두유 발효물

두유 발효물 {SOY MILK FERMENTED SUBSTANCE}

본 발명은 두유를 유산균으로 발효함으로써 얻어지는 두유 발효물에 관한 것이다.

대두는 밭의 고기라고도 불리고, 풍부한 식물성 단백질을 포함하는 식품 소재이며, 두유는 그 대두로부터 열수 등에 의해 단백질, 그 밖의 성분을 용출시키고, 섬유질을 제거하여 얻어지는 유상의 음료이며, 저콜레스테롤, 고단백의 건강 소재로서 이전부터 주목받고 있다. 또한, 마찬가지로 건강 소재로서 주목받고 있는 유산균으로 두유를 발효시킴으로써, 대두와 유산균의 상승 효과에 의한 건강 기능도 기대되고 있다. 그러나, 대두 독특한 불쾌한 냄새 또는 대두 냄새나 유산균에 의한 발효 냄새나 절임 냄새가 과제로 되어, 좀처럼 시장에 침투하고 있지 않은 것이 현상이다.

한편, 우유에 있어서는, FAO/WHO 합동 식품 규격 위원회(코덱스 위원회)가 정한 CODEX(이하, 「CODEX」라 함)에 의해 요구르트용 유산균으로서 정의되어 있는 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus)와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)가, 공생 관계를 구축하는 것은 이전부터 알려져 있다. 또한, 이 공생 관계를 구축함으로써 양 균종의 생육이 단독 발효에 비해 비약적으로 향상되고, 결과적으로 풍미가 좋은 요구르트로 되는 것도 알려져 있다.

그러나, 두유에서는 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 그대로 접종하여 발효해도 우유와 같이 충분히 발효가 진행되지 않고, 두유에 유당을 첨가하는 등의 조작을 가하지 않으면 락트산 생성에 의해 물성이 양호한 카드를 형성시키거나 양호한 풍미를 생성하는 것이 어려운 것이 알려져 있다. 이것은 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스가 두유에 포함되는 수크로스를 자화할 수 없어, 정상적으로 유산 발효를 행하거나 균수를 늘릴 수 없는 것이 주된 요인이다.

지금까지, 유산 발효에 의해 풍미 양호한 두유 발효물을 제조하는 방법은, 다수 보고되어 있다. 예를 들어, 락토바실러스·아시도필루스, 락토바실러스·카제이, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스, 락토코커스·락티스, 스트렙토코커스·서모필러스의 5종의 유산균을 혼합시키고, 또한 무조정의 두유에 당분이나 지질, 젤라틴을 첨가함으로써 풍미를 개선하는 방법이 있다(특허문헌 1 참조).

또한, 락토바실러스·플란타룸 및 락토코커스·락티스의 2종의 유산균으로 발효함으로써 풍미를 개선하는 방법(특허문헌 2 참조)이나, 락토바실러스·아시도필루스, 또는, 락토바실러스·카제이 중 어느 하나와 비피도박테리움속 유산균 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 적어도 3균종으로 발효시키고, 풍미가 개선된 두유 발효물을 얻는 방법(특허문헌 3 참조), 그리고 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스와 락토바실러스·엑시도필루스로부터 선택되는 균주 1종과 락토바실러스·카제이 및 스트렙토코커스·서모필러스의 3종의 유산균으로 두유를 발효시키는 방법(특허문헌 4 참조) 등, 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스에 또 다른 균종을 첨가하거나, 혹은 이들 균� �을 다른 균종으로 치환함으로써 두유 중의 유산 발효를 촉진하고, 풍미를 개선하는 다양한 보고가 있다. 또한, 입맛을 개선하기 위해 두유에 당 및 유산균과 프로테아제를 동시에 첨가하여 발효하는 방법(특허문헌 5 참조)도 보고되어 있다.

그러나, 이들 종래 기술에 있어서는, CODEX에서 정의된 요구르트용 유산균인 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 2종류의 유산균뿐만 아니라, 상기 유산균과는 다른 종류의 유산균을 사용하여 두유를 발효하므로, 그 유산균 유래의 잡미나 절임 냄새 등이 발생해 버리거나, 우유를 발효한 요구르트와는 크게 다른 풍미나 물성으로 되어 버리는 문제가 있었다. 또한, 3종류 이상의 유산균을 사용함으로써, 각 균주의 제조·관리가 매우 번잡해지고, 제조 로트의 품질의 유지가 용이하지 않게 되는 문제나, 대두 유래 이외의 식품 원료를 조합하거나, 유산균 접종과 동시에 효소를 첨가하는 등, 가공상의 번잡함이 더해지는 것과 같은 문제도 있다.

