앰피실린 내성 조직화 젖산 박테리아 균주 {AMPICILLIN RESISTANT TEXTURIZING LACTIC ACID BACTERIA STRAINS}
본 발명은 젖산 박테리아, 예컨대 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 ( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ) 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 ( Streptococcus thermophilus )의 돌연변이체에 관한 것으로, 이들은 항생제 앰피실린에 내성이고, 우유에서 성장시 모균주의 기타 성장 특성은 유지하면서 조직감 향상을 가져오는 것으로 알려져 있었다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이체를 포함하는 배양체, 예컨대 스타터 배양체 (starter cultures), 및 상기 배양체로 발효시킨 낙농 제품에 관한 것이다.
식품 산업에서는 식품의 맛 및 조직감의 개선 뿐 아니라 이들 식품의 유통 기한을 연장시키기 위하여 다수의 박테리아, 특히 젖산 박테리아가 이용된다. 유업계의 경우, 젖산 박테리아는 우유의 산성화 (발효에 의한 것)를 유발시킬 뿐 아니라 그 젖산균이 들어있는 제품을 조직화하는 데 집중적으로 이용된다. 식품 산업에서 이용되는 젖산 박테리아 중에서, 스트렙토코쿠스 ( Streptococcus ), 락토코쿠스 ( Lactococcus ), 락토바실러스 ( Lactobacillus ), 류코노스톡 ( Leuconostoc ), 페디오코쿠스 ( Pediococcus ) 및 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ) 속을 들 수 있다. 스트렙토코쿠스 써모필러스 종의 젖산 박테리아는 식품, 특히 발효 제품의 생산에 단독으로 또는 다른 박테리아, 예컨대 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스와의 조합 형태로 널리 이용된다. 이들은 발효유, 예컨대 요거트의 제조용으로 사용되는 발효체 제제에 특히 이용된다. 이들 중 어떠한 것들은 발효 제품의 조직화 전개에 지배적 역할을 한다. 이러한 특성은 폴리새커라이드의 생성과 밀접하게 관련되어 있다. 요거트의 현재 트렌드는 연한 향미와 높은 조직감이다. 오늘날 이는 연한 향미를 생성하는 배양체를 사용하고 원하는 농후감을 제공하는 농후제 또는 단백질을 첨가함으로써 이루어진다. 요거트 제조자들은 농후 제제의 첨가 없이도 이들 특성을 갖는 요거트를 만들 수 있기를 원한다. 이는 그들에게 비용 절감과 보다 간명한 레이블을 제공할 수 있도록 할 것이다. 이를 달성할 매우 매력적인 방법 하나는 고수준의 조직감을 만들어 내는 스타터 배양체를 갖는 것일 것이다. 산업상 요건을 만족시키기 위하여, 식제품을 조직화하기 위한, 신규한 젖산 박테리아 조직화 균주들, 특히 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스를 제공함이 요구되어 왔다. 특히, 신규한 조직화 균주 스와 함께 사용될 수 있는 신규한 조직화 균주 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스에 대한 요구가 있다. 본 발명의 발명자들은 이전에 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 박테리아와 같은 개선된 젖산 박테리아의 동정을 위한 신규한 선별 방법을 개발하였고, 이들 박테리아들은 발효유 제품용 우유 기질을 발효시키는데 사용시 높은 조직감이라는 결과는 낳는 것이다. 국제특허출원 (PCT) WO2012/052557에 기재된 방법은 본원 발명의 발명자들이 D-시클로세린 및 기능적으로 균등한 항생제들과 젖산 박테리아의 개선된 조직 특성간의 놀랍게도 관련된 관계를 밝혔다는 것에 관한 것이다. D-시클로세린 (D-4-아미노-이속자솔리돈)은 세포 용혈을 야기하는 알라닌 라세마아제, D-알라닐-D-알라닌 리가아제, D-알라닌-알라닌 합성효소 및 D-알라닌 퍼미아제를 억제하는 항생제이다. D-알라닌 라세마아제는 D-알라닌 생성에 필수적이고, 세포벽의 펩티도글리칸의 내재부이다. 앰피실린은 베타-락탐계 항생제들 중 하나의 항생제이고, 대부분의 젖산 박테리아를 포함하는 그람-양성 박테리아에 대해 유효하다. 앰피실린은 DD-트랜스펩티다아제 유형 (EC 3.4.16.4)의 효소들의 경쟁적 억제자이다. 앰피실린에 의한 DD-트랜스펩티다아제의 억제는 박테리아 세포벽 형성에 필요한 펩타이드 결합의 형성을 막아 궁극적으로 세포의 용혈을 이끌어낸다. 많은 상이한 박테리아에 대해 앰피실린에 내성인 돌연변이체들이 기술되어 왔지만 - 본 발명의 발명자들의 지식 내에서는 - 본 발명의 앰피실린 내성과 개선된 조직 특성간의 관련된 관계를 개시하거나 제시하고 있지 아니한 선행기술들일 뿐이다.
