[0001] 本发明涉及具有改善胃炎、胃溃疡、胃酸过多以及反流性食管炎的效果的乳酸菌、包含该乳酸菌的药物组合物以及食品组合物。

[0002] 肠道内包含富有多样性的微生物菌群，所述菌群由包含高密度生存的细菌的多个11 12
不同菌种形成，该菌群的浓度达到管腔内容物的10 ～10 cells/g。已充分获知，消化道内生来就具备的微生物菌群对健康、疾病的作用包括：滋养代谢活性、肠道上皮以及免疫系统的效果、以及保护其宿居的宿主不受外来微生物的侵入等(非专利文献1)。

[0003] 另一方面，在胃未感染幽门螺杆菌的情况下，人体内仅存在数种细菌。绝食期间，2 3
胃液仅包含包括Streptococcus、Lactobacillus以及Veillonella在内的、约10 ～10/ml的少数细菌。然而，这些细菌是源自口腔、咽喉的一时性细菌，并不常见(非专利文献2和3)。可以认为人的胃中缺乏这种细菌是导致管腔内酸度高的原因。

[0004] 已充分获知，幽门螺杆菌是在人的胃中引起消化性溃疡、癌的病原性细菌。也提出了螺杆菌属细菌一直以来属于人生来就具备的胃内微生物菌群(非专利文献4)。该假说受到如下事实的支持：幽门螺杆菌在婴幼儿期的早期就获得、并在随后的几十年内以相当的数量持续宿居在胃中。由此，对于胃的生理学发展和功能，需要弄清胃生来就具备的微生物菌群的作用。然而，难以通过使用了幽门螺杆菌的感染试验来弄清其作用。这是因为，CagA、空泡毒素、尿素酶及其代谢产物等的幽门螺杆菌的各种病原性因子在胃组织中诱发慢性病的炎症，该情况使幽门螺杆菌作为生来就具备的细菌生理学作用变得模糊。

[0005] 在先前的研究中，本发明人等在无特殊病原体(specific pathogen-free、SPF)小鼠的胃中发现了占优势的由乳酸菌属细菌形成的生来就具备的微生物菌群(非专利文献5)。可以认为，由于SPF小鼠的胃的酸度更低，因此乳酸菌属细菌能够宿居在胃中。进而，SPF小鼠的胃中产生了原因不明的炎症变化。

[0006] 像这样，包括本发明人等在内的多个研究小组针对乳酸菌属细菌等的乳酸菌、幽门螺旋杆菌(幽门螺杆菌)与胃的关系，重复进行了研究。其中，针对乳酸菌所致的胃炎、胃溃疡的予防改善进行了大量的研究(专利文献1～5)。然而，这些大量的研究利用了乳酸菌的抗幽门螺旋杆菌作用，针对不利用所述作用的上消化道疾病等的予防改善，尚未进行充分的研究，此为现状。

[0007] 现有技术文献

[0008] 专利文献

[0009] 专利文献1：日本专利第4509250号公报

[0010] 专利文献2：日本专利第3046303号公报

[0011] 专利文献3：日本专利第2672247号公报

[0012] 专利文献4：日本专利第3810403号公报

[0013] 专利文献5：日本专利第4021951号公报

[0014] 非专利文献

[0015] 非 专 利 文 献1：Guarner F,Malagelada JR. ″ Gut flora in health and disease.″Lancet 2003;361:512-519.

[0016] 非专利文献2：Lambert J,and Hull R.″Upper gastrointestinal tract disease and probiotics″Asia Pacific J Clin Nutr 1996;5:31-35.

[0017] 非专利文献3：Ruddell WS,Axon AT,Findlay JM,Bartholomew BA,and Hill MJ.″Effect of cimetidine on the gastric bacterial flora.″Lancet.1980;Mar29:672-674.

[0018] 非专利文献4：Blaser M J.″Helicobacters are indigenous to the human stomach:duodenal ulceration is due to changes in gastric microecology in the modern era.″Gut 1998;43:721-727.

[0019] 非 专 利 文 献5：Kabir AMA,Aiba Y,Takagi A,Kamiya S,Miwa T,and Koga Y. ″ Prevention of Helicobacter pylori infection by lactobacilli in a gnotobiotic murine model.″Gut 1997;41:49-55.

