制造益生菌制剂的乳酸细菌的新颖菌株和其组合

申请号 CN201080058508.7 申请日 2010-10-27 公开(公告)号 CN102686112A 公开(公告)日 2012-09-19
申请人 塞路尔控股有限公司; 发明人 罗盖利·罗盖利; 瓦伦蒂娜·尼古拉耶芙娜·科斯塔迪诺娃; 博雅那·博古维克·玛蒂翟西科;
摘要 本 专利 申请 涉及从生产于保加利亚山脉(Bulgarian mountains)——巴尔干山脉(Stara Planina)和洛多皮山脉(Rhodopes)中的传统酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)(Selur 6和Selur 19)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Selur 12的新颖菌株,以及这些新颖菌株组合从 母乳 喂养婴儿的 粪便 中分离的 益生菌 菌株加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)K7用于制造打算供人或动物使用的益生菌食品补充剂的用途。本 发明 还涉及 预防 和 治疗 制剂,其含有上述菌株和来源于奶或 乳清 发酵 的生源物质的不同组合作为活性组分,且希望用于维持宿主的整体 健康状态 以及预防和/或治疗胃肠道 疾病 。此外,还公开了基于用上述菌株对奶或乳清进行发酵来制造益生菌发酵剂培养物、益生菌保加利亚酸奶和益生菌食品补充剂的程序。
权利要求

1.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)菌株Selur 6,其从由巴尔干山脉(Stara Planina Mountain)(保加利亚(Bulgaria))的原料乳生产的传统酸奶中分离,且以登记号CCM 7712存放于捷克生物保藏中心(CCM)。
2.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 19,其从由洛多皮山脉(Rhodope Mountains)(保加利亚)的原料乳生产的传统酸奶中分离,且以登记号CCM 7713存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
3.一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株Selur 12,其从由巴尔干山脉(保加利亚)的原料乳生产的传统酸奶中分离,且以登记号CCM 7711存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
4.一种发酵剂培养物,其含有至少一种根据权利要求1至3所述的细菌菌株,特征在于
6 11
每种菌株可以在每克组合物10cfu(集落形成单位)到10 cfu范围内的活细胞浓度存在,
6 7 8 9
包括每克组合物至少10cfu,例如10cfu/g,优选至少10cfu/g,例如至少10cfu/g,或至少
10 11
10 cfu/g,例如至少10 cfu/g。
5.根据权利要求4所述的发酵剂培养物,特征在于其含有2到3种根据权利要求1至
3所述的菌株。
6.根据权利要求4所述的发酵剂培养物,特征在于其含有至少一种根据权利要求1至
3所述的细菌菌株以及另一种培养物或含有两种培养物的培养物混合物,各自以0.1%到
99.9%、优选以1%到99%、更优选以10%到90%的比率存在于产品中。
7.根据权利要求6所述的发酵剂培养物,特征在于其含有至少一种根据权利要求1至3所述的细菌菌株以及以登记号CCM 7710存放于捷克微生物保藏中心(CCM)的加氏乳杆菌(Lb.gasseri)益生菌菌株K7,其中所述加氏乳杆菌菌株K7以在每克或每毫升组合
6 11
物10cfu(集落形成单位)到10 cfu范围内的活细胞浓度存在,每克或每毫升组合物至少
6 7 7 8 8 9
10cfu,例如至少10cfu/g或10cfu/ml,即至少10cfu/g或10cfu/ml,例如至少10cfu/g
9 10 11
或10cfu/ml,例如至少10 cfu/g,例如至少10 cfu/g。
8.根据权利要求4至7中任一权利要求所述的发酵剂培养物,其用于发酵各种通常经历乳酸细菌发酵步骤的物质,例如奶、植物物质、肉制品、果汁和面团。
9.一种食品,其含有载剂物质和至少一种根据权利要求1至3所述的菌株或根据权利要求4至7中任一权利要求所述的发酵剂培养物。
10.根据权利要求9所述的产品,特征在于所述载剂物质代表以下食品组合物:奶、酸奶、白干酪、发酵乳、基于奶的发酵产品、基于肉的发酵产品、基于发酵谷类物质的产品、基于奶和小麦的散剂、婴儿食品、淇淋、果汁、糖果或口香糖。
11.一种制造根据权利要求1至3所述的细菌菌株和加氏乳杆菌菌株K7的生物质以及制造根据权利要求4至6所述的益生菌发酵剂培养物的方法,特征在于其以环境制备、实施发酵和最终冻干等步骤进行。
12.根据权利要求11所述的方法,特征在于其基于奶发酵或其它发酵基质进行,所述其它发酵基质例如为乳清或植物基质,例如豆乳、米乳或其它谷物乳。
13.一种获得打算供人和动物使用的食品补充剂和药物制剂的方法,所述食品补充剂和药物制剂含有至少一种根据权利要求1至3所述的细菌菌株以及加氏乳杆菌菌株K7,或独立含有加氏乳杆菌菌株K7。
14.根据权利要求13所述的方法,特征在于其基于奶发酵或其它发酵基质进行,所述其它发酵基质例如为乳清或植物基质,例如豆乳、米乳或其它谷物乳。
15.一种打算供人和动物使用的食品补充剂组合物,特征在于其含有至少一种根据权利要求1至3所述的细菌菌株以及加氏乳杆菌菌株K7或其它菌株,或独立含有加氏乳杆菌菌株K7。
16.一种医药组合物,特征在于其含有至少一种根据权利要求1至3所述的细菌菌株以及加氏乳杆菌菌株K7或其它菌株,或独立含有加氏乳杆菌菌株K7。
17.根据权利要求15至16所述的组合物,特征在于其含有至少一种根据权利要求1至
7 12
3所述的细菌菌株,数量为每克载剂物质10cfu到约10 cfu,以及加氏乳杆菌菌株K7,数量
8 12 9 12
为每克载剂物质约10cfu到约10 cfu,优选每克载剂物质10cfu到约10 cfu,更优选约
10 12
10 cfu到约10 cfu。
18.根据权利要求15至17所述的组合物,特征在于其也含有其它食品补充剂、益生菌、矿物质、维生素和其它食品或/和药学上可接受的物质。
19.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的细菌菌株、根据权利要求4至7和15至18所述的培养物、组合物或产品,其打算用于治疗性或预防性治疗人或动物的疾病
20.一种根据权利要求1至3中任一权利要求所述的菌株、根据权利要求4至6和15至18所述的培养物、组合物或产品的用途,用于获得打算用于治疗性或预防性治疗人或动物疾病的产品。
21.根据权利要求20所述的用途,特征在于所述疾病是胃肠道疾病。
22.根据权利要求20至21所述的用途,特征在于所述疾病选自包含以下的群组:抗生素相关病症、胃肠炎、腹泻(包括旅行者腹泻和急性儿童腹泻)、不耐症、胃肠道感染、病原菌(包括难辨梭菌(Clostridium difficile))在胃肠道中的发展、肠易激综合症(IBS)、炎症性肠道疾病(IBD)和其它免疫调节综合症。

说明书全文

制造益生菌制剂的乳酸细菌的新颖菌株和其组合

技术领域

[0001] 本发明涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的新 颖菌株(Selur 6和Selur 19)和 嗜热链 球菌(Streptococcus thermophilus)的新颖菌株(Selur 12),以及这些新颖菌株组合益生菌菌株加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)K7用于制备打算供人或动物使用的益生菌食品补充剂的用途。
此外,本发明涉及一种预防治疗制剂,其含有上述菌株的不同组合作为有效组分,用于维持和改善宿主的整体健康状态以及预防和/或治疗胃肠道疾病。另外,已经发明和公开了基于用上述菌株对奶或乳清进行发酵来制备生物质、益生菌发酵剂培养物、食品补充剂和药物制剂的新式程序和技术。

背景技术

[0002] 乳酸细菌(LAB)是一组多样性的革兰氏阳性无芽孢细菌,它们是需要特定营养环境的厌菌或兼性厌氧菌,最终代谢产物是乳酸。如今,LAB因其发酵活性以及其健康和营养益处而成为工业上重要的微生物。LAB、特别是乳酸细菌在胃肠道(GIT)中占据重要生态位,认为它们为整体健康状态和正确生理条件提供许多益生菌益处。这些益处包括对天然菌群的积极影响、竞争性排斥病原体和刺激/调节粘膜免疫。在这一点上,值得特别强调的是,由益生菌赋予的健康益处具有菌株特异性,这取决于个别菌株特征(沙阿(Shah),2007)。
[0003] 乳清蛋白和生物活性肽可能是乳制品中所含的最重要且研究最充分的生源物质。乳清蛋白与众多营养和生理结果有关,包括生理变化、体育运动后恢复和预防肌肉萎缩、饱腹感和体重控制、感染和健康老龄化控制(史密瑟斯(Smithers),2008)。乳蛋白是生物活性肽的丰富来源。来源于乳蛋白的生物活性肽在亲本蛋白序列内是无活性的,且可在奶/乳清消化或发酵期间通过酶蛋白解从LAB释放。一旦释放,生物活性肽就可在体内作为具有不同活性的调节化合物起作用,例如作为降低或控制高血压的手段、抗氧化剂、预防血栓形成的手段、抗微生物手段和调节免疫系统的手段(迈泽尔(Meisel),1998,科尔霍宁(Korhonen)和费兰图(Pihlanto),2006)。
[0004] 酸奶是通过发酵生产的所有类型的奶中最流行的。长久以来,许多文明都坚信它对人类健康具有有益影响。阿育吠陀(Ayurveda),约公元前2500年出现的最古老健康科学之一,推荐消费酸奶来维持正确的整体健康状态(乔普拉(Chopra)和多菲德(Doiphode),2002)。尽管酸奶和因此酸奶细菌德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌在历史上与人类健康有关,但酸奶细菌并不经常作为益生菌被提及。出现这种情况很可能是因为无法在人类胃肠道(GIT)的天然菌群中观察到这些细菌,且因此过去大多数学者都认为这些物种无法在GIT和器官系统的条件下存活(瓜内尔(Guarner)等人,2005)。遗传方法的发展促使学者能够在某些特定菌株通过GIT期间追踪它们。近年来,已在消费酸奶的人类的排泄物中观察到乳酸细菌(特(Mater)等人,2005,埃利(Elli)等人,2006)。相反,加西亚-阿尔比亚克(García-Albiach)等人(2008)提出人类粪便微生物群中的变化主要归因于酸奶自身的不要求细菌活的性质。在这点上,专利申请WO 96/20607、WO 2005/056028和WO
2008/002484揭示了具有益生菌性质的酸奶发酵剂培养物的特定菌株(嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种),其用于治疗各种GIT病症的组合和制剂。
[0005] 一直到20世纪80年代,大多数从肠分离的乳杆菌属菌株基于其形态和表型特征都被归类为嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)。随着基于分子技术的现代分类学的发展,已在先前被确定为嗜酸乳杆菌的群组内鉴定出六种不同物种且进一步分成DNA同源组A(嗜酸乳杆菌、食淀粉乳杆菌(Lb.amylovorus)、卷曲乳杆菌(Lb.crispatus)、鸡乳杆菌(Lb.gallinarum))和DNA同源组B(加氏乳杆菌、约氏乳杆菌(Lb.johnsonii))。通过使用型特异性PCR引物或是通过DNA测序,确定了高变的16S-23S基因间间隔区以及16SrPHK基因序列的特异性足以区分类似的乳杆菌属物种(坦诺克(Tannock)等人,1999,库伦(Kullen)等人,2000)。
[0006] 1996年,在卢布 尔雅那大学 生物技术院 乳品学系(Chair of DairyScience,Biotechnical faculty,University of Ljubljana)从7天大的母乳喂养的健康婴儿分离出加氏乳杆菌K7菌株。其存放在ZIM工业微生物菌种保藏中心(ZIM Culture Collection of Industrial Microorganisms),登记为WDCM810(WFCC-MIRCEN世界微生物数据中心(WFCC-MIRCEN World Data Centre for Microorganisms,WDCM))。在2009年
9月,所述菌株已根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)以登记号CCM 7710存放于捷克微生物保藏中心(Czech Collection of Microorganisms,CCM)。基于生理和生化性质,包括用API 50CHL(生物梅里埃公司(BioMerieux),法国(France))鉴别的发酵流程,将其鉴定为嗜酸乳杆菌群组的成员。缺少S层蛋白、使用菌株特异性引物的PCR和对16SrPHK的V2-V3区一级序列的确定已经表明,菌株K7归属于加氏乳杆菌类型(博格维奇·马提亚斯奇和罗吉尔(Rogelj),2000,坎赛克·马亨尼奇 等人,