발명의 요약 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 앰피실린 내성인 1군의 젖산 박테리아 돌연변이체들이, 그 박테리아가 우유 발효에 사용되는 경우 높은 전단 응력 및/또는 겔 강성 (gel stiffness)을 생성한다는 것을 밝혔다. 본 발명의 발명자들은 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 항생제 앰피실린 및/또는 기타 항생제에 내성인 이러한 조직화 젖산 박테리아를 수득하는 방법을 개발하였다. 본 발명에 개시되는 젖산 박테리아 균주를 수득하는 방법은 하기의 두 단계를 포함한다: (i) 앰피실린 내성인 젖산 박테리아 균주들을 스크리닝하고 선별하는 제1 단계로서, 이용자는 천연/야생형 젖산 박테리아에 통상 존재하는 것보다 현저히 높은 것을 앰피실린에 대한 내성이라고 말할 수 있는 것인 단계; 및 (ii) 단계 (i)에서 동정된 앰피실린 내성 균주들의 풀 (pool)에서 조직화 특성이 향상된 젖산 박테리아 균주들을 스크리닝하고 선별하는 단계. 본 발명의 실시예 2에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 앰피실린 내성 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터, 개선된 조직화 특성을 갖는 젖산 박테리아 균주를 스크리닝/선별하는 것이 비교적 신속하다는 것을 알게 되었다. 기본적으로, 그 이유는 본 발명의 발명자들이 상기 앰피실린 내성 젖산 박테리아 균주 (단계 (i)에서 선별된)가 매우 높은 비율로 개선된 조직화 특성을 가짐을 확인했다는 것에 있다. 따라서, 앰피실린 내성에 대한 제1 스크리닝 및 선별은 개선된 조직화 특성을 갖는 젖산 박테리아를 신속하고 효율적으로 스크리닝하고 선별할 수 있는 일종의 전-단계 (pre-step)로 보일 수 있다. 이 기술 분야의 숙련자에게는 자명할 바 - 본 발명에 개시되는 스크리닝 및 선별 방법의 유의미한 이점은, 이용자가 개선된 조직화 특성을 가지는 젖산 박테리아 균주를 비교적 신속하고 효율적으로 스크리닝 및 선별할 수 있다는 것에 있다. 예컨대, 이용자가 이미 예컨대 발효유 제품 제조에 사용되는 경우 낮은 후산성화 (post-acidification)과 관련된 특성을 갖는 시판 젖산 박테리아 균주를 보유한다면, 그 후 이용자는 이 균주를 돌연변이화의 개시 세포로 이용한 후 비교적 신속하게 예컨대 낮은 후산성화와 관련된 훌륭한 특성을 여전히 유지하면서도 개선된 조직화 특성을 갖는 신규한 젖산 박테리아를 선별 및 수득할 수 있다. 본 발명의 실시예 2에 나타나는 바, 대략 25%의 1차 선별된 앰피실린 내성 균주들이 또한 조직감도 현저히 더 높다는 결과를 얻었는데, 이는 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 28 ml 산성화된 우유가 유출되는 시간이 50 초 이상인 것에 의하여 측정된 것이다. 본 발명에 개시되는 상기 신규한 스크리닝 및 선별 방법을 이용함이 없이는, 이러한 긴 유출 시간이라는 결과를 낳는 젖산 박테리아를 동정하는 것은 가능하지 않았을 것 (또는 매우 긴 시간이 걸렸을 것)이 확실하다. 이론에 얽매일 것 없이, 본 발명에서 놀랍게도 밝혀진 앰피실린 내성과 개선된 조직화 특성 간의 관계에 대한 이론적 설명은, 이러한 앰피실린 내성 젖산 세포들이 소위 세포외 폴리새커라이드 (EPS)를 더 많이 생성한다는 것일 수 있다. 그러면, 이러한 EPS가 세포 주위에 일종의 보호를 제공할 수 있다, 즉 이들 EPS가 세포를 그 세포로의 앰피실린 유입으로부터 보호하고 그로써 앰피실린 내성이 증가된다는 이론이 가능할 수 있다. 이론에 얽매일 것 없이, 이는 EPS의 생성 증가일 수도 있는데, EPS의 생성 증가는 상기 앰피실린 내성 젖산 박테리아로 발효시킨 우유에서 조직감 증가라는 결과를 낳는 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에서 동정된 젖산 박테리아 균주들은 우선 앰피실린에 내성인 것으로 선별되는데, 즉 천연/야생형 젖산 박테리아에서 용인되는 앰피실린 농도보다 현저히 더 높은 앰피실린 농도에 내성인 것이다. 상기 놀라운 발견에 따라, 본 발명은 조직화 젖산 박테리아 균주들, 예컨대 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주들 및 이러한 균주들을 수득하는 방법에 관한 것으로서, 이들 균주들은 앰피실린 내성 및/또는 효소 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성이다. 또한, 본 발명은 상기 돌연변이체를 포함하는 배양체, 예컨대 스타터 배양체에 관한 것이고, 그 배양체로 발효시킨 낙농 제품, 예컨대 발효유 제품에 관한 것이다. 상세한 설명 정의 본 명세서에서 사용되는 "젖산 박테리아"이라는 용어는 그람-양성의, 미호기성 또는 혐기성 박테리아로서, 우세하게 생성되는 산으로서 젖산과 아세트산 및 프로피온산을 포함하는 산을 생성하며 당을 발효시킨다. 공업적으로 가장 유용한 젖산 박테리아는 락토코쿠스 종 ( Lactococcus spp.), 스트렙토코쿠스 종 ( Streptococcus spp.), 락토바실러스 종 ( Lactobacillus spp.), 류코노스톡 종 ( Leuconostoc spp.), 페디오코쿠스 종 ( Pediococcus spp.), 브레비박테리움 종 ( Brevibacterium spp.), 엔테로코쿠스 종 ( Enterococcus spp.) 및 프로피오니박테리움 종 ( Propionibacterium spp.)을 포함하는 "락토바실라레스" 목에서 발견된다. 또한, 엄격한 혐기성 박테리아의 군에 속하는 젖산 생성 박테리아인 비피도 박테리아, 즉 비피도박테리움 종 ( Bifidobacterium spp.)은 일반적으로 젖산 박테리아의 군(群)에 포함된다. 이들은 단독으로 또는 다른 젖산 박테리아와 함께 조합하여 식품 배지로서 자주 사용된다. 젖산 박테리아, 예컨대 락토바실러스 종 및 스트렙토코쿠스 써모필러스는 보통 벌크 스타터 (bulk starter) 증식을 위한 냉동 또는 동결 건조 배지로서, 또는 소위 "다이렉트 배트 세트 (Direct Vat Set)" (DVS) 배지로서 유업계에 공급되고, 낙농 제품, 예컨대 발효유 제품 제조용의 발효관 또는 발효통으로 직접 접종된다. 이들 배지를 일반적으로 "스타터 배지" 또는 "스타터 (starter)"라고 부른다. "우유"라는 용어는, 예컨대 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타 등의 임의의 포유 동물을 착유하여 얻는 젖 분비액이라고 이해하여야 한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 우유는 소의 젖이다. 또한, 우유라는 용어는 식물 재료, 예컨대 두유로 제조된 단백질/지방 용액도 역시 포함한다. "우유 기질"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따른 발효를 거칠 수 있는 임의의 원유 및/또는 가공유일 수 있다. 