항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법

항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법{Method for producing mushroom extract with enhanced antioxidative activity through lactobacillus fermentation}

본 발명은 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 버섯 자실체를 열수 추출하여 버섯 자실체 추출물을 얻는 단계; 상기 버섯 자실체 추출물에 항산화 활성을 가진 표준 유산균주를 접종하여 1차 발효시켜 1차 발효액을 얻는 단계; 및 상기 1차 발효액에 김치 유래 유산균을 접종하여 2차 발효시켜 2차 발효액을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

모든 생물체는 산소를 이용하여 생명유지에 필요한 에너지를 발생하는 과정에서 활성산소들의 공격에 대한 근본적인 자기방어를 가지고 있다. 그러나 방어기구에 의해 해리되지 못한 활성산소들은 노화, 암 등의 다양한 질환을 일으키는 원인으로 알려져 있다.

이와 같은 활성산소를 억제하기 위한 항산화제에 대한 연구는 butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT), tert-butylhydroquinone(TBHQ) 등과 같은 합성 항산화제가 강력한 항산화 활성을 지니고 있긴 하지만, 여러 가지 부작용 때문에 합성 항산화제의 사용을 기피하는 추세이며 이에 따라 많은 연구자들은 안전성과 각종 질병의 예방 및 치료가 동시에 가능한 천연 항산화제 개발에 초점을 두고 다양한 연구들이 이루어지고 있다.

최근 천연 항산화제로 주목받고 있는 버섯은 고등균류로써 담자균강 (Basidomycote)과 일부의 자낭균강(Ascomycote)에 속하는 종들로써 풍미가 뛰어나고 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질, 비타민 및 미네랄 등의 각종 영양소를 다양하게 함유하고 있을 뿐만 아니라 생리활성 물질을 생산함으로써 예로부터 식용 혹은 약용 등의 목적으로 사용하여 왔다. 특히 버섯의 다당체는 항암작용, 면역증강작용, 항산화효과, 혈중 콜레스테롤 저하효과 등의 다양한 기능성이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 발효법은 역사상 가장 오래된 기술로서 식품, 약품, 화장품 등 다양한 분야에서 활용되고 있는데 그 중 인류 역사와 함께 해온 식품 발효는 현재까지 전 세계적으로 가장 널리 이용되고 있는 기술이다. 최근에는 발효식품의 생리활성 작용이 알려지면서 세계적으로 건강기능성 장수식품으로 인식되고 있으며, 특히 프로바이오틱스(probiotics)로서 유산균의 건강기능성이 밝혀지면서 이에 대한 관심이 높아지고 있다. 유산균은 발효식품에 특유의 풍미와 우수한 보존성을 부여할 뿐만 아니라 유당불내증의 완화작용, 정장작용, 병원성세균의 생육억제 작용, 콜레스테롤 저하작용, 항암작용 등 다양한 질병을 예방하고 치료할 수 있다고 알려져 있다.

또한, 건강한 사람의 장내에 존재하면서 인체의 특이 및 비특이적 면역체계의 증강에 기여한다고 알려져 있으며, 최근에는 유산균 발효에 의한 천연물의 면역증진 효과에 관한 연구가 많이 보고되고 있다.

하지만, 아직까지 발효기술을 이용한 버섯의 항산화 활성에 대한 연구는 미미한 실정이다. 이에 본 연구에서는 식용 및 약용으로 널리 이용되는 상황, 영지 및 표고의 자실체 및 균사체를 열수 추출하여 프로바이오틱스 표준 유산균으로 1차 발효하였다. 1차 발효 후 김치로부터 분리한 활성 유산균으로 2차 발효하여 항산화 활성 향상에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 유산균을 이용한 버섯 발효액의 항산화 활성 기작을 밝히고자 하였다.

본 발명은 발효기술을 이용한 버섯의 항산화 활성에 대한 연구를 수행하여, 식용 및 약용으로 널리 이용되는 상황버섯, 영지버섯 또는 및 표고버섯의 자실체 에 유산균 발효기술을 접목하여 유용한 효과가 있는 버섯 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법은 버섯 자실체를 열수 추출하여 버섯 자실체 추출물을 얻는 단계; 상기 버섯 자실체 추출물에 항산화 활성을 가진 표준 유산균주를 접종하여 1차 발효시켜 1차 발효액을 얻는 단계; 및 상기 1차 발효된 버섯 자실체 추출물에 김치로부터 분리한 유산균을 접종하여 2차 발효시켜 2차 발효액을 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법에서 상기 버섯은 상황버섯, 영지버섯 및 표고버섯 중 어느 하나를 선택하거나 또는 둘 이상을 선택하여 혼합한 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법에서 1차 발효에 사용되는 표준 유산균은 B. bifidum, L. plantarum 및 Leu. lactis 중 어느 하나를 선택하거나 또는 둘 이상을 선택하여 혼합한 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항산화 기능이 증진된 버섯 추출물의 제조방법에서 2차 발효에서 사용하는 김치 분리 유산균은 L. sakei subsp.인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 버섯 자실체 추출물을 얻는 단계 후에, 버섯 자실체 추출물에 보당 및 희석한 후 멸균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 1차 발효액 및 2차 발효액은 원심분리한 후 상층액을 회수하여 멸균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 버섯 자실체에 유산균을 이용하여 발효시킴으로써 유용한 효과가 있는 버섯 추출물을 제공할 수 있다는 효과가 있다.

또한, 발효기술을 이용한 버섯의 항산화 활성에 대한 연구를 수행하여 상황, 영지 및 표고버섯의 자실체를 열수 추출하여 표준 유산균으로 1차 발효시키고, 김치로부터 분리한 활성 유산균으로 2차 발효하여 항산화 활성을 갖는 버섯 추출물을 제조할 수 있고, 이를 다양한 식품에 활용할 수 있다는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 버섯 자실체 추출물에 김치로부터 분리한 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 버섯 추출물을 제조하고 다양한 실험으로 통하여 그 효과를 확인할 수 있었다.