[0020] 发明要解决的问题

[0021] 本发明人等发现：以活菌或死菌的形式对无菌小鼠给予乳酸菌属细菌时，胃内生成的胃泌素的细胞数显著减少，进而重复进行深入研究，其结果，完成了本发明。

[0022] 用于解决问题的方案

[0023] 即，本发明涉及以下的胃泌素生成抑制剂及含有该胃泌素生成抑制剂的食品组合物。

[0024] [1]一种胃泌素生成抑制剂，其包含乳酸菌属细菌的死菌体。

[0025] [2]一种胃泌素生成抑制剂，其包含乳酸菌属细菌的死菌体、不包含活菌体。

[0026] [3]根据前述[1]或[2]所述的胃泌素生成抑制剂，其中，乳酸菌属细菌为加氏乳杆菌。

[0027] [4]根据前述[1]或[2]所述的胃泌素生成抑制剂，其中，乳酸菌属细菌为加氏乳杆菌OLL2716(保藏号：FERM BP-6999)。。

[0028] [5]一种食品组合物，其含有前述[1]～[4]中任一项所述的胃泌素生成抑制剂。

[0029] [6]根据前述[5]所述的食品组合物，其是用乳酸菌发酵的食品。

[0030] [7]根据前述[6]所述的食品组合物，其中，用乳酸菌发酵的食品为发酵乳。

[0031] [8]根据前述[7]所述的食品组合物，其中，发酵乳为酸奶。

[0032] 发明的效果

[0033] 本发明的胃泌素生成抑制剂由于使用了乳酸菌属细菌的死菌体，因此对幽门螺旋杆菌不具有除菌作用(例如，专利文献1和2)，能够直接作用于构成胃组织的细胞从而抑制胃酸分泌。进而，还可期待其对例如去除幽门螺旋杆菌后的胃酸过多、由此引起的反流性食管炎、进而与幽门螺旋杆菌无关的胃炎、胃溃疡、反流性食管炎、例如随年龄增加而致的反流性食管炎等的效果。

[0034] 尤其是，根据本发明，提供一种新型的药物或食品，其不利用乳酸菌的抗幽门螺旋杆菌作用，预防改善胃酸过多引起的胃灼热、胃痛等的一系列症状、反流性食管炎、食管癌等。

[0035] 进而，例如，非甾体性抗炎药(NSAID)服用者出现胃酸引起的胃炎、反流性食管炎的问题时，现状是，采取利用质子泵抑制剂(PPI)来抑制胃酸分泌的治疗方法。然而，能够给药PPI的期限最长为8周，且作用点为质子泵，因此存在胃酸分泌促進激素即胃泌素的表达非正常上升的副作用。与此相对，可预测：本发明的胃泌素生成抑制剂由于直接作用于构成胃组织的细胞来抑制胃泌素的分泌，因此可以减少PPI的用量或抑制PPI给药结束后的胃泌素上升的副作用，可以认为，通过组合使用本发明的胃泌素生成抑制剂和PPI，可以有效地改善胃酸过多引起的胃炎、胃溃疡、反流性食管炎以及胃酸过多。

[0036] 另外，由于使用死菌体，不需要管理运输时等的温度，因此操作简便，无品质变差之虞。另外，不需要考虑其与其它微生物(尤其是细菌)的共生关系，在相对利用方面不受限制。

[0037] 进而，本发明的包含胃泌素生成抑制剂的食品组合物中积极地含有乳酸菌属细菌的死菌体，与以往的食品组合物具有完全不同的组成，通过抑制胃泌素而能够抑制胃酸分泌等。

[0038] 本发明的胃泌素生成抑制剂包含乳酸菌(Lactobacillus)属细菌的死菌体。本发明的胃泌素生成抑制剂也可以用作药物或食品添加剂。另外，本发明的胃泌素生成抑制剂还能够包含乳酸菌(Lactobacillus)属细菌的死菌体而不包含活菌体。此外，也可以仅包含死菌体。

