用于肠神经系统发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938 |
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| 申请号 | CN201280065592.4 | 申请日 | 2012-11-30 | 公开(公告)号 | CN104244736A | 公开(公告)日 | 2014-12-24 |
| 申请人 | 生命大地女神有限公司; | 发明人 | 加芙列拉·贝尔贡齐立-德蒙; 马加利·福尔; 尼科尔·库施; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于促进幼年 哺乳动物 中肠神经系统的健康发育和/或修复的罗伊氏乳杆菌DSM17938，和包含罗伊氏乳杆菌DSM17938的组合物。人类或动物，特别是 胎儿 、早产或足月婴儿、学步儿或儿童可以受益于本发明。本发明对于在子宫内、在出生期间或之后经历了IUGR、具有低或极低出生体重、和/或遭受肠神经系统生长停滞的那些婴儿是特别有益的。施用罗伊氏乳杆菌DSM17938促进正常的和健康的神经元和神经胶质发育。它还确保了外周神经系统中的健康的神经元分化。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于促进幼年哺乳动物中肠神经系统的健康发育和/或修复的罗伊氏乳杆菌DSM17938。 |
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| 说明书全文 | 用于肠神经系统发育的罗伊氏乳杆菌DSM17938技术领域背景技术[0003] 中枢神经系统驱动认知功能(记忆、注意力、知觉、动作，等等)。与外周神经系统一起，它在行为控制中具有基础性的作用。体神经系统负责协调身体运动(处于有意识控制下)。自主神经系统在没有意识控制的情况下(心率，等等)维持身体活动的稳态。最后，作为后一系统的一部分，肠神经系统直接控制胃肠道功能。这些包括胃肠屏障和免疫功能、运动、吸收、消化和外分泌/内分泌，它们有助于肠对任何类型损伤的保护以及有助于消化舒适性[Neunlist，M.et al.(2008)；“在炎症性肠道疾病的神经胶质的串扰”，J Intern.Med，263：577-583]，[Burns，A.J.et al.(2009)；“在胎儿和新生儿早期的肠神经系统的发展及其在肠动力的作用”，Semin.Pediatr.Surg.，18：196-205]，[Tapper E.J.(1983)；“通过肠神经元肠离子迁移的局部调整”，Am J Physiol.， 244：G457-68]。 [0004] 神经系统在妊娠期间发育，然后在出生后的时间精炼为成熟的、有功能的网络。 [0005] 神经系统的不成熟或延迟成熟导致其调节的重要生物学功能的建立和适当发挥功能的延迟。特别是，它引起出生后的肠功能障碍，包括降低的消化/吸收能力、胃肠返流、可能引起便秘的更慢的肠转运/更硬的大便、受损的肠定殖、提高了感染和过敏风险的弱的肠屏障功能，所有这些导致食物不耐受(从而需要胃肠外的营养支持物)，在最严重的情况下导致坏死性小肠结肠炎，以及导致胃肠不适。 [0006] 这可以在以下婴儿中观察到，例如： [0007] -早产婴儿、低出生体重(＜2500g)和极低出生体重婴儿(＜1500g)；“胃肠发展和满足早产儿的营养需要”，Am J Clin Nutr2007；85(2)：629S-634S [0008] -经历了在妊娠期间任何有害事件(母亲吸烟、母亲用药、低胎盘质量、胎盘位置异常、母亲和胎儿的营养不良、母亲的过大压力/焦虑，等)之后发生的胎儿宫内生长迟缓(IUGR)的早熟或足月婴儿；-[Shanklin D.R.and Cooke R.J.(1993)；“子宫内生长对胎儿的肠长度的影响”，Biol Neonate，64：76-81]，[Neu，J.(2007)；“胃肠发展和满足早产儿的营养需要”，Am.J.Clin.Nutr.，85(2)：629S-634S]，[Brandaoa，M.C.S.et al.，(2003)；“出生前和出生后蛋白质能量损失对小肠的肠肌丛的影响”：a morphometric study in weanling rats，Nutr.Res.，23：215-223]。 [0009] -在出生或任何其他有害事件时例如低氧血症-缺血之后显示神经系统生长停滞的任何新生儿和幼儿[Taylor，C.T.and Colgan S.P.(2007)；“缺氧和肠胃疾病”，J.Mol.Med.(Bert.)，85：1295-300]，[Barrett R.D.et al.(2007)；“破坏和重建：缺氧和脑显影”，Birth Defects Res C Embryo Today，81：163-76]。 [0010] -显示胃肠功能失调(消化失调、运动性失调、胃肠返流、缓慢的胃肠转运、口饲喂不耐性)、赫希施普龙氏病、影响胃肠道的炎症(例如，坏死性小肠结肠炎)以及阻塞病理的任何新生儿和婴儿[Burns A.J.et al.(2009)；“在胎儿和新生儿早期的肠神经系统的发展及其在肠动力的作用”，Semin.Pediatr Surg.，18(4)：196-205]。 [0011] 已知的是，在人类中，衍生出肠神经系统的神经脊细胞在受孕后很早(从发育的7.5周开始)就在子宫中的胎儿中发育[Burns，A.J.and Thapar，N.(2006)；”肠神经系统的个体发生学的进展”，Neurogastroenterol.Motil.，18，876-887]。已经显示了肠神经系统在出生后直到6岁经历了重大的变化，较微小的改变持续发生直到10岁的年龄[Wester，T.et al.