따라서 본 발명이 해결하려는 과제는, 두유를 원료로 하는 발효물을 제조할 때에, 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus)와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)만을 유산균 혼합 스타터로 하는 경우라도, 원료인 두유에 효소 처리나 추출 처리 등의 가공 처리를 실시하지 않고, 또한 당원 등의 원료를 첨가하는 일 없이, 우유를 유산 발효한 요구르트와 동등한 풍미나 매끄러운 물성을 갖는 두유 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행한 결과, CODEX에서 정의된 요구르트용 유산균인 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 2종류의 유산균을 조합한 유산균 혼합 스타터에 있어서, 두유 중에서 프럭토스를 0.4g/L 이상 축적할 수 있는 스트렙토코커스·서모필러스와, 동 스트렙토코커스·서모필러스와 조합한 때에 0.4g/L 이상의 D-락트산을 생성할 수 있는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 조합함으로써, 두유 환경에 있어서도 젖 환경과 거의 동일한 정도로 2종류 양쪽의 균이 생육하고, 우유를 유산 발효한 요구르트에 가까운 풍미나 물성을 갖는 두유 발효물이 얻어지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, (1) 두유에 접종하고 배양한 때에, 발효물 중에 0.4g/L 이상의 프럭토스를 축적 가능한 스트렙토코커스·서모필러스와, 두유에 접종하여 배양한 때에, 발효물 중에 0.4g/L 이상의 D-락트산을 축적 가능한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 포함하는 유산균 혼합 스타터를 사용하여 얻어진 두유 발효물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 (2) 두유에 접종하고 배양한 때에, 발효물 중에 0.4g/L 이상의 프럭토스를 축적 가능한 스트렙토코커스·서모필러스와, 두유에 접종하여 배양한 때에, 발효물 중에 0.4g/L 이상의 D-락트산을 축적 가능한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 포함하는 유산균 혼합 스타터를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 두유를 원료로 하고, 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스만을 유산균 혼합 스타터로 하는 경우라도, 원료인 두유에 효소 처리나 추출 처리 등의 가공 처리를 실시하지 않고, 또한 당원 등의 원료를 첨가하는 일 없이, 우유를 유산 발효한 요구르트와 동일한 정도로 풍미·물성이 우수한 두유 발효물을 제공할 수 있다. 본 발명의 요구르트 상태 두유 발효물은, 대두 발효물 특유의 불쾌 냄새를 느끼게 하지 않으므로, 대두와 유산균의 상승 효과에 의한 우수한 기능을 갖는 건강 소재로서 보급하는 것을 기대할 수 있다.

도 1은 육종한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(K1581주)와, 시판 혼합 스타터로부터 단리하여 선발한 스트렙토코커스·서모필러스주 또는, 육종한 스트렙토코커스·서모필러스주(K1580주)를 혼합하여 두유에 접종하고, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산량을 나타낸 도면이다.
도 2는 육종한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주(K1585주)와 시판 혼합 스타터로부터 단리한 스트렙토코커스·서모필러스주를 혼합하여, 두유에 접종하고, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산량을 나타낸 도면이다.
도 3은 육종한 스트렙토코커스·서모필러스주(K1580주)와, 시판 혼합 스타터로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 혼합하여 두유에 접종하고, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산량을 나타낸 도면이다.
도 4는 육종이나 단리 조작, 선발 조작 등을 행하고 있지 않은 시판 혼합 스타터(스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 혼합 스타터)만으로 발효(42℃, 24시간)하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산량을 나타낸 도면이다.
도 5는 무조정 두유를 MF 한외 여과막에 의해 투과한 액에 1.0％(w/v)의 프럭토스를 첨가한 두유막 투과액을 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 단독으로, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 발효액 중의 D-락트산 생성량을 측정한 도면이다.
도 6은 무조정 두유를 MF 한외 여과막에 의해 투과한 액에 1.0％(w/v)의 프럭토스를 첨가하고, pH를 5.0에 맞춘 산성 두유막 투과액을 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 단독으로, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 발효액 중의 D-락트산 생성량을 측정한 도면이다.
도 7은 시판 혼합 스타터(스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 혼합 스타터)로부터 단리한 스트렙토코커스·서모필러스주를 42℃, 24시간 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 프럭토스 농도를 측정한 도면이다.
도 8은 시판 혼합 스타터 YO-MIX305, 499로부터 단리한 스트렙토코커스·서모필러스주와 동일하게 시판 혼합 스타터 YO-MIX505, 511, 863으로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 1:1로 혼합하고, 42℃, 24시간 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산 생성량을 측정한 도면이다.
도 9는 육종한 유산균인 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 단독으로 두유를 42℃에서 발효한 때의 경시적인 수크로오스 농도의 추이를 나타낸 도면이다.
도 10은 육종한 유산균인 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 단독으로 두유를 42℃에서 발효한 때의 경시적인 프럭토스 농도의 추이를 나타낸 도면이다.
도 11은 육종한 유산균인 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 육종한 유산균인 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주로 두유를 42℃에서 공발효한 때의 경시적인 프럭토스 농도의 추이를 나타낸 도면이다.
도 12는 시판 혼합 스타터 또는 육종주의 혼합 스타터, 혹은 선발주의 혼합 스타터에서 발효하여 얻은 두유 발효물의 입도 분포의 측정 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 두유 발효물은, 두유에 효소 처리 등 특별한 가공 처리를 가하지 않고, 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 2종류의 유산균만으로 발효함으로써 얻어진다.

본 발명에서 사용하는 두유로서는, 종래의 방법에 의해 얻어지는 것이라면 어느 것이어도 되고, 시판되고 있는 두유를 사용해도 된다. 예를 들어, 탈피한 대두 또는 탈지 대두를 물에 침지하여 팽윤시킨 두류를 증자·마쇄하여 얻어지는 액체를 사용할 수 있고, 상기 액체로부터 비지를 제거한 액체를 사용하는 것이 맛이나 식감의 관점에서 보다 바람직하다. 또한, 전립 대두분, 탈지 대두분 등을 용해한 액을 사용해도 된다. JAS 규격으로는, 대두 고형분 8.0％ 이상의 것은 두유라고 정의되고, 조제 두유는 6.0％ 이상, 두유 음료는 4.0％ 이상이라고 정의되어 있지만, 대두 고형분량에 대해서는, 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 스트렙토코커스·서모필러스는 두유에서 증식 가능하고, 단독으로 두유 중에 증식시킨 경우에 두유 중의 수크로스를 분해하여 글루코오스와 프럭토스를 생성하고, 그 중 프럭토스를 0.4g/L 이상의 농도로 축적하는 성질을 갖는 것이 요구된다.