[0039] 作为Lactobacillus属的菌种的例子，可列举出Lactobacillus delbrueckii subsp.burgalicus、Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus helveticus subsp.jugurti、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus oris、Lactobacillus casei subsp.rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevis，本发明中的乳酸菌属细菌只要利用死菌体来制剂胃泌素的生成就没有特别限定，也可以是前述例子的1种或2种以上。优选为加氏乳杆菌，特别优选为加氏乳杆菌OLL2716(保藏号：FERM BP-6999)(本菌株于1999年5月24日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(旧通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)、邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(旧地址：邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号))。

[0040] 将本发明的胃泌素生成抑制剂用作药物时，只要作为有效成分的乳酸菌属细菌的死菌体最终作用于胃，则对其给药途径不作特别限定。所给药的个体抑制胃泌素的生成，起到改善胃酸过多、胃炎、胃溃疡、反流性食管炎等的效果。

[0041] 本发明的胃泌素生成抑制剂的给药方式包括口服给药和非口服给药。例如，也可以是口服给药、经管给药。从简便且安全性的观点出发，优选为口服给药。另外，对剂型没有特别限定，可以按照给药途径而适当选择，例如，可列举出液体制剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、悬浊剂、乳剂、散剂、片剂、糖浆剂、注射剂、含片剂等。

[0042] 作为口服给药制剂，可制成公知的各种剂型，例如，可制成颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂、糖浆剂、乳剂、悬浊剂、含片剂等剂型。

[0043] 作为非口服给药，可列举出以注射剂等的形式进行给药。另外，也可以将本发明的胃泌素生成抑制剂局部给药至要施加处理的区域。例如，还可以通过手术中的局部注入、使用导管进行给药。

[0044] 作为本发明的药物组合物中能够使用的载体，可列举出表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、保存料、稳定剂、缓冲剂、悬浊剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、滑剂、流动性改善剂、矫味剂等在药物中可允许的载体，可以适当使用其它常用的载体。具体而言，可列举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙胺、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

[0045] 将本发明的胃泌素生成抑制剂用于药物的情况下，对所含有的乳酸菌属细菌的死10
菌体的菌体浓度没有特别限定，优选的是，以浓缩液的形式利用时设为2×10 个/g以上，
11
以干燥物的形式利用时设为1×10 个/g以上。

[0046] 在将本发明的胃泌素抑制剂用作药物时，乳酸菌属细菌的死菌体的配合量没有特别限定，可以按照剂型、症状、体重、用途等进行适当调整。

[0047] 本发明的药物的单日摄取量没有特别限定，可以按照年龄、症状、体重、用途等进行适当调整。典型而言，可以摄取0.1～10000mg/kg体重，优选为1～2000mg/kg体重，进一步优选摄取10～500mg/kg体重。另外，摄取方法没有特别限定，可以适当地进行变更，例如1日摄取1只大约为1g的制剂～1日摄取3只为10g的制剂等。作为1日的摄取例，11
例如可例示出体重60kg的人1日分1～3次摄取1～5×10 细菌/g的粉末制剂的6g棒
状物(stick)，每日摄取100～300mg/kg。

[0048] 本发明的食品组合物含有本发明所述的胃泌素生成抑制剂。

[0049] 本发明中的食品组合物没有特别限定。例如，可以使原本就含有乳酸菌的食品，也可以是原本不含有乳酸菌的食品。另外，还可以是流食(患者等无需咀嚼而能饮入的、具有流动性的液状食品)。

[0050] 本发明所述的胃泌素生成抑制剂含有乳酸菌属细菌的死菌体，

[0051] 因此本发明的食品组合物包含选自乳酸菌属细菌中的1种或2种以上细菌的死菌体。所述食品组合物抑制摄取个体的胃泌素的生成，起到改善胃酸过多、胃炎、胃溃疡、反流性食管炎等的效果。

[0052] 本发明的食品组合物可以包含糖质、蛋白质、脂质、维生素类、生物体必需微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料、其它配合物。

[0053] 作为糖质，可列举出糖类、加工淀粉(除了糊精之外，可溶性淀粉、英国淀粉、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。

[0054] 作为蛋白质，例如可列举出全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白质、乳清蛋白质浓缩物、乳清蛋白质分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白质、鸡蛋蛋白质、肉蛋白质等动植物性蛋白质、它们的水解物；黄油、乳性矿物质、乳油、乳清、非蛋白态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种乳来源成分等。

