过敏是指一种后天获得的对正常无害的物质产生有害免疫反应的潜力。过 敏反应引起的症状有瘙痒、咳嗽、气喘、喷嚏、泪溢、发炎和疲乏等等。人们 认为过敏反应包括早期特异性免疫反应和晚期炎症反应。据报道过敏原(如花 粉和螨尘)通过刺激高亲和力的免疫球蛋白(IgE)受体形成早期之过敏反应。 例如，当肥大细胞和嗜碱性粒细胞受到过敏原刺激的时候，释放组胺和细胞因 子。从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放出来的细胞因子随后聚集炎症细胞形成 晚期之过敏反应(见Serafin，WE，In Goodman and Gillmans，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，Hardmen，Ja；Limbird，L，Eeds， McGraw-Hill，N.Y.，659-682，1996)。同样有报道，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、 淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血小板的汇集可引发恶性的炎症反应循环。晚期之 过敏反应增强最初的免疫反应，这转而促使释放更多的炎症细胞(Townley，RG and Okada，C，Annals of Allergy，68：190-196，1991)。
现已有多种疗法用于治疗过敏症状，其中有抗过敏剂和组胺H-受体拮抗剂 (抗组胺)。组胺拮抗剂投与用于拮抗组胺的作用，这些组胺是在过敏原刺激下 由肥大细胞释放出来的。组胺拮抗剂可减轻由组胺作用于目標组织引起的充血、 瘙痒和肿胀等症状，并且可预防或缓和许多由肥大细胞去颗粒引起的症状。但 是，同时也有报道，组胺拮抗剂和一些副作用如警觉性降低、反应迟钝和嗜睡 有关联(Goodman and Gillman，The Pharmacological Basis of Therapeutics， Eighth Edition，Pergamon Press，New York，pages 575-588，1990)。 有关联(Goodman and Gillman，The Pharmacological Basis of Therapeutics， Eighth Edition，Pergamon Press，New York，pages 575-588，1990)。
还有一些报道认为可通过调节细胞因子来治疗过敏。其中，有人发现γ-干 扰素(IFN-γ)可抑制细胞因子在Th2淋巴细胞中的过度表达，特别是抑制IL-4 的分泌以降低B淋巴细胞的增殖。另外，IFN-γ还可以刺激Th1的免疫反应， 抑制IgE的合成(Sareneva T等人，Influenza Avirus-induced IFN-α/β and IL-18 synergistically enhance IFN-γ gene expression in human T cells.J Immunol 160：6032-6038，1998；Shida K等人，Lactobacillus casei inhibits antigen-induced IgE secretion through regulation of cytokine production in murine splenocyte culture.Int Arch Allergy Immunol 115：278-287，1998)。由于IFN-γ能抑制B细胞增殖和IgE分泌，所以人们相 信其对于治疗过敏有效。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，其通常用于工业食品发酵。近年的研究证明，乳 酸菌可以刺激细胞分泌IFN-γ(Blum S等人，Intensinal microflora and the interaction with immunocompetent cells.Antonie Van Leeuwenhoek 67：199-205，1999；Contractor NV等人，Lymphoid hyperplasia，autoimmunity and compromised intestinal intraepithelial lymphocyte development in colits-free gnotobiotic IL-2-deficient mice.J Immunol 160：385-394，1998； Delneste Y等人，Functional foods：Mechanism of action on immuncompetent cells.Nutr Rev 56：593-98，1998；Haller D等人，Non-pathogenic bacteria elicit a different cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-culture.Gut 47：79-87，2000)。人们发现某些特殊的乳 酸菌如乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)和短乳酸杆菌 (Lactobacillus brevis subsp.)