(1999)；“正常人肠的肠肌丛在产后显著改变”，Gut，44：666-674]。因而，如果胎儿、新生儿或婴儿经历了神经系统生长停滞，希望的是这种停滞被快速逆转，从而神经系统发育“追上”正常水平。希望的是对肠神经系统产生的任何破坏被尽可能快地修复，从而生长中的胎儿或婴儿经历尽可能少的任何胃肠功能失调或与不成熟的或破坏的肠神经系统相关的任何其他病理。 [0012] 因而，在胎儿、新生儿以及成长中儿童中的肠神经系统的健康发育帮助控制肠屏障功能的正确建立和维持，从而防止与肠功能障碍相关的炎症性病理状态，以及降低感染和过敏症的风险(Neulist et al.2008) [0013] 因此，出生前和/或出生后的介入是确保肠神经系统的健康发育的有前景的方法。与针对儿童的介入相比，在妊娠/哺乳期间的介入在方便性和顺应性方面具有相当大的优势。 [0014] 在妊娠期间以及在新生儿生命的早期阶段，需要尽可能早的促进和支持肠神经系统的健康发育和/或修复，此时神经系统正在快速成熟。由于神经系统在儿童期的前几年(直到大约十岁)继续发育，需要在这整个期间继续支持。 [0015] 科学文献报道了使用益生菌来积极地影响新生儿和婴儿的健康状态，特别是，对于降低炎症，对抗感染，以及积极地影响大便习惯和胃肠运动性。近期的一般性综述参见[Dobrogosz，W.J.，Peacock，T.J.and Hassan，H.M.(2010)；“益生元概念的演化：在药物科学从概念到生效和认可”，Advances in Applied microbiology，72：1-41]。 [0016] 人类衍生的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)被认为是人类胃肠道的内源生物体，存在于胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上[Reuter，G.(2001)；“人肠道的乳杆菌和双歧杆菌：组成和演变”，Curr.Issues Intest.Microbiol，2：43-53]以及[Valeur，N.et al.(2004)；路氏乳杆菌(ATCC55730)在人肠道的培植和免疫调节，Appl.Environ.Microbiol.，70：1176-1181]。有许多关于罗伊氏乳杆菌作为对许多不同的状况有前景的疗法的报道，包括痢疾疾病[Saavedra，J.(2000)；Am.J.Gastroenterol，95：S16-S18]、婴儿急腹痛[Savino，F.et al.(2007)；“路氏乳杆菌(ATCC55730)对二甲基硅油在婴儿疝气的治疗：前瞻性研究”，Pediatrics，119：e124-e130]、湿疹[Abrahamsson，T.R.et al.(2007)；“益生菌防止IgE相关的湿疹：对照试验”，J Allergy Clin.Immunol.，119：1174-1180]以及幽门螺杆菌感染[Imase，K.et al.(2007)；“乳杆菌药片抑制幽门螺杆菌感染双盲的控制交叉灵床研究”，Kansenshogaku Zasshi，81：387-393]。对四种罗伊氏乳杆菌菌株DSM17938、ATCC PTA4659、ATCC PTA5289和ATCC PTA6475的新研究展现了这些菌株在小肠上皮细胞中和在新生小鼠的回肠中差异性 地调节脂多糖诱导的炎症。 [0017] 在2008年报道的对三十名早产新生儿进行的双盲随机研究中[Indrio，F.et al.(2008)；“益生菌对早产儿的喂养耐受度、排便习惯、肠蠕动的影响”，J.Pediatr.，152(6)：801-6]，接受罗伊氏乳杆菌ATCC55730的新生儿显示了与给与安慰剂的相比，显著降低反流和平均每日的哭闹时间，以及更多次数的大便。 [0018] 迄今为止，还没有关于益生菌对新生儿中神经元发育的影响的报道。 [0019] 因而，根据这些引证的现有技术文件，需要在益生菌施用的领域的进一步发展，作为一种方法来改善新生婴儿、幼小婴儿、学步儿和儿童的健康状态。 [0020] 特别是，需要支持新生儿、婴儿和幼童中肠神经系统的健康发育，以最好地使他们准备面对胃肠挑战，例如，膳食变化、化学物质(例如药物)或物理损伤(擦伤)、感染、炎症/免疫反应，等等，以及增强未来在之后的生活期间他们肠神经系统的成熟。 [0021] 本发明适用于所有哺乳动物，包括动物和人类。 发明内容[0022] 本发明涉及用于促进新生儿中肠神经系统的健康发育和/或修复的罗伊氏乳杆菌DSM17938。人类或动物，特别是胎儿、早产或足月婴儿、学步儿或儿童可以受益于本发明。本发明对于在子宫内、在出生期间或出生之后经历了IUGR、具有低或极低出生体重、和/或遭受肠神经系统生长停滞的那些婴儿是特别有益的。 [0023] 施用罗伊氏乳杆菌DSM17938促进正常的和健康的神经元和神 经胶质发育。它还确保了外周神经系统中的健康的神经元分化。 [0024] 罗伊氏乳杆菌DSM17938以它的纯的形式，或稀释在水或母乳中，在食品增补剂中，或在奶补强剂或在营养喂养期间使用的任何奶支持物中，在婴儿配制食品中，或在基于3 12 奶的饮料中直接施用给婴儿或学步儿。罗伊氏乳杆菌DSM17938以1×10 到1×10 ，优选 7 11 的1×10 到1×10 cfu(cfu＝菌落形成单位)的日剂量施用给婴儿、学步儿或儿童。 [0025] 本发明涉及包含罗伊氏乳杆菌DSM17938的组合物，罗伊氏乳杆菌DSM17938用于促进新生儿中肠神经系统的健康发育和/或修复。 [0028] A：空肠 [0029] 在CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri(DSM17938)幼仔中处死时(出生后14天)响应于10Hz的电场刺激，空肠的等长收缩获得的张力(曲线下面积(AUC))。