그러므로, 유용한 우유 기질로서는 단백질을 함유하는 임의의 우유 또는 유사 우유 제품의 용액/현탁액, 예컨대 전지 우유 또는 저지방 우유, 무지방 우유, 버터 우유, 재구성 분유, 연유, 분유, 유청, 유청 막투과액 (whey permeate), 젖당, 젖당의 결정화 모액, 유청 단백질 농축액 또는 크림을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 명백히, 상기 우유 기질은 임의의 포유 동물로부터 유래한 것, 예컨대 실질적으로 순수한 포유류의 젖 또는 재구성 분유일 수 있다. 좋기로는, 우유 기질 내 단백질 중 적어도 일부는 우유 내에 천연적으로 존재하는 단백질, 예컨대 카세인 또는 유청 단백질이다. 그러나, 상기 단백질 중 일부는 우유에 천연적으로 존재하지 않는 단백질일 수 있다. 발효 전에, 상기 우유 기질은 이 기술 분야에 알려져 있는 방법에 따라 균질화 및 살균 처리될 수 있다. "균질화"라는 용어는 격렬하게 혼합하여 용해성 현탁액 또는 에멀전을 얻는 것을 의미한다. 발효 전에 균질화가 수행되는 경우, 우유 지방을 작은 크기로 분쇄함으로써 우유 지방이 더 이상 우유로부터 분리되지 않도록 상기 균질화를 수행할 수 있다. 이는 작은 오리피스를 통하여 우유에 고압의 힘을 가함으로써 달성될 수 있다. "살균"이라는 용어는 우유 기질을 처리하여 살아있는 생물체, 예컨대 미생물의 존재를 저감시키거나 제거하는 것을 의미한다. 살균은 특정 시간 동안 특정 온도를 유지하여 행하는 것이 좋다. 특정 온도는 보통 가열로 이루어진다. 상기 온도와 시간은 특정의 균, 예컨대 유해균을 죽이거나 불활화시키기 위하여 선택될 수 있다. 급속 냉각 과정이 수반될 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서 "발효"는 미생물의 작용을 통하여 탄수화물을 알코올 또는 산으로 전환시키는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 있어서 발효는 젖당의 젖산으로의 전환으로 이루어지는 것이 좋다. 발효유 제품의 제조에 이용되는 발효 공정은 잘 알려져 있고, 이 기술 분야의 숙련자라면 온도, 산소, 탄수화물의 첨가 및 미생물의 양과 특성 및 공정 시간 등의 적절한 공정 조건을 선택하는 방법을 알게 될 것이다. 명백히, 발효 조건은 본 발명의 목적, 즉 고형 또는 액상형 유제품 (발효유 제품)을 얻기 위한 목적을 뒷받침하기 위하여 선택된다. 본 발명의 문맥상, 요거트 스타터 배양체는 1종 이상의 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 및 1종 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 포함하는 박테리아 배양체이다. 본 발명에 따르면, "요거트"는 우유를 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 포함하는 조성물로 접종 및 발효시킴으로써 얻을 수 있는 발효유 제품을 말한다. "조직감" 또는 "구강감 (mouthfeel)"이라는 용어는 구강 내에서 상기 제품의 물리적 및 화학적 상호작용을 의미한다. 우유의 조직감을 측정하는 방법은 발효유의 전단 응력 (점도), 겔 강성 및 점질성 (ropiness) 측정을 포함하고, 쉽게 이용 가능하며 이 기술 분야에 알려져 있고, 본 발명에 예시된 것이다. 본 발명의 문맥상, "전단 응력", "겔 강성" 및 "점질성"이라는 용어들은 점도를 결정한다. 점도 (단위는 Pa s)는 전단 응력 (Pa)/전단 속도 (1/s)로 정의된다. 본 발명에서 전단 응력 값은 전단 속도 300 1/s에서 표준으로 보고된다. 관능 실험은 전단 속도 300 1/s에서 측정된 점도를 사용하였을 때 유동학적 측정과 관능 점도/구강 두께감 사이의 관계가 가장 좋다는 것을 보여주었다 (데이터 미기재). "겔 강성" 또는 "겔 견고성 (gel firmness)"은 가압 적용하여 1 HZ (Pa)에서 측정시 얼마나 오래 발효유 제품의 구조가 유지되는가에 관한 척도이다. 본 발명에서 사용되는 "점질성"이라는 용어는 발효유 제품 내 끈 (strings) 및 줄기 (threads) 및 점착성 (cohesiveness) 형성을 말한다. 점질성은 문헌 [Int. Dairy J. 16(2);111-118 (Folkenberg et al . 2006)]에 개시된 바와 같이 정의되고 측정된다. 본 발명의 "앰피실린에 내성"이라는 용어는 특정 돌연변이된 박테리아 균주가, 배양 배지 내에서 상기 항생제의 존재 하에서, 그 돌연변이된 균주가 유래한 대응하는 비(非)돌연변이화 균주와 비교했을 때 죽지 않거나, 또는 유의미하게 훨씬 천천히 죽는 것을 의미한다. 배양 배지 내 항생제 화합물의 농도에 따라, 내성은 상기 돌연변이된 균주들 및 비돌연변이화 균주들의 성장 특성 변화로 반영될 수도 있다. 예컨대, 배양 배지 내 상기 항생제가 저농도로 존재함은 비돌연변이화 균주들의 성장을 방해하거나 현저히 감소시킬 것일 반면 상기 돌연변이된 균주들은 영향을 받지 않을 것이다. 내성 시험에서 민감성 레퍼런스 균주로 사용될 수 있는 비돌연변이화 균주는, 좋기로는 균주 CHCC13995를 포함한다. 항생제 앰피실린에 내성인 젖산 박테리아 균주를 본 발명에서는 젖산 박테리아 균주로서 정의하는데, 여기서 상기 항생제 앰피실린 무함유 배지에서 OD 600 측정된 성장과 비교하여, 37℃, 젖산 박테리아 균주의 성장에 적합한 배지 (예컨대, 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주용 MRS 배지 및 스트렙토코쿠스 써모필러스용 2% (w/v) 락토오스 함유 M17)에서 20 시간 성장 후, OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 항생제 앰피실린의 양은 400 ng/ml보다 높다. 본 발명에서, 앰피실린에 내성인 돌연변이체 젖산 박테리아 균주는 또한 E-테스트 판독 최소 억제 농도 (MIC) 값이, 상기 돌연변이체 균주가 유래한 모균주에서보다 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에서 최소 1 증가하는 것으로 정의된다. 본 발명에 있어서, "돌연변이체"라는 용어는, 본 발명의 균주 (또는 모균주)로부터, 예컨대 유전 공학, 방사선 및/또는 화학적 처리의 방법에 의하여 유래할 수 있는 균주 또는 유래한 균주라고 이해하여야 한다. 상기 돌연변이체는 자발적으로 발생한 돌연변이체일 수도 있다. 상기 돌연변이체는 모균주와 기능적으로 균등한 돌연변이체, 예컨대 실질적으로 동일하거나, 또는 (예컨대, 점도, 겔 강성, 및점질성에 관한) 성질이 개선된 돌연변이체인 것이 좋다. 이러한 돌연변이체는 본 발명의 일부이다. 