亚种可以刺激来自小鼠和人的血液淋巴细胞 分泌IFN-γ(Arunachalam K等人，Enhancement of natural immune function by dietary consumption of Bifidobacterium lactis(HN 019).Eur J Clin Nutr 54：1-5，2000；Kishi A等人，Effect of the oral administration of Lactobacillus brevis subsp.Coagulans on interferon-α producing capacity in humans.J Am Coll Nutr 15：408-412，1996)。同样也有报道说 乳酸菌能刺激来自人或小鼠的淋巴细胞分泌白细胞介素-12(IL-12)，而IL-12 是一种T细胞刺激因子，可以刺激T细胞和NK细胞分泌IFN-γ(Pouwels PH 等人，The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization： development and preliminary characterization of vector systems for targeted delivery of antigens.J Biotechnol 44：183-92，1996)。
异位性皮炎是儿童最常见的一种过敏症。治疗异位性皮炎的传统方法是局 部类固醇疗法。但症状很难根除而且停药后经常复发。益生菌疗法被认为是一 种较为安全有效的治疗异位性皮炎的方法。人们提出，某些乳酸菌对于预防及 /或治疗异位性皮炎很有效，如鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus)GG菌株 (Kalliomaki，M.，S.Salminen，等人，Probiotics and prevention of atopic disease：4-year follow-up of a randomised placebo-controlled trial. Lancet 361(9372)：1869-71，2003；Kirjavainen，P.V.，S.J.Salminen， 等人，Probiotic bacteria in the management of atopic disease： underscoring the importance of viability.J Pediatr Gastroenterol Nutr 36(2)：223-7，2003；Dreborg，S.，The implications of nomenclature.Ann Allergy Asthma Immunol 89(6 Suppl 1)：83-5，2002；Pessi，T.，Y.Sutas， 等人，Interleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG.Clin Exp Allergy 30(12)：1804-8，2000； Isolauri，E.，T.Arvola，等人，Probiotics in the management of atopic eczema.Clin Exp Allergy 30(11)：1604-10，2000)、鼠李糖乳酸杆菌19070-2 菌株和洛德乳酸杆菌(L.reuteri)DSM 122460菌株的组合(Rosenfeldt，V.，E. Benfeldt，等人，Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis.J Allergy Clin Immunol 111(2)：389-95，2003)， and Bifidobacterium lactitis Bb-12(Isolauri，E.，T.Arvola，等人，2000)。

本发明提供一种新颖的微生物菌株，即发酵乳酸杆菌菌株GM-090。
本发明另一方面提供经分离之微生物菌株发酵乳酸杆菌菌株GM-090在生产 刺激IFN-γ分泌的药物的用途。
本发明再一方面还提供分离出的微生物菌株发酵乳酸杆菌菌株GM-090在生 产治疗过敏的药物的用途。
附图说明
图1.所示为GM-090放大1000倍的显微照片。
图2所示为用P2作引物获得的多种发酵乳酸杆菌菌株的RAPD图谱，其中M 为100个碱基对大小的DNA标准品(第一道为发酵乳酸杆菌GM-090；第二道为 发酵乳酸杆菌ATCC 9338；第三道和第四道分别为发酵乳酸杆菌ATCC 11739和 ATCC 14931)。
图3所示为用P3作引物获得的多种发酵乳酸杆菌菌株的RAPD图谱，其中 M为100个碱基对大小的DNA标准品(第一道为发酵乳酸杆菌GM-090；第二道 为发酵乳酸杆菌ATCC 9338；第三道和第四道分别为发酵乳酸杆菌ATCC 11739 和ATCC 14931)。
图4所示为多种发酵乳酸杆菌菌株细胞壁蛋白的SDS-PAGE图谱，其中M为 蛋白标准品(第一道为发酵乳酸杆菌GM-090；第二道为发酵乳酸杆菌ATCC 9338； 第三道和第四道分别为发酵乳酸杆菌ATCC 11739和ATCC 14931)。
图5所示为PHA、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)和发酵乳酸 杆菌分别刺激小鼠脾细胞产生IFN-γ的效应图(第一道为空白对照(naive)； 第二道加PHA；第三道加副干酪乳酸杆菌；第四道加发酵乳酸杆菌GM-090)。