도 1은 1차 선발 유산균의 배양시간에 따른 생육도.
도 2는 1차 선발 유산균의 배지의 초기 pH에 따른 생육도.
도 3은 1차 선발 유산균의 NaCl 첨가에 따른 생육도.
도 4는 1차 선발 유산균의 내산성.
도 5는 1차 선발 유산균의 내답즙성.
도 6은 김치로부터 분리한 L. sakei subsp. LI033의 항생제 내성.
도 7은 1차 선발 유산균을 이용한 1차 버섯 발효액이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 영향.
도 8은 유산균을 이용한 버섯 발효공정 및 조건.
도 9는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 영향.
도 10은 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 ABTS 라디칼 소거 활성에 미치는 영향.
도 11은 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 XO 활성에 미치는 영향.
도 12는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 SOD 활성에 미치는 영향.
도 13은 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향.
도 14는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 NO 생성 억제에 미치는 영향.
도 15는 버섯 발효액이 iNOS 생성 억제에 미치는 영향.
도 16은 버섯 발효액이 염증성 사이토카인 생성 억제에 미치는 영향.
도 17은 버섯 발효액이 NF-B p65억제 활성에 미치는 영향.
도 18은 버섯 발효액이 IBa 활성에 미치는 영향.
도 19는 버섯 발효액이 HO-1 활성에 미치는 영향.
도 20은 버섯 발효액이 HO-1 저해제인 ZnPP 첨가에 따른 NO 생성에 미치는 영향.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

Ⅰ. 연구내용

1. 항산화에 관여하는 표준 유산균

국내외 문헌을 통하여 항산화 활성이 있다고 보고된 유산균주를 탐색하여 Bifidobacterium bifidum , Lactobacillus acidophillus , Lactobacillus planatarum , Leuconostoc lactis , Streptococcus thermophilus 를 한국미생물보전센터(KCCM, Korea)로부터 표준 유산균주 5종을 구입하였다(표 1). 모든 표준 유산균주는 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)를 사용하여 배양하였다. Bifidobacterium 속 유산균주는 CO ₂ 배양기에서 혐기적으로, Bifidobacterium 속 유산균주를 제외한 4종은 37℃ 배양기에서 미호기적으로 계대배양하며 실험에 사용하였다.

연구에 사용된 표준 유산균주

2. 전통식품에서 유산균의 탐색 및 선발

가. 전통식품에서 유효 유산균의 탐색

최근 각국의 전통 발효식품에는 다양한 기능성이 있다는 학계의 결과가 발표되면서 국내외적으로 많은 관심을 불러일으키고 있으며, 세계적인 건강기능식품시장에 내세울만한 우리나라의 전통식품으로는 김치, 된장, 고추장, 청국장 등이 있다. 특히, 우리 고유의 발효식품은 풍부한 유산균을 내포하고 있어 생활 습관병(고혈압, 비만, 당뇨 등)의 예방, 항암 효과, 소화, 강장 효과 및 뇌기능 활성화 등의 과학적 우수성이 지속적으로 밝혀지고 있다. 유산균의 건강증진효과에 대해서는 장운동 조절, 유산균에 의한 장내 균총의 균형유지에 의한 소화기 건강, 병원성 세균의 억제, 소화 흡수의 촉진, 변비, 설사 등의 효과 이외에 영양생리적인 건강 증진작용 혹은 항암기능 등과 같은 질병 억제작용에 대한 과학적인 연구에 기초를 두고 있다. 최근에는 혈 중의 콜레스테롤 저하효과에 관해서도 연구결과가 보고되고 있다. 발효식품에 관여하는 유산균은 고부가가치를 창출할 수 있는 자원으로써 새롭게 인식되고 있으며 웰빙 및 건강과 밀접한 관계를 가지고 있다. 김치 유산균에 대한 정확한 정의는 없지만 현재까지 크게 3개의 속에 속하는 20여 종의 다양한 유산균으로 구성되어 있다. 특히, 김치에서 분리된 Lactobacillus plantarum 의 세포 추출물은 지질과산화를 저해뿐 아니라 ROS에 대한 저항력도 강한 것으로 밝혀졌다.

한편, Lactobacillus lactis 와 같이 SOD를 생산하는 유산균은 대장의 염증개선에도 효과가 있는 것으로 알려졌다. 따라서 본 연구는 우리 고유의 김치로부터 유산균을 분리하고 활성을 평가하여 단계적으로 선발하여 버섯 발효를 위한 스타터로 사용함으로써 생리활성의 변화를 확인하고자 하였다.

나. 김치로부터 유산균의 분리

전라북도 전주시와 임실군, 전라남도 광양시, 경기도 등지에서 제조원이 다른 배추김치를 수집하여 각각의 김치 내용물 전체를 마쇄한 후에 멸균거즈로 여과하였다. 김치 여과액을 멸균수를 이용하여 단계적으로 희석한 후 100 uL를 MRS 평판배지(Lactobacilli MRS agar, Difco, USA)에 1차적으로 도말하여 37℃에서 배양하였다. 배양 중 투명환을 나타내고 집락을 형성하는 균주들을 분리하여 BCP 평판배지(BCP plate count agar, EIKEN, Japan)에 2차적으로 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 중 BCP 평판배지의 보라색이 노란색으로 변하는 군집을 각각 취하여 3차적으로 새로운 BCP 평판배지에 도말하였으며, 순수한 유산균이 얻어질 때까지 3회 반복하였다. 그 결과 44종의 유산균을 분리하였으며, 각각의 유산균은 MRS 평판배지와 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 냉장(4℃) 보관하면서 실험에 사용하였다.

다. 항산화 활성에 관여하는 김치유래 유산균 선발

1) 김치유래 유산균주 선발을 위한 시료 제조

항산화 활성에 관여하는 유산균을 선발하기 위해 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA) 10 mL에 44종의 분리 유산균을 2중량부씩 접종하여 24시간 배양한 후 10,000rpm, 10분, 4℃ 조건에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. 각각의 상층액은 동결건조하여 냉동보관하며 항산화 활성을 평가하는 시료로 사용하였다.

2) 항산화 활성에 관여하는 김치유래 유산균주 선발

(1) DPPH 라디칼 소거 활성

김치로부터 분리한 각각의 유산균주 배양액을 농도별(0~5 mg/mL)로 희석하여 96 well plate에 50 uL씩 분주하고 에탄올에 녹인 100 uM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 용액을 150uL 첨가하였다. 실온에서 차광상태로 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(DYNEX, USA)를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 50uM L-ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 각 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.

3) 김치로부터 분리한 유산균의 동정

다양한 지역의 김치로부터 분리한 44종의 유산균 중 DPPH 라디칼 소거 활성이 크다고 판단되어 1차 선별된 12종의 유산균을 (주)마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA 염기서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다.

3. 선발 유산균의 특성 규명

가. 배양시간에 따른 생육도

항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치유래 유산균주 1종의 배양 시간에 따른 생육도를 조사하기 위해 24시간 전배양한 선발 유산균주들을 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 2중량부씩 접종하여 37℃에서 48시간 정치 배양하면서 매 4시간마다 630 nm에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다.