특히, "돌연변이체"라는 용어는 본 발명의 균주를 에탄 메탄 술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘 (NTG) 등의 화학적 뮤타젠 처리, UV광 처리를 비롯한 종래에 사용되는 임의의 돌연변이화 처리를 거치게 하여 얻은 균주 또는 자생적인 돌연변이체를 말한다. 돌연변이체는 수회의 돌연변이화 처리 (하나의 처리는 스크리닝/선별 단계를 거친 1회의 돌연변이화 단계로 이해되어야 한다)를 거친 것일 수 있으나, 본 발명에서는 20회 이하, 또는 10회 이하, 또는 5회 이하의 처리 (또는 스크리닝/선별 단계)를 수행하는 것이 좋다. 본 발명에서 양호한 돌연변이체에 있어서, 박테리아 게놈 중의 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 또는 0.0001% 미만 또는 심지어 0.1% 미만의 뉴클레오티드가 모균주에 비하여 또 다른 뉴클레오티드로 대체 또는 결실된다. 본 발명에 있어서, "변이체"라는 용어는 본 발명의 균주와 기능적으로 균등한 균주, 예컨대 실질적으로 동일하거나, 또는 (예컨대, 점도, 겔 강성 및 점질성에 관하여) 성질이 개선된 균주라고 이해하여야 한다. 적절한 스크리닝 기법을 이용하여 확인될 수 있는 이러한 변이체들은 본 발명의 일부이다. 본 발명의 설명과 관련하여 (특히 후술하는 청구 범위와 관련하여), "a"와 "an" 및 "the"와 이에 유사한 낱말의 사용은 본 발명에서 달리 표시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 양자 모두를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는 (comprising)", "가지는 (having)", "비롯한 (including)" 및 "함유하는 (containing)" 이라는 용어들은 달리 표시되지 않는 한, 개방형 (open-ended) 용어 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 아니하는"을 의미)로 이해되어야 한다. 본 발명에 있어서, 수치 범위에 관한 언급은 달리 명시하지 않는 한, 그 범위에 속하는 별도의 각 값을 개별적으로 나타내는 약기(略記) 방식으로서 사용하고자 하는 것일 뿐이며, 별도의 각 값은 이것이 마치 본 명세서에서 개별적으로 설명되어 있는 것처럼 본 명세서에 포함된다. 달리 명시하거나 문맥상 명백히 반대되는 경우가 아닌 한, 본 명세서에 설명된 방법들은 모두 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 발명에 제시된 임의의 실시예 및 모든 실시예, 또는 예를 들고자 한 용어 (예컨대, “...과 같은”)의 사용은, 단지 본 발명을 더 분명히 나타내기 위한 목적일 뿐이며, 달리 필요하지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 한정을 가하지 않는다. 본 명세서 중의 어떠한 언어도, 어떤 청구되지 않은 사항을 본 발명의 실시에 필수적인 것을 나타낸다고 해석되어서는 아니된다. 본 발명의 구현 및 측면 본 발명에서 설명하는바, 항생제 앰피실린에 내성인 젖산 박테리아들 중 다수가 (high percentage) 시판되는 관련 조직화 균주와 비교할 때 우유에서 성장시키는 경우 조직감 증가를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 이 기술 분야의 숙련자는 앰피실린과 동일한 작용 모드를 갖거나 동일한 표적을 표적화하는 기타 항생제들을 앰피실린과 조합하거나 단독으로 사용하여 본 발명에 개시되는 유형의 돌연변이체들을 단리할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명은 이러한 기타 기능적으로 균등한 항생제들, 예컨대 DD-트랜스펩티다아제의 억제제들을 이용하는 것 역시 포함한다. 이러한 항생제들은 아목시실린, 페니실린 G, 프로케인 페니실린, 벤자틴 페니실린 및 페니실린 V를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 제1 측면에 있어서, 본 발명은 하기와 같이 특징화되는 젖산 박테리아 균주에 관한 것으로서: (i) 상기 젖산 박테리아 균주는 항생제 앰피실린 및/또는 효소 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 것으로, 상기 항생제를 함유하지 않은 배지에서 OD 600 측정된 성장과 비교하여, 젖산 박테리아 균주의 성장에 적합한 배지에서 37℃, 20 시간 성장 후의 OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 상기 항생제의 양은 400 ng/ml보다 높은 것으로 정의되는 것이고; 및 (ii) 10 4 CFU/ml 이상의 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은 50 초 이상이다. 좋기로는, 단계 (i)의 항생제는 앰피실린이다. 요소 (i)의 OD 600 측정 성장을 20%까지 감소시키는 항생제의 양을 결정하는 시험 및 요소 (ii)의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터 28 ml의 산성화된 우유의 유출 시간을 측정하는 시험 양자 모두는 공지의, 시판 표준 구성들에 기초한다. 이 기술 분야의 숙련자는 젖산 박테리아 균주의 성장에 적합한 표준 배지를 알고 있을 것이고, 예컨대 본 발명에서 예시되는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주의 성장에 적합한 MRS 배지 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주의 성장에 적합한 M17 배지+2% (w/v) 락토오스가 그것이다. 따라서, 본 발명의 시험에 대한 상세한 설명에 기초하여 (예컨대, 실시예 2 참고) 이 기술 분야의 숙련자는 통상적으로 이들 시험을 반복하여 특정한 대상 젖산 박테리아 균주가 앰피실린 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 조건을 충족하는지 (요소 (i)) 및 조직화 특성이 개선되었는지 (요소 (ii)) 객관적으로 결정할 수 있다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주이다. 양호한 구현예에 있어서, 요소 (i)의, OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 항생제의 양은 500 ng/ml보다 높은데, 예컨대 600 ng/ml보다 높고, 예컨대 700 ng/ml보다 높다. 다른 양호한 구현예에 있어서, 요소 (ii)의 유출 시간은 60 초 이상, 예컨대 70 초 이상, 예컨대 80 초 이상, 예컨대 90 초 이상, 예컨대 100 초 이상, 예컨대 110 초 이상이다. 