락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스는 두유에 포함되는 수크로스를 당원으로 하여 자화할 수 없지만, 스트렙토코커스·서모필러스가 수크로스를 글루코오스와 프럭토스로 분해함으로써, 그들을 자화하여 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스도 증식할 수 있다.

스트렙토코커스·서모필러스는 수크로스를 분해하면서, 스스로 분해 산물을 당원으로서 도입하지만, 특히 분해력이 높은 균주를 선발하면 발효물 중에 분해된 당이 축적된다. 그리고 그와 같이 하여 축적된 프럭토스의 양이 0.4g/L를 초과하는 두유 발효물 중에서는, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스는 잘 증식하고, 그리고 증식 과정에 있어서 다양한 대사 산물을 생성하여 요구르트의 풍미를 형성하는 데 있어서 큰 역할을 담당할 수 있다.

이와 같이 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 대사는 두유를 요구르트 상태로 발효하는 데 있어서 중요하지만, 그 대사에 의해 생성되는 D-락트산은, L-락트산만을 생성하는 스트렙토코커스·서모필러스에서는 생성되지 않으므로 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 대사 활동을 나타내는 측정 용이한 지표로서 활용할 수 있다. 본 발명에 있어서 그 D-락트산량이 발효물 중에서 0.4g/L 이상 축적되는 발효물은 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스가 활발하게 대사 산물을 생성한 결과, 특히 풍미가 좋아지는 것을 발견한 것이다.

상기 성질을 갖는 유산균은, 우유의 요구르트 제조에 사용되는 유산균이나 환경 중의 동종의 유산균으로부터 선발할 수 있다. 유산균을 육종하는 경우에는, 일반적으로 널리 사용되는 수단은 모두 이용할 수 있다. 예를 들어, 자외선을 사용한 변이의 유발이나 약제를 사용한 변이의 유발, 두유를 주성분으로 하는 배지에서의 계대 배양 등을 행함으로써, 두유 중에 0.4g/L 이상의 프럭토스를 축적하는 스트렙토코커스·서모필러스나 그들과 동시에 배양한 때에 두유 중에서의 0.4g/L 이상의 높은 D-락트산 생성량을 나타내는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 얻는 것이 가능하다.

유산균의 육종을 행하는 데 있어서는, 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 동시에 접종하여, 발효 온도를 30∼45℃, 보다 바람직하게는 32∼42℃에서, 발효 시간을 4∼24시간을 행함으로써 산 생성력이 높은 주를 육종할 수 있다.

D-락트산을 생성하는 유산균은 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스이지만, 두유 중의 당의 주성분인 수크로오스를 자화할 수 없으므로, 단독으로는 증식할 수 없고, 사멸해 버리는 경우도 있다. 한편, 스트렙토코커스·서모필러스는 수크로오스를 자화하여 두유 중인 정도로 생육할 수 있는 것이 많고, 그때에 동 유산균이 수크로오스를 분해함으로써 글루코오스와 프럭토스가 생성되고, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 공존시키면, 그들을 자화하여 서서히 생육할 수 있도록 되는 것을 발명자들은 발견하였다.

락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 증식시키기 위해, 두유에 당을 첨가하여 보완시키는 것도 생각되지만, 당의 보완만으로는 충분한 양의 D-락트산 생성을 나타내지 않는 경우도 있고, 당의 보완 관계 이외에 2개의 주의 상성이 존재하므로, 프럭토스를 축적하는 스트렙토코커스·서모필러스와 함께 배양한 때에 D-락트산량으로서 0.4g/L 이상 생성할 수 있는 대사가 활발한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 선택하는 것이 중요하다.

다수 존재하는 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 중에서 적절한 주의 조합을 선발 혹은 육종함으로써, 두유 중에서 양 균종이 모두 활성화되고 요구르트 상태의 양호한 풍미나 물성을 형성할 수 있지만, 스트렙토코커스·서모필러스가 수크로스를 활발히 자화하는 결과, 동 균이 생성하는 L-락트산도 발효물 중에 생성된다.

요구르트 상태의 양호한 두유 발효물을 얻기 위해서는, D-락트산뿐만 아니라, 스트렙토코커스·서모필러스에 의해 생성되는 L-락트산도 포함되어 있을 필요가 있다.

본 발명에서 사용하는 유산균은, 상술한 바와 같이 선발 혹은 육종에 의해 얻을 수 있고, 본원 명세서의 실시예에 있어서는, 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주의 조합, 스트렙토코커스·서모필러스 K1584주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1585주의 조합, 스트렙토코커스·서모필러스 다니스코사 주(혼합 스타터 YO-MIX499로부터 단리한 주)와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 다니스코사 주(혼합 스타터 YO-MIX505, 511, 863으로부터 단리한 주)의 조합 등이 해당한다. 본 발명의 두유 발효물은, 상기 성질을 갖는 유산균을 사용함으로써 얻을 수 있으므로, 실시예에 기재된 균주에 한정되는 것은 아니다.