나. 배지의 초기 pH에 따른 생육도

배지의 초기 pH가 항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치유래 유산균주 1종의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1 N NaOH(sodium hydroxide, Sigma, USA) 또는 1 N HCl(hydrogen chloride, Sigma, USA)으로 pH 4, 5, 6, 7, 10으로 보정한 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 630nm에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다.

다. NaCl 첨가에 따른 생육도

NaCl 농도가 항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치유래 유산균주 1종의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NaCl(sodium chloride, Sigma, USA)을 0, 1, 3, 5, 7%(W/V)가 함유된 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 630nm에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다.

라. 내산성

항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치유래 유산균주 1종의 산 저항성 시험으로 산성 pH에 대한 내성의 측정은 1 N HCl(hydrogen chloride, Sigma, USA)을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에서 시행하였다. 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 원심분리(3,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 각각의 균체를 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 2시간 정치 배양한 후 BCP 평판배지(BCP plate count agar, EIKEN, Japan)에서 생균수를 측정하였다.

마. 내담즙성

항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치유래 유산균주 1종의 인공담즙에 대한 내성 평가를 위한 인공담즙의 조제는 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 0.45 um filter(Sartorius, Gemany)로 여과 제균된 bile salts(Sigma, USA) 용액을 0.5%(W/V)가 되도록 첨가하였다. 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 원심분리(3,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 각각의 균체를 0.5%(W/V) bile salts 용액이 첨가된 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 6시간 정치 배양한 후 BCP 평판배지(BCP plate count agar, EIKEN, Japan)에서 생균수를 측정하였다.

바. 항생제 내성

항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종과 김치 유래 유산균주 1종의 다양한 항생제에 대한 감수성 검사는 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, USA)에 24시간 배양 한 후 유산균 배양액을 1 mL 취하여 BCP 평판배지(BCP plate count agar, EIKEN, Japan)에 혼합하여 평판배지를 만들고 배지의 표면에 항생제 디스크 6종(표 2)을 부착하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 발육 저지대 형성 수준에 따라 감수성 여부를 확인하였다. 본 실험에 이용된 항생제 디스크는 senti-disc ^TM (BBL co. USA)를 사용하였다.

연구에 사용된 항생제

4. 유산균을 이용한 버섯 발효

3종의 버섯(상황, 영지, 표고) 추출물을 보당 및 희석하여 항산화 활성을 가진 표준균주 5종을 접종하여 발효시켰다. 1차 발효액에 김치유래 선발 유산균주 1종을 접종하여 2차 발효하였다.

5. 버섯 발효액의 항산화 활성 평가

가. DPPH 라디칼 소거 활성

버섯 추출물과 1차, 2차 발효액을 농도별(0~10 mg/mL)로 희석하여 96 well plate에 50 uL씩 분주하고 에탄올에 녹인 100 uM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 용액을 150 uL 첨가하였다. 실온에서 차광상태로 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(DYNEX, USA)를 이용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 50 uM L-ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 각 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.

나. ABTS 라디칼 소거 활성

2.4 mM potasium persulfate(Sigma, USA)와 7 mM ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid, Sigma, USA) 용액을 혼합하여 16시간 동안 차광상태에서 ABTS ^＋ ·를 형성시킨 후 ELISA reader(DYNEX, USA)로 630 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 희석하였다. 버섯 추출물과 1차, 2차 발효액을 농도별(0~10 mg/mL)로 희석하여 96 well plate에 100uL씩 분주하고 희석된 ABTS ⁺ · 용액을 동량으로 가하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로 50 uM L-ascorbic acid(Sigma, USA)를 사용하였으며, 각 시료에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.

다. XO 저해 활성

버섯 추출물과 1차, 2차 발효액을 0~10 mg/mL의 농도로 희석하여 xanthin oxidase activity assay kit(Biovision, USA)를 이용하여 xanthin oxidase(XO)의 억제 활성 정도를 측정하였다. XO의 활성은 H ₂ O ₂ 의 희석농도로 환산하였으며, 0.1 mM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

라. SOD 활성

버섯 추출물과 1차, 2차 발효액을 0~10 mg/mL의 농도로 희석하여 EpiQuik superoxide dismutase activity/inhibition assay kit(Epigentek, USA)를 이용하여 superoxide dismutase(SOD)의 활성 정도를 측정하였다. SOD의 농도는 10 U/uL 까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

6. 버섯 발효액의 항산화 활성 기작 연구

가. 세포 배양

실험에 사용된 대식세포주(RAW 264.7)는 한국세포주은행으로부터 분양받아 형태를 관찰하며 10회 이하로 계대배양한 세포를 실험에 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 10%(V/V) FBS(Invitrogen, USA)가 첨가된 DMEM(Invitrogen, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO ₂ incubator에서 2~3일마다 계대배양하며 실험에 사용하였다.

나. 세포 생존율

버섯 추출물과 1차, 2차 발효액이 RAW 264.7 세포 성장에 미치는 영향을 판정하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4×10 ⁵ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 버섯 추출물과 1차, 2차 발효액을 0~1 mg/mL의 농도로 희석하여 24시간 반응 후 PrestoBlue ^TM (Invitrogen, USA)시약을 10 uL씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader(DYNEX, USA)로 570 nm(reference 600 nm)에서 흡광도를 측정하였으며 세포의 증식 정도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.

다. NO 생성 억제 활성

버섯 추출물과 1차, 2차 발효액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 nitric oxide(NO)를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×10 ⁴ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 세포 생존율 실험을 통해 독성을 보이지 않는 각각의 시료를 0~0.5 mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 ug/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA) 자극을 주었다. 24시간 반응시킨 후 배양액 100 uL와 동량의 Griess reagent(Promega, USA)를 첨가하여 ELISA reader(DYNEX, USA)로 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 sodium nitrite를 이용하여 64 uM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

라. iNOS 생성 억제 활성

버섯 2차 발효액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 생성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×10 ⁴ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 발효액을 0~0.5 mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 ug/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA) 자극을 주었다. 24시간 반응시킨 후 mouse inducible nitric oxide synthase(iNOS) ELISA Kit(MyBioSource, USA)를 이용하여 iNOS의 발현 양을 측정하였다. iNOS의 농도는 48 ng/mL 까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