제2 측면에 있어서, 본 발명은 하기와 같이 특징화되는 젖산 박테리아 균주에 관한 것으로서: (i) 상기 젖산 박테리아 균주는 항생제 앰피실린 및/또는 효소 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 것으로, 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에 대한 최소 억제 농도 (MIC)는 상기 젖산 박테리아 균주가 유래한 모균주에 대한 MIC보다 E-테스트에서 최소 1 증가하는 것으로 정의되는 것이고; 및 (ii) 10 4 CFU/ml 이상의 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 모균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간보다 3배 이상인 것이다. 좋기로는, 상기 단계 (i)의 항생제는 앰피실린이다. 요소 (i)의 E-테스트 및 요소 (ii)의 폴리스트렌 25-ml 피펫으로부터 28 ml 산성화된 우유의 유출 시간을 결정하는 시험 양자 모두는 공지의 시판 표준 구성들에 기초한다. 따라서, 본 발명의 시험에 대한 상세한 설명에 기초하여 (예컨대, 실시예 1 및 실시예 2), 이 기술 분야의 숙련자는 통상적으로 이들 시험을 반복하여 특정한 대상 젖산 박테리아 균주가 앰피실린 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 조건을 충족하는지 (요소 (i)) 및 조직화 특성이 개선되었는지 (요소 (ii)) 객관적으로 결정할 수 있다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주이다. 양호한 구현예에 있어서, 요소 (i)의 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에 대한 MIC는 모균주에 대한 MIC보다 E-테스트에서 2 이상 증가, 예컨대 3 이상 증가, 예컨대 4 이상 증가, 예컨대 5 이상 증가한다. 다른 양호한 구현예에 있어서, 요소 (ii)의 유출 시간은 50 초 이상, 예컨대 60 초 이상, 예컨대 70 초 이상, 예컨대 80 초 이상, 예컨대 90 초 이상, 예컨대 100 초 이상, 예컨대 110 초 이상이다. 본 발명의 제3 측면은 독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 수탁번호 DSM 25852로 기탁된 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC15466과 그로부터 유래된 돌연변이체 및 변이체들로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 기탁된 균주를 출발 재료로 사용하여 이 기술 분야의 숙련자가 종래의 돌연변이화법 또는 재단리 기법을 통하여 본 발명에 기재되는 해당 특징 및 이점을 보유하는 그들의 추가적인 돌연변이체 또는 유도체들을 통상적으로 얻을 수 있다는 것은 이 기술 분야의 숙련자에게 명확하다. 따라서, "그로부터 유래하는 돌연변이체"라는 용어는 상기 기탁된 균주를 출발 재료로 이용하여 얻어지고, 그 돌연변이체는 상기 기탁된 균주의 기본적인 특성을 보유하며, 이때 상기 기본적 특성은 10 4 CFU/ml 이상의 상기 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간이 50 초 이상인 것인 돌연변이체 균주들에 관한 것이다. 본 발명의 제4 측면은 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 젖산 박테리아 균주 10 4 내지 10 14 CFU/g을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 1종 이상의 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주를 포함한다. 좋기로는, 상기 조성물은 1종 이상의 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 및 1종 이상의 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주를 포함한다. 또 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 스타터 배양체로서 사용될 수 있다. 또 다른 양호한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 동결, 동결-건조 또는 액체형이다. 본 발명에 따른 젖산 박테리아 균주 (앰피실린 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성이고, 조직화 특성이 증가된)는 좋기로는 발효유 제품을 제조하는데 사용될 수 있다. 용량 및 투여법은 이 분야의 기술에 따라 이루어질 수 있다. 또한, 발효유 제품을 제조하는 다른 모든 본 발명의 단계들은 이 분야의 기술에 따라 이루어질 수 있다. 발효유 제품을 제조하는 이러한 다른 관련 단계들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 통상적인 단계들이다. 따라서, 본 발명의 제5 측면은 발효유 제품을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면에 따른 젖산 박테리아 균주 또는 본 발명의 제4 측면에 따른 조성물로 우유 기질을 발효시키는 단계를 포함한다. 제6 측면은 상기 본 발명의 제4 측면에 따른 방법으로 얻어지는 발효유 제품에 관한 것이다. 제7 측면은 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면에 따른 젖산 박테리아 균주 또는 본 발명의 제4 측면에 따른 조성물을 포함하는 발효유 제품에 관한 것이다. 본 발명의 제8 측면은, 낙농 제품의 제조를 위한, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면에 따른 젖산 박테리아 균주 또는 본 발명의 제4 측면에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 낙농 제품은 발효유 제품이다. 좋기로는 상기 발효유 제품은 요거트이다. 본 발명의 제9 측면은 젖산 박테리아를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 항생제 앰피실린에 내성 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 젖산 박테리아 균주들의 풀을 스크리닝하고 단리하는 단계로서, 상기 항생제를 함유하지 않은 배지에서의 성장과 비교하여, 상기 젖산 박테리아 균주의 성장에 적합한 배지에서 37℃, 20 시간 성장 후의 OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 상기 항생제의 양은 400 ng/ml보다 높은 것으로 정의되는 것인 단계; 및 b) 단계 a)의 상기 항생제 앰피실린에 내성 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 젖산 박테리아 균주를 선별하고 단리하는 단계로서, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은 50 초 이상인 것인 단계 를 포함한다. 