두유를 유산균으로 발효하는 방법에 관해서는, 일반적으로 알려져 있는 요구르트나 유산균 음료의 제법에 기초하여 행할 수 있고, 예를 들어 스트렙토코커스·서모필러스를 1×10 ⁴ ∼1×10 ⁸ cfu/mL, 보다 바람직하게는, 1×10 ⁵ ∼1×10 ⁷ cfu/mL, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스를 1×10 ² ∼1×10 ⁷ cfu/mL, 보다 바람직하게는, 1×10 ³ ∼1×10 ⁵ cfu/mL로 되도록 두유에 접종하고, 발효 온도 30∼45℃, 보다 바람직하게는 37∼42℃에서, 4∼24시간의 범위 내에서 발효하면 되고, 발효 형태는 특별히 제한되는 것은 아니다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 요구르트 상태 두유 발효물은, D-락트산을 0.4g/L 이상 함유하는 것을 특징으로 하고 있고, 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 대사가 모두 활발해짐으로써, 지금까지 시판되고 있는 유산균 혼합 스타터를 그대로 사용한 경우에는 얻어지지 않은 락트산 생성량을 나타내고, 각각의 균종에서 유래되는 방향 성분을 갖는 요구르트 상태의 풍미나 물성이 좋은 두유 발효물로 된다. 또한, 대두 유래 이외의 원료를 첨가하지 않고 발효하는 것이 가능하므로, 부원료 유래의 맛에 영향을 받는 일도 없다. 또한, 본 발명의 두유 발효물은 범용성이 높고, 요구르트 상태 식품뿐만 아니라, 조미료나 치즈, 음료 형태 등, 대두 관련 식음료의 어느 제품에도 응용하는 것이 가능하다.

또한, 본 실시 형태에서는 스트렙토코커스·서모필러스 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 2종류만을 사용하여 유산 발효물을 제조하는 예를 설명하였지만, 이것에 한정되지 않고, 스트렙토코커스·서모필러스 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 유산 발효나 얻어지는 두유 발효물의 풍미에 영향을 미치지 않는 한, 본 발명에 나타내는 2종의 유산균에 더하여 스트렙토코커스·서모필러스 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 이외의 유산균을 병용해도 된다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는, 그들 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 시판되고 있는 유산균 혼합 스타터를 사용한 두유 발효물의 D-락트산량의 측정

(1) 유산균 혼합 스타터

유산균 혼합 스타터로서, 시판되고 있는 요구르트 제조용의 유산균 혼합 스타터(다니스코사제, 스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주의 양쪽을 포함하는 동결 건조품. 이하, 「시판 혼합 스타터」라 하는 경우가 있음)를 사용하였다. 이 시판 혼합 스타터는, 스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주의 성질에 따라, 다양한 것이 존재한다. 구체적으로는, YO-MIX300, YO-MIX305, YO-MIX496, YO-MIX499, YO-MIX505, YO-MIX511, YO-MIX863, YO-MIX883, YO-MIX885, YO-MIX401, YO-MIX421, YO-MIX495, YO-MIX601이다(모두 제품 번호).

(2) 발효 조건 및 측정 방법

두유 발효 원액에는, 시판되고 있는 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)를 사용하였다. 한편, 각 유산균 혼합 스타터의 동결 건조물을 10mL의 LM17 배지(Terzaghi 및 Sandine, Appl.Microbiol.29, 807∼813, 1975)에서 배양하고, 배양액을 0.9％ NaCl 용액으로 원심·세정하고, 10mL의 0.9％ NaCl 용액에 재현탁하였다. 이 조제한 현탁액을 상기 두유 발효 원액에 1.0％(v/v) 접종하고, 42℃, 24시간 발효하였다. 그리고, 24시간 경과 후에 발효를 종료하고, 두유 발효물 중의 D-락트산량을, 효소 전극법[오지 게이소꾸사(王子計測社)제, 바이오센서 BF-5]에 의해 측정하였다.

(3) 결과

결과를 도 4에 나타낸다. 24시간 발효시켜 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 측정한 바, D-락트산은 거의 생성되지 않고, 원하는 요구르트 상태의 풍미를 갖는 두유 발효물이 얻어지지 않는 것을 확인하였다(도 4).

2. 공시 균주의 단리, 선발 및 육종

(1) 스트렙토코커스·서모필러스

시판 스타터(모두 스트렙토코커스·서모필러스 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 2균종을 포함함)로부터, 스트렙토코커스·서모필러스주만을 단리하였다. 단리한 주는, 시판 스타터의 제품 번호에 기초하여, 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus:St.) 45주, St. 40주, St. 505주, St. 511주, St. 863주, St. 883주, St. 885주, St. 300주, St. 305주, St. 495주, St. 496주, St. 499주, St. 187주, St. 205주, St. 207주, St. 208주, St. 211주, St. 401주, St. 421주, St. 492주, St. 601주로 하였다.

상기한 단리주 중, 단리 균주의 종균을 1％의 비율로 두유에 접종하고, 37∼45℃에서 12∼24시간 배양한 때에 발효물 중에 0.4g/L 이상의 프럭토스를 축적 가능한 스트렙토코커스·서모필러스주를 선발하고, 선발주로 하였다. 구체적으로는, 스트렙토코커스·서모필러스(St.) 40주, St. 511주, St 863주, St. 885주, St. 496주, St. 499주, St. 187주, St. 205주, St. 401주, St. 421주, St. 492주, St. 601주를 선발주로 하였다.