마. 염증성 사이토카인 생성 억제 활성

버섯 2차 발효액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×10 ⁴ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 버섯 2차 발효액을 0~0.5 mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 ug/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA) 자극을 주었다. 24시간 반응시킨 후 mouse IL-1 beta/IL-1F2 Quantikine(R&D system, USA), mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit(R&D system, USA) 및 mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit(R&D system, USA)를 각각 이용하여 사이토카인의 발현 양을 측정하였다. IL-1β의 농도는 400 pg/mL, IL-6의 농도는 250 pg/mL, 그리고 TNF-α의 농도는 700 pg/mL까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

바. NF-κBα 억제 활성

버섯 2차 발효액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성을 억제하는 활성이 nuclear factor-kappaB(NF-κB)와 관련하는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×10 ⁴ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 버섯 2차 발효액을 0~0.5 mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 ug/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA) 자극을 주었다. 18시간 반응시킨 후 mouse nuclear factor-kappaB p65(NF-kappaB p65) ELISA kit(MyBioSource, USA)와 mouse inhibitory subunit of NF-κB(IKBa) ELISA kit(MyBioSource, USA)를 이용하여 NF-κB의 발현 량을 측정하였다. NF-κB p65의 농도는 12 ng/mL까지, IKBα의 농도는 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.

사. HO-1 활성

버섯 2차 발효액에 의한 heme oxygenase-1(HO-1)의 발현 여부를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×10 ⁴ cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 버섯 2차 발효액을 0~0.5 mg/mL의 농도로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 ug/mL LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, USA)자극을 주었다. 24시간 반응시킨 후 mouse heme oxygenase 1 ELISA Kit(MyBioSource, USA)를 이용하여 HO-1의 발현 량을 측정하였다. HO-1의 농도는 32 ng/mL까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. HO-1과의 관계를 확인하기 위해 HO-1의 저해제인 10 uM ZnPP(Zinc Protoporphyrin, Sigma, USA)의 처리 전후의 NO 생성량을 비교하였다.

Ⅱ. 연구결과

1. 전통식품에서 유산균의 선발

가. 김치로부터 유산균의 분리

전라북도 전주시와 임실군, 전라남도 광양시, 경기도 등지에서 제조원이 다른 배추김치를 수집하여 각각의 김치 내용물 전체를 마쇄한 후에 멸균거즈로 여과하였다. 김치 여과액을 멸균수를 이용하여 단계적으로 희석한 후 100 uL를 취해 MRS 평판배지에 1차적으로 도말하여 37℃에서 배양하였다. 배양 중 투명환을 나타내고 집락을 형성하는 균주들을 분리하여 BCP 평판배지에 2차적으로 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 중 BCP 평판배지의 보라색이 노란색으로 변하는 군집을 각각 취하여 3차적으로 새로운 BCP 평판배지에 도말하였으며, 순수한 유산균이 얻어질 때까지 3회 반복하였다. 그 결과 44종의 유산균을 분리하였으며, 각각의 유산균은 MRS 평판배지와 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 냉장(4℃) 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 유산균 44종 중 전주지역 김치에서 분리한 유산균 29종을 LJ001에서 029로, 임실지역 김치에서 분리한 유산균 6종을 LI030에서 LI035, 경기도지역 김치에서 분리한 유산균 4종을 LGy036에서 039, 광양지역 김치에서 분리한 유산균 4종을 LGw040에서 044로 명명하여 실험에 사용하였다(표 3).

다양한 지역의 김치로부터 분리된 유산균

LJ: 전주지역 김치로부터 분리된 유산균, LI: 임실지역 김치로부터 분리된 유산균, LGy: 경기지역 김치로부터 분리된 유산균, LGw: 광양지역 김치로부터 분리된 유산균

나. 항산화 활성에 관여하는 김치유래 유산균의 선발

1) DPPH 라디칼 소거 활성

다양한 지역에서 수집한 김치로부터 분리한 44종 유산균의 항산화 활성에 관여하는 김치유래 유산균을 선발하기 위해 각각의 유산균 배양액 5 mg/mL로 희석하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 표 4와 같다. 전주에서 분리한 LJ019와 임실에서 분리한 LI033 유산균의 활성이 50% 이상으로 가장 컸으며, 40% 이상의 활성을 보이는 10종의 유산균(LJ005, LJ007, LJ013, LJ014, LJ015, LJ022, LJ024, LJ029, LI031, LGy039)을 확인하였다.

김치유래 유산균 배양액의 DPPH 라티칼 소거 활성

LJ: 전주지역 김치로부터 분리된 유산균, LI: 임실지역 김치로부터 분리된 유산균, LGy: 경기지역 김치로부터 분리된 유산균, LGw: 광양지역 김치로부터 분리된 유산균

다. 김치로부터 분리한 유산균의 동정

다양한 지역에서 수집한 김치로부터 분리한 44종의 분리 유산균 중 DPPH 라디칼 소거 활성이 크다고 판정된 12종의 유산균을 선별하여 동정한 결과는 표 5와 같다. 전주지역 김치로부터 분리한 유산균 LJ005, LJ007과 임실지역 김치로부터 분리한 유산균 LI031, LI033, 경기지역 김치로부터 분리한 유산균 LGy039는 Lactobacillus sakei subsp. 로 동정되었다. 또한 전주지역 김치로부터 분리한 유산균 LJ013, LJ014, LJ015, LJ019, LJ022, LJ024, LJ029는 Pediococcus pentosaceus 로 동정되었다.

김치로부터 분리한 항산화 활성에 관여하는 유산균의 동정

LJ: 전주지역 김치로부터 분리된 유산균, LI: 임실지역 김치로부터 분리된 유산균, LGy: 경기지역 김치로부터 분리된 유산균

3. 선발 유산균의 특성 규명

가. 선발 유산균의 종류

항산화 활성에 효과가 있다고 보고된 유산균 표준균주 5종(표 1)과 김치로부터 분리한 44종(표 2)의 유산균 중 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 큰 L. sakei subsp. LI033(LI033)을 버섯 발효에 적용 실험할 유산균으로 선발하였다(표 6).

버섯 발효에 이용된 1차 선발 유산균

나. 배양시간에 따른 생육도

선발된 6종 유산균(Table 5)의 배양 시간에 의한 균체생육 변화를 확인하기 위해 37℃에서 4시간 간격으로 48시간 동안 630 nm에서 흡광도 측정하여 확인하였다. 6종의 유산균들은 배양 4시간부터 대수적으로 증가하였고 20~24시간에서 생육도가 최대가 되었으며 그 이후에는 정지기로 들어가는 것을 확인할 수 있었다. 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033도 표준 유산균주와 비슷한 경향을 보였고 20시간에서 생육도가 최대가 되었으며 그 이후에는 정지기로 들어가는 것을 관찰하였다. 시간에 따른 유산균별 차이는 확인할 수 없었다(도. 1).