좋기로는, 상기 방법은: a) 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 항생제 앰피실린에 내성인 젖산 박테리아 균주들의 풀을 스크리닝하고 단리하는 단계로서, 앰피실린을 함유하지 않은 배지에서의 성장과 비교하여, 상기 젖산 박테리아 균주의 성장에 적합한 배지에서 37℃, 20 시간 성장 후의 OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 상기 앰피실린의 양은 400 ng/ml보다 높은 것으로 정의되는 것인 단계; 및 b) 단계 a)의 상기 항생제 앰피실린에 내성인 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 젖산 박테리아 균주를 선별하고 단리하는 단계로서, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은 50 초 이상인 것인 단계 를 포함한다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스이다. 양호한 구현예에 있어서, 요소 (i)의, OD 600 측정 성장을 20%로 감소시키는 상기 항생제의 양은 500 ng/ml보다 높고, 예컨대 600 ng/ml보다 높고, 예컨대 700 ng/ml보다 높다. 또 다른 양호한 구현예에 있어서, 요소 (ii)의 상기 유출 시간은 60 초 이상, 예컨대 70 초 이상, 예컨대 80 초 이상, 예컨대 90 초 이상, 예컨대 100 초 이상, 예컨대 110 초 이상이다. 제10 측면은 젖산 박테리아 균주를 얻는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) 젖산 박테리아 모균주를 제공하는 단계; b) 항생제 앰피실린에 내성 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들의 풀을 스크리닝하고 단리하는 단계로서, 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에 대한 최소 억제 농도 (MIC)는 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들이 유래한 모균주에 대한 MIC보다 E-테스트에서 최소 1 높게 증가하는 것으로 정의되는 단계; 및 c) 단계 b)의 상기 앰피실린에 내성 및/또는 DD-트랜스펩티다아제를 억제하는 다른 항생제에 내성인 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 돌연변이체 젖산 박테리아 균주를 선별하고 단리하는 단계로서, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 모균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간보다 최소 2배인 것인 단계 를 포함한다. 좋기로는, 상기 방법은: a) 젖산 박테리아 모균주를 제공하는 단계; b) 항생제 앰피실린에 내성인 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들의 풀을 스크리닝하고 단리하는 단계로서, 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에 대한 최소 억제 농도 (MIC)는 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들이 유래한 모균주에 대한 MIC보다 E-테스트에서 최소 1 높게 증가하는 것으로 정의되는 단계; 및 c) 단계 b)의 상기 앰피실린에 내성인 돌연변이체 젖산 박테리아 균주들의 풀로부터 돌연변이체 젖산 박테리아 균주를 선별하고 단리하는 단계로서, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간은, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 모균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 유출 시간보다 최소 2배인 것인 단계 를 포함한다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 모균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코쿠스 써모필러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 양호한 구현예에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주이다. 또 다른 본 발명의 양호한 구현예에 있어서, 상기 모균주는 독일생물자원센터에 기탁번호 DSM 24021로 기탁된 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC13995이다. 양호한 구현예에 있어서, 요소 (i)의, 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주에 대한 MIC는 상기 모균주에 대한 MIC보다 E-테스트에서 2 이상 높게 증가, 예컨대 3 이상 높게 증가, 예컨대 4 이상 높게 증가, 예컨대 5 이상 높게 증가한다. 다른 양호한 구현예에 있어서, 요소 (ii)의, 10 4 CFU/ml 이상의 상기 돌연변이체 젖산 박테리아 균주로 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화시킨, 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유 28 ml의 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터의 상기 유출 시간은 50 초 이상, 예컨대 60 초 이상, 예컨대 70 초 이상, 예컨대 70 초 이상, 예컨대 90 초 이상, 예컨대 100 초 이상, 예컨대 110 초 이상이다. 본 발명의 제11 측면은 본 발명의 제8 측면 또는 제9 측면에 따른 방법으로 얻어지는 젖산 박테리아 균주에 관한 것이다. 하기 비제한적 실시예에 의하여 본 발명은 더욱 구체화된다.
실시예 재료: 배지: 스트렙토코쿠스 써모필러스를 위하여, 적절한 배지로는 하기의 조성을 갖는 공지의 M17 아가 배지를 들 수 있다: 아가, 12.75 g/L 아스코르브산, 0.5 g/L 카세인 펩톤 (트립틱), 2.5 g/L 디소듐 β-글리세로포스페이트 5수화물, 19 g/L 마그네슘 술페이트 수화물, 0.25 g/L 육류 추출물, 5 g/L 육류 펩톤 (펩틱), 2.5 g/L 콩펩톤 (파파이닉), 5 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L
그리고 M17 브로쓰 배지는 이 조성을 갖는다: 아스코르브산, 0.5 g/L 락토오스, 5 g/L 마그네슘 술페이트, 0.25 g/L 육류 추출물, 5 g/L 육류 펩톤 (펩틱), 2.5 g/L 소듐 글리세로포스페이트, 19 g/L 콩 펩톤 (파파이닉), 5 g/L 트립톤, 2.5 g/L 효모 추출물, 2.5 g/L 최종 pH 7.0±0.2 (25℃)
이들 배지는 일반적으로 20 g/l의 락토오스를 첨가한 후 (2% w/v) 사용된다.