2003)。
[0007] 据证实加氏乳杆菌K7满足益生菌菌株的基本准则,因为其耐低pH值且耐胆汁,产生抗微生物物质(包括具有广泛抗微生物谱的细菌素)且粘附于Caco-2细胞[博格维奇·马提亚斯奇和罗吉尔,2000,博格维奇·马提亚斯奇等人,2003]。加氏乳杆菌K7的特点在于生物合成和产生至少两种细菌素,命名为乳酸菌素K7A(gassericene K7A)和乳酸菌素K7B(gassericene K7B),其核苷酸序列以登记号EF392861和AY307382存放在GenBank中。两种细菌素均属于二肽细菌素的类别(佐里奇·彼得内尔 2007)。
[0008] 此外,菌株能够在通过胃肠道时存活下来,且在通过标准方式或通过剖腹产出生的仔猪的肠韧带中至少临时地形成菌群。在通过剖腹产出生且人工感染有产肠毒素性大肠杆菌(Escherichia coli)的仔猪中,加氏乳杆菌K7在一定程度上降低感染的存活率,且除了因为产生有机酸和刺激免疫反应而引起的抗微生物活性以外,肠韧带竞争性地释放大肠杆菌是充当所述活性的可能机制。通过细胞模型Caco-2证实了加氏乳杆菌K7防止非产肠+毒素性突变体大肠杆菌菌株O8:K88 定植于肠上皮细胞的能力(博格维奇·马提亚斯奇等人,2004;博格维奇·马提亚斯奇等人,2006;罗吉尔和博格维奇·马提亚斯奇,2006)。一些先前的专利申请描述了从婴儿粪便(JP 04320642、JP 05227946、美国专利6596530)和人乳(WO 2004/003235、WO 2008/016214)中分离一组不同的菌株,包括益生菌加氏乳杆菌菌株。
[0009] 此外,美国专利申请US2008233104揭示在治疗性组合物中应用益生菌生物体的组合物和方法。具体而言,揭示了乳酸细菌的一种或一种以上菌株控制病原体的用途。菌株对于抗微生物手段(例如抗生素和抗病毒手段)具有耐药性或大大降低的敏感性。所揭示的组合物用于治疗或预防细菌介导的胃肠道感染。
[0010] 国际专利申请WO8905849揭示从猪的胃肠道中分离的乳酸细菌,其能够在胃肠道环境中存活,也就是对胆汁或酸耐受。这些细菌包括于希望为人类或动物所消费以治疗或预防胃肠道疾病的发酵乳产品中。
[0011] NZ523010揭示一种具有益生菌活性的乳酸细菌的分离菌株。所述菌株已选自乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)或肠球菌属(Enterococcus),且更确切地说,选自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)NCC2581(CNCMI-2448)、罗伊氏乳杆菌NCC2592(CNCM I-2450)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)NCC2583(CNCM1-2449)、罗伊氏乳杆菌NCC2603(CNCMI-2451)、罗伊氏乳杆菌NCC2613(CNCMI-2452)、嗜酸乳杆菌NCC2628(CNCM 1-2453)。

发明内容

[0012] 本发明涉及从生产于保加利亚山脉(Bulgarian mountains)——巴尔干山脉(Stara Planina)和洛多皮山脉(Rhodopes)的传统酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb.bulgaricus)和嗜热链球菌(St.Thermophilus)菌株,其显示数种独有特征。这些菌株是:
[0013] ·德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6,根据布达佩斯条约在2009年9月以登记号CCM 7712存放于捷克微生物保藏中心(CCM);
[0014] ·德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19,根据布达佩斯条约在2009年9月以登记号CCM 7713存放于捷克微生物保藏中心(CCM);
[0015] ·嗜热链球菌Selur 12,根据布达佩斯条约在2009年9月以登记号CCM 7711存放于捷克微生物保藏中心(CCM)。
[0016] 本发明的另一方面涉及含有至少一种上述菌株以及先前所述从儿童粪便中分离的益生菌加氏乳杆菌K7菌株的组合物和产品,所述加氏乳杆菌K7菌株具有登记号CCM7710。
[0017] 本发明的另一方面揭示基于奶或乳清发酵,从上述菌株制造生物质和益生菌发酵剂培养物、供人和动物使用的食品补充剂和药物制剂的程序。
[0018] 最后,本发明的最后一个方面涉及上述菌株或含有上述菌株的任何培养物、组合物或产品的用途,其在制造功能性食品和预防性制剂(如供人和动物使用的食品补充剂)和治疗性制剂期间用于维持宿主的整体健康状态以及预防和/或治疗胃肠道病症、泌尿生殖感染或阴道感染。
[0019] 定义
[0020] 根据本发明,术语“益生菌”应按FAO/WHO(2002)的定义理解,且具体而言,这些益生菌是活的生物体,当被摄取足够数量时会提供某些生理益处,且通常具有菌株特异性。
[0021] 根据本发明,术语“生源物质”意指来源于微生物活动的营养组分,其有益于健康状态,与肠道菌群无关(光冈(Mitsuoka),2000)。根据这一定义,来自发酵乳的所述物质是例如由LAB在发酵期间产生的乳酸、丁酸、生物活性肽、β-半乳糖苷酶和胞外多糖。
[0022] 根据本发明且如本文所用,术语“营养和/或药学上可接受的物质/载体”意指一种或一种以上固体或液体物质或填充剂、稀释剂或包囊物质,其适于被人或动物摄取且与活性益生菌菌株相容。
[0023] 根据本发明,术语“可相容”是指组分在人或动物体内不抑制益生菌且允许根据本发明的栗色着色和菌株活性以及加氏乳杆菌菌株K7。附图说明
[0024] 图1展示使用德氏乳杆菌型特异性Del I和Del II引物的PCR。注解:M-100bpT(富酶泰斯公司(Fermentas));1.Selur 6;2.L7;3.L8;4.L12;5.Selur 19;6.LMG 6412 德T
氏乳杆菌保加利亚亚种;7.LMG 6901 德氏乳杆菌德氏亚种(Lb.delbr.delbr.);8-12是从天然酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种;13.阴性对照。
[0025] 图2展示使用嗜热链球菌型特异性Th1和Th2引物的PCR。注解:M-100bp(富酶泰斯公司);1-ST4;2-ST7;3-Selur 12。
[0026] 图3展示使用德氏乳杆菌保加利亚亚种亚型特异性LB1和LLB1引物的PCR。注T解:M-1kb(富酶泰斯公司);1-Selur 6;2-L7;3-L8;4-L12;5-Selur 19;6-LMG 6412 德氏T
乳杆菌保加利亚亚种;7-LMG 6901 德氏乳杆菌德氏亚种;8-12是从天然酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种;13.阴性对照。
[0027] 图4展示在使用引物1254的RAPD-PCR之后所获得的DNA片段。注解:M-1kb(富T酶泰斯公司);1-Selur 6;2-L7;3-L8;4-L12;5-Selur 19;6-LMG 6412 德氏乳杆菌保加利T
亚亚种;7-LMG 6901 德氏乳杆菌德氏亚种;8-12是从天然酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种;13.阴性对照。
[0028] 图5展示在使用引物KGT-70GC的RAPD-PCR之后所获得的DNA片段。注解:1+12-标记1kb(富酶泰斯公司);2-加氏乳杆菌K7;3-嗜热链球菌Selur 12;4-德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6;5-德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19;6-10-从天然酸奶中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种;11-阴性对照(RAPD-反应参考混合物)。
[0029] 图6呈现德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19菌株针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213的抗微生物活性。采用加氏乳杆菌K7进行比较。
[0030] 图7呈现各种菌株对CaCo-2细胞的粘附能力;(1=德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur19,2=嗜热链球菌Selur 12,3=德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6,4=鼠李糖乳杆菌GG,5=约氏乳杆菌Lj1,6=罗伊氏乳杆菌ING 1,7=代田乳杆菌(Lb.Shirota)SHI,8=加氏乳杆菌K7)。
[0031] 图8呈现经嗜热链球菌Selur 12和各种乳杆菌菌株(Selur 6、Selur 19和K7)感染的奶在42℃和37℃下发酵期间的pH值变化。

具体实施方式

[0032] 新颖德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6和Selur 19以及嗜热链球菌菌株Selur 12
[0033] 新颖德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6和Selur 19以及嗜热链球菌菌株Selur 12的样本已经以登记号CCM 7712、CCM 7713和CCM 7711存放于CCM(捷克微生物保藏中心),存放日期是2009年9月。存放是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of the Patent Procedure)的条款进行。
[0034] 乳杆菌属菌株Selur 6和链球菌属菌株Selur 12是从由巴尔干山脉(保加利亚)的原料乳获得的传统酸奶中分离,乳杆菌属菌株Selur 19是从由洛多皮山脉(保加利亚)的原料乳获得的传统酸奶中分离。
[0035] 同样地,加氏乳杆菌菌株K7的样本已经以登记号CCM 7710存放于CCM(捷克微生物保藏中心),存放日期是2009年9月。这一存放同样根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款进行。加氏乳杆菌K7是一种已被充分描述的益生菌菌株(博格维奇·马提亚斯奇和罗吉尔,2000;博格维奇·马提亚斯奇等人,2003,2004,2006;罗吉尔和博格维奇·马提亚斯奇,2006,佐里奇·彼得内尔,2007),其在ZIM工业微生物菌种保藏中心(斯洛文尼亚)的登记号是IM105,登记为WDCM810(WFCC-MIRCEN世界微生物数据中心(WDCM))。其于1996年8月在斯洛文尼亚卢布尔雅那分离自7天大的母乳喂养婴儿的粪便。K7是以下两种细菌素的生产者:乳酸菌素K7A和乳酸菌素K7B。基于染色体细菌素操纵子的核苷酸序列,将两种细菌素归入二肽非抗生素(IIb)的群组。乳酸菌素K7A(1143bp)和乳酸菌素K7B(3276bp)的核苷酸序列存放在GenBank中,登记号是EF392861(乳酸菌素K7A)和AY307382(乳酸菌素K7B)。其含有1个质粒且形成位于长链中的较短杆。在微需氧条件中生长的最佳温度是37℃。
[0036] 如以下实例1中所述,首先通过基因分型表征新颖乳杆菌属菌株和链球菌属菌TM株。针对利用 基因组DNA纯化套装(普洛麦格公司(Promega))或利用Maxwell 16系统(普洛麦格公司)从常见培养物中分离的DNA执行PCR,所述PCR使用德氏乳杆菌菌株特异性引物Del I(5'-ACG GAT GGA TGG AGA GCA G-3')和Del II(5'-GCAAGT TTG TTC TTT CGAACT C-3')以及嗜热链球菌菌株特异性引物Th I(5'-ACG GAATGT ACT TGA GTT TC-3')和Th II(5'-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C-3')(替尔萨拉-蒂米斯耶尔维和阿拉托萨瓦(Alatossava),1997)。用引物LB1(5'-AAA AAT GAA GTT
GTT TAA AGT AGG TA-3')和LLB1(5'-AAG TCT GTC CTCTGG CTG G-3')执行德氏乳杆菌的亚型鉴定(托里亚尼(Torriani)等人,1999)。菌株Selur 6和Selur19被鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种,且菌株Selur12被鉴定为嗜热链球菌。