结果是中值±中值的标准误差，n＝5(CTRL-w和PR-w)或6(PR-L.reuteri)。不带共同的字母的中值是不同的，p＜0.05。 [0030] 图1表示体外收缩反应的电场刺激； [0031] B：结肠 [0032] 在CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri(DSM17938)幼仔中处死时(出生后14天)响应于5Hz的电场刺激，结肠的等长收缩获得的张力(曲线下面积(AUC))。结果是中值±中值的标准误差，n＝5(CTRL-w和PR-w)或6(PR-L.reuteri)。不带共同的字母的中值是不同的，p＜0.05。 [0033] 图2表示体外收缩反应的乙酰胆碱刺激； [0034] A：空肠 [0035] 在CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri(DSM17938)幼仔中处死时(出生后14天)响应-5于10 M浓度的乙酰胆碱，空肠的等长收缩获得的张力(曲线下面积(AUC))。结果是中值±中值的标准误差，n＝5(PR-w)或6(CTRL-w和PR-L.reuteri)。不带共同的字母的中值是不同的，p＜0.05。 [0036] 图2表示体外收缩反应的乙酰胆碱刺激； [0037] B：结肠 [0038] 在CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri(DSM17938)幼仔中处死时(出生后14天)响应-5于10 M浓度的乙酰胆碱，结肠的等长收缩获得的张力(曲线下面积(AUC))。结果是中值±中值的标准误差，n＝5(PR-w)或7(PR-L.reuteri)和9(CTRL-w)。不带共同的字母的中值是不同的，p＜0.05。 [0039] 发明详细说明 [0040] 定义： [0042] “益生菌”是指具有对宿主的健康或安宁的有益效果的微生物细胞制品或微生物细胞的成分。[Salminen，S.et al.(1999)；Probiotics：how should they be defined，Trends Food Sci.Technol.10107-10].益生菌的定义一般是公认的并且符合WHO定义。益生菌可以包括微生物的唯一菌株、各种菌株的混合物和/或各种细菌种和属的混合物。在混合物的情况下，单数的术语“益生菌”可以仍然用于指代益生菌混合物或制品。对于本发明来说，乳杆菌属的微生物被认为是益生菌。 [0043] “益生元(Prebiotic)”一般是指不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激宿主的肠中存在的微生物的生长和/或活性来有益地影响宿主，由此试图改善宿主健康状态。 [0044] “早产婴儿”是指在37周妊娠之前出生的婴儿。“足月婴儿”是指在37周妊娠之后出生的婴儿。 [0045] “学步儿”是指可以走路直到三岁的儿童。 [0046] “幼童(Young child)”是指从三岁到十岁的儿童。 [0047] 罗伊氏乳杆菌(Lactobaccilus reuteri)DSM17938在全文中称为罗伊氏乳杆菌，是Biogaia AB，Sweden拥有的罗伊氏乳杆菌菌株，具有科学的菌株名称DSM17938，之前为罗伊氏乳杆菌ATCC55730。DSM标记是指DSMZ德国微生物和细胞保藏所(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)GmbH Inhoffenstr.7b，D-38124Braunschweig，Germany。DSM17938.Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr.7b D-38124Braunschweig-Germany。 [0048] 本发明提供了益生菌罗伊氏乳杆菌DSM17938，通过施用用于促进哺乳动物肠神经系统的健康发育。 [0049] 益生菌的施用可以通过母亲施用给胎儿。还可以直接地或通过母乳施用给早产或足月婴儿。也可以施用给一般低于十岁的幼童，或相当年龄的动物。 [0050] 罗伊氏乳杆菌施用给幼年哺乳动物，其可以是人类(胎儿、婴儿、学步儿、或幼童)、动物，对它们的肠神经系统的发育具有积极效果，容许系统正常成熟和发育。这种效果对于经历了例如，子宫内生长停滞(IUGR)的那些人是特别有益的，子宫内生长停滞可能在妊娠期间 的任何有害事件之后发生(例如，母亲的主动或被动吸烟、母亲的服药，低胎盘质量，胎盘位置异常，母亲和/或胎儿的营养不良，等等)。 [0051] 本发明人发现，由与这些生物活性相关的蛋白质的表达的促进所显示，本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物可以用于促进神经元细胞发育、功能性、存活、可塑性和分化，和用于保护神经元细胞对抗退化。这种退化可能跟随着，例如，任何应激情况，如，影响胎儿(子宫内)的那些，例如上述的IUGR，或影响新生儿的那些(出生时的低氧血症-缺血，氧气疗法和氧过多，炎症，胃肠外支持物的需要，等等)，或引起氧化压力的任何原因。发现罗伊氏乳杆菌促进神经元存活，和/或限制或防止肠神经元细胞的神经元死亡，以及促进神经元生长，这在例如发育过程中是重要的。 [0052] 在婴儿中，本发明的罗伊氏乳杆菌和/或含有罗伊氏乳杆菌的组合物可以用于保护肠神经系统对抗任何压力，例如，在神经元发育期发生的，因而限制和/或防止压力诱导的神经元生长停滞和相关的肠功能障碍。 [0053] 因而，在本发明的情境中，当已经观察到肠神经系统的发育中的延迟时可以施用罗伊氏乳杆菌，或尚未观察到这种延迟时预防性施用罗伊氏乳杆菌。 [0054] 通过施用根据本发明的罗伊氏乳杆菌，幼年哺乳动物的肠微生物群受到有益的影响，被治疗的受试者的肠神经系统健康地发育。这样治疗的婴儿或学步儿或幼童在出生后遭受与肠功能障碍相关的病理的风险被降低了。这些病理包括降低的消化/吸收能力，胃肠逆流，更慢的肠转运/更硬的大便和便秘，受损的肠定殖，以及弱的肠屏障功能。后面这些状况提高了感染和过敏的风险，从而引起食物不耐受(因此需要胃肠外的营养支持)。与出生后肠功能障碍相关的其他病理有坏 死性小肠结肠炎和胃肠不适。在以下段落中详细说明罗伊氏乳杆菌对哺乳动物肠神经系统的健康发育的有益效果。 [0055] 益生菌的剂量： [0056] 益生菌可以作为日剂量或以组合物的形式施用。施用给怀孕的或哺乳母亲的罗伊6 12 8 11 氏乳杆菌的日剂量是1×10 到1×10 cfu，优选地1×10 到1×10 cfu(cfu＝菌落形成单 3 12 7 11 位)。适合于新生婴儿的日剂量从1×10 到1×10 ，优选地1×10 到1×10 cfu。 [0057] 因而，罗伊氏乳杆菌可以在组合物中以大范围的百分比存在，以提供其传递所描3 12 述的有益效果。然而，优选地，罗伊氏乳杆菌在组合物中以相当于1×10 到1×10 cfu/g 4 干组合物的数量存在。优选地，对于向怀孕或哺乳母亲的施用，益生菌以相当于1×10 到 11 1×10 cfu/g干组合物之间的数量存在。用于向新生儿、学步儿、和儿童施用的每克干组合 6 9 物中益生菌的数量可以更低，优选的，1×10 到1×10，当然地，要遵循上述每日剂量。 [0058] 上述剂量包括所述细菌是活的、灭活的或死亡的，或甚至作为碎片例如DNA或细胞壁材料存在的可能性。换句话说，配方含有的细菌的数量以该细菌数量的菌落形成能力来表示，如同所有的细菌都是活的，而不管它们实际上是活的、灭活的或死亡的、碎片的还是任意或所有这些状态的混合。 [0059] 施用方法： [0060] (i)向怀孕母亲施用： [0061] 组合物可以通过各种途径施用给怀孕母亲，只要它诱导组合物与女性的胃肠道之间的联系。优选地，所述组合物作为怀孕母亲的食物、饮料或食物增补剂的部分口服施用。组合物还可以在药物组合物中施 用。优选地，施用是口服的。然而，在病理学的状况下或在使用肠内喂养时，组合物的施用可以添加在肠内喂养中。 [0062] (ii)向新生儿子代施用： [0063] 罗伊氏乳杆菌可以作为增补剂(例如，作为人乳补强增补剂)或作为药物或营养组合物，或作为婴儿配方乳中的成分，向个体的子代直接口服施用(纯的，或稀释在例如水或母乳中)。如果子代是早产或具有低出生体重，这样的配方可以是婴儿″早产配方″，可以是″初始配方(starter formula)”或″后续配方(follow-on formula)”。配方还可以是低过敏原性(HA)配方，其中牛乳蛋白质是水解的。在实施例2中给出了这样的初始配方的实例。 [0064] (iii)向学步儿和幼童施用： [0065] 罗伊氏乳杆菌还可以以药物或营养组合物、成长奶(growing-up milk)、基于奶的饮料、食品增补剂、基于奶的酸乳酪、甜品和布丁、饼干和谷物棒、基于谷物和水果的饮料的形式，向学步儿和幼童施用。 [0066] (iv)向动物施用： [0067] 罗伊氏乳杆菌还可以在水中，或以食品增补剂、药物或营养组合物、奶或宠物食物的形式向个体的动物口服施用。 [0068] 与其他化合物一起施用： [0069] 罗伊氏乳杆菌可以单独施用(纯的，或稀释在水或奶中，包括例如母乳)，或在与其他化合物的混合物中施用(例如，食物增补剂、营养增补剂、药物、载体、调味品、易消化的或不易消化的成分)。维生素和矿物质是典型的食物增补剂的实例。在优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌在组合物例如婴儿配制食品中与增强对幼年哺乳动物的所述有益作用的其他化合物一起施用。这类协同性化合物可以是载体 或基质，其促进罗伊氏乳杆菌递送至肠道，或者它们可以另外增强组合物对后代的肠神经系统的作用。这类化合物可以是协同地或单独地影响婴儿肠神经系统发育，和/或强化益生菌的作用的其他活性化合物。这类协同性化合物的实例是麦芽糊精。麦芽糊精的作用之一是提供益生菌的载体，增强其作用，以及防止聚集。 [0070] 本发明的可以包括在组合物特别是婴儿配制食品中的协同性化合物的其他实例是益生元化合物。益生元是不易消化的食物成分，其通过选择性地刺激结肠中一种或有限种的细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主，从而改善宿主健康状态。这类成分在胃或小肠中不易被分解和吸收，因而完整通过到达结肠，在此它们被有益细菌选择性地发酵，在此意义上它们是不可消化的。益生元的实例包括某些低聚糖，例如，低聚果糖(FOS)、牛乳低聚糖(CMOS)和低聚半乳糖(GOS)。可以使用益生元的组合，例如，90％GOS和10％短链低聚果糖，例如，以商标 销售的产品，或10％菊粉，例如以商标 销售的产品。可以用于本发明的情境的益生元的其他实例包括获自奶或其他来源的低聚糖的组，任选地含有唾液酸、果糖、岩藻糖、半乳糖或甘露糖。优选的益生元有：低聚唾液糖(SOS)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚异麦芽糖(IMO)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯木聚糖(AXOS)、低聚甘露聚糖(MOS)、大豆低聚糖、葡糖基蔗糖(glycosylsucrose，GS)、乳蔗糖(1actosucrose，LS)、唾液基乳糖(SL)、岩藻糖基乳糖(FL)、乳糖-N-四糖(LNNT)、乳果糖(LA)、低聚异麦芽酮糖(PAO)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶、淀粉，和/或其水解产物。