또한, 네덜란드에 거점을 두는 NIZO food research사가 보유하는 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus) St. 2333주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) Lb. 185주를 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 계대 배양을 행하였다. 두유 발효물을 1％(v/v)의 비율로 반복하여 두유에 접종하고, 37∼45℃에서 12∼24시간 배양하였다. 약 700세대, 계대 배양을 실시하고, 얻어진 두유 발효물로부터 단리한 스트렙토코커스·서모필러스주를 K1580주로 하였다.

또한 동일하게 NIZO food research사가 보유하는 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus) St. 131주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) Lb. 194주를 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 계대 배양을 행하였다. 두유 발효물을 1％(v/v)의 비율로 반복하여 두유에 접종하고, 37∼45℃에서 12∼24시간 배양하였다. 약 700세대, 계대 배양을 실시하고, 얻어진 두유 발효물로부터 단리한 스트렙토코커스·서모필러스주를 K1584주로 하였다.

(2) 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스

상기 시판 스타터로부터, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주만을 단리하였다. 단리한 주는, 시판 스타터의 제품 번호에 기초하여, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus:Lb.) 300주, Lb. 305주, Lb. 401주, Lb. Lb. 421주, Lb. 492주, Lb. 495주, Lb. 496주, Lb. 499주, Lb. 505주, Lb. 511주, Lb. 601주, Lb. 863주, Lb. 883주, Lb. 885주로 하였다.

상기한 단리주 중, 상술한 스트렙토코커스·서모필러스의 선발주 1.0％와 함께, 상기 단리주의 종균 1.0％를 두유에 접종하여 37∼45℃에서 12∼24시간 배양한 때에, 발효물 중에 0.4g/L 이상의 D-락트산을 축적하는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 선발하고, 선발주로 하였다. 구체적으로는, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lb.) 492주, Lb. 505주, Lb. 511주, Lb. 601주를 선발주로 하였다.

또한, NIZO food research가 보유하는 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus) St. 2333주와 락토바실러스·불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) Lb. 185를 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 계대 배양을 행하였다. 두유 발효물을 1％(v/v)의 비율로 반복하여 두유에 접종하고, 37∼45℃에서 12∼24시간 배양하였다. 약 700세대, 계대 배양을 실시하고, 얻어진 두유 발효물로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 K1581주로 하였다.

또한 동일하게 NIZO food research가 보유하는 스트렙토코커스·서모필러스(Streptococcus thermophilus) St. 131과 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) Lb. 194를 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 계대 배양을 행하였다. 두유 발효물을 1％(v/v)의 비율로 반복하여 두유에 접종하고, 37∼45℃에서 12∼24시간 배양하였다. 약 700세대, 계대 배양을 실시하고, 얻어진 두유 발효물로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 K1585주로 하였다. 마찬가지로 St. 131과 Lb. 185의 계대 배양으로부터 얻은 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 K1583주로 하였다.

3. 두유 발효물 중의 D-락트산량의 비교

(1) 공시 균주

시판 혼합 스타터로부터 단리한 유산균 및 선발·육종한 유산균(상기 2 참조)을 사용하여 두유를 발효시키고, 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 측정·비교하였다.

(2) 발효 조건 및 측정 방법

발효 원료는, 성분 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)를 사용하였다. 이 발효 원료에, 스트렙토코커스·서모필러스주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주로 이루어지는 유산균 혼합 스타터를 구성한 것을 첨가하고, 42℃, 24시간 발효하였다. 발효 종료 후, 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 효소 전극법(오지 게이소꾸사제, 바이오센서 BF-5)으로 측정하였다.

(3) 결과

도 1은 각종 스트렙토코커스·서모필러스주와, 육종주인 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주로 유산균 혼합 스타터를 구성하고, 발효하여 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주 대신에, 동일하게 육종주인 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1585주를 유산균 혼합 스타터로 하고, 마찬가지의 조건에서 두유를 발효하고, 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이, 동일한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주라도, 조합하는 스트렙토코커스·서모필러스주에 의해 D-락트산 생성량이 다르므로, 스트렙토코커스·서모필러스주의 특징에 의해서도 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주의 대사능이 변화하는 것을 확인하였다. 특히, 프럭토스의 생성량이 0.4g/L 이상으로 되는 것을 지표에 선발한 주에서는 현저하게 D-락트산 생성량이 높아지는 경향이 있었다.

도 3은 육종주인 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와, 시판 스타터로부터 단리한 각 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주로 유산균 혼합 스타터를 구성하고, 이것을 두유에 접종하고, 마찬가지의 조건에서 발효하여 얻은 두유 발효물 중의 D-락트산량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3에 나타내는 바와 같이, 육종한 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 사용한 경우라도, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에 의해 그 D-락트산량의 생성에 큰 차이가 있는 것을 확인하였다.

도 1, 도 2, 도 3, 도 4에서 나타내는 바와 같이, 스트렙토코커스·서모필러스주, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주 모두, 시판되고 있는 유산균 혼합 스타터를 그대로 사용한 발효에 의해 얻은 두유 발효물 중에서는, D-락트산이 그다지 생성되지 않는 것에 반해, 스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주의 양쪽을 선발 또는 육종한 주로 치환함으로써, 0.4g/L 이상의 D-락트산을 포함한 두유 발효물을 얻을 수 있다. 특히, 본 발명에서 육종한 유산균끼리(스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주 K1581주)로 구성된 유산균 혼합 스타터를 사용한 경우에는, D-락트산량이 더 많은 두유 발효물을 얻을 수 있다(도 1 참조).