[0037] 为了另外证实类型鉴定,对经PCR扩增的16S rPHK可变区V1和V3执行测序。乳杆菌属菌株Selur 6和Selur 19与德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC BAA-365或ATCC11842的参考序列(德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6的16S rPHK的PCR延伸可变区V1和V3的序列(测序是由瑞士巴尔加赫(Balgach-Switzerland)的微合成实验室(Microsynth Lab)进行)和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 19的16S rPHK的PCR延伸可变区V1和V3的序列(测序是由瑞士巴尔加赫的微合成实验室进行))一致(99%),
[0038] A1,Premium RUN
[0039] 986446 49880
[0040]
[0041] GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATG ATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGYAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAAT
[0042] 乳杆菌属....................116个命中物20个生物体[根源;细胞生物体;细菌;厚壁菌;杆菌纲;乳杆菌目;乳杆菌科]
[0043] .德氏乳杆菌....................................94个命中物7个生物体[0044] ..德氏乳杆菌保加利亚亚种................61个命中物3个生物体
[0045] ...德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC BAA-365......9个命中物1个生物体
[0046] ...德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC 11842......10个命中物1个生物体
[0047] ..德氏乳杆菌印度亚种...............1个命中物1个生物体
[0048] ..德氏乳杆菌德氏亚种...............4个命中物1个生物体
[0049] ..德氏乳杆菌乳亚种...................13个命中物1个生物体
[0050] .乳杆菌属JCM 8653种.............1个命中物1个生物体
[0051] .乳杆菌属CY1种......................1个命中物1个生物体
[0052] .未经培养的乳杆菌属种............9个命中物1个生物体[环境样本]
[0053] .乳杆菌属RA2120种................1个命中物1个生物体
[0054] .乳杆菌属RA2062种................1个命中物1个生物体
[0055] .乳杆菌属RA2066种................1个命中物1个生物体
[0056] .乳杆菌属DJF_CR11种............1个命中物1个生物体
[0057] .乳杆菌属19-2种......................1个命中物1个生物体
[0058] .乳杆菌属JCM 1552种.............1个命中物1个生物体
[0059] .乳杆菌属DumLac1种..............1个命中物1个生物体
[0060] .乳杆菌属MF-07种...................1个命中物1个生物体
[0061] .乳杆菌属DI70种......................1个命中物1个生物体
[0062] .瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)...........2个命中物1个生物体或
[0063] A1,Premium RUN
[0064] 986445 49879
[0065]
[0066] GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGTAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGA
[0067] 乳杆菌属..........................................116个命中物20个生物体[根源;细胞生物体;细菌;厚壁菌门;杆菌纲;乳杆菌目;乳杆菌科]
[0068] .德氏乳杆菌....................................94个命中物7个生物体[0069] ..德氏乳杆菌保加利亚亚种...........61个命中物3个生物体
[0070] ...德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC BAA-365...9个命中物1个生物体
[0071] ...德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC 11842........10个命中物1个生物体
[0072] ..德氏乳杆菌印度亚种...............1个命中物1个生物体
[0073] ..德氏乳杆菌德氏亚种...............4个命中物1个生物体
[0074] ..德氏乳杆菌乳亚种....................13个命中物1个生物体
[0075] .乳杆菌属JCM 8653种..............1个命中物1个生物体
[0076] .乳杆菌属CY1种.......................1个命中物1个生物体
[0077] .未经培养的乳杆菌属种.............9个命中物1个生物体[环境样本]
[0078] .乳杆菌属RA2120种.................1个命中物1个生物体
[0079] .乳杆菌属RA2062种.................1个命中物1个生物体
[0080] .乳杆菌属DJF_CR11种.............1个命中物1个生物体
[0081] .乳杆菌属RA2066种.................1个命中物1个生物体
[0082] .乳杆菌属19-2种.......................1个命中物1个生物体
[0083] .乳杆菌属JCM 1552种..............1个命中物1个生物体
[0084] .乳杆菌属DumLac1种...............1个命中物1个生物体
[0085] .乳杆菌属MF-07种...................1个命中物1个生物体
[0086] .乳杆菌属DI70种......................1个命中物1个生物体
[0087] .瑞士乳杆菌................................2个命中物1个生物体
[0088] Selur12菌株与嗜热链球菌LMG 18311的参考序列(嗜热链球菌菌株Selur12的16SrPHK的PCR延伸可变区V1和V3的序列(测序是由瑞士巴尔加赫的微合成实验室进行))一致(100%),
[0089] A1,Premium RUN
[0090] 986447 49881
[0091]
[0092] GAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGAATGACTCATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGAGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG
[0093] 链球菌属................................100个命中物4个生物体[根源;细胞生物体;细菌;厚壁菌门;杆菌纲;乳杆菌目;链球菌科]
[0094] .未经培养的链球菌属种....46个命中物1个生物体[环境样本]
[0095] .唾液链球菌(Streptococcus salivarius).....10个命中物1个生物体
[0096] .链球菌属C165种.......1个命中物1个生物体
[0097] .嗜热链球菌...43个命中物1个生物体
[0098] 菌株K7与加氏乳杆菌ATCC 33323的参考序列(加氏乳杆菌菌株Selur K7的16SrPHK的PCR延伸可变区V1和V3的序列(测序是由瑞士巴尔加赫的微合成实验室进行))一致(100%)。
[0099] A1,Premium RUN
[0100] 986443 49877
[0101]
[0102] AATTTGGTGCTTGCACCAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTAAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATG
[0103] 乳杆菌属........................111个命中物19个生物体[根源;细胞生物体;细菌;厚壁菌门;杆菌纲;乳杆菌目;乳杆菌科]
[0104] .加氏乳杆菌.............................51个命中物2个生物体
[0105] ..加氏乳杆菌ATCC 33323.......7个命中物1个生物体
[0106] .乳杆菌属IDSAc种.................1个命中物1个生物体
[0107] .未经培养的乳杆菌属种..........11个命中物1个生物体[环境样本]
[0108] .乳杆菌属BLB3种..................1个命中物1个生物体
[0109] .乳杆菌属KC36a种.................1个命中物1个生物体
[0110] .乳杆菌属BLB1b种.................1个命中物1个生物体
[0111] .约氏乳杆菌..............................34个命中物2个生物体
[0112] ..约氏乳杆菌NCC 533.............6个命中物1个生物体
[0113] .乳杆菌属BCRC 17755种.......1个命中物1个生物体
[0114] .乳杆菌属20326H4L1种........1个命中物1个生物体
[0115] .乳杆菌属DJF SLA41种........1个命中物1个生物体
[0116] .乳杆菌属AD102种................1个命中物1个生物体
[0117] .乳杆菌属L-YJ种...................1个命中物1个生物体
[0118] .乳杆菌属KC45a种................2个命中物1个生物体
[0119] .嗜酸乳杆菌.............................1个命中物1个生物体
[0120] .乳杆菌属JCM 2010种............1个命中物1个生物体
[0121] .乳杆菌属ID9203种................1个命中物1个生物体
[0122] .乳杆菌属MF213种................1个命中物1个生物体
[0123] 此外,如实例1中所揭示,已经确定了新颖菌株的RAPD模型。重要的是将特殊菌株与其它菌株区分开来,且在这一点上,RAPD-PCR可能是有用的方法。为了从工业酸奶生产所用的不同菌株中鉴别出新颖菌株,使用数种寡核苷酸引物。用于菌株鉴别最适当的似乎是RAPD引物1254(图4)或KGT-70GC(图5)。使用两种引物和所述方案,也可区分这两种新颖德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Selur 6和Selur 19)。
[0124] 在另一方面,本发明描述新颖菌株自身或结合加氏乳杆菌菌株K7所展现的特征,所述特征有益于人类健康,尤其有益于预防或治疗消化性疾病、传染性疾病或其它免疫相关疾病,例如过敏或炎症性疾病、旅行者腹泻或抗生素治疗引起的腹泻。
[0125] 如实例2中所示,根据FSA的最终技术报告项目编号G01022"(Final Technical report for FSA project ref G01022")(FSA,2005)来执行不同的测试以评估新颖菌株在模拟胃肠道条件中存活的能力。根据结果,在pH 1下,Selur 6和Selur 12是仅有的在SCJ中处理20分钟后与菌株加氏乳杆菌K7存活程度类似的菌株。在pH 2下,所有受试菌株中约一半的活细胞和100%的加氏乳杆菌K7细胞存活(表1)。菌株对由含胆汁盐(1g/l)和胰酶(1g/L)的PBS缓冲液(pH 8)组成的模拟上段肠液更为敏感。当暴露于UIJ时(T0时),立即观察到纯培养物中所有受试菌株的细胞数目减少约3或4个对数单位。嗜热链球菌Selur 12并未立刻受到影响,但对于这一菌株而言培育2小时会致死(表2)。菌株更好地存活于在乳环境中培育的制剂中(表3)。根据体外测试,嗜热链球菌Selur 12几乎不可能存活于GIT条件中。这一菌株的重要特征在于其对德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur6和Selur 19的生长和发酵能力具有刺激作用(如实例9中所示)。
