텍스처화 유산균 균주{TEXTURIZING LACTIC ACID BACTERIA STRAINS}
본 발명은 항생제 D-시클로세린 및/또는 기능적으로 동등한 항생제에 내성이 있고, 모균주의 다른 성장 특성을 유지하면서 밀크에서 성장시킬 경우 증가된 텍스처를 나타내는 것으로 밝혀진, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 ( Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus ) 및 스트렙토코커스