락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스를 위하여, 적절한 배지로는 공지의 MRS 배지를 들 수 있다. MRS 아가 배지는 하기의 조성을 갖는다: 박토 프로테오스 펩톤 no.3 10 g/l 박토 쇠고기 추출물 10 g/l 박토 효모 추출물 5 g/l 덱스트로스 20 g/l 소르비탄 모노올리에이트 복합체 1 g/l 암모늄 시트레이트 2 g/l 소듐 아세테이트 5 g/l 마그네슘 술페이트 0.1 g/l 망간 술페이트 0.05 g/l 포타슘 포스페이트 디베이시스 2 g/l 박토 아가 15 g/l
그리고 MRS 브로쓰 배지는 이러한 조성을 갖는다: 박토 프로테오스 펩톤 no.3 10 g/l 박토 쇠고기 추출물 10 g/l 박토 효모 추출물 5 g/l 덱스트로스 20 g/l 소르비탄 모노올리에이트 복합체 1 g/l 암모늄 시트레이트 2 g/l 소듐 아세테이트 5 g/l 마그네슘 술페이트 0.1 g/l 망간 술페이트 0.05 g/l 포타슘 포스페이트 디베이시스 2 g/l 최종 pH 6.5±0.2 (25℃)
이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 바와 같이, M17 배지는 스트렙토코쿠스 써모필러스의 성장에 적합한 것으로 사료되는 배지이고, MRS 배지는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스의 성장에 적합한 것으로 사료되는 배지이다. 본 발명의 문맥상 및 이 기술 분야의 숙련자에게 이해될 바와 같이, 특정 M17 및 MRS 배지 농축제가 여러 공급자들로부터 공급될 수 있고 상기 특정 공급자 중 독립적으로 이용자는 본 발명의 관심 대상인 해당 균주에 대한 본 발명의 해당 앰피실린 내성이라는 동일한 결과를 (표준 측정 불확실성 내에서) 얻을 것이다.
실시예 1: 앰피실린 내성 선별 시험 이 방법은 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스를 이용하여 구체화된다. 스트렙토코쿠스 써모필러스로 앰피실린 내성 선별 시험을 수행하기 위하여, 2% w/v로 첨가된 락토오스를 함유하는 M17 배지가 MRS 배지 대신 사용되어야 한다. 대상 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스를 10 ml MRS 브로쓰 배지에 접종시키고 혐기성 조건, 37℃에서 20 시간 이상 성장시켰다. 면봉을 배양체 내에 담갔다가 MRS 아가 플레이트 (90 mm 직경)의 전체 표면상에 스트리킹하는데 사용하였다. 항균 민감성 시험 (Biomerieux, cat. #501558)을 위하여 앰피실린 E-테스트 막대 (0.016-256 μg/ml)을 아가상에 위치시키고, 혐기성 조건하, 37℃에서 24 시간 이하로 플레이트를 배양하였다. 앰피실린의 최소 억제 농도 (MIC)는 플레이팅된 균주의 육안 성장을 저해하는 최소 농도이고, 억제 타원 영역이 상기 E-테스트 막대를 가로지르는 시점에 읽는다. 본 발명에서 기술되는 앰피실린에 대하여 증가된 내성을 갖는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 세포를, 본 발명에서 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 세포로 정의하며, 이 경우 판독된 MIC 값은 모균주에 대한 것보다 E-막대 상으로 1 이상 높게 증가한다. 이러한 앰피실린에 대한 내성 증가 조건을 충족할 수 있는 세포를, 본 발명에서는 이 실시예 1의 앰피실린 내성 시험에서 앰피실린 내성인 세포로 정의한다. 결론: 이 실시예 1의 앰피실린 내성 선별 시험에 기초하여 - 특정한 대상 균주에 대하여 (예컨대, 해당 시판품 중 하나) - 이 기술 분야의 숙련자는 이 특성한 대상 균주가 본 발명의 해당 앰피실린 내성을 갖는지를 통상적으로 시험할 수 있다.