[0126] 在实例3中,展示新颖菌株乳杆菌属菌株Selur 6和Selur 19的抗生素敏感性,所述菌株对四种临床上最适用的抗生素(即庆大霉素(gentamicin)、四环素(tetracycline)、红霉素(erythromycin)和万古霉素(vancomycin))敏感。当应用丹尼尔森(Danielsen)和温德(Wind)(2003)的转变点时,加氏乳杆菌恰好也对这四种抗生素敏感。根据FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会(European Commission),2005),嗜热链球菌Selur12耐庆大霉素和红霉素。根据FEEDAP(欧盟委员会,2005)边界点,所有菌株都具有链霉素(streptomycin)耐药性。当应用丹尼尔森和温德(2003)的边界点时,发现乳杆菌属菌株对链霉素敏感。因为没有针对甲硝唑(metronidazol)、头孢噻肟(cefotaxim)、头孢克洛(cefachlor)和阿莫西林(amoxicillin)的边界点值,所以无法将菌株定义为敏感性或耐药性。所有菌株对甲硝唑都达到高MIC值。这一结果与德尔加多(Delgado)等人(2007)一致,德尔加多等人(2007)在测试人类胃肠道分离物时已注意到大多数乳杆菌属物种对甲硝唑具有实质上的耐药性。当针对临床研究考虑符合CLSI/NCCLS的微生物边界点时,嗜热链球菌Selur 12耐阿奇霉素(azithromycin)。FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)尚未提出这种抗生素的边界点值。
[0127] 本发明的一个尤其有利的实施方式是证明新颖菌株的一些益生菌特征。在这一方面,检验根据本发明的新颖菌株的抗微生物活性、疏水性、β-半乳糖苷酶活性、粘附Caco-2细胞的能力、竞争性和排斥性质以及在用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6刺激时THP-1巨噬细胞的免疫反应。
[0128] 通过琼脂点测试法(agar point test)来测试对31种指示菌株的抗细菌活性,所述菌株包括各种乳细菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)1b 1106、酪丁酸梭菌T(Cl.tyrobutyricum)DSM 2637、蜡样芽孢杆菌(Bacilus cereus)CCM 2010、三种金黄色葡萄球菌菌株、耐久肠球菌(Enterococcus durans)CCM 5612、两种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)菌株、屎肠球菌(E.faecium)LMG 11423、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)IM 372、无害利斯特氏菌(L.innocua)ATCC 33090和大肠杆菌O8:K88。如实例4中所示,尤其证明了德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6和Selur 19的大范围抗微生物活性(表8)。观察到德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19菌株的广泛抗微生物活性不仅针对乳杆菌属指示菌株,而且也针对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌和无害利斯特氏菌。除了抑制乳细菌之外,嗜热链球菌Selur 12仅适度抑制肠球菌和利斯特氏菌菌株。新颖菌株都不能抑制产气荚膜梭菌1b 1106、酪丁酸梭菌DSM2637、耐久肠球菌CCM 5612或大肠杆菌O8:K88。加氏乳杆菌K7针对各种酪丁酸梭菌和难辨梭菌(Cl.difficile)菌株的抗微生物活性先前已被证明(博格维奇·马提亚斯奇和罗吉尔,2000,博格维奇·马提亚斯奇等人,2007)。
[0129] 根据维因德若拉(Vinderola)和莱因海默(Reinheimer)(2003),通过测量有机相(正十六烷)与水相之间的细菌细胞分离来测定疏水性。如实例5中所述,确定了加氏乳杆菌K7以及德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19的高细胞表面疏水性。
[0130] 在使用合成化合物邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(OPNG)根据维因德若拉和莱因海默(2003)的方案测定之后,显示德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6的β-半乳糖苷酶活性最高。与其它菌株相比,德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6和Selur 19都表现出极佳的β-半乳糖苷酶活性(实例6),对于乳糖酶活性降低的所有这些菌株来说,这是极好的迹象。
[0131] 益生菌的一个重要功能性质是菌株粘附肠上皮细胞的能力。我们的实验使用Caco-2细胞作为体外模型。详细程序和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 19针对两种菌株(金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922)的竞争性和排斥性质测试一起描述于实例7中。与针对加氏乳杆菌K7和一些其它益生菌菌株(鼠李糖乳杆菌GG、约氏乳杆菌Lj1、罗伊氏乳杆菌ING 1、代田乳杆菌SHI)确立的粘附相比,德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19以及嗜热链球菌Selur 12菌株的粘附总体上至少相当,或在某些计算粘附%(粘附的集落形成单位/孔(cfu/axilla)除以添加的集落形成单位/孔,以%表示)的实例中甚至更佳。在竞争性分析中,德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19能够抑制大肠杆菌ATCC 25922的粘附,但不能抑制金黄色葡萄球菌的粘附。在排斥分析中,Selur 19并不有效。
[0132] 调节免疫反应是益生菌有益健康的作用之一。因为一些初步实验指出加氏乳杆菌K7和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6可能具有免疫刺激作用,所以测试这两种菌株影响THP-1小噬细胞细胞系释放细胞因子的能力。鼠李糖乳杆菌GG和干酪乳杆菌(Lb.examplei)DN-114001由于其众所周知的益生菌作用(包括调节免疫反应)而被用作阳性对照。这一实验描述于实例8中。Selur 6和K7菌株并不引起巨噬细胞细胞系THP-1释放炎性细胞因子(IL-8、IL-6和TNF),而这两种菌株都降低由添加LPS(大肠杆菌O111:B4的脂多糖)产生的一种主要炎性细胞因子的浓度。炎性细胞因子的释放减少展示Selur 6和K7菌株可能具有抗炎作用。IL-1β的明显增加可能引起淋巴细胞B增殖且随后产生IgA,这应在体内得以证实。
[0133] 由至少一种新颖菌株单独或与加氏乳杆菌菌株K7组合组成的益生菌制剂
[0134] 总的来说,乳酸细菌用作发酵剂培养物来生产日常食品或其它类型食品。含有至少一种本发明菌株的发酵剂培养物是本发明的另一实施方式。总的来说,所述发酵剂培养物组合物含有呈浓缩形式(包括冷冻、干燥或冻干浓缩物)的细菌,每克组合物具有在6 11 6
10cfu(集落形成单位)到10 cfu范围内的总活细胞浓度,包括每克组合物至少10cfu,例
7 8 9 10 11
如10cfu/g,即至少10cfu/g,例如至少10cfu/g,即至少10 cfu/g,例如至少10 cfu/g。
[0135] 含有本发明的每种细菌菌株以及加氏乳杆菌K7或另一菌株的组合物也是本发明的一方面。在这一点上,本发明涉及每种菌株或彼此的混合物或每种菌株与加氏乳杆菌K7或与其它细菌菌株的混合物的生物学纯培养物。因此,提及的本发明的方面是获得含有根据本发明的至少一种菌株或菌株混合物的各种组合物,包括益生菌组合物。
[0136] 当将乳酸细菌用作发酵剂培养物来获得发酵食品(例如发酵乳)时,对菌株发酵活性和提供大量活菌株的组合的了解至关重要。对各种菌株组合和发酵温度的研究描述于实例9中。嗜热链球菌菌株Selur 12被证明是良好的乳酸细菌刺激剂。将用各种菌株组合接种的奶发酵5小时到7.5小时(达到平均值pH 4.6)。相应地,在两种发酵温度42℃和37℃下,确定奶发酵期间益生菌菌株加氏乳杆菌K7与嗜热链球菌菌株Selur 12和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 19的发展和存活极佳。相应地,当在42℃和37℃下执行发
8 9
酵时,发酵乳中加氏乳杆菌K7的活细胞数目达到8.70×10cfu/ml到1.6×10cfu/ml的程度。证实了加氏乳杆菌K7可与新颖菌株组合用于益生菌食品和制剂。
[0137] 本发明的下一个重要实施方式是生产生物质和益生菌发酵剂培养物、供人和动物使用的食品补充剂和药物制剂的技术。程序详细地呈现于实例10中。所引述的组合物可能基于奶、乳清或植物基质(例如豆乳、米乳或其它谷物乳)的发酵。
[0138] 总的来说,可用作发酵剂培养物的基于奶发酵的制剂含有冻干细菌以及在每克7 10 7 8
制剂10cfu到10 cfu范围内的活细胞(包括至少10cfu/g,例如至少10cfu/g、例如至少
9 10
10cfu/g、例如至少10 cfu/g)、低于400mg/g的乳糖和在25mg/g到50mg/g范围内的乳果糖。
[0139] 本发明的另一方面是食品,其含有载剂物质和根据本发明的至少一种菌株、根据本发明的培养物、组合物或产物。优选载剂物质是选自以下各物的食品:奶、酸奶、奶酪、发酵乳、基于奶的发酵产品、基于肉的发酵产品、基于小麦的发酵产品、基于奶或小麦的散剂、婴儿食品、供人或动物使用的食品补充剂、淇淋、果汁、糖果、面包、蛋糕或口香糖。在优选6 11
实施方式中,本发明的微生物菌株以在约10cfu/g与约10 cfu/g之间的含量含于载剂物
6 9 7 9
质中,优选以在约10cfu/g与约10cfu/g之间、更优选以在约10cfu/g与约10cfu/g之间的含量含于载剂物质中。
[0140] 在另一方面,本发明提供供人和动物进食用的益生菌食品补充剂和医药组合物,其含有根据本发明的至少一种菌株,所述菌株仅与加氏乳杆菌K7组合或与加氏乳杆菌K7以及其它营养物质、益生菌、矿物质、维生素或其它食品或/和药学上可接受的物质组合。7 12
为了获得所述制剂,根据本发明,至少一种本发明菌株应以在10cfu/g与约10 cfu/g之间
8 12
的数量存在于载剂物质中,且加氏乳杆菌菌株K7应以在10cfu/g与约10 cfu/g之间的数
9 12 10
量存在于载剂物质中,优选以在10cfu/g与约10 cfu/g之间、更优选以在10 cfu/g与约
12
10 cfu/g之间的数量存在于载剂物质中。
[0141] 供人和动物使用的益生菌食品补充剂和药物制剂可以片剂、胶囊、颗粒剂、液体细菌悬浮液、糊剂或散剂的形式获得。此外,根据本发明,益生菌组合物可为选自由以下各物组成的群组内的任何可消化物质:奶、凝乳、基于发酵乳的产品、酸乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、基于奶的散剂、奶浓缩物、奶酪、乳脂干酪、饮料、冰淇淋、基于发酵小麦的产品、婴儿食品、片剂、液体细菌悬浮液、干燥口服补充剂、湿润口服补充剂、通过管子饲养动物的干燥食品或通过管子饲养的湿润食品,其已通过使用根据本发明的至少一种菌株以及加氏乳杆菌菌株K7来获得。
[0142] 在另一实施方式中,所提及的组合物另外含有食品和/或药学上可接受的物质和药学上可接受的载剂。
[0143] 在有用实施方式中,根据本发明的益生菌组合物适用于预防或治疗选自由以下组成的群组的疾病、综合症或病症:抗生素相关病症、胃肠炎、腹泻(包括旅行者腹泻或急性儿童腹泻)、乳糖不耐症、胃肠道感染和病原菌在胃肠道中的发展、炎症性肠道疾病(IBD)或其它免疫调节综合症。
[0144] 实例
[0145] 实例1:
[0146] 新颖菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的表征
[0147] 根据经典方法,将分离的菌株在M17(嗜热链球菌Selur 12)和MRS(德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19)琼脂上纯化3次,并通过基因分型来表征。
[0148] 除新颖菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Selur 6和Selur 19)和嗜热链球菌Selur T12之外,还使用从微生物培养物的收集物中获得的参考菌株(LMG 6901 德氏乳杆菌保加利T