根据本发明的婴儿配制食品优选地进一步含有按照干组合物总重量的0.3％到 10％的数量的至少一种益生元。 [0072] 含有罗伊氏乳杆菌的组合物例如婴儿配制食品，可以含有数量不超过4.0、3.0或2.0g/100kcal，优选的1.8到2.0g/100kcal的蛋白质源。蛋白质的类型对于本发明不是关键的，只要满足了必需氨基酸含量的最低要求以及确保满意的生长，然而优选的是按蛋白质源重量的超过50％是乳清。在一个实施方式中，蛋白质含量在30％到80％乳清蛋白之间。因而，可以使用基于乳清、酪蛋白和其混合物的蛋白质源，以及基于大豆的蛋白质源。对于所涉及的乳清蛋白，蛋白质源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，可以包括按照任何期望比例的alpha-乳白蛋白和beta-乳球蛋白。 [0073] 蛋白质可以是完整的或水解的，或完整的和水解的蛋白质的混合物。人们可能希望的是提供部分地水解的蛋白质(水解度在2到20％之间)，例如，对于被认为处于发生牛奶过敏的风险中的婴儿。如果水解的蛋白质是期望的，水解过程可以按期望的和按照本领域已知的来进行。例如，可以通过在一个或更多个步骤中酶水解乳清来制备乳清蛋白水解产物。如果用作起始材料的乳清部分是基本上没有乳糖的，发现的是在水解过程期间蛋白质遭遇更少得多的赖氨酸阻断。这允许赖氨酸阻断的程度从按总赖氨酸重量的约15％降低到按赖氨酸重量的低于约10％；例如，按赖氨酸重量的约7％，其大大改善了蛋白质源的营养质量。 [0074] 组合物还可以包含碳水化物源和/或脂肪源。婴儿配制食品可以含有脂质源。脂质源可以是适合于在婴儿配制食品中使用的任何脂质或脂肪。优选的脂肪源包括棕榈油精、高油酸葵花油和高油酸红花油。 必需的脂肪酸、亚油酸和α-亚麻酸也可以添加，作为含有高数量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的少量的油，例如鱼油或微生物油。总起来，例如，脂肪含量优选地贡献配方的总能量的30到55％之间。脂肪源优选地具有约 5∶1到约15∶1，例如约8∶1到约10∶1的n-6比n-3脂肪酸比例。 [0075] 其他来源的碳水化物可以添加到营养组合物中。其优选地提供营养组合物的能量的约40％到约80％。可以使用任何适合的碳水化物，例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、淀粉糖浆干粉、麦芽糊精或其混合物。 [0076] 如果希望，可以添加额外的膳食纤维。如果添加，它优选地包含达到营养组合物的能量的约5％。膳食纤维可以来自任何适合的来源，包括，例如，大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜耳豆胶、阿拉伯树胶、低聚果糖或其混合物。适合的维生素和矿物质可以以符合适当指南的数量被包括在营养组合物中。 [0077] 可选地存在于婴儿配制食品中的矿物质、维生素和其他营养物的实例包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉毒碱。矿物质通常以盐形式添加。特定矿物质和其他维生素的存在和数量将根据预期的婴儿群体而变化。 [0078] 婴儿配制食品可以任选地含有可能具有有益效果的其他物质，例如，纤维、乳铁蛋白、核苷酸、核苷，等等。 [0079] 一种或更多种必需的长链脂肪酸(LC-PUFA)可以被包括在组合物中。可以添加的LC-PUFA的实例有二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。LC-PUFA可以以一定浓度添加，从而它们构成在组合 物中存在的大于0.01％的脂肪酸。 [0080] 如果需要，一种或更多种食品级乳化剂可以被包括在营养组合物中；例如，单甘油酯和双甘油酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和单甘油酯或双甘油酯，或其混合物。类似地，可以包括适合的盐和/或稳定剂。调味剂可以添加到组合物中。 [0081] 施用周期： [0082] 施用的持续时间可以变化。虽然以相对短的施用持续时间预期了积极的效果(例如，对于新生儿在一到两周期间每天施用)，更长的持续时间被认为提供了增强的效果，或至少，在更大的婴儿(例如，三、五、八或十二个月)或在幼童(例如，达到4或6岁或甚至10岁的持续时间)中维持效果。对于向动物施用，适用相应的持续时间。 [0083] 一旦知道了怀孕，怀孕母亲可以开始服用罗伊氏乳杆菌。然而，施用持续时间也可以在妊娠开始之前开始，例如，如果该女性试图怀孕前开始。施用可以在妊娠开始后的任何时间开始。对于人类妊娠来说，可以在妊娠的相对晚期开始，优选的，在妊娠的第3、4、5、6、7或8个月开始，或对于其他哺乳动物在相应的时期，或者在预产期前两周。 [0084] 施用的时间可以是连续的(例如，直到和包括哺乳期直到断乳)或是不连续的。对于更为持续的效果，连续施用是优选的。然而，推测的是，不连续的模式(例如，在每个月的一周内，或在间隔的周数期间每天施用)可以对后代诱导积极的效果。 [0085] 施用可以覆盖妊娠期的至少部分，或哺乳期的至少部分，或不母乳喂养的新生儿的相应时期。优选地，对怀孕母亲的施用持续时间基本上覆盖整个妊娠期，当然也可以更短。