이상의 결과로부터, 스트렙토코커스·서모필러스가 갖는 특징에 의해 모두 발효하는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스에 의한 D-락트산 생성량에 큰 변화가 보이고, 또한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스도 주에 의해 두유 중에서의 D-락트산 생성량이 크게 다른 것을 확인하였다.

4. 무조정 두유막 투과액 중에서의 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에 의한 발효 후의 D-락트산량의 비교

(1) 상술한 바와 같이, 스트렙토코커스·서모필러스주의 특징에 의해 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에 의한 D-락트산 생성량이 크게 변화한 것을 알 수 있었다. 따라서, 선발·육종한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주와 시판 스타터로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주의 두유막 투과 중에서의 대사능의 차이를 확인하기 위해, 미리 프럭토스를 보당한 두유막 투과액 중에서의 D-락트산 생성량을 비교하였다. 두유막 투과액은 두유로부터 고분자의 불용성 단백질이나 지질이 제거된 것이며, 두유 중의 유리아미노산, 가용성의 펩티드, 당분이나 미네랄 등 큰 차이는 없는 것으로 생각된다.

(2) 무조정 두유막 투과액의 제작

시판되고 있는 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)를 중공사 형상의 한외 여과 모듈{형식:USP-143[아사히 가세이(旭化成)사제]}을 사용하고, 진공 펌프로 흡인하고(－60㎪), 막을 투과한 액을 성분 무조정의 두유막 투과액으로 하였다. 이 액에 대해, 최종 농도 1.0％(v/v)로 되도록 프럭토스를 무균적으로 첨가하였다(무조정 두유막 투과액). 또한, 이 두유막 투과액에 염산을 첨가하고, pH5.0으로 조정한 산성 두유막 투과액을 제작하였다.

(3) 두유막 투과액에서의 배양 후의 D-락트산 생성량의 측정

시판되고 있는 요구르트 제조용 분말 혼합 스타터(다니스코사제:스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·불가리쿠스주를 포함하는 동결 건조품)로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주, 육종한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주 3주(K1581주, K1583주, K1585주), 야생주(ATCC11842주)를 각각 MRS 배지에서 배양하였다. 얻어진 균액을 0.85％ 멸균 식염수로 2도 원심·세정하고, 얻어진 펠릿을 무조정 두유막 투과액에 현탁하고, 스타터 균액으로 하였다.

무조정 두유막 투과액, 산성(pH5.0) 두유막 투과액 각각에 균을 세정한 균액을 1.0％ 접종하고, 42℃에서 24시간 배양(락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주 단독 배양)하고, 배양 후의 균액의 D-락트산량을 측정하였다(도 5 및 도 6).

무조정 두유막 투과액에서는, 시판 스타터나 ATCC11842주에 비해, 본 발명에서 육종한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에 의한 D-락트산 생산량은 현저하게 높은 값을 나타냈다. 마찬가지로, 산성 두유막 투과액에서는 무조정 두유막 투과액에 비해, 시판 스타터와 육종한 주로, D-락트산 생성량에 현저한 차이가 보였다. 시판 스타터로부터 분리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에서는 특히 저pH 조건하(pH5.0)에 있어서, D-락트산의 생성량이 낮은 것에 반해, 육종한 주는 동 조건하에서, 약 3배 이상의 D-락트산을 생산하는 것을 확인하였다. 두유 중에서의 스트렙토코커스·서모필러스주와의 공발효에서는, 먼저 서모필러스주의 생육에 의해 pH가 저하되고, 그 후 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주가 생육한다고 생각된다. 시판되고 있는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에서는, 이상과 같은 환경에서는, D-락트산의 생성이 0.4(g/L)를 초과하는 주가 존재하지 않고, 역시, 두유 환경 중에서는 생육·대사가 제한되고 있는 것이 확인되었다. 이상의 결과와 아울러, 육종한 주에 관해서는, 저pH, 또한 두유 조건하에 있어서도, 시판주나 ATCC11842주에 비해, 매우 대사가 활발히 일어나고 있다고 추정되고, 결과적으로, 요구르트 상태의 양호한 산미나 풍미가 있는 두유 발효물을 제작할 수 있는 것으로 생각된다.

또한, 시판 스타터 유래의 단리주 중에는 Lb. 505주나 Lb. 511주 등, 도 3에 있어서 선발주로서 0.4g/L 이상의 D-락트산을 생성한 주도 포함되어 있고, 도 5, 도 6에 있어서도 다른 시판 스타터 유래의 주보다도 높은 D-락트산 생성을 나타내고 있지만, 0.4g/L의 생성량에는 이르고 있지 않다. 이것은 도 5, 도 6에 나타낸 시험에 있어서는 스트렙토코커스·서모필러스가 존재하지 않기 때문이라고 생각된다. 무조정 두유막 투과액에 프럭토스를 보당하고 있지만, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 대사를 활발화하여 D-락트산의 생성량을 높이기 위해서는 단순하게 프럭토스를 공급할 뿐만 아니라, 스트렙토코커스·서모필러스는 다른 역할도 담당하고 있다고 생각된다.