亚亚种、LMG 6412 德氏乳杆菌德氏亚种)、从传统酸奶中分离的菌株(乳细菌:L7、L8和L12;
链球菌属细菌:ST4和ST7)和从一组从市场获得的各种酸奶中分离的菌株进行比较。
[0149] 在42℃下,将乳杆菌属菌株培育于MRS肉汤/MRS琼脂中,并将链球菌属菌株培养于M17肉汤/M17琼脂(默克公司(Merck),德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))中。使TM用 基因组DNA纯化套装(普洛麦格公司)或使用Maxwell 16系统(普洛麦格公司)
从新颖分离株的纯培养物和从参考菌株中分离基因组DNA。
[0150] 型特异性和亚型特异性PCR
[0151] 针对从所选菌株的纯培养物中提取的DNA执行PCR以用于型鉴定,所述PCR使用德氏乳杆菌型特异性引物Del I(5'-ACG GAT GGA TGG AGA GCA G-3')和Del II(5'-GCA AGT TTG TTC TTT CGA ACT C-3')以及嗜热链球菌型特异性引物Th I(5'-ACGGAA TGT ACT TGA GTT TC-3')和Th II(5'-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C-3')(替尔萨拉-蒂米斯耶尔维和阿拉托萨瓦,1997)。在使用德氏乳杆菌型特异性Del I和Del II引物的PCR之后获得预计约200bp的DNA片段(图1),且在使用嗜热链球菌型特异性Th I和Th II引物的PCR之后获得预计约260bp的DNA片段(图2)。尺寸较大的片段可能是二聚体,且缺少来自德氏乳杆菌德氏亚种收集物的另一亚型参考菌株(图1)。
[0152] 使用引物LB1(5'-AAAAAT GAA GTT GTT TAA AGT AGG TA-3')和LLB1(5'-AAGTCT GTC CTC TGG CTG G-3')执行德氏乳杆菌的亚型鉴定(托里亚尼等人,1999)。在使用德氏乳杆菌保加利亚亚种亚型特异性LB1和LLB1引物的PCR之后,获得预计约1065bp的DNA片段。在菌株德氏乳杆菌德氏亚种的另一亚型收集物中未观察到扩增产物(图3)。
[0153] 通过对经PCR扩增的16S rPHK可变区V1和V3测序来鉴定菌株
[0154] 为了另外证实型鉴定,对经PCR扩增的16S rPHK可变区V1和V3进行测序。如先前由科林等人(1991)所述,利用引物P1(5'-GCG GCG TGC CTA ATA CAT GC-3')和P4(5'-ATC TAC GCA TTT CAC CGC TAC-3')对德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Selur6和Selur19以及L7、L8、L12)、嗜热链球菌Selur 12菌株和加氏乳杆菌K7菌株的分离基因组DNA进行PCR扩增,获得660bp大的乳酸细菌16S rPHK的可变区V1和V3用于型的鉴定和分类。
通过加热阶段(在52℃下持续30秒)和延长阶段(在72℃下持续30秒)来修改PCR方案。
PCR产物用凝胶电泳纯化,且使用 凝胶和PCR净化系统(普洛麦格公司)从凝胶
中提取。由瑞士巴尔加赫的微合成实验室(Microsynth Lab)对PCR产物进行测序。随后,直接在NCBI数据库中通过BLAST搜索来分析所得序列,以确定与来自GenBank数据库的核苷酸序列的同源性,且随后确定型/亚型。
[0155] 乳杆菌属菌株Selur 6和Selur 19与德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC BAA-365或ATCC 11842的参考序列一致(99%),Selur 12菌株与嗜热链球菌LMG 18311的参考序列一致(100%)。再次证实了菌株K7与加氏乳杆菌ATCC 33323的参考序列一致(100%)。
[0156] 与先前从使用型特异性和亚型特异性PCR引物的PCR获得的结果(图1、图2和图3)一致,新颖菌株Selur 6和Selur 19被证实为德氏乳杆菌保加利亚亚种,菌株Selur12被证实为嗜热链球菌。
[0157] RAPD-PCR扩增
[0158] 在一系列PCR扩增中个别地使用数种寡核苷酸引物,目的是发现在德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株间划归RAPD特征以及区分新颖菌株和从酸奶工业生产所用的各种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的最大可能性。
[0159] ·M13(托里亚尼等人,1999)(5'-GAG GGT GGC GGT TCT-3')(应用2种版本的方案:由托里亚尼等人(1999)描述的方案——4mM MgCl2以及45℃的加热温度持续20秒;以及由罗塞蒂(Rossetti)和吉拉法(Giraffa)(2005)研制的方案——3mM MgCl2和42℃的加热温度持续20秒);
[0160] ·OPL-01(凡·里宁(Van Reenen)和迪克斯(Dicks),1996)(5'-GGC ATG ACC T-3′);
[0161] ·VALIO(廷屈宁(Tynkkynen)等人,1999)(5'-AGT CAG CCA C-3');
[0162] ·1254(托里亚尼等人,1999)(5'-CCG CAG CCAA-3');
[0163] ·KGT-70GC*(5'-AGC GGG CGT A-3')和
[0164] ·KGT-80GC*(5'-CGC GTG CCC A-3')(使用新颖方案:4mM MgCl2和以下循环程序:95℃持续2分钟,35个循环:95℃持续1分钟,37℃持续2分钟,72℃持续2分钟和最终72℃持续5分钟的延长)。
[0165] *寡核苷酸引物KGT-70GC和KGT-80GC由乳品学研究小组(卢布尔雅那大学生物技术院)的组长构建。
[0166] 扩增产物通过在1.5%凝胶和TAE缓冲液中电泳,用SYBR安全DNA凝胶着色剂(英杰公司分子探针公司(Molecular Probes,Invitrogen))着色且拍摄照片来进行分析。
[0167] 在所示菌株鉴别试条的数目、分布、强度上最适用的似乎是RAPD引物1254(图4)或KGT-70GC(图5)。
[0168] 实例2:
[0169] 新颖菌株在模拟胃肠道(GIT)条件中的存活率
[0170] 根据FSA(2005)执行各种测试。除菌株Selur 6、Selur 19和Selur 12之外,测试中还包括从儿童粪便中分离的菌株加氏乳杆菌K7和从传统酸奶中分离的菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种L7、L8和L12以用于比较。
[0171] 在模拟胃液(SGJ)中的存活率
[0172] 培养基模拟胃液(SGJ)是由蛋白胨水(7.5g/l)制成,使用1M盐酸调节到pH 1、pH 2、pH 3和pH 6.5。在实验之前,以终浓度达到15mg/L的量添加胃蛋白酶(300mg/L)的新鲜溶液。离心浓缩10ml的菌株过夜培育的培养物且再悬浮于1ml SGJ中。在T0时和在20分钟之后,将1ml样本稀释于蛋白胨水中且播种于MRS或M17琼脂上。在37℃下将培养皿培育48小时。结果以20分钟处理后的活细胞对数值与处理前的活细胞对数值之间的比率(r)形式呈现。根据结果,在pH 1下,在SCJ中处理20分钟后,仅菌株Selur 6和Selur
12以与菌株加氏乳杆菌K7类似的比率存活。在pH 2下,所有受试菌株中约一半的活细胞以及100%的加氏乳杆菌K7细胞存活。pH 3和pH 6.5仅导致嗜热链球菌Selur 12部分死亡(表1)。
[0173] 表1.德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株L7、L8、L12、Selur 19、Selur 6、加氏乳杆菌K7和嗜热链球菌Selur 12菌株在pH 1、pH 2、pH 3和pH 6.5的模拟胃肠液中历时20分钟后的存活率(r是两次测试的平均值)
[0174]菌株 rpH1 SDpH1 rpH2 SDpH2 rpH3 SDpH3 rpH6.5 SDpH6.5
L7 0.13 0.00 0.49 0.02 0.96 0.01 1.00 0.00
L8 0.20 0.01 0.55 0.01 1.01 0.01 1.00 0.01
L12 0.12 0.00 0.58 0.05 1.00 0.00 0.99 0.02
Selur 19 0.46 0.09 0.57 0.06 1.00 0.00 1.00 0.00
Selur 6 0.46 0.07 0.53 0.04 0.99 0.01 1.00 0.01
K7 0.54 0.00 1.00 0.01 0.99 0.01 0.99 0.01
Selur 12 0.00 0.00 0.55 0.01 0.86 0.03 0.96 0.06
[0175] 注解:
[0176] r-细胞在T20的平均值/细胞在T0的平均值
[0177] SD-标准差
[0178] r=1-细胞在20分钟的SGJ暴露后存活,
[0179] r>1-菌株生长,
[0180] r=0.5-培养中可获得的活细胞丧失一半
[0181] 在模拟上段肠液(UIJ)中的存活率
[0182] 模拟上段肠液(UIJ)是由悬浮于1×PBS缓冲液(pH 8)中的胆汁盐(1g/l)组成。在实验之前,添加新鲜获取的胰酶(1g/L)溶液。将1ml过夜培养的培养物或1g具有菌株的制剂接种于10ml UIJ中且在37℃下培育2小时。在T0和2小时时,将1ml悬浮液稀释且播种于MRS或M17琼脂上。在37℃下将培养皿培育48小时。在暴露于UIJ后,即刻(T0时)观察到纯培养物中所有受试菌株的细胞数目减少3或4个对数单位。在2小时处理之后,仅观察到对照菌株L12又减少了两个数量级。虽然嗜热链球菌Selur12并未立刻受到影响,但这一菌株在培育2小时后会死亡(表2)。当菌株生物质是通过在生物反应器中的奶发酵来获得(如实例10中所述)且具有菌株的冻干制剂暴露于UIJ时,菌株存活率更佳(表
3)。
[0183] 表2.菌株乳杆菌属L7、L8、L12、Selur 19、Selur 6、K7和菌株嗜热链球菌Selur12在模拟UIJ中于37℃下培育2小时后的存活率(log10值是两次测试的平均值)
[0184]菌株 含量(cfu/ml) SD T0 SD T2 SD
L7 7.40 0.27 3.77 0.53 3.29 0.26
L8 8.23 0.21 4.01 0.73 2.78 1.17
L12 8.70 0.08 5.41 0.46 3.76 0.20
Selur 19 8.43 0.54 5.54 0.90 5.17 0.84
Selur 6 7.85 0.42 3.92 0.71 4.03 0.12
K7 8.68 0.11 4.80 0.45 4.20 0.80
Selur 12 7.80 0.25 7.64 0.35 0.35 0.60
[0185] 注解:
[0186] 含量cfu/ml-细胞的初始数目(集落形成单位/毫升),以log10值表示
[0187] T0-开始(时间0)时的log10细胞数
[0188] T2-2小时培育后的log10细胞数
[0189] SD-标准差
[0190] 表3.基于奶的产品中的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6在模拟UIJ中于37℃下培育2小时后的存活率
[0191]制剂 Selur 6(cfu/g) T0(cfu/g) T2h(cfu/g)
1 8.27 7.51 6.05
2 9.17 8.33 6.69
3 9.10 8.24 6.89
[0192] 注解:
[0193] Selur 6cfu/g-细胞的初始数目(集落形成单位/克),以log10值表示
[0194] T0-开始(时间0)时的log10细胞数
[0195] T2-2小时培育后的log10细胞数
[0196] 实例3:
[0197] 新颖菌株的抗生素敏感性特征
[0198] 根据制造商的说明书,通过E-test法(AB Biodisk公司,瑞典索尔纳(Solna,Sweden))分析菌株对新抗生素的敏感性,所述E-test法使用试条来测定链霉素(SM)、庆大霉素(GM)、四环素(TC)、苄青霉素(ampycillin)(AM)、甲硝唑(MZ)、克林霉素(clindamycin)(CM)、氯霉素(chloramphenicol)(CL)、红霉素(EM)、利福平(rifampicyn)(RI)、万古霉素(VA)、头孢噻肟(CTL)、头孢克洛(CF)、阿莫西林(AC)、阿奇霉素(AZ)、克拉霉素(clarithromycin)(CH)或阿莫西林/克拉维酸(clavulanate)(XL)耐药性。如下制备具有细菌悬浮液的穆勒·韩丁琼脂(Mueller Hinton Agar,MH琼脂)平皿:从过夜的MRS肉汤培养物中获取具有约107cfu/ml细胞密度的生理溶液悬浮液,并将100μL悬浮液播种在补充有10%MRS的干燥MH琼脂上(克莱尔(Klare)等人,2005)。在37℃下在厌氧条件(针对乳酸细菌)或需氧条件(针对嗜热链球菌)中将平皿培育24小时,随后测定最小抑菌浓度(MIC)。使用由FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)以及丹尼尔森和温德(2003)报导的MIC值将菌株分类为敏感(s)或耐药(r)(表4到表7)。