图6所示为实例7中所描述病人的治疗效果照片(a：治疗前.b：治疗 后)。
图7所示实例7中所描述病人的治疗效果照片(a：治疗前.b：治疗后)。
图8所示为实例8中所描述病人的治疗效果照片(a：治疗前.b：治疗 后)。

本发明提供一种新颖的微生物菌株发酵乳酸杆菌菌株GM-090，该菌株能刺 激IFN-γ的分泌及/或治疗过敏。该菌株GM-090于2004年7月19日被保藏到 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC M 204055。
发酵乳酸杆菌菌株GM-090是从人胃肠道分离出来的。
发酵乳酸杆菌菌株GM-090的细菌学特征如下：
(a)形态特征
(1)细胞形状和大小：杆状细菌，经MRS肉汤培养基37℃过夜培养后， 在显微镜下可观察到其具有杆样形状及圆形端部。
(2)运动性：不能运动
(3)鞭毛：无
(4)孢子形成：不形成孢子
(5)革兰氏染色反应：阳性
(b)培养特征
(1)培养基：MRS肉汤培养基(DIFCO0881)(见表1)，最终pH为6.5 ±0.2。
表1：
    组分     G/L     蛋白胨     10.0     牛肉抽提物     10.0     酵母抽提物     5.0     葡萄糖     20.0
    聚山梨醇酯80     1.0     柠檬酸铵     2.0     醋酸钠     5.0     硫酸镁     0.1     硫酸锰     0.05     磷酸氢二钾     2.0
(2)培养条件：37℃，厌氧条件
(c)生理特征
(1)API 50 CHL检测：API 50 CHL系统用于鉴定乳酸菌。通过对一系列 酶反应的分析来确定具有乳酸的特征。用API 50 CH试剂条和API 50 CHL 培养基(APISystems SA，Montalieu Vercieu，France)来进行碳水化合 物发酵试验以鉴定发酵乳酸杆菌菌株GM-090。发酵乳酸杆菌菌株GM-090的 API 50 CHL检测结果见表2。
表2：
0 -  GLY -  ERY - DARA - LARA - RIB + DXYL + LXYL - ADO - MDX - GAL + GLU +  FRU +  MNE + SBE - RHA - DUL - INO - MAN - SOR - MDM - MDG - NAG -  AMY -  ARB - ESC - SAL - CEL - MAL + LAC + MEL + SAC - TRE - INU -  MLZ -  RAF + AMD - GLYG - XLT - GEN - TUR - LYX - TAG - DFUC - LFUC -  DARL -  LARL - GNT + 2KG - 5KG -                                                                                 检测项(Tests 菌种类别                          相似率(％Id)                      T                                                                                 against) 发酵乳酸杆菌                      99.9                                           0.92                            1 短乳酸杆菌                        0.1                                            0.55                            3 发酵乳酸杆菌                               1检测(test(s))                                  相似率(Against) 蔗糖                                      (SAC)                                           86％ 短乳酸杆菌                                 2：3检测(test(s))                               相似率
L-阿拉伯糖     (LARA)    99％ 蔗糖          (SAC)     93％ D-甘露糖      (MNE)      7％
(d)基因特性
根据Yeung等人提出的方法用乳酸杆菌种特异性引物来鉴定GM-090菌株的 种特异性(Yeung，P.S.M.，Sanders，M.E.，Kitts，C.L.，Cano，R.，Tong， P.S.，Species-specific Identification of Commercial Probiotic Strains. J.Diary.Sci.85：1039-1051，2002)。16s rDNA序列见SEQ ID NO：1。同时 实施随机扩增多态DNA(RAPD分析)。其证明GM-090属于发酵乳酸杆菌，但是 有自己特异性的RAPD图谱。由此可见GM-090是一种新颖的发酵乳酸杆菌菌株。