5. 서모필러스 단독으로 발효하여 얻은 두유 발효액 중의 프럭토스 잔당량의 측정

시판되고 있는 유산균 혼합 스타터(다니스코사제) YO-MIX300, 305, 496, 499, 501, 885로부터 스트렙토코커스·서모필러스주(St. 300주, St. 305주, St. 496주, St. 499주, St. 501주, St. 885주)만을 단리하였다. 단리한 각 균주를 10mL의 LM17 배지에서 배양하고, 배양액을 0.9％ NaCl 용액으로 원심·세정하고, 10mL의 0.9％ NaCl 용액에 재현탁하였다. 두유 발효 원액에는, 시판되고 있는 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)를 사용하였다. 이 두유 발효 원액에 상술에서 조제한 현탁액을 1.0％(v/v) 접종하고, 42℃, 24시간 발효하였다. 발효 후, 원심 상청을 회수하고, 프럭토스의 잔당량을 F킷 D-글루코오스/과당(제이·케이·인터내셔널사제)에 의해 측정하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.

도 7에 나타내는 바와 같이, 스트렙토코커스·서모필러스주 중에는, St. 496주, St. 499주, St. 885주와 같이, 두유 발효물 중에 프럭토스를 0.4g/L 이상 축적하는 주와, 축적하지 않는 주가 존재하는 것이 판명되었다.

6. 유산균 스타터의 조합에 의한 D-락트산량의 생성에 미치는 영향

프럭토스를 축적하는 특징이 있는 스트렙토코커스·서모필러스주(St. 499주)와 축적하지 않는 주(St. 305주)를 시판 혼합 스타터 YO-MIX505, 511, 863으로부터 단리한 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주(Lb. 505주, Lb. 511주, Lb. 863주)와 1:1로 조합한 유산균 혼합 스타터를 구성하였다. 이것을 시판되고 있는 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 첨가하고 42℃에서 24시간, 발효하여 두유 발효물을 얻었다. 그리고, 발효 종료 후, 얻어진 두유 발효물 중의 D-락트산량을 효소 전극법(오지 게이소꾸사제, 바이오센서 BF-5)으로 측정하였다.

도 8에, 두유 발효물 중의 D-락트산 생성량의 측정 결과를 나타낸다. 도 8에 나타내는 바와 같이, 프럭토스를 축적하는 스트렙토코커스·서모필러스주와 조합함으로써, 0.4g/L 이상의 D-락트산이 생성되고, 부원료 무첨가에서도 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스와의 공생 관계가 두유에서도 구축되는 것을 확인하였다.

7. 두유 발효 중의 당 농도의 경시적 추이

스트렙토코커스·서모필러스주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주가 두유 중에서 공생 관계를 구축하기 위해서는, 스트렙토코커스·서모필러스주에 의해 두유의 주요 당분인 수크로오스를 분해하고, 프럭토스를 축적함으로써, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주에 당원을 공급하는 것이 불가결하다고 생각된다. 금회, 육종한 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 단독으로 발효한 때, 또한 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주를 공발효한 때의 수크로오스, 프럭토스의 잔당량을 경시적으로 측정하였다. 발효 온도는 42℃로 설정하였다. 수크로오스의 경시 변화를 도 9에, 프럭토스의 경시 변화를 도 10에 나타낸다.

도 11은 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주로 두유를 42℃에서 공발효한 때의 경시적인 프럭토스 농도의 추이를 나타낸 도면이다.

스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 단독으로 발효한 조건에서는, 수크로오스의 양이 경시적으로 감소하고, 프럭토스의 축적이 확인되었다(도 9, 도 10). 한편, 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주로 공발효한 때에는, 한번, 프럭토스가 소량 축적되고, 그 후 감소하는 것을 알 수 있었다(도 11).

2개의 결과로부터, K1581주에 의해 프럭토스가 대사되고, 결과적으로 D-락트산이나 기타, 방향 성분의 생성에 기여하고 있는 것으로 생각된다. 스트렙토코커스·서모필러스에는 프럭토스를 적극적으로 자화하는 주와 그렇지 않은 주로 나뉘고, 본 실시예에 있어서의 선발주 및 육종주와 같이 프럭토스를 자화하지 않고, 발효물 중에 축적시키는 특징이 있는 스트렙토코커스·서모필러스를 사용함으로써, 두유 중에 있어서도 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스와 공생 관계를 구축하고, 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 유래의 풍미를 두유 발효물에 부여할 수 있고, 결과적으로 풍미가 좋은 두유 발효물을 만들어 내는 것이 가능해진다.

8. 육종주를 사용한 관능 평가

육종주인 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주로 이루어지는 유산균 혼합 스타터를 조제하고, 이것을 사용하여, 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)를 42℃, 24시간 발효시켜 두유 발효물을 얻었다. 한편, 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주를 단독으로 무조정 두유에 첨가하고, 42℃, 24시간 발효시켜, 두유 발효물을 얻었다. 각각의 성분 분석값은 이하와 같다.

다음으로, 단독 발효한 두유 발효물과 공발효물을 적절히 혼합함으로써, 발효물 중의 D-락트산량을 조제하였다. 즉, 100％ 공발효물(샘플 1), 40％ 공발효물(샘플 2), 30％ 공발효물(샘플 3), 20％ 공발효물(샘플 4), 15％ 공발효물(샘플 5), 10％ 공발효물(샘플 6), 100％ 단독 발효물(샘플 7)을 각각 제작하였다. 각 샘플의 D-락트산 추측값, 추정 D/L비는 표 2와 같다.

또한, 각 샘플을 시식하고, D-락트산량과 두유 발효물의 풍미의 관계를 하기의 평가 기준으로 평가하였다.