[0199] 表4.利用 (AB Biodisk公司,瑞典)得到的加氏乳杆菌K7的MIC结果(展示2次测试的结果:第1次平行测试,第2次平行测试)。
[0200]
[0201] MICbpa:根据FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)的强制同型发酵乳杆菌属物种的微生物中断点。
[0202] MICbpb:根据丹尼尔森和温德(2003)的微生物中断点。
[0203] s/r:敏感/耐药
[0204] -:不适用
[0205] ?:未指定,因为这种抗生素的边界点尚未经说明
[0206] 表5.利用 (AB Biodisk公司,瑞典)得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur6的MIC结果(展示2次测试的结果:第1次平行测试,第2次平行测试)。
[0207]
[0208] MICbpa:根据FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)的强制同型发酵乳杆菌属物种的微生物中断点。
[0209] MICbpb:根据丹尼尔森和温德(2003)的微生物中断点。
[0210] s/r:敏感/耐药
[0211] -:不适用
[0212] ?:未指定,因为这种抗生素的边界点尚未经说明
[0213] 表6.利用 (AB Biodisk公司,瑞典)得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur19的MIC结果(展示2次测试的结果:第1次平行测试,第2次平行测试)。
[0214]
[0215]a
[0216] MICbp :根据FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)的强制同型发酵乳杆菌属物种的微生物中断点。b
[0217] MICbp :根据丹尼尔森和温德(2003)的微生物中断点。
[0218] s/r:敏感/耐药
[0219] -:不适用
[0220] ?:未指定,因为这种抗生素的边界点尚未经说明
[0221] 表7.利用 (AB Biodisk公司,瑞典)得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur12的MIC结果(展示2次测试的结果:第1次平行测试,第2次平行测试)。
[0222]
[0223]
[0224] MICbpa:根据FEEDAP专家小组报告(欧盟委员会,2005)的强制同型发酵乳杆菌属物种的微生物中断点。
[0225] MICbpb:根据丹尼尔森和温德(2003)的微生物中断点。
[0226] s/r:敏感/耐药
[0227] -:不适用
[0228] ?:未指定,因为这种抗生素的边界点尚未经说明
[0229] 实例4:
[0230] 新颖菌株的抗细菌活性
[0231] 测试所有菌株针对31种指示菌株的抗细菌活性,所述指示菌株包括各种乳酸细T菌、产气荚膜梭菌1b 1106、酪丁酸梭菌DSM 2637、蜡样芽孢杆菌CCM 2010、三种金黄色葡萄球菌菌株、耐久肠球菌CCM 5612、两种粪肠球菌菌株、屎肠球菌LMG 11423、单核细胞增生利斯特氏菌IM 372、无害利斯特氏菌ATCC 33090和大肠杆菌O8:K88。
[0232] 针对乳杆菌属菌株使用低葡萄糖浓度(0.2%wt/v)的MRS琼脂且针对菌株嗜热链球菌Selur 12使用M17琼脂来执行琼脂点测试,且将受试细菌培养物培育24小时,随后用指示微生物覆盖平皿。从5ml各种指示菌株的相应软琼脂(乳酸细菌用MRS,蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和利斯特氏菌属菌株用BHI,梭菌属菌株用RCM且肠球菌用M17)和50μl的18小时指示培养物获得覆盖琼脂。随后,在适于个别指示菌株的条件(蜡样芽孢杆菌和清酒乳杆菌(Lb.sakei)用30℃/需氧条件,乳酸细菌、肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和利斯特氏菌属菌株用37℃/需氧条件,梭菌属用37℃/厌氧条件)下将经覆盖平皿培育24小时。
[0233] 表8中仅呈现培育自至少一种受试菌株的指示菌株的结果。图6展示德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株Selur 6和Selur 19以及加氏乳杆菌K7菌株针对金黄色葡萄球菌ATCC29213的抗微生物活性。
[0234] 表8.新颖菌株(德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19、嗜热链球菌Selur 12)和加氏乳杆菌K7菌株的抗微生物活性
[0235]
[0236] 注解:
[0237] 1:在MRS琼脂平皿上执行的点测试
[0238] 2:在M17琼脂平皿上执行的点测试
[0239] -:未观察到抑制区域
[0240] +:抑制区域在0mm到2mm范围内
[0241] ++:抑制区域在2.5mm到5mm范围内
[0242] +++:抑制区域大于5.5mm
[0243] s:锐区域,其通常不仅由酸引起,而且也由其它抗微生物物质引起
[0244] n.d.:未定义
[0245] 实例5:
[0246] 新颖菌株的疏水性质
[0247] 根据维因德若拉和莱因海默(2003)通过测量有机相(正十六烷)与水相之间的细菌细胞分离来测定疏水性。随后使用下式计算细胞表面的疏水性(H%):
[0248] H%=(A0-A)/A0×100
[0249] 其中A0和A是用有机稀释剂提取之前和之后的相应光密度。除菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和Selur 19之外,测试中还包括从传统保加利亚酸奶中分离的菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种L7、L8和L12以及加氏乳杆菌K7以用于比较。
[0250] 确定了加氏乳杆菌K7和德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19的高细胞表面疏水性。所有其它菌株的疏水性都非常低且在12.8%到16.9%范围内(表9)。
[0251] 表9.新颖菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的疏水性
[0252]样本 A0 A H(%)
L7 1.002 0.857 14.47
L8 1.062 0.883 16.85
L12 1.069 0.932 12.82
Selur 19 1.023 0.221 78.40
Selur 6 0.948 0.812 14.35
K7 1.058 0.115 86.13
Selur 12 1.007 0.875 13.11
[0253] 实例6:
[0254] 菌株的β-半乳糖苷酶活性
[0255] 在使用合成化合物邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(OPNG)的维因德若拉和莱因海默(2003)方案之后,研究新颖菌株的β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性。β-Gal在细胞中的功能是将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,所以其可能用作源。合成化合物OPNG是在水解时产生半乳糖和黄色的邻硝基苯酚的底物。当OPNG相对于反应中的酶过量时,每单位时间产生的邻硝基苯酚与β-半乳糖苷酶的浓度成正比;因此,可通过黄色着色来确定酶浓度。确定每个样本在420nm和560nm下的吸收值,且如下计算β-Gal活性(穆勒单位(Muller unit)=β-Gal活性的标准化数量):
[0256]
[0257] t=反应时间(分钟)
[0258] v=所分析的培养物体积(毫升)
[0259] A420=黄色邻硝基苯酚的吸收值
[0260] A2560=反应混合物的吸收值(来自细胞残留物的耗散,当乘以1.75时约为在420nm下观察到的耗散)
[0261] A1560=是指分析前经冲洗的细胞悬浮液的细胞密度
[0262] 为了比较,测试中包括三种众所周知的益生菌菌株(鼠李糖乳杆菌ATCC 53103、干酪乳杆菌DN-11401和代田乳杆菌)(表10)。
[0263] 表10.新颖菌株的β-半乳糖苷酶活性
[0264]菌株 穆勒单位
德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6 3710.0±111.2
嗜热链球菌Selur 12 156.2±3.5
德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19 3158.6±17.2
加氏乳杆菌K7 9.4±2.3
鼠李糖乳杆菌ATCC 53103 5.6±0.8
干酪乳杆菌DN-11401 8.1±2.1
代田乳杆菌 37.9±1.2
[0265] 实例7:
[0266] 新颖菌株的粘附能力
[0267] 益生菌的一个重要功能性质是菌株粘附肠上皮细胞的能力。我们的实验使用Caco-2细胞作为体外模型。粘附研究含有以下步骤:
[0268] a)将人类结肠腺癌细胞系Caco-2(IZSBS BS TCL 87)以常规方式培育于具有L-谷氨酰胺、10%(体积分数)胎血清Fetalclone II(海克隆公司(Hyclone),德国(Germany))和50μg/mL硫酸庆大霉素(西格玛公司(Sigma),美国(USA))的达尔伯克改良伊格尔环境(Eagle environment modified after Dulbecco,DMEM)(西格玛公司,CAIII)中。在37℃下在10%CO2培养中进行培育。
[0269] b)为了分析粘附,将Caco-2细胞以104个细胞/孔的细胞浓度播种于24孔标准组织培养板中。细胞在汇合(此时其被视为完全分化)后维持32周。测试前至少24小时,将具有庆大霉素的DMEM环境替换为不具有抗生素的相同环境。通过将18小时的MRS培养物离心(3500g/10min)来获得乳酸和链球菌细胞,用PBS缓冲液(pH=7.3)冲洗一次并用分析中所用的缓冲液(不具有FBS和抗生素的DMEM,pH=7)冲洗一次。通过在600nm下测量吸收来使细胞密度达到0.5的光密度。离心沉淀细菌细胞,随后再悬浮于一半体积的DMEM(pH=7)中。通过对MRS(用于乳杆菌)或M17(用于链球菌)琼脂上的集落进行计数来确定每个实验的分析中所用的活细菌细胞的准确数目。
[0270] c)在24孔标准组织培养板中执行粘附分析。在冲洗后,向具有PBS(pH=7.3)、0.5mL乳杆菌或链球菌的DMEM悬浮液(含有来自1ml乳杆菌悬浮液的细胞,OD=0.5)的每个孔中添加两次Caco-2单层,并在37℃下在10%CO2气氛中培育30分钟。随后,用具有PBS的3倍冲洗液去除无关的细菌细胞。为了计算相关细菌,用1mL 0.05%TritonX-100将每个孔处理10分钟。将溶解的Caco-2细胞和细菌细胞的混合物放置于MRS琼脂(默克公司,德国)上。在37℃下在微需氧气氛中培育72小时后,执行计数。在10个孔中测试每种细菌菌株。结果是10个数据的平均值且呈现于图7中。
[0271] 另外也测试了德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19针对两种菌株(金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922)的竞争和排斥性质。基于琼脂点分析的结果选择后两种菌株——它们受到德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19抑制。将金黄色葡萄球菌ATCC29213和大肠杆菌ATCC 25922培育于BHI肉汤中且如针对乳杆菌描述般进行制备,差别仅在于在测试中应用与乳杆菌细胞悬浮液相比多稀释10倍的细胞悬浮液。(将悬浮液调节到OD=0.5,随后1:10稀释,离心;随后,将细胞再悬浮于适量DMEM中)。