(e)GM-090菌株的细胞壁蛋白质
和其它常见的发酵乳酸杆菌菌株相比，GM-090菌株的细胞壁蛋白有着特定 的组成结构，其SDS-PAGE图谱见图4。
本发明提供一种在一患者中刺激IFN-γ的分泌及/或治疗过敏的方法，该 方法包括投予该患者一含有GM-090菌株的组合物。
通常可在麦芽威士忌发酵过程中发现发酵乳酸杆菌菌株(van Beek，S.and Pries，F.G.Evolution of the lacticacid bacterial community during malt whisky fermentation：a polyphasic study.Appl Environ Microbiol 68(1)： 297-305，2002；及Simpson，K.L.等人，Characterization of lactobacilli from Scotch malt whisky distilleries and description of Lactobacillus ferintoshensis sp.nov.，a new species isolated from malt whisky fermentations.Microbiology 147：1007-1016，2001)。给兔子静脉注射盐水 洗过的发酵乳酸杆菌可以诱导兔子发生过敏反应(Jackson，D.E.，C.R. Howlett，等人，Induction of hypersensitivity reactions to Lactobacillus fermentum and lipoteichoic acid in rabbits.Part II.Int Arch Allergy Appl Immunol 65(3)：304-12，1981；Jackson，D.E.，G.D.Jackson等人， Induction of IgM immunological memory to lipoteichoic acids in rabbits. Part I.Int Arch Allergy Appl Immunol 65(2)：198-202，1981；Jackson，D. E.，A.J.Wicken等人，Immune responses to lipoteichoic acid：comparison of antibody responses in rabbits and mice.Part II.Int Arch Allergy Appl Immunol 65(2)：203-11，1981)。另外发现，与对照组相比，发酵乳酸杆菌的 CP34菌株对降低血清中的抗原特异性IgE水平有显著作用(Ishia，Y.等人， Decrease in ovalbumin specific IgE of mice serum after oral uptake of lactic acid bacteria.Biosci Biotechnol Biochem 67(5)：951-957，2003)。
本发明一个令人惊奇的发现是GM-090菌株能刺激IFN-γ的分泌。在本发明 的动物模型中，GM-090菌株能使体外培养的脾细胞分泌IFN-γ的水平提高，其 作用甚至优于阳性对照PHA。
根据本发明，发酵乳酸杆菌可用于在一患者中治疗过敏，尤其是对皮炎效 果较佳，对异位性皮炎效果更佳。此处“过敏”特指由IFN-γ介导的过敏反应。 这些过敏性疾病包括鼻炎、鼻窦炎、哮喘、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、 结膜炎、荨麻疹、湿疹、皮炎、过敏性休克、血管性水肿、过敏性头疼和偏头 疼以及某些肠胃病。
根据本发明实例，用GM-090菌株治疗皮炎可使其病况得到显著改善。此外， 症状几乎消失。
根据本发明，该乳酸菌菌株可以是活菌株或者是失活菌株。比如，可将活 的菌株以加热的方式或者以其它杀死乳酸菌株的常用方法来灭活以得到失活乳 酸菌。冻乳酸菌较佳经冻干。
本发明的另一方面提供一种包含发酵乳酸杆菌菌株GM-090的组合物。
根据本发明，该乳酸菌株可添加在人们常用的药物组合物、营养补充品、 食品、保健食品、医疗食品或其组分中。在本发明的一较佳实施例中，可将乳 酸菌株以食品形式投用，例如以通过在牛奶中发酵乳酸菌株而制成的凝固乳制 品形式。如此制成的食品可以方便婴儿或儿童食用。
本发明再一方面提供分离出的微生物菌株发酵乳酸杆菌GM-090在生产刺激 IFN-γ分泌的药物的用途。
本发明另一方面还提供分离出的微生物菌株发酵乳酸杆菌GM-090在生产治 疗过敏的药物的用途。
以下所给出的实例仅用于说明解释而非意欲限制本发明的范围。
实例1：GM-090发酵乳酸杆菌菌株的分离
用内窥镜采集一片人胃组织，在2毫升乳酸菌MRS肉汤培养基(DIFCO 0881)中培养。将含有该组织的肉汤转入乳酸菌选择性琼脂培养皿中，并在37 ℃培养一天。挑出培养皿上的单菌落并进行革兰氏染色。然后选择革兰氏染色 阳性菌落。通过无性繁殖得到被称为GM-090发酵乳酸杆菌菌株的单菌落。
实例2：革兰氏染色