(평가 기준)

◎:매우 풍미가 좋다

○:풍미가 좋다

△:풍미가 조금 나쁘다

×:풍미가 나쁘다

결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 샘플 1로부터 샘플 3까지는 풍미 양호인 것이 판명되었다. 따라서, 두유 발효물에 있어서는, D-락트산을 적어도 0.4g/L 이상 생성하는 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 사용함으로써 풍미가 양호해지는 것이 판명되었다. 또한, 단순히 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주만이 왕성하게 생육하는 것만으로는 양호한 풍미가 얻어지는 것이 아니라, 스트렙토코커스·서모필러스의 생육과의 밸런스가 중요하며, D/L 락트산비가 0.05 이상인 것이 바람직한 것이 명확해졌다.

9. 기타 시판 혼합 스타터를 사용하여 발효하여 얻은 두유 발효물의 관능 평가

시판되고 있는 요구르트 제조용 분말 혼합 스타터(다니스코사제:스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·불가리쿠스주를 포함하는 동결 건조품) YO-MIX300, YO-MIX305, YO-MIX511, YO-MIX863(모두 제품 번호)의 분말을 멸균수로 용해하고, 동량의 현탁액을 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 42℃, 24시간 발효시켜, 두유 발효물을 얻었다.

한편, 시판 혼합 스타터 YO-MIX885, YO-MIX496 유래의 스트렙토코커스·서모필러스주(St. 885주, St. 496주)를 단리하였다. 또한, 시판 혼합 스타터 YO-MIX305, YO-MIX492, YO-MIX601 유래의 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주(Lb. 305주, Lb. 492주, Lb. 601주)를 단리하고, 각각 글리세롤 스톡 균액으로서 보관하고, 시험에 사용하였다.

또한, 육종주로서, 스트렙토코커스·서모필러스 K1580주 및 K1584주와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스 K1581주 및 K1585주를 사용하였다.

제작한 스트렙토코커스·서모필러스주(St.주)와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주(Lb.주)를 각각 1:1로 혼합하고(예를 들어, K1580주＋K1581주나 St. 885주＋Lb. 305주 등), 10mL의 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)로 발효시켜, 전 발효물을 얻었다. 이러한 전 발효물 1.0％(v/v)를 무조정 두유(기꼬만 소이푸드사제)에 접종하고, 42℃, 24시간 발효시켜, 두유 발효물을 얻었다. 각 두유 발효물의 락트산 분석값을 이하에 나타낸다.

상기한 바와 같이 하여 얻어진 각 두유 발효물에, 최종 농도 6.0％(w/v)로 되도록 자당을 첨가하고, 풍미나 정미에 대해 관능 평가를 실시하였다. 그 결과, D-락트산을 포함하지 않는 두유 발효물에서는, 단맛이 선행하고, 바람직한 것은 되지 않았지만, D-락트산을 0.4g/L 이상 포함하는 두유 발효물에서는, 산감 밸런스를 취할 수 있고, 풍미 양호한 두유 발효물로 되는 것이 판명되었다. 이상의 내용으로부터, 두유 발효물에 설탕을 첨가한 경우에 있어서도, 본 발명에 관한 유산균 혼합 스타터(선발 또는 육종한 주로 이루어지는 유산균 혼합 스타터)를 사용하여 제조한 두유 발효물의 쪽이 우수한 풍미나 정미를 갖는 것을 발견하였다.

10. 두유 발효물의 물성 측정

두유 발효물의 물성을 측정하고, 평가를 실시하였다. 물성의 평가에 관해서는, 두유 발효물 중에 어떠한 입자경의 입자가, 어떠한 비율로 포함되어 있는지를 나타내는 지표인 입도 분포를 사용하였다. 입도 분포를 측정함으로써, 발효물을 입에 머금었을 때의 혀의 촉감이나 매끄러움을 평가할 수 있다.

시판되고 있는 요구르트 제조용 분말 혼합 스타터(다니스코사제:스트렙토코커스·서모필러스주 및 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스주를 포함하는 동결 건조품) YO-MIX300, YO-MIX305(모두 제품 번호)에 의해 발효하여 얻은 두유 발효물, 또한 선발 또는 육종한 주(K1580주＋K1581주, St. 496＋Lb. 601, St. 885＋Lb. 305)에 의해 발효하여 얻은 두유 발효물을 균일하게 교반하고, 레이저 회절식 입도 분포 측정 장치{SALD-2200[시마즈 세이사꾸쇼(島津製作所)]}에 제공하고, 입도 분포를 측정하였다.

측정 결과를 도 12에 나타낸다. 그래프 내에는 각 샘플마다 동일 심볼로 입자경의 출현 빈도와 함께 적산 결과도 나타냈다. 시판 스타터에 의해 발효하여 얻은 두유 발효물에 비해, 선발 또는 육종한 주의 발효에 의해 얻은 두유 발효물에 있어서는, 입자경 100마이크로미터 이상의 입자가 전체에 차지하는 비율이 10％ 이하이며, 보다 혀의 촉감이 매끄러운 두유 발효물인 것이 확인되었다. 이것은 육종 혹은 선발에 의해 두유 발효 시의 스트렙토코커스·서모필러스와 락토바실러스·델브루키·서브스피시스·불가리쿠스의 대사가 각각 활성화됨으로써, 그들 유산균이 생성하는 다당류의 생성도 활발해지고, 결과적으로 까칠함의 원인으로 되는 대두 단백의 과잉의 응집을 방지하여 물성이 개선된 것을 나타내는 것이다.