[0272] 在竞争分析(乳杆菌+金黄色葡萄球菌;乳杆菌+大肠杆菌)中,向孔中的Caco-2细胞中添加乳杆菌,同时添加金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。为了测试乳杆菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌可能存在的排斥(乳杆菌/金黄色葡萄球菌;乳杆菌/大肠杆菌),将Caco-2细胞与乳杆菌一起培育,随后冲洗无关细胞,添加金黄色葡萄球菌或大肠杆菌,且随后培育30分钟。用0.05%Triton X-100(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.),美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA)将Caco-2细胞溶解5分钟,且相应地通过在BHI和VRB琼脂环境(默克公司)下对平板进行计数来计数粘附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(集落形成单位/孔)。BHI和VRB平板在30℃下培育24小时。
[0273] 与针对加氏乳杆菌K7和一些其它益生菌菌株(鼠李糖乳杆菌GG、约氏乳杆菌Lj1、罗伊氏乳杆菌ING 1、代田乳杆菌SHI)测定的粘附相比,德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur6和Selur 19以及嗜热链球菌Selur 12菌株的粘附总体上相当,或在计算粘附%(粘附的集落形成单位/孔除以添加的集落形成单位/孔,以%表示)的实例中甚至更佳(图7)。
[0274] 当测试大肠杆菌ATCC 25922与德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19之间或金黄色葡萄球菌ATCC 29213与德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19之间对于粘附Caco-2细胞的7 7
竞争时,添加1.75×10 集落形成单位/孔的Selur 19和2.22×10 集落形成单位/孔的
7
大肠杆菌(所添加的集落形成单位比率大肠杆菌:Selur 19=1.3:1)或1.75×10 集落形成
7
单位/孔的Selur 19和0.52×10 集落形成单位/孔的金黄色葡萄球菌(所添加的集落形成单位比率金黄色葡萄球菌:Selur 19=0.3:1)。
[0275] 当以接近的浓度向Caco-2细胞同时添加两种菌株时,德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19能够抑制大肠杆菌ATCC 25922的粘附。在排斥分析(Selur 19/大肠杆菌)中,大肠杆菌的粘附并未受到抑制。然而,Selur 19不能抑制金黄色葡萄球菌ATCC 29213的粘附,尽管乳杆菌浓度是大肠杆菌ATCC 25922的情况中所用乳杆菌浓度的约3倍(表11)。
[0276] 表11.德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur对大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213粘附能力的影响
[0277]
[0278] *粘附抑制(%)是通过将在大肠杆菌+Selur 19和Selur 19/大肠杆菌分析中获得的结果(粘附大肠杆菌的集落形成单位/孔)与单独大肠杆菌的粘附(100%)进行比较来计算。
[0279] **粘附甚至优于单独时。
[0280] 实例8:
[0281] 体外受Selur 6和K7刺激的THP-1小噬细胞细胞系的免疫反应
[0282] 测试Selur 6和K7影响巨噬细胞细胞系THP-1释放细胞因子的能力。鼠李糖乳杆菌GG和干酪乳杆菌DN-114001由于其众所周知的益生菌作用(包括调节免疫反应)而被用作阳性对照。
[0283] 程序如下:
[0284] 用TPA(佛波酯(phorbol esther))将细胞系THP-1刺激24小时,引起成熟巨噬细胞的分裂。冲洗分裂的细胞并在不具有TPA且补充有10%牛血清和抗生素的新鲜环境(RPMI-1640)中培育24小时。在第三天进行实验,其中添加乳杆菌、LPS(大肠杆菌O111:B4TM的脂多糖)且与巨噬细胞一起培育24小时。使用BD CBA(流式细胞微珠阵列(Cytometric BeadArray))人类炎症试剂盒,利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)测量六种不同细胞因子(IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNP和IL-12p70)的浓度。
[0285] Selur 6和K7菌株并不引起炎性细胞因子(IL-8、IL-6和TNF)从巨噬细胞细胞系THP-1分离,而所述细胞因子的分离是由添加LPS引起的。当同时应用LPS和Selur或K7菌株时,两种菌株都降低大部分炎性细胞因子的浓度。在IL-8层面下观察到最显著的细胞因子浓度变化(表12)。当个别添加Selur 6或K7时,观察到IL-1β(局部炎症介体)浓度略微增加,然而,这一作用并无统计学上显著性。所有的免疫反应都和对照菌株类似。IL-10和IL-12p70的浓度未受到任何受试菌株的影响。
[0286] 表12.由LPS引起的IL-8产量减少
[0287]细菌菌株 减少%
加氏乳杆菌K7 93
卷曲乳杆菌4/26* 86
德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6 99
鼠李糖乳杆菌GG 95
干酪乳杆菌DN 114001 99
[0288] *从猪肠中分离的菌株
[0289] 实例9:
[0290] 各种菌株组合的发酵能力
[0291] 测试各种菌株组合和发酵温度。组合过夜的纯培养物并以2%的量接种于无菌脱脂乳中,并在42℃和37℃下培育(仅组合S20+L89和S20+L89+K7)。在发酵期间,测量pH值,且在达到pH=4.6时停止发酵。发酵后,将发酵乳样本播种在MRS琼脂、M17琼脂和具有克林霉素(0.1mg/l)的MRS琼脂上用于对链球菌、乳杆菌和加氏乳杆菌K7进行选择性计数。
[0292] 与嗜热链球菌Selur 12和不同乳杆菌菌株(Selur 6、Selur 19和Selur 19+K7)以比率1:1或1:1:1(Selur 12+Selur 19+K7)一起培育的奶在42℃和37℃温度下(仅Selur12+Selur 19和Selur 12+Selur 19+K7)发酵期间的pH值变化展示于图8中。发酵后个别菌株的平均数(cfu/ml)呈现于表13中。
[0293] 表13.嗜热链球菌Selur 12、德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6或Selur 19以及加氏乳杆菌K7在发酵乳样本中的平均数(cfu/mL)
[0294]
[0295]
[0296] *在37℃下发酵
[0297] 实例10:
[0298] 制造生物质以及益生菌发酵剂培养物、食品补充剂和药物制剂的技术
[0299] 通过在18小时期间的培育将菌株制备成纯培养物(培育条件描述于表14中)。将过夜的肉汤培养物离心(10分钟,6000g),去除上清液,且将细胞以1/10的数量再悬浮于林9 10
格液(Ringer solution)中。1ml细胞悬浮液中的细胞浓度为约1×10 到1×10 个细胞。
相应地,将Selur 12、Selur 6和Selur 19的细胞悬浮液分别接种或组合接种于无菌复原脱脂乳粉中(1%接种物),且将加氏乳杆菌K7(1%接种物)接种于补充有0.4%酵母提取物(培芝公司(Biolife)412220;在奶灭菌前添加到奶中)的复原脱脂乳粉中,以产生母培养物,其可用作生物反应器中发酵的接种物。使Selur 12、Selur 6和Selur 19在42℃下且加氏乳杆菌K7在37℃下培育过夜。
[0300] 通过对奶、乳清或植物基质(例如豆乳、米乳或其它谷物乳)发酵来获得生物质。将奶用作基质的程序中的步骤如下:
[0301] a)为了建立培养基,将100g/L脱脂乳粉和4g/L酵母提取物稀释于饮用水中,并在115℃下在生物反应器中将混合物灭菌30分钟。灭菌后,使培养基冷却到适于各种菌株或菌株组合的温度。
[0302] b)通过发酵来产生生物质——技术参数
[0303] 实例1
[0304] 用1%的嗜热链球菌Selur 12的新鲜18小时培养物和1%的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 19的新鲜18小时培养物接种在生物反应器中建立的培养基。在42℃下执行培育1小时,此后,使温度增加到44℃,并在发酵期间在其后的3到4小时中,用NH4OH执行3次中和以使pH值维持在4.7与5.7之间。仅在中和期间搅拌培养基。在发酵末期,添加10%(体积/体积)低温保护液(200g/L无菌脱脂乳粉溶液),并将发酵培养基迅速冷却到22℃,并在这一温度下维持30分钟。随后,将培养物送去冻干。
[0305] 实例2
[0306] 用2%的加氏乳杆菌K7的新鲜18小时培养物接种在生物反应器中建立的培养基,并在37℃下执行16小时的发酵,其中不调节pH值。在发酵末期,添加10%(体积/体积)低温保护液(200g/L无菌脱脂乳粉溶液),并将生物反应器中的发酵培养基冷却到22℃并维持30分钟。随后,冻干发酵培养基。
[0307] 实例3
[0308] 用2%的加氏乳杆菌K7的新鲜18小时培养物接种在生物反应器中建立的培养基,并在37℃下执行发酵,其中不调节pH值。在37℃下发酵/培育16小时后,使pH值增加到5.7,用2%的德氏乳杆菌保加利亚亚种Selur 6或Selur 19的新鲜18小时培养物接种发酵肉汤。在播种之后,使温度增加到44℃并在发酵期间在其后的3到4小时中,用pH 5.0到pH 5.7的NH4OH执行3次中和。仅在中和期间搅拌发酵培养基。在发酵末期,添加10%(体积/体积)低温保护液(200g/L无菌脱脂乳粉溶液),并将生物反应器中的发酵肉汤冷却到22℃并维持30分钟。
[0309] a)冻干——技术参数
[0310] 液层深度——10mm;在4℃下冷却3小时;在40℃下冷冻90分钟;在35℃下加热直到蒸发结束(<6%水)。
[0311] 制剂含有活细胞浓度通常在107cf/g到1010cf/g范围内的脱水冻干细菌、低于400mg/g的乳糖或在25mg/g到50mg/g范围内的乳果糖。
[0312] 表14.菌株生长的最佳条件
[0313]
[0314] 产品实例(医药组合物):
[0315]
[0316]
[0317] 1.需要根据总混合物数量的百分比扩大每种组分的所需数量以制造批次。
[0318] 2.通过具有0.5mm筛孔尺寸的筛对所有组分过筛。
[0319] 3.混合:
[0320] 3.1馈入混合器中混合30分钟(除硬脂酸镁以外);
[0321] 3.2将预先筛选量的硬脂酸镁添加到项目3.2的混合物中并再混合10分钟。
[0322] 4.将制备好的混合物封装在容器中。
[0323] 参考文献
[0324] 1.基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool):http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
[0325] 2.B·博格维奇·马提亚斯奇 I·罗吉尔(Rogelj I).乳杆菌属K7——一种新颖的潜在益生菌菌株(Lactobacillus K7-ANew Potential Probiotic Strain).食品技术生物技术(Food Technol.Biotechnol.)2000;38:113-119。
[0326] 3.B·博格维奇·马提亚斯奇 M·那拉提(Narat M),M·佐里奇 两种加氏乳杆菌益生菌菌株对Caco-2细胞的粘附(Adhesion of two
Lactobacillus gasseri Probiotic Strains on Caco-2Cells).食品技术生物技术(Food Technol.Biotechnol.)2003;41:83-88。
[0327] 4.B·博格维奇·马提亚斯奇 S·斯托伊科维奇J·萨洛比尔(Salobir J),S·马洛维尔(Malovrh S),I·罗吉尔(Rogelj
I).在断乳仔猪中评估加氏乳杆菌K7和LF221菌株的潜在益生菌用途以及其在粪便中的检测(Evaluation of the Lactobacillus gasseri K7and LF221strains in weaned piglets for their possible probiotic use and their detection in the faeces).动物研究(Anim.Res.)2004;53:35-44。
[0328] 5.B·博格维奇·马提亚斯奇 M·那拉提(Narat M),M·佐里奇·彼得内尔 I·罗吉尔(Rogelj I).加氏乳杆菌K7抑制大肠杆
菌体外粘附于Caco-2细胞和离体粘附于猪空肠组织的能力(Ability of Lactobacillus gasseri K7to inhibit Escherichia coli adhesion in vitro on Caco-2cells and ex vivo on pigs’j ejunal tissue).国际食品微生物学杂志(Int.J.Food Microbiol.)