도 1에는 1차 선발 유산균의 배양시간에 따른 생육도가 도시되어 있으며, 1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus, 6: L. sakei subsp. LI033이다.

다. 배지의 초기 pH에 따른 생육도

배지의 초기 pH가 선발된 6종의 유산균의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1 N NaOH 또는 1 N HCl으로 pH 4, 5, 6, 7, 10으로 보정한 MRS 액체배지에 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 630 nm에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 도 2와 같이 6종의 유산균 모두 pH 6에서부터 pH 8까지의 범위에서 잘 생육하였으나 pH 5 이하 그리고 pH 10 이상에서는 급격히 감소하는 생육도를 나타내었다. 분리균주의 최적 pH는 6종 모두 pH 7로 나타났으며 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033도 최적 pH는 7로 확인되었다.

도 2에는 1차 선발 유산균의 배지의 초기 pH에 따른 생육도가 도시되어 있으며, 1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus , 6: L. sakei subsp. LI033이다.

라. NaCl 첨가에 따른 생육도

NaCl 농도가 선발된 6종의 유산균의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NaCl을 0, 1, 3, 5, 7%(W/V)가 함유된 MRS 액체배지에 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 630 nm에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 도 3과 같이 6종의 유산균 모두 NaCl 농도 0~3%(W/V) 범위에서 생육도가 왕성하였다. 표준균주 중 B. bifidum 과 S. thermophilus 는 NaCl 농도 3%(W/V) 이상에서 생육도가 50% 이하로 급격하게 감소하였으나 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033(67%)를 포함한 표준 유산균주인 L. acidophilus, L. plantarum (67%)와 Leu . lactis 는 NaCl 농도 5%(W/V)에서도 67% 이상의 생육을 보여 0~5%(W/V) NaCl 농도에서 내염성을 나타내었다.

도 3에는 1차 선발 유산균의 NaCl 첨가에 따른 생육도가 도시되어 있으며, 1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus, 6: L. sakei subsp. LI033이다.

마. 내산성

선발된 6종의 유산균의 산 저항성 시험으로 산성 pH에 대한 내성의 측정은 1 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에서 시행하였다. 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 원심분리(3,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 각각의 균체를 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 2시간 정치 배양한 후 BCP 평판배지에서 생균수를 측정한 결과는 도 4와 같다. 선발된 표준 유산균주 5종은 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에서 2시간 동안 사멸하지 않고 90% 이상의 높은 산 저항성을 나타낸 반면 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033은 66%의 다소 낮은 산 저항성을 보였다. 그러나 L. sakei subsp. LI033은 음식물의 완충작용을 고려한다면 생존율이 더욱 높아질 수 있을 것으로 사료되며 김치에서 분리한 유산균 중 내산성이 비교적 높은 것으로 판단되었다.

도 4에는 1차 선발 유산균의 내산성이 도시되어 있으며, 1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus, 6: L. sakei subsp. LI033이다.

바. 내담즙성

선발된 6종의 유산균의 인공담즙에 대한 내성 평가를 위해 MRS 액체배지에 0.45 um filter로 여과 제균된 bile salts 용액을 0.5%(W/V)가 되도록 첨가하였다. 선발 유산균주를 2중량부씩 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양한 후 원심분리(3,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 각각의 균체를 0.5%(W/V) bile salts 용액이 첨가된 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 6시간 정치 배양한 후 BCP 평판배지에서 생균수를 측정한 결과는 도 5와 같다. 선발된 표준 유산균주 5종은 0.5%(W/V) bile salts 용액이 첨가된 MRS 액체배지에서 6시간 동안 사멸하지 않고 80% 이상의 높은 생존율을 보였으나 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033은 65%의 다소 낮은 내담즙성을 보였다. 그러나 L. sakei subsp. LI033은 음식물의 완충작용을 고려한다면 생존율이 더욱 높아질 수 있을 것으로 사료되며 김치에서 분리한 유산균 중 내담즙성이 비교적 높은 것으로 판단되었다.

도 5에는 1차 선발 유산균의 내답즙성이 도시되어 있으며, 1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus , 6: L. sakei subsp. LI033이다.

사. 항생제 내성

선발된 6종의 유산균의 항생제에 대한 감수성 검사는 MRS 액체배지에 24시간 배양 한 유산균액을 1 mL 취하여 BCP 평판배지를 만들고 배지의 표면에 항생제 디스크 6종(표 2)을 부착하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 발육 저지대 형성 수준에 따라 감수성 여부를 확인한 결과는 표 6과 같다. 선발된 표준 유산균주와 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033(도 6)는 ciprofloxacin과 kanamycin에 대하여 환을 형성하지 않고 강한 항생제 내성을 보였다. 특히, S. thermophilus 는 선별 유산균 중에서 항생제 내성이 가장 큰 것으로 확인되었다.

1차 선발 유산균의 항생제 내성(단위: mm)

1: B. bifidum , 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus, 6: L. sakei subsp. LI033

도 6은 김치로부터 분리한 L. sakei subsp. LI033의 항생제 내성이며, A: Ampicillin, B: Ciprofloxacin, C: Chloramphenicol, D: Erythromycin, E: Kanamycin, F: Tetracycline이다.

4. 유산균을 이용한 버섯 발효

상황, 영지, 표고 자실체 100 g을 1L로 추출하여 보당 및 희석하여 °Brix를 동일하게 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 3종의 버섯 자실체 추출물에 항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종을 2중량부씩 접종하여 1차 발효하였다. 1차 발효액의 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성(도 7)을 평가하여 발효를 위한 3종의 표준 유산균주(표 8)를 최종 선발하였다. 1차 발효 후 각각의 버섯 자실체 발효액은 원심분리(10,000 rpm, 5 min, 4℃)한 후 상층액을 회수하여 다시 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균된 1차 발효액에 김치 유래 선발 유산균주인 L. sakei subsp. LI033을 2중량부씩 접종하여 2차 발효하였다. 2차 발효 후 각각의 발효액은 원심분리(10,000 rpm, 5 min, 4℃)한 후 상층액을 회수하여 다시 121℃에서 15분간 멸균하였다(도 8). 발효 전 버섯 자실체 추출물과 1차, 2차 발효액은 멸균 후 동결건조하여 냉동 보관하면서 이후 항산화 활성을 평가하는 시료로 사용하였다.