类似地，对哺乳母亲的施用持续时间优选地基本上覆盖整个哺乳期，当然这个时期也可以更短。 [0086] 优选地，对母亲的施用是每日服用(每日服用一次或两次)，或每周服用(每周服用一次或两次)。 [0087] 罗伊氏乳杆菌可以直接施用给婴儿。特别是如果母亲不母乳喂养或在她停止母乳喂养之后。然而，被母乳喂养的婴儿也可以通过直接施用来接受罗伊氏乳杆菌。 [0088] 优选地，向婴儿的施用是通过每日服用。例如，如果罗伊氏乳杆菌作为婴儿配制食品来施用，施用可以与每次喂食一起，即，对小于一岁的婴儿每天约四次到约六次，喂食的次数随年龄降低。对于超过一岁的婴儿，施用可以更少，每天一次或两次。对于学步儿和幼童，施用可以是每天的或每周的(每周服用一次或两次)。 [0089] 经由母乳喂养、或通过直接施用、或两种方法向婴儿施用可以持续直到六月龄，或甚至一岁或更大。因而，如果进行哺乳，罗伊氏乳杆菌可以在哺乳期间施用，或在部分或完全断乳之后施用。施用可以从婴儿持续到学步儿期，甚至直到十岁。已知的是，肠神经系统继续在儿童中发育直到这个年龄[Wester，T.et al.(1999)；Notable postnatal alterations in the myenteric plexus of normal human bowel，Gut，44：666-674]。因而，本发明人推测，施用罗伊氏乳杆菌直到这个年龄可以继续具有积极的效果。 [0090] 罗伊氏乳杆菌施用的作用： [0091] 施用给新生儿的罗伊氏乳杆菌促进肠神经系统的健康发育。在实施例1中详述的大鼠模型实验中，评估了罗伊氏乳杆菌施用对神经元发育的影响。 [0092] 在这个实验中，经历了母亲的饮食诱导的子宫内生长停滞的幼仔(PR组)，以及没有经历IUGR的幼仔(CTRL)从出生后2天起补充水(对照：即，CTRL-w和PR-w)或罗伊氏乳杆菌(PR-L.reuteri)。 [0093] 出生后2周，在处死时，使用两种方法评估神经元发育：(i)空肠中的目标基因表达分布，以及(ii)测量空肠和结肠对电场刺激(EFS)的体外收缩反应。后一种方法测量肠神经系统诱导的收缩反应，从而测量肠神经系统的成熟和功能程度。 [0094] 还评估了空肠和结肠对乙酰胆碱的体外收缩反应，这测量了肠肌肉本身的收缩性反应，因而反映了肠肌肉的成熟和功能程度。进行后一实验作为对照，来容许发明人区分控制所测量的收缩反应的因素，即，神经系统和肌肉。 [0095] 空肠和结肠对EFS的体外收缩反应： [0096] 为了评估在蛋白质限制模型中和罗伊氏乳杆菌补充之后的神经元成熟，测量了空肠和结肠对EFS的收缩反应，其衡量了神经元网络刺激肌肉收缩的关联/能力。由于蛋白质限制或在罗伊氏乳杆菌补充之后，通过测量空肠和结肠对乙酰胆碱的收缩反应来评估与任何肠肌肉成熟可能的关联。 [0097] 在10Hz的频率下，与CTRL-w相比，在PR-w中空肠对EFS的收缩反应降低了(P＝0.055)(附图1A)。与CTRL-w相比，在PR-w中空肠对乙酰胆碱的收缩反应稍微降低，但不显著(P＝0.30)(附图2A)。合起来，这反映了在蛋白质限制的幼仔的空肠中受损的神经-肌肉相互作用，特别是受损的神经元成熟。 [0098] 补充罗伊氏乳杆菌显著地(P＝0.017)提高了在10Hz空肠的收缩反应能力达到统计学上类似对照的水平(图1A)。这表明罗伊氏乳杆菌对空肠中神经元刺激能力的促进性作用，其反映了新生儿期神经元发育和功能的促进。在罗伊氏乳杆菌补充之后空肠肌肉区室的成熟实际上没有显著的改变(P＝1.00)，因为与PR-w相比对于乙酰胆碱的空肠收缩反应能力保持不变(图2A)。 [0099] 在5Hz下与CTRL-w相比，在PR-w中，结肠对EFS的收缩反应显著地降低(图1B)。与CTRL-w相比，在PR-w中结肠的对乙酰胆碱的收缩反应显著降低(P＝0.04)(图2B)。合起来，这反映了受损的神经-肌肉相互作用，在蛋白质限制的幼仔的结肠中，带有神经元和肌肉成熟两种损伤。 [0100] 在5Hz的频率下补充罗伊氏乳杆菌提高了结肠收缩反应能力(P＝0.008)(图1B)，这再次表明罗伊氏乳杆菌对结肠中神经元发育和功能的刺激作用。在罗伊氏乳杆菌补充之后结肠的肌肉区室的成熟实际上没有显著的改变(P＝0.43)，因为与PR-w相比对于乙酰胆碱的结肠的收缩反应能力保持不变(图2B)。 [0101] 合起来，这些数据清楚地显示了在出生后罗伊氏乳杆菌促进神经元发育和功能的有益效果。基于这些数据，罗伊氏乳杆菌构成了在新生儿期间促进和/或加速肠神经元发育的新的营养性解决方案。 [0102] 涉及肠神经元发育的基因的表达： [0103] 在实施例1的大鼠模型实验中，使用基因表达分布方法，研究了蛋白质限制，以及蛋白质限制之后的罗伊氏乳杆菌补充对空肠中涉及神经元发育生物学途径的主要基因的表达的影响。研究的基因在表2中列出，数据在表3中呈现。 [0104] 对于以有意义水平表达的11种基因，在处理(蛋白质限制)和罗伊氏乳杆菌补充之间观察到表达水平的显著差异，而3种基因显示了统计学上不显著的差异倾向。显著地差异表达的基因是主要涉及神经元和胶质细胞的成熟或分化的那些，或是神经元生长和可塑性的标志物。 [0105] 本发明人早先显示(Cettour and Faure，manuscript in preparation)在蛋白质限制的幼仔(PR)中发生补偿机制来帮助促进小肠中的细胞和神经元发育。当前的数据确认了这些发现。具体的，与CTRL-w相比， 神经营养因子和它们的受体，例如Gfral(GDNF家族受体alpha1)Ntf4(神经营养素4)、S100B(S100钙结合蛋白B)和神经元发育标志物GAP43(生长相关蛋白43)的基因表达在PR-w组中显著地上调了。这可能反映了动物中的不平衡和“压力”情况，尽管如此，根据我们在EFS刺激后的结果所显示的，这仍然不足以促进神经元成熟。 [0106] 补充罗伊氏乳杆菌显著地把这些重要基因的表达水平恢复到与CTRL-w类似的水平(参见表3)。下文描述了受影响的基因。 [0107] GAP43是神经元生长和可塑性标志物，在发育期间它在神经元生长锥中高度表达，因而是神经元发育的标志物[Benowitz，L.I.and Routtenberg，A.(1997)；GAP-43：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity，Trends Neurosci.，20(2)：84-91].[Capone G.T.et al.(1991)；Developmental expression of the gene encoding growth-associated protein43(Gap43)in the brains of normal and aneuploid mice，J.Neurosci.Res.，29(4)：449-60]。 [0108] Ntrk3也称为TrkC，是调节几种神经营养因子(例如，神经元分化和存活)的多重效果的受体，特别是它结合神经营养素-3，神经营养素-3在新生儿肠神经系统发育期间是特别重要的[Maisonpierre P.C.et al.(1990)；Neurotrophin-3：a neurotrophic factor related to NGF and BDNF，Science，23；247(4949Pt1)：1446-51]。 [0109] S100存在于发育中的鸡神经元和Schwann细胞中，促进运动神经元的体内存活。[Bhattacharyya，A.，et al.(1992)；S100B，a potent neurotrophic factor，is also a biomarker for glial cell development，J Neurobiol.，23(4)：451-66]。 [0110] 后面这些基因的基因表达水平水平恢复到对照动物水平，表明补充罗伊氏乳杆菌在幼仔中帮助恢复正常的和健康的神经元和神经胶质 发育活性。因而，模型展现了，就神经元细胞发育、功能性、存活、可塑性和分化而言，施用罗伊氏乳杆菌可以帮助遭遇IUGR的动物恢复到“正常”或“健康”状态。 [0111] SOX10的基因表达水平在补充罗伊氏乳杆菌之后显著地上调。在发育期间在外周神经系统中SOX10编码对于神经元分化至关重要的转录因子。它是在胚胎期和产后发育期的早期高度存在的神经胶质和神经元祖细胞的标志物[Wegner M.and Stolt，C.C.(2005)；From stem cells to neurons and glia：a Soxist′s view of neural development，Trends Neurosci.，25(11)：583-8]以及[Young，et al.(2003)；Acquisition of neuronal and glial markers by neural crest-derived cells in the mouse intestine，The Journal of Comparative Neurology，456：1-11]。因而补充罗伊氏乳杆菌对SOX10表达的这种刺激可能加速和/或促进了神经元的分化和功能，从而促使神经元网络快速建立。 [0112] 表3中观察到的基因表达的修饰可能促进了图1中观察到的对EFS的神经元刺激反应的启动。 [0113] 罗伊氏乳杆菌菌株是从母乳喂养的儿童的粪便微生物群中分离的益生菌。因而，对于尝试尽可能紧密地模拟母乳喂养儿童的微生物群的健康促进策略，施用罗伊氏乳杆菌，特别是向非母奶喂养儿童施用，可以提供与不在母乳喂养儿童中发现的其他菌株相比的优点。 [0114] 实施例1： [0115] 动物研究(饲喂和处死)： [0116] 动物试验在由Office Vétérinaire Cantonal，Etat de Vaud许可的授权n°2120下进行。从Harlan，Barcelona获得妊娠一周后的两月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠。在它们到达的当天，母鼠置于单独的笼子中，随机分为对照(CTRL)或蛋白质限制(PR)组。动物不限量得到食物和 水，维持在12小时的光/暗周期下。 [0117] CTRL和PR母鼠的日粮在表1中详述。CTRL母鼠接受含有20％蛋白质(酪蛋白)的对照日粮，配合妊娠期间标准大鼠蛋白质需要量(Reeves et al.，1993)。PR母鼠接受含有10％蛋白(酪蛋白)的PR日粮。两种日粮是等热量的，蛋白质缺乏通过添加玉米淀粉来平衡。 [0118] 表1：对照(CTRL)和蛋白质限制(PR)AIN-93G日粮的组成日粮 [0119] [0120] CTRL和PR母鼠在妊娠和哺乳期间都接受它们各自的日粮，直到处死当天(产后14天(PND14))。 [0121] 在PND2，幼仔随机分配给来自同一实验组的母鼠，窝产仔数调节到每窝9只幼崽，每窝最少四到五只雄性。 [0122] 从PND2直到PND14，每天用手/吸移管饲喂的水或含罗伊氏乳杆菌溶液的增补剂分别施用给对照组或治疗组。增补剂的体积逐渐调整以匹配鼠仔的生长(150μl/100g体重)。 [0123] 组别和日粮如下： [0124] 1)CTRL-w：CTRL母鼠生出的CTRL幼仔，接受水的增补剂， [0125] 2)PR-w：PR母鼠生出的PR幼仔，接受水的增补剂， [0126] 3)PR-L.reuteri：PR母鼠生出的PR幼仔，接受冻干罗伊氏乳杆菌DSM17938的增9 补剂(1.10cfu/天)。 [0127] 在PND14，来自CTRL和PR组的最多10只幼仔进行称重，在氟烷麻醉后通过断头术来处死。 [0128] 空肠和结肠对电场刺激(EFS)的体外收缩反应： [0129] 远端空肠和远端结肠的约1cm长度节段置于冷的Krebs′溶液中(CaCl2(5mM)，MgCl2.6H2(1.2mM)，NaCl(120mM)，NaH2PO4.H2O(1.2mM)，NaHCO3(15.5mM)，KCl(5.9mM)，酚红(0.005mM)和葡萄糖(11.5mM))，用95％O2/5％CO2预先氧处理。肠的节段沿着它们的纵向轴在37℃下悬浮在用95％O2/5％CO2氧化的Krebs溶液充氧的组织浴(50ml体积)中。肌肉的一端连接到固定夹钳。容许30分钟的稳定期来获得自发性收缩。组织然后伸展到初-5始长度，使得任何进一步的延伸将提高静止时的张力。通过乙酰胆碱(Ach，10 M)或通过电场刺激(EFS，5-10Hz)诱导远端空肠和结肠的等长收缩。Ach应用1分钟。在剂量反应曲线完成之后，用80mM KCI测试肠段，以确保它们维持了收缩的能力。利用Powerlab Chart3.4在计算机上数字地记录信号。在小心地印迹和称重组织片段之后，结果通过横截面积来标准化。使用Prism4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，USA)进行非线性拟合。为了获得频率，进行了测得的信号的功率密度谱的分析。应用截止频率2Hz(比100Hz尼奎斯特频率小得多)的高通滤波器。Welch方法被用于计算功率谱密度，1、3秒重叠，采用低频离散化：频率的系列限定在0到2Hz之间，等距间隔0.05Hz。功率谱密度的计算使用Goertzel算法进行。选择相应于2Hz以下三个最大功率值的三个频率。 [0130] 基因表达分布： [0131] 根据厂家的说明使用 (Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)试剂用苯酚/氯仿方法从PR和CTRL幼仔的空肠提取总RNA。简要地，冷冻组织样品(50-100mg)在1ml 中使用TissueLyser(Qiagen AG，Basel，Switzerland)来均质化。使用 RiboGreen RNA定量试剂盒(Invitrogen-Molecular Probes，Carlsbad，CA)和RNA6000Nano LabChip试剂盒(agilent Technologies)根据试剂盒提供的说明来测量分离的RNA的数量和治疗。用1μg总RNA，使用寡聚(dT15)引物(Promega，Madison，Wl)和ImProm-ll(tm)逆转录系统(Promega)根据厂家提供的说明进行逆转录。 [0132] 表2：分析的基因的列表 [0133] [0134] [0135] 肠神经系统发育中涉及的主要基因(参见表2)的表达水平通过使用Sybergreen(SABiosciences)的RT Profiler PCR Array System通过2-步定量实时RT-PCR来评估。 [0136] 使用7600HT TaqMan Fast实时PCR系统(Applied Biosystems)，使用Sequence Detection Software，版本2.2，使用特异性引物集和荧光TAMRA探针，在PCR反应的log-线性期双份进行测量。PCR反应在2ul反应孔中进行，特异性引物和探针由厂家预先加载到反应卡的384个反应孔的每一个中。用含有AmpliTaq Gold DNA Polymerase enzymes(Applied Biosystems) 的 TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)，使用0.8ng/μl的最终cDNA样品浓度进行反应，核苷酸和ROX荧光染料用作无加载参考物。由Applied Biosystems设计和验证所 使用的引物和探针的序列，取自Assay-on-Demand大鼠文库。每个基因的相对表达水平通过对照基因(在我们的条件下在实验组之间表达是统计学上稳定的那些基因)的几何平均数来标准化。 [0137] 表3.处死时(出生后14天)CTRL-w、PR-w和PR-L.reuteri幼仔的空肠中基因的表达水平。结果是平均值±SEM，n＝6(PR-w)或8(CTRL-w；PR-L.reuteri) [0138] [0139] 统计： [0140] 通过比较PR和CTRL组来评估蛋白质限制的作用。通过比较PR-L. reuteri和PR组来评估罗伊氏乳杆菌补充的作用，通过比较PR-L.reuteri和CTRL组来评估最后向CTRL水平的恢复。 [0141] 使用非参数方法来分析数据(基因表达除外，见下文)。Wilcoxon秩和检验用于测试治疗之间的差异。还获得了在其95％置信区间内配对式处理差异的Hodges-Lehmann估计。对于基因表达，对原循环阈值(Ct)计数进行了统计分析，假定为log2值。对变化：基因-参考基因应用单向方差分析(ANOVA)，计算的p-值为组中至少一个与其他不同的概率。对5中潜在的持家基因，或对超过一种基因的平均值进行了计算，仅保留最稳定的作为最小残差的指标。 [0142] 实施例2： [0143] 下文给出了根据本发明使用的婴儿配制食品的组成的实例。仅通过举例的方式给出该组合物。蛋白质源是乳清蛋白和酪蛋白的常规混合。 [0144] [0145]罗伊氏乳杆菌L.reuteri DSM 17938于2006年01月30日保存于德国微生物菌种保 藏中心DSMZ。 |
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