2006;107:92-96。
[0329] 6.B·博 格维奇· 马提 亚斯奇 M·科 曼·拉 耶B·泊科(Perko B),I·罗吉尔(Rogelj I).加氏乳杆菌对奶酪中酪丁酸
梭菌的抑制(Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in cheese by Lactobacillus gasseri).国际乳品杂志(Int.DairyJ)2007;17(2):157-166。
[0330] 7.A·乔普拉(Chopra A),VV·多菲德(Doiphode VV).阿育吠陀医学——核心概念、治疗原理和当前的相关性(Ayurvedic medicine-Core concept,therapeutic principles,and current relevance). 北 美 临 床 医 学(Med.Clin.North Am.)2002;86(1):75。
[0331] 8.A·坎热克·马恩里奇 B·博格维奇·马提亚斯奇 I·罗吉尔(Rogelj I).由加氏乳杆菌K7产生的细菌素的
遗传决定子染色体位置(Chromosomal location of the genetic determinants for bacteriocins produced by Lactobacillus gasseri K7).乳品研究杂志(J.Dairy Res.)
2003;70:199-203。
[0332] 9.M·丹尼尔森(Danielsen M),A·温德(Wind A).乳杆菌属亚种对抗微生物剂的敏感性(Susceptibility of Lactobacillus spp.to antimicrobial agents).国际食品微生物学杂志(Int.J.Food Microbiol.)2003;82:1-11。
[0333] 10.S·德尔加多(Delgado S),E·奥沙利文(O’Sullivan E),G·菲茨杰拉德(Fitzgerald G),B·梅奥(Mayo B).在新颖益生菌的寻找中针对来自人类胃肠道的乳杆菌属物种益生菌性质的消减筛选(Subtractive Screening for Probiotic Properties of Lactobacillus Species from the Human Gastrointestinal Tract in the Search for New Probiotics).食品科学杂志(J.Food Sci.)2007;65(8):M310-M315。
[0334] 11.M·埃利(Elli M),ML·卡莱加里(Callegari ML),S·法拉利(Ferrari S),E·贝西(Bessi E),D·卡蒂韦利(Cattivelli D),S·索尔蒂(Soldi S),L·莫雷利(Morelli L),NG·弗耶拉(Feuillerat NG),JM·安托万(Antoine JM).酸奶细菌在人类肠道中的存活率(Survival of Yogurt Bacteria in the Human Gut).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)2006;72(7):5113-5117。
[0335] 12.欧 盟 委 员 会(European Commission),2005.欧 盟 委 员 会(European Commission),FEEDAP专家小组对评估细菌对具有人类或家畜重要性的抗生素的耐药性中所用准则更新的意见(Opinion of the FEEDAP Panel on the updating of the criteria used in the assessment of bacteria for resistance to antibiotics of human or veterinary importance),欧洲食品安全局(EFSAJ.)2005;223:1-12。
[0336] 13.FAO/WHO,2002.食品中益生菌的评估指南(Guidelines for the evaluation of probiotics in food).安大略伦敦(London,Ontario):联合国粮食及农业组织和世界卫生组织工作组报告(Food and Agriculture Organization of United Nations and World Health Organization Working Group Report)。
[0337] 14.FSA的最终技术报告项目编号G01022(Final Technical report for FSA project ref G01022).评估人类肠道中的益生菌效应:微生物方面(An evaluation of probiotic effects in the human gut:microbial aspect),FSA 2005,编号G01022,2-22。
[0338] 15.R·加西亚-阿尔比亚克(García-Albiach),M·何塞(JoséM),P·费利佩(de Felipe P),S·安古洛(Angulo S),M-I·莫罗西尼(Morosini M-I),D·布拉沃(Bravo D),F·巴克罗(Baquero F),R·坎波(del Campo R).含有德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的酸奶在人类肠道微生物群中的分子分析(Molecular analysis of yogurt containing Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus in human intestinal microbiota).美国临床营养学杂志(Am.J.Clin.Nutr.)2008;87:91-96。
[0339] 16.F·瓜内尔(Guarner F),G·佩迪贡(Perdigon G),G·科尔捷(Corthier G),S·萨米宁(Salminen S),B·科勒茨科(Koletzko B),L·莫雷利(Morelli L).是否应将酸奶培养物视为益生菌?(Should yoghurt cultures be considered probiotic?)英国营养学杂志(Br.d.Nutr.)2005;93:783-786。
[0340] 17.I·克莱尔(Klare I),C·孔斯塔伯尔(Konstabel C),S·穆勒-伯特林(Müller-Bertling S),R·瑞斯布罗德(Reissbrodt R),G·于斯(Huys G),M·万坎内特(Vancanneyt M),J·斯因斯(Swings J),H·古森斯(Goossens H),W·维特(Witte W).针对乳杆菌、片球菌、乳酸球菌和双歧杆菌的微量稀释抗生素敏感性测试评估新颖肉汤培养基(Evaluation of New Broth Media for Microdilution Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacilli,Pediococci,Lactococci,and Bifidobacteria).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)2005;71(12):8982-8986。
[0341] 18.N·科林(Klijn N),AH·韦尔坎普(Weerkamp AH),WM·德沃斯(De Vos WM).使用经聚合酶链式反应扩增的16S rRNA可变区和特异性DNA探针鉴定嗜温性乳酸细菌(Identification of Mesophilic Lactic Acid Bacteria by Using Polymerase Chain Reaction-Amplified Variable Regions of 16S rRNA and Specific DNA Probes).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)1991;57(11):3390-3393。
[0342] 19.H·科尔霍宁(Korhonen H),A·费兰图(Pihlanto A).生物活性肽:生产和功能性(Bioactive peptides:Production and functionality).国际乳品杂志(Int.Dairy J.)2006;16:945-960。
[0343] 20.MJ·库伦(Kullen MJ),RB·萨诺茨基-道斯(Sanozky-Dawes RB),DC·克劳威尔(Crowell DC),TR-科南哈马尔(Klaenhammer TR).使用16S rRNA基因的可变区DNA序列在嗜酸乳杆菌复合物中快速且准确地鉴定细菌(Use of the DNA sequence of variable regions of the 16S rRNA gene for rapid and accurate identification of bacteria in the Lactobacillus acidophilus complex).应用微生物学杂志(J.Appl.Microbiol.)2000;89(3):511-516。
[0344] 21.DD·马特(Mater DD),L·布雷蒂尼(Bretigny L),O·费尔梅斯(Firmesse O),MJ·弗洛雷斯(Flores MJ),A·莫热内(MogenetA),JL·布列松(BressonJL),G·科尔捷(Corthier G).嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种在消费酸奶的健康志愿者的胃肠传送时存活(Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus survive gastrointestinal transit of healthy volunteersconsuming yogurt).欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol Lett.)
2005;15(2):185-7。
[0345] 22.H· 迈 泽 尔(Meisel H). 乳 蛋 白 源 肽 的 概 述(Overview on Milk Protein-derived Peptides).国际乳品杂志(Int.Dairy J.)1998;8(5/6):363-373。
[0346] 23.T·光冈(Mitsuoka T).膳食改变肠道菌群和肠道环境的显著性(Significance of dietary modification of intestinal flora and intestinal environment).生物科学与微小植物(Biosci.Microflora),2000;19:15-25。
[0347] 24.I·罗吉尔(Rogelj I),B·博格维奇·马提亚斯奇加氏乳杆菌LF221和K7——从分离到应用(Lactobacillus gasseri LF221and K7-from isolation to application).生物学(Biologia),2006;61:761-769。
[0348] 25.L·罗塞蒂(Rossetti L),G·吉拉法(Giraffa G).利用M13生成的RAPD-PCR指纹数据库快速鉴定乳品乳酸细菌(Rapid Identification of Dairy Lactic Acid Bacteria by M13-generated RAPD-PCR Fingerprint Databases).微生物学方法杂志(J.Microbiol.Meth.)2005;63:135-144。
[0349] 26.NP·沙阿(Shah NP).功能性培养物和健康益处(Functional cultures and health benefits).国际乳品杂志(Int.Dairy J.)2007;17:1262-1277。
[0350] 27.GW·史密瑟斯(Smithers GW).乳清和乳清蛋白——从‘沟槽’到'黄金’(Whey and whey proteins-From‘gutter-to-gold’).国际乳品杂志(Int.Dairy J.)2008;18:695-704。
[0351] 28.GW·坦诺克(Tannock GW),A·替尔萨拉-蒂米斯耶尔维(Tilsala-Timisjarvi A),S·罗德通(Rodtong S),J·纳(Ng J),K·蒙罗(Munro K),T·阿拉托萨瓦(Alatossava T).利用16S-23S rRNA基因的基因间间隔区序列比较来鉴定分离自胃肠道、青贮和酸奶的乳杆菌(Identification of Lactobacillus Isolates from the Gastrointestinal Tract,Silage,and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)1999;65(9):4264-4267。
[0352] 29.A·替尔萨拉-蒂米斯耶尔维 T·阿拉托萨瓦(Alatossava T).从16S-23S rRNA基因间序列中开发寡核苷酸引物以通过PCR来鉴
定不同乳品和益生菌乳酸细菌(Development of Oligonucleotide Primers from the
16S-23S rRNA Intergenic Sequences for Identifying Different Dairy and Probiotic Lactic Acid Bacteria by PCR).国际食品微生物学杂志(Int.J.Food Microbiol.)
1997;35:49-56。
[0353] 30.S·托里亚尼(Torriani S),G·扎帕罗利(Zapparoli G),F·德拉利奥(Dellaglio F).使用基于PCR的方法快速鉴别德氏乳杆菌保加利亚亚种和德氏乳杆菌乳亚种(Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L.delbrueckii subsp.lactis).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)1999;65(10):4351-4356。
[0354] 31.S·廷屈宁(Tynkkynen S),R·萨托卡里(Satokari R),M·萨雷拉(Saarela M),T·马蒂拉-桑德霍尔姆(Mattila-Sandholm T),M·萨克塞林(Saxelin M).鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌菌株分型中核糖分型、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场凝胶电泳 的比较(Comparison of ribotyping,randomly amplified polymorphic DNA analysis,and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L.examplei strains).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)
1999;65:3908-3914。
[0355] 32.CA·凡·里宁(Van Reenen CA),LMT·迪克斯(Dicks LMT).对随机扩增多态性DNA(RAPD)-PCR的数值分析评估作为鉴别植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的方法(Evaluation of Numerical Analysis of Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)-PCRas a Method to Differentiate Lactobacillus plantarum and Lactobacillus pentosus).当代微生物学(Cur.Microbiol.)1996;32:183-187。
[0356] 33.GG·维因德若拉(Vinderola CG),JA·莱因海默(Reinheimer JA).乳酸发酵剂和益生菌:益生菌特征和生物屏障耐药性的“体外”比较研究(Lactic acid starter and probiotic bacteria:a comparative"in vitro"study of probiotic characteristics and biological barrier resistance).国际食品研究(Food Res.Int.)2003;36:895-904。
[0357] 34.M·佐里奇·彼得内尔 不同表达系统中加氏乳杆菌K7和加氏乳杆菌LF221菌株的细菌素复合物活性:博士生论文(Aktivnost bakteriocinskih kompleksov sevov Lactobacillus gasseri K7 in Lactobacillus gasseri LF221 v ekspresijskih sistemih:doktorska disertacija=Activity of bacteriocin
complex of Lactobacillus gasseri K7and Lactobacillus gasseri LF221strains in different expression systems:doctoral dissertation). 卢 布 尔 雅 那
(Ljubljana),2007:138p。
QQ群二维码
意见反馈