도 7에는 버섯 발효액의 DPPH 라디칼 소거 활성이 도시되어 있으며, 1: B. bifidum, 2: L. acidophilus 3: L. plantarum , 4: Leu . lactis , 5: S. thermophilus, A: 상황, B: 영지, C: 표고이다.

버섯 자실체 및 균사체 발효에 이용된 최종 선발 유산균

도 8에는 본 발명에 따른 유산균을 이용한 버섯 발효 공정 및 조건이 도시되어 있다.

먼저, 상황버섯, 영지버섯 및 표고버섯의 각각의 자실체 100 g을 1 L로 추출, 보당(sucrose) 및 희석하고 0.5~1 brix로 동일하게 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 각각 3종의 버섯 자실체 추출물에 항산화 활성을 가진 표준 유산균주 5종을 각각 버섯 자실체 추출물 100중량부에 대하여 2중량부씩 접종하여 37℃에서 72시간 동안 1차 발효하였다. 1차 발효액의 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성(도 7)을 평가하여 발효를 위한 3종의 표준 유산균주(표 8)를 최종 선발하였다. 1차 발효 후 각각의 버섯 자실체 발효액은 원심분리(10,000rpm, 5 min, 4℃)한 후 상층액을 회수하여 다시 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균된 1차 발효액에 김치 유래 선발 유산균주인 L. sakei subsp. LI033을 각각 2중량부씩 접종하여 2차 발효하였다. 2차 발효 후 각각의 발효액은 원심분리(10,000rpm, 5 min, 4℃)한 후 상층액을 회수하여 다시 121℃에서 15분간 멸균하였다(도 8). 발효 전 버섯 자실체 추출물과 1차, 2차 발효액은 멸균 후 동결건조하여 냉동 보관하면서 이후 항산화 활성을 평가하는 시료로 사용하였다.

5. 버섯 발효액의 항산화 활성 평가

가. DPPH 라디칼 소거 활성

항산화 활성 평가를 위해 각각의 버섯 추출물과 1차, 2차 발효액의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인한 결과는 도 9에 나타내었다. 버섯 추출물 중 상황 자실체 추출물의 라디칼 소거 활성이 10 mg/mL의 농도에서 74% 이상으로 영지와 표고에 비하여 높게 나타났다. 또한 표준 유산균(표 8)으로 1차 발효 시 B. bifidum 에 의한 발효액의 라디칼 소거 활성이 크게 나타났으며 이는 김치 분리 유산균인 L. sakei subsp. LI033에 의한 2차 발효에서도 유사결과를 보였다. 표고는 10 mg/mL의 농도에서 9%였으나 1차 발효 후 20%로, 2차 발효 후 16%로 라디칼 소거 활성이 증가하였다. 그러나 1차, 2차 발효 과정을 거치면서 상황과 영지의 라디칼 소거 활성은 감소하였으며 상황의 활성 감소 폭이 가장 컸다. 이는 발효 과정 중 생성되는 라디칼 소거 활성 물질의 생성량보다 상황과 영지의 천연 항산화 물질인 카로티노이드계 색소의 분해 등에 의해 라디칼 소거 활성의 저하가 나타났다고 사료된다.

도 9에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 영향이 도시되어 있고, 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고이다.

나. ABTS 라디칼 소거 활성

항산화 활성 평가를 위해 각각의 버섯 추출물과 1차, 2차 발효액의 ABTS 라디칼 소거 활성을 확인한 결과는 도 10에 나타내었다. 버섯 추출물 중 상황 추출물의 라디칼 소거 활성이 10 mg/mL의 농도에서 53% 이상으로 영지와 표고에 비하여 높게 나타났다. 또한 표준 유산균(표 8)으로 1차 발효 시 유산균별 차이는 나타나지 않았으며 이는 김치 분리 유산균인 L. sakei subsp. LI033에 의한 2차 발효에서도 유사결과를 보였다. 표고는 1차, 2차 발효 후 라디칼 소거 활성에 변화가 없었으나 상황과 영지의 라디칼 소거 활성은 감소하였으며 상황의 활성 감소 폭이 가장 컸다. 이는 DPPH 라디칼 소거 활성 감소와 마찬가지로 발효 과정 중 생성되는 라디칼 소거 활성 물질의 생성량보다 상황과 영지의 천연 항산화 물질인 카로티노이드계 색소의 분해가 이루어져 라디칼 소거 활성의 저하가 나타났다고 사료된다..

도 10에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 ABTS 라디칼 소거 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고.

다. XO 저해 활성

1) 버섯 자실체 추출물 및 발효액의 XO 저해 활성

XO는 XOR의 oxidase type 효소로 생체 내에서 hypoxanthine을 xanthine으로, xanthine을 uric acid로 산화하는데 관여하며, 산소를 전자수용체로 이용하여 ROS를 생성함으로써 지질의 과산화, 노화 등에 관여한다. 이에 항산화 활성 평가를 위해 버섯 추출물과 각각의 1차, 2차 발효액의 XO 효소 저해 활성을 확인한 결과는 도 11에 나타내었다. 3종의 버섯 추출물과 비교하여 유산균을 이용한 발효액의 XO 효소 활성이 농도의존적으로 감소함을 확인하였다. 버섯 자실체 추출물 보다 1차 발효액에서, 1차 발효액에서보다 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033을 이용하여 2차 발효시킨 발효액에서 효소 활성이 더욱 감소하였으며, 이는 영지 발효액에서 더욱 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 버섯이 가지는 천연 항산화제인 색소의 분해에도 불구하고 버섯 발효 과정 중 새롭게 생성되는 유효 성분과 더불어 유산균이 생성하는 2차 대사산물에 의한 효과라 사료된다.

도 11에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 XO 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum, 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고.

라. SOD 활성

1) 버섯 추출물 및 발효액의 SOD 활성

SOD는 superoxide를 과산화수소로 전환하는데 관여하는 효소로 ROS의 생성을 억제함으로써 지질의 과산화, 노화 등에 관여한다. 이에 항산화 활성 평가를 위해 버섯 추출물과 1차, 2차 발효액의 SOD 효소 활성을 확인한 결과는 도 12에 나타내었다. 3종의 버섯 자실체 추출물과 비교하여 유산균을 이용한 발효액의 SOD 효소 활성이 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. 1차 발효액의 효소 활성 평가 시 3종의 유산균 중 B. bifidum 에 의한 발효액의 효과가 가장 크게 나타났다. XO 효소 저해 활성과 마찬가지로 1차 발효액에 SOD 효소 활성이 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033을 이용하여 2차 발효시킨 발효액에서 효소 활성이 증가하였으며, 이는 상황 발효액에서 더욱 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 이는 버섯이 가지는 천연 항산화제인 색소의 분해에도 불구하고 버섯의 발효 과정 중 새롭게 생성되는 유효 성분과 더불어 유산균이 생성하는 2차 대사산물에 의한 효과라 사료된다.