按照MERCK公司(Darmstadt，Germany)提供的整套革兰氏染色液的随附说 明进行革兰氏染色。细菌首先用结晶紫染色1分钟，然后用卢戈尔氏溶液(Lugol’ s solution)处理1分钟。以蒸馏水小心冲洗试样约5秒。然后将玻片置于脱 色液(溶液3或4)中翻转10-15秒进行脱色，脱色至不再有颜料脱落，此时 涂片显灰蓝色。再用蒸馏水小心冲洗试样约5秒。用溶液5即番红溶液完全覆 盖玻片1分钟，最后用蒸馏水小心冲洗试样约5秒。待试样干燥后在显微镜下 观察。
镜检结果见图1。
实例3：16s rDNA序列测定
按照Yeung等人(2002)的方法用乳酸杆菌种特异性引物来鉴定GM-090菌株 的种属。简单地说，用引物PAF(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，SEQ ID NO：2)和536 R(5′-GTA TTA CCG CGG CTG CTG-3′，SEQ ID NO：3)来扩增16s rDNA 基因的5′区。用iCycler(Bio-RadLaboratories Inc.)PCR仪来进行PCR扩增， 扩增按下列程序进行：94℃预培育2分钟后，再进行40个反应循环，循环条件 为94℃45秒，55℃45秒，72℃60秒。循环反应完成后，再于72℃下维持反应 7分钟，然后冷却至4℃。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，洗脱后自动测 序。从基因库(National Center of Biotechnology information， www.ncbi.nlm.nih.gov)查找与该些寡聚核苷酸序列同源的序列。
其结果显示发酵乳酸杆菌GM-090菌株的16s rDNA序列与发酵乳酸杆菌PL 9006菌株的16S核糖体RNA基因同源。
实例4：随机扩增多态DNA(RAPD分析)
用RAPD分析来区别发酵乳酸杆菌GM-090菌株和其它的发酵乳酸杆菌菌株， RAPD分析按照Angelis等人提出的方法进行(Angelis，M.D.，Corsetti，A.， Tosti，N.，Rossi，J.，Corbo，M.R.，and Gobbetti，M.，Characterization of Non-Starter Lactic Acid Bacteria from Italian Ewe Cheeses Based on Phenotypic，Genotypic，and Cell Wall Protein Analyses.Appl.Environ. Microbiol.67：2011-2020，2001)。使用两种引物，P2(5′-ATG TAA CGC C-3′， SEQ ID NO：4)和P3(5′-CTG CGG CAT-3′，SEQ ID NO：5)。用iCycler(Bio-Rad Laboratories Inc.)PCR仪进行PCR。PCR程序包括45个以下的循环：94℃变性 1分钟，35℃退火1分钟，72℃延伸反应2分钟。在循环之前先在94℃下变性4 分钟，循环后再于72℃下延伸反应5分钟。PCR产物用1.5％(重量体积比)的 琼脂糖凝胶电泳进行分离，溴化乙锭(0.5毫克/毫升)染色后通过紫外荧光检 测DNA。
用P2作引物得到的RAPD图谱见图2，用P3作引物得到的RAPD图谱见图 3。结果证明GM-090的RAPD图谱和常见发酵乳酸杆菌菌株的RAPD图谱不同。 由此可知，GM-090是一种新颖的发酵乳酸杆菌菌株。
实例5：GM-090细胞壁蛋白的提取及分析
细胞壁蛋白的提取参照Angelis等人(2001)提出的方法。简短地说，将 嗜温性乳酸杆菌于MRS肉汤中培养24小时后收集，用0.05M Tris-HCl(pH7.5， 含0.1M CaCl2)缓冲液清洗两次，并重新悬浮于1毫升该缓冲液中，使其浓度 为A600吸收值为10.0。8000×g离心5分钟，加入1.0毫升提取缓冲液(pH 8.0) 即可从离心沉淀物中提取细胞壁蛋白，提取缓冲液含0.01M EDTA、0.01M NaCl 及2％(重量/体积)SDS。悬浮液先置室温60分钟，再于100℃加热5分钟， 然后于4℃ 11,600×g离心10分钟。取上清液进行SDS-PAGE分析，考马斯亮 蓝(Comassie blue)染色。
结果显示GM-090为一种发酵乳酸杆菌菌株，见图4。
实例6：GM-090刺激IFN-γ的分泌
为测量小鼠脾细胞产生的细胞因子量，用补加10％胎牛血清的RPMI 1640 培养基(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，USA)培养取自BALB/c小鼠的脾脏 细胞。取100微升已培养好的脾细胞悬液(含细胞4×105个/毫升)加至96孔 板中，并在不含或含各种乳酸杆菌下培养。另加入10微克/毫升的PHA(Sigma， St.Louis，MO，USA)作为阳性对照孔。96孔板置于37℃ CO2培养箱中，5％CO2 培养48小时。脾细胞培养物上清液中的IFN-γ含量用商用ELISA试剂盒(OptEIA Mouse IFN-γ Set，BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA.，USA)测 得。
结果显示，GM-090刺激IFN-γ分泌的作用优于阳性对照物PHA，见图5。
实例7：GM-090用于治疗过敏(1)