[0055] 作为脂质，例如可列举出猪油、鱼油等、它们的分馏油、氢化油、酯交换油等动物性油脂；棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分馏油、氢化油、酯交换油等植物性油脂等。

[0056] 作为维生素类，例如可列举出维生素A、胡萝卜素类、维生素B群、维生素C、维生素D群、维生素E、维生素K群、维生素P、维生素Q、烟酸(niacin)、烟酸(nicotinicacid)、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等，作为矿物质类，例如可列举出钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。

[0057] 本发明的食品组合物的类别、种类没有限定，可以是功能性食品、特定保健用食品、特定用途食品、营养功能食品、健康食品、护理用食品，另外，也可以是点心、乳酸菌饮料、奶酪、酸奶等乳制品、调味品等。饮料食品的形状没有限定，可以呈现固状、液状、流食状、果冻状、片状、颗粒状、胶囊状等通常能够流通的所有饮料食品的形状，还可以添加到各种食品(牛奶、清凉饮料、发酵乳、酸奶、奶酪、面包、饼干、咸饼干、披萨、配方奶粉、流食、患者用食品、营养食品、冷冻食品、加工食品及其它市售食品等)中。上述饮料食品的制造可以按照本领域技术人员的常规方法进行。

[0058] 本发明所述的乳酸菌属细菌的死菌体可以添加到用乳酸菌发酵的食品中而使用。用乳酸菌发酵的食品可列举出例如发酵乳、泡菜、酱菜等。特别优选为发酵乳，其中优选酸奶。在用乳酸菌发酵的食品中，乳酸菌属细菌的活菌绘制增殖曲线而呈指数函数性地增殖，前述发酵食品中的活菌数会根据其适合的发酵程度而自然而然地确定，在本发明的食品组合物中，除了活菌体之外，还添加死菌体，从而含有的总量(活菌＋死菌)超过已有的用乳酸菌发酵的食品中包含的菌体数，由此在胃中有效地抑制胃泌素的生成。例如，可以推测，
10
在酸奶的情况下，最终制品中包含的乳酸菌属细菌的菌体量为平均100g为1×10 左右，为
8 13 9 12
了有效地抑制胃泌素的生成，添加1×10 ～5×10 、优选添加1×10 ～5×10 、特别优选
10 11 10 13
添加5×10 ～5×10 左右的死菌体，而使总量(活菌＋死菌)为1×10 ～5×10 左右、
10 12 11
优选为1×10 ～5×10 、特别优选为1×10 左右。

[0059] 本发明的食品组合物中含有的乳酸菌属细菌的死菌体的菌体浓度没有特别限定，10
优选的是，以浓缩液的形式利用时设为2×10 个/g以上，以干燥物的形式利用时设为
11
3×10 个/g以上。

[0060] 本发明的食品组合物中，乳酸菌属细菌的死菌体的配合量没有特别限定，可以按照剂型、症状、体重、用途等进行适当调整。

[0061] 本发明的食品组合物的单日摄取量没有特别限定，可以按照年龄、症状、体重、用途等进行适当调整。典型的而言，可以摄取0.1～30000mg/kg体重，优选摄取0.1～20000mg/kg体重、进一步优选摄取0.1～4000mg/kg体重。

[0062] 以下，基于实施例来进一步说明本发明，但所述实施例是本发明的例示，不对本发明进行限定。

[0063] 实施例

[0064] 试验例：使用了乳酸菌属细菌的死菌体的胃泌素生成抑制

[0065] 1.材料以及方法

[0066] [细菌]

[0067] 细菌使用加氏乳杆菌OLL2716(明治乳业株式会社)。

[0068] 为了对小鼠进行接种，将乳酸菌属细菌在Difco(商标)MRS broth(Becton Dickinson)中增殖1天。

[0069] 乳酸菌属细菌的热处理通过将细菌悬浊液在100℃下培养10分钟而进行。

[0070] [小鼠]

[0071] 从CLEA Japan,Inc.获得无菌(germ-free、GF)的BALB/c雄性小鼠。使用Trexler型可挠性薄膜塑料隔离器对同母的GF小鼠给予已灭菌的饲料和水，进行饲育。