실시예 2: 개선된 유동학적 특성을 갖는 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 돌연변이체를 단리하기 위한 앰피실린의 용도 균주: 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 CHCC13995 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 CHCC15466 (CHCC13995의 앰피실린 내성 돌연변이체) 돌연변이체 단리: 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC13995의 앰피실린 내성 돌연변이체들을 단리하기 위하여, 단일 콜로니의 성장으로부터 유래한 세포들을, 다음 중 하나의 양으로 앰피실린을 함유하는 10 ml MRS로 혐기 접종하고, 37℃에서 20시간 이상 성장시켰다. 앰피실린 0 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml 또는 700 ng/ml. 20 시간 성장 후, 모든 시료에 대하여 OD 600 을 측정한다. 앰피실린을 함유하지 않은 MRS 배지 (즉, 0 ng/ml 앰피실린 함유)에서의 성장과 비교할 때, 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스의 OD 600 측정 혐기성 성장을 20% 이상으로 감소시키는 통상적인 앰피실린의 농도는 300 ng/ml보다 높다. 앰피실린 농도가 500 ng/ml인 배양체를 희석하여 어떠한 앰피실린도 첨가되지 않은 MRS 아가 플레이트 상에 도말한 후 37℃에서 20 시간 이상 혐기 배양하였다. 그 후, 500 ng/ml 앰피실린의 존재하 마이크로타이터 플레이트에서 37℃의 혐기성 성장에 대하여 콜로니를 골라 스크리닝하였다. 통상, 결과 콜로니 중 25%가 앰피실린 존재하에서 빨리 성장하는 것으로 확인되었다. 이들은 추가 연구를 위하여 선택되었다. 선별된 앰피실린 내성 돌연변이체들을 추가 정제하여 우유에서 자라는 그들의 능력을 시험하였다. 이 과정 중에, 돌연변이체들 중 일부가 이 조건하에서 모균주보다 상당히 더 많은 조직감을 생성함이 관찰되었다. 점도 스크리닝: 단순 피펫 점도 시험을 이용하여 유동학적 스크리닝 분석이 이루어졌다. 이 시험에서, 상기 앰피실린 내성 돌연변이체들은 28 ml의 산성화된 우유를 로딩한 폴리스티렌 25-ml 피펫 (CELLSTAR®)으로부터의 유출 시간을 측정함으로써 그 점도를 사전 평가하였다 (실제 유동학 시험 이전에). 각 시료에 대하여, 우유 ml당 10 4 CFU/ml 이상의 앰피실린 내성 돌연변이체로 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 (cow) 우유를 접종시키고 37℃에서 20 시간 산성화되도록 두었다. 피펫팅 시험 전, 폴리스티렌 25-ml 피펫 꼭대기로 로딩 (28 ml)하기 전 교반함으로써 상기 산성화된 우유를 가볍게 균질화하였고, 각 시료에 대하여 피펫으로부터 유출 시간을 3회 측정하였다. 표 1은 21종의 앰피실린 내성 돌연변이체들로 37℃에서 20 시간 동안 발효된 우유 상에서 이루어진 피펫 점도 시험의 결과를 나열하고 있다. 이 결과는 이들 돌연변이체들 대부분이 모균주보다 높은 점도라는 결과를 낳는다는 것을 보여준다. 21종의 앰피실린 내성 돌연변이체들 중 6종은 모균주의 유출 시간보다 2배인 유출 시간을 나타내었고 상기 앰피실린 내성 돌연변이체들 중 대략 25%가 유출 시간 50 초 이상이라는 결과를 낳았다. 특히 돌연변이체 18 (amp mut 18)이 높은 유출 시간을 나타내었다. 이 돌연변이체 유도체를 CHCC15466으로 지정하고, 실시예 3에 기술된 유동학적 시험에 사용하였다. 표 1. 28 ml의 산성화된 우유로 로딩된 폴리스티렌 25-ml 피펫으로부터 초(s)로 측정된 유출 시간 (평균 3회 측정)
결론 본 발명에 개시된 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 앰피실린 내성 돌연변이체들은 배양체, 예컨대 스타터 배양체 내로 포함될 수 있는데, 이들은 바람직한 고수준의 조직감을 생성한다.
실시예 3: 발효유 제품의 제조를 위한 스트렙토코쿠스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 앰피실린 내성 돌연변이체들의 용도 유동학: 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 우유에서 성장 후, ReoLogica Instruments AB, Sweden의 StressTech 레오미터에서 유동학 분석이 수행되었다. 전술된 실시예들은 단일 배양체로서 선별된 앰피실린 내성 돌연변이체들로 발효시킨 발효유의 조직감 개선을 설명하고 있다. 이 실시예에서, 요거트로 제조된, 즉 스트렙토코쿠스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주들을 조합하여 이용하여 요거트로 제조된 발효유의 조직감을 분석할 것이다. 상기 돌연변이체들 중 몇몇의 개선된 조직화 효과를 기록하기 위하여, 하나의 고정된 야생형 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC4895와, 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 야생형 균주 CHCC13995 및 앰피실린 내성 균주 CHCC15466을 각각 혼합한 조합으로 요거트를 제조하였다. 요거트 배양체를 스트렙토코쿠스 써모필러스:락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 9:1의 비율로 혼합하여 2% (w/v) 무지방 분유를 함유하는 전지 소 우유에 접종하고 최종 pH 4.50까지 40℃에서 발효시켰다. 4℃에서 5 일간 저장 후 하기 혼합물들을 StressTech 레오미터를 이용하여 분석하였다. 점질성은 문헌 [Folkenberg et al. (2006. Int. Dairy J. 16(2);111-118)]에 개시된 바에 의하여 측정되었다. 결과를 표 2에 제시하였다. 표 2. 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC4896와, 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 CHCC13995 또는 앰피실린 내성 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC15466 중 어느 하나로 제조된 요거트의 유동학적 측정
결과는, 단일 배양체를 이용하여 관찰된 바와 같이, 앰피실린 내성 돌연변이체 CHCC15466의 개선된 조직화 특성이 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주의 존재하에서도 역시 유지됨을 명확히 보여준다. 전단 응력은 단지 조금 영향받지만, 겔 강성과 점질성은, 요거트 발효에 야생형 균주 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 대신에 상기 돌연변이체가 사용된 경우 현저히 개선된다. 결론 본 발명에 개시된 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 앰피실린 내성 돌연변이체는 배양체, 예컨대 스타터 배양체로 포함될 수 있고, 이는 요거트와 같은 발효유 제품에서 바람직한 고수준의 조직감을 생성한다. 기탁 및 전문가용 참조 사항 스트렙토코쿠스 써모필러스 균주 CHCC4895는 독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig에 2007년 3월 29일에 기탁되었고, 수탁 번호는 다음과 같다: DSM19242. 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC13995는 독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig에 2010년 9월 22일에 기탁되었고, 수탁 번호는 다음과 같다: DSM24021. 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주 CHCC15466은 독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig에 2012년 4월 3일에 기탁되었고, 수탁 번호는 다음과 같다: DSM25852. 기탁은 특허 절차상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 따라 이루어졌다. 본원의 출원인은 이하 언급되는 기탁된 미생물 시료가 특허 결정일자까지 전문가에게만 이용 가능할 것을 요구한다.
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19242 20070329
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24021 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM25852 20120403 |