도 12에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 SOD 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum, 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고.

6. 버섯 발효액의 항산화 활성 기작 연구

가. 세포 생존율

각각의 버섯 발효액의 항산화 활성을 세포 내에서 평가하기 위해 먼저 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액을 농도별 처리하여 세포의 생존율을 측정하였다. 실험에 사용한 세포는 RAW 264.7 세포로 계대배양 횟수는 10회를 넘지 않았다. RAW 264.7 세포에 버섯 추출물 및 발효액을 농도별(0~1 mg/mL)로 처리하여 24시간 후 흡광도를 측정하여 생존율을 계산한 결과는 도 13에 나타내었다. 버섯 추출물과 선발 유산균을 이용하여 1차, 2차 발효한 각각의 발효액은 0~0.5 mg/mL의 농도에서 세포 생존에 영향을 미치지 않았으며 1 mg/mL의 농도에서 세포 생존율이 10% 내외로 감소하여 미미하지만 세포 생존에 독성을 나타내는 것으로 판단되어 이후에 진행되는 활성 평가에서는 최대 농도를 0.5 mg/mL로 정하였다.

도 13에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 RAW 264.7 세포의 생존율에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고.

나. NO 생성 억제 활성

1) 버섯 추출물 및 발효액의 NO 생성 억제 활성

각각의 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액의 항산화 활성을 세포 내에서 평가하기 위해 세포 독성을 나타내지 않는 농도(0~0.5 mg/mL)로 각각의 발효액을 처리 한 후 LPS 자극으로 생성되는 NO의 생성 억제 활성을 확인한 결과는 도 14와 같다. LPS를 단독으로 투여했을 때 NO의 생성이 비처리구와 비교하여 3배가량 증가하였다. LPS를 처리하기 2시간 전 버섯 추출물과 선발 유산균을 이용하여 1차, 2차 발효한 각각의 발효액을 처리했을 때 발효하지 않은 버섯 추출물과 비교하여 NO 생성은 감소하였다. 또한 NO의 생성량 감소는 1차 발효액보다 김치에서 분리한 L. sakei subsp. LI033을 이용하여 발효시킨 2차 발효액에서 활성이 증가하는 것으로 나타났으며 선발 유산균 중 B. bifidum 에 의한 발효액의 활성이 L. plantarum 과 Leu. lactis .에 비하여 크게 나타남을 확인하였다. 이는 버섯이 발효 과정을 거치면서 생성되는 유효 성분과 1차, 2차 발효에 이용된 유산균의 대사산물에 의한 영향으로 판단되었다. 이에 항산화 활성 기작 연구에는 보다 우수한 활성을 보인 2차 발효액을 실험에 사용하기로 하였다.

도 14에는 버섯 추출물, 1차 및 2차 발효액이 NO 생성 억제에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum, 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: 상황, B: 영지, C: 표고.

다. iNOS 생성 억제 활성

선발 유산균을 이용한 버섯 발효액이 NO의 생성을 감소시켜 세포 손상을 억제함을 확인(도 14)하고 버섯 2차 발효액이 NO 생성에 직접적으로 관여하는 iNOS의 생성에 미치는 영향을 확인한 결과는 도 15와 같다. iNOS는 세포 내에 존재하지 않으나 다양한 자극에 의해 유도되어지면 NO를 생성하게 된다. LPS를 처리하지 않은 비처리구와 비교하여 LPS를 처리한 시험구에서는 iNOS의 생성량이 4배 이상 증가하였다. LPS를 처리하기 2시간 전 각각의 발효액을 농도별(0~0.5 mg/mL)로 첨가하여 LPS 자극을 받게 한 시험구에서는 iNOS 생성이 농도의존적으로 감소하였다. 영지와 표고의 발효액이 상황의 발효액보다 iNOS 생성 억제 활성이 크게 나타났다. 특히, 영지의 발효액은 0.5 mg/mL의 농도에서 LPS 단독 처리한 시험구의 iNOS 생성과 비교하여 B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 이용되었을 때 55% 가량의 감소를 보여 가장 큰 활성을 보였다. 상황과 표고에서도 마찬가지로 B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 이용되었을 때 iNOS 생성 억제 활성이 증가되는 것을 확인하였다.

도 15에는 버섯 발효액이 iNOS 생성 억제에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033.

다. 염증성 사이토카인 생성 억제 활성

버섯 2차 발효액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)이 생성을 억제 할 수 있는지 평가하였다(도 16). LPS 자극에 의해 다량의 TNF-α가 분비되고, 분비된 TNF-α는 대식세포와 호중구를 활성화시켜 superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxy radical 등의 산화제, 단백질 분해효소, 그리고 IL-1β, IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 활성화시킨다. RAW 264.7 세포에 각각의 버섯 2차 발효액을 0~0.5 mg/mL의 농도로 처리하여 2시간 미리 반응시킨 후, LPS를 1 ug/mL의 농도로 24시간 더 자극하여 농도에 따른 염증성 사이토카인의 생성량을 측정하였다. LPS를 첨가한 RAW 264.7 세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 농도가 모두 증가하였으나 발효액을 첨가한 경우에는 염증성 사이토카인의 생성이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 또한 B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 이용되었을 때 더욱 효과적으로 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다. 이는 발효액이 염증성 사이토카인의 생성을 억제함으로써 세포 손상을 억제하는 것으로 판단되었다.

도 16에는 버섯 발효액이 염증성 사이토카인 생성 억제에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum, 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: IL-1β, B: IL-6, C: TNF-α.