[0072] 为了使细菌宿居于小鼠，将109CFU的活菌悬浊于0.5ml的磷酸缓冲液(PBS)，使用胃管对8周龄的小鼠口服接种1次。

[0073] 作为基于死菌的处理，将1010CFU的热处理过的细菌(死菌)悬浊于0.5ml的磷酸缓冲液(PBS)中，每日共计10日经由胃来接种。

[0074] 在最后一次接种的10日后，切取胃，用于免疫组织化学分析。

[0075] [组织分析]

[0076] 为了进行胃的组织病理学分析，将沿尾大弯切除的胃的一半用4％缓冲福尔马林固定，包埋于石蜡中，切出2μm的切片。接着，按照标准方法用苏木素和曙红将切片染色。胃的肌肉层的厚度使用分析用软件(Olympus BP2-BSW)用显微镜(Olympus AX80)沿垂直轴进行测定。总计测定10处不同的点，得到标本各领域的平均厚度。计算尾的各领域的肌肉层中的矩形(150×200μm)的核的数量。

[0077] 为了进行免疫组织化学分析，使组织切片脱石蜡化，用微波炉以98℃在10mM枸橼酸缓冲液(pH6.0)中沸腾15分钟，在室温下用含5％正常山羊血清的PBS封闭15分钟。切片在4℃下与一次抗体共同培养一晩，接着，在室温下与用荧光标记进行标记的二次抗体共同培养2小时。最后，样品用DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)和DABCO(1,4-重氮二环[2,2,2]辛烷)进行处理。切片用调整为荧光图像化用的显微镜(Keyence BZ-9000)进行可视化。使用Axio Vission Rel.4.8(Zeiss)，对从小鼠的幽門洞至沿胃体部-幽門窦的轴的1mm长的间隔的随机场的胃泌素阳性(生成)细胞进行染色而成的切片进行形态学分析。

[0078] 使用稀释至1:300的抗胃泌素抗体(兔多克隆抗体、Dako)、对照即兔IgG(Dako)以及对照即小鼠IgG(Dako)作为一次抗体。使用山羊抗兔IgG Alexa 488(分子探针，Molecular Probe)以及山羊抗小鼠Alexa 594(分子探针，Molecular Probe)作为二次抗体。

[0079] [统计学分析]

[0080] 结果通过适当地利用Student′s t检验或单因素方差分析(ANOVA)来进行统计学评价。将SSPS version 16.0(SSPS)或GraphPad Prism 5(GraphPad Software)的软件程序用于数据分析。

[0081] 2.结果

[0082] 分别测定无处置GF小鼠、L.gasseri OLL2716宿居限菌(gnotobiote)小鼠、PBS处置GF小鼠、投与了经热处理的L.gasseri OLL2716的死菌体的GF小鼠的胃幽門洞中的胃泌素生成细胞数量。将其结果示于下表。

[0083] [表1]

[0084] 胃幽门洞中的胃泌素生成细胞数量

[0085]

[0086] a）标本的水平方向上1mm的生成细胞数量

[0087] b）Mean±SE

[0088] c）使用胃管对8周龄的GF宿主小鼠口服接种1次109CFU的乳酸菌属细菌，并在10天后进行分析。

[0089] d）在对8周龄的GF宿主小鼠中的、1010CFU的经过热处理的乳酸菌属细菌的死菌体进行分析之前，在10天内每日经胃进行接种。

[0090] *对于基于Turkey’st检验的GF或GF/PBS组，P<0.001

[0091] 3.考察

[0092] 对于口服给药经热处理的乳酸菌属细菌(死菌体)的GF小鼠而言，可确认胃泌素生成细胞的减少数量与由活菌衍生的数量为同等程度。所述显著减少在加氏乳杆菌OLL2716的情况下也可见。

[0093] 产业上的可利用性

[0094] 根据本发明的胃泌素抑制剂，不利用对幽门螺旋杆菌的除菌作用，能够直接作用于构成胃组织的细胞从而抑制胃酸分泌，因而能够用作改善非幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡以及反流性食管炎、改善去除幽门螺旋杆菌后的胃酸过多等的药物组合物。

[0095] 进而，例如在用乳酸菌发酵的食品等中，虽然在其食品性质方面考虑无法使其含有一定量以上的活菌，但根据本发明的胃泌素抑制剂，通过使用死菌体，可以作为包含超过现有食品中的菌体量(活菌和死菌)的食品组合物而使用。