0071] 6、排出。悬浮液排出到一个200 升的不锈钢容器中，以氮覆盖。悬浮液维持在容器中直至灌入瓶子。

[0072] 虽然这里介绍了一定的代表性实施例，但是本领域技术人员可以作出改变而不脱离本发明的精神或范围。

[0073] 罗伊乳酸杆菌菌株（简称罗伊乳杆菌菌株）SD2112，保藏号为ATCC 55730，于1995年12月07日保藏在ATCC，ATCC的地址为美国马里兰州20852罗克维尔市。