라. NF-κBα 억제 활성(IκBα 활성)

NF-κB는 자극이 없는 상태에는 세포질에서 IκB와 결합되어 존재하다가 자극이 되어 활성화되면 IKB가 분해되고 NF-κB는 핵으로 이동하여 다양한 염증성 cytokine을 생산하게 된다. 따라서 NF-κB의 활성은 IKB의 분해에 의존하게 된다. 정상적인 상태에서 NF-κB의 지속적인 활성을 억제하기 위한 방어 시스템이 작동하는데 NF-κB가 활성화 된 후 곧바로 IKB가 다시 만들어져 핵 안으로 들어가 NF-κB와 결합하여 다시 핵 밖으로 빠져나옴으로써 NF-κB의 활성을 억제한다. 버섯 추출물과 선발 유산균을 이용한 발효액이 염증성 사이토카인(도 16) 및 NO의 생성을 감소(도 14)시켜 세포 손상을 방어하는 것이 NF-κB와 관련하는지 조사하였다. LPS 처리 전 버섯 2차 발효액을 처리하였을 때 NF-κB와 IKB의 활성 변화를 도 17과 18에 나타내었다. LPS를 단독으로 처리한 시험구와 비교하여 LPS를 처리하기 전 각각의 버섯 2차 발효액을 농도별(0~0.5 mg/mL)로 첨가한 시험구에서는 농도의존적으로 NF-κB p65의 활성은 감소하였고, IκBα의 활성은 더욱 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는 발효액이 NF-κB의 활성은 억제하고 NF-κB의 억제자인 IκB의 활성을 유도하여 염증성 사이토카인이나 NO의 생성을 억제하는 것으로 판단되었다. 이는 iNOS 생성 억제 활성과 유사하게 B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 이용되었을 때 NF-κB p65의 활성이 억제, IκBα의 생성이 보다 크게 증가하였다.

도 17에는 버섯 발효액이 NF-κB p65억제 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033, A: NF-κB p65

도 18에는 버섯 발효액이 IκBα 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033.

마. HO-1 활성

HO-1은 NADPH와 산소를 이용하여 heme을 산화적으로 파괴하여 heme에 내포되었던 철분을 유리하고 일산화탄소(CO)와 biliverdin을 생성하는 heme의 산화를 촉매하는 과정의 초기 속도 조절 효소이다. 생성된 biliverdin은 세포 내에서 항산화 역할을 하는 bilirubin으로 변하고 bilirubin은 유리기들을 무독화 시켜 자극받은 세포를 보호하는 역할을 한다. 한편, 생성된 CO는 heme과 반응하여 O ₂ ^- 와 NO와 같은 라디칼들의 생성을 촉매하는 NADPH-oxidase와 iNOS와 같은 효소들의 활성을 억제하여 추가적 라디칼의 생성을 억제함으로써 세포를 보호하는 역할을 한다. 버섯 발효액이 NO의 생성을 감소시켜 세포 손상을 억제(도 14)하는데 이와 같은 결과가 HO-1 발현과 관련하는지 알아보았다. LPS 자극만으로도 세포 내 HO-1의 발현이 소량 이루어졌으나 발효액을 처리한 시험구에서는 발현양이 더욱 증가됨을 확인하였다. 이는 농도의존적으로 증가되었으며 특히, B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 이용되었을 때 HO-1의 발현양이 더욱 증가하는 것으로 나타났다(도 19). NO 생성과 HO-1의 보다 직접적인 연관성을 확인하기 위해 HO-1의 저해제인 ZnPP를 처리하여 NO 생성량을 확인하였다(도 20). 그 결과, ZnPP에 의해 NO의 생성이 증가되어 LPS 자극에 대하여 버섯 추출물과 선발 유산균을 이용한 발효액이 NO생성 억제 작용에 있어 HO-1의 발현과 관련이 있음을 확인하였다.

도 19에는 버섯 발효액이 HO-1 활성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033.

도 20에는 버섯 발효액이 HO-1 저해제인 ZnPP 첨가에 따라 NO 생성에 미치는 영향이 도시되어 있다. 1: B. bifidum , 2: L. plantarum , 3: Leu . lactis , 4: L. sakei subsp. LI033.

본 발명에서는 항산화 활성에 관여하는 프로바이오틱스 표준 유산균 5종을 선발하였다. 즉, B. bifidum , L. plantarum , L. acidophilus , Leu . lactis 과 S. thermophilus 는 상황, 영지 및 표고 열수 추출물의 1차 발효에 이용하였다. 또한 다양한 지역의 김치로부터 분리한 유산균 44종에 대해 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하여 가장 활성이 좋았던 김치분리 유산균( L. sakei subsp. LI033)을 최종 선발하여 2차 발효에 이용하였다. 3종의 버섯 추출물과 선발 유산균을 이용한 1차, 2차 발효액의 항산화 활성 평가를 위해 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 정도를 비교하였다. 상황과 영지 추출물은 유산균 발효에 의해 라디칼 소거 활성이 감소하였는데 이는 상황과 영지의 천연 항산화제인 카로티노이드계 색소의 분해에 의한 것으로 판단되었다. 그러나 버섯 발효액은 XO 저해 활성, SOD 활성, RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 대한 NO 생성 억제 활성은 발효가 진행됨에 따라 그 활성이 증가되었다. 이는 발효에 의한 버섯 성분의 변화와 유산균에 의한 유효 성분의 생성 등이 다양하게 작용하여 세포 내에서 작용되었을 것으로 판단되었다. 우선 버섯 추출물 중 항산화 활성이 가장 크게 나타난 2차 발효액의 항산화 활성 기작을 알아보기 위해 먼저 NO 생성에 직접적으로 관여하는 iNOS의 억제 활성을 확인한 결과, 3종의 버섯 발효액 모두 LPS 자극으로부터 농도의존적으로 iNOS의 생성을 감소시켰다. 또한 iNOS의 발현에 관여하는 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 분비를 억제할 뿐 아니라 NF-κB p65의 활성화를 억제하고 IBa의 생성을 증가시켰다. 한편, 버섯 2차 발효액은 LPS 자극에서 농도의존적으로 HO-1의 발현을 유도하였다. 이상의 결과들로 미루어보아 상황, 영지 및 표고 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효액은 LPS 자극이 주어졌을 때 HO-1의 발현을 유도하고 NF-κB의 활성을 억제하여 NO 및 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성을 억제함으로써 세포의 노화를 방지하는 것으로 판단되었다. 이는 상황, 영지 및 표고 추출물을 유산균 발효시켰을 때 버섯의 성분 변화와 유산균의 대사산물 생성이 보다 긍정적이게 작용한 것으로 사료된다. 특히 1차 발효보다 2차 발효에서 활성이 증가되었으며, B. bifidum 과 L. sakei subsp. LI033이 발효에 순차적으로 이용되었을 때 항산화 활성이 증가되었다.