现年6岁的一女孩最初于3个月大时被确诊为异位性皮炎。当时脸上有湿 疹。由于后来的二次感染，症状进一步恶化。初期培养物显示为金黄色葡萄球 菌感染。经过7天的抗生素治疗后，以水解婴儿配方奶粉喂养。然而在其后的 五年中，感染现象仍不断发生。另外，其脸部及四肢的关节区域同时出现苔藓 样硬化和湿疹。虽然她在不同医疗中心经过几位著名的皮肤病学专家诊治，但 症状很难根除且经常反复发作。该病例局部使用类固醇具有一定疗效，但一旦 停药症状立即复现。临床医生曾测量过她的IgE水平(免疫球蛋白(Ig)E：IgE 总量1120IU/毫升，螨特异性IgE＞100KU/毫升)。
病人使用冻干的GM-090进行治疗，2×109CFU/天。
三周后，所有症状均已消失。病人照片见图6和7。
实例8：GM-090用于治疗过敏(2)
另一病人在其小学期间不时出现以下症状：每当起床时会出现鼻塞及眼睛 发痒。症状持续大约五年后，她的脸上、脖子及四肢出现红斑疹，有些皮肤甚 至出现苔藓样硬化。虽然她接受了各地很多皮肤病学专家的诊断，采用了类固 醇治疗，但症状只是略有好转而且在停药(类固醇)后又迅速恶化。在过去的 一年中她又接受了他克莫司(protopic)治疗。虽然这种治疗方法可以控制病 情，她仍然在寻找替代疗法。在家族病史中她的父母均有过敏性鼻炎的病史。
病人每天早晚于饭前使用冻干的GM-090。
经过14天的治疗后，病情有了很大改善，而且症状几乎消失。(临床测量 免疫球蛋白(Ig)E的数据：IgE总量580IU/毫升，螨特异性IgE＞50KU/毫 升)。病人照片见图8。
尽管用图形解释和说明了本发明的具体实施例，但所属技术领域的技术人 员仍可对其作出不同的更改及改进。本发明不欲受所例示的特定形式的限制， 而且所有不背离本发明精神和范围的改进方案都涵盖在随附权利要求书所界定 的范围中。
                                     序列表
<110>景岳生物科技股份有限公司
<120>新颖微生物菌株酦酵乳酸杆菌GM-090及其刺激IFN-γ分泌及/或治疗过敏之用途
<130>无
<160>5
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>510
<212>DNA
<213>酦酵乳酸杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(498)..(498)
<223>n为a，c，g，or t
<400>1
cgaacgcgtt ggcccaattg attgatggtg cttgcacctg attgattttg gtcgccaacg     60
agtggcggac gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccag aagcggggga caacatttgg    120
aaacagatgc taataccgca taacaacgtt gttcgcatga acaacgctta aaagatggct    180
tctcgctatc acttctggat ggacctgcgg tgcattagct tgttggtggg gtaacggcct    240
accaaggcga tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg gccacaatgg gactgagaca    300
cggcccatac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatgggc gcaagcctga    360
tggagcaaca ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa    420
gaacacgtat gagagtaact gttcatacgt tgacggtatt taaccagaaa gtcacggcta    480
actacgtgcc agcagcgngg gttaatacaa                                     510
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引子
<400>2
agagtttgat cctggctcag                                                      20
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引子
<400>3
gtattaccgc ggctgctg                                                        18
<210>4
<211>10
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引子
<400>4
atgtaacgcc                                                                 10
<210>5
<211>9
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引子
<400>5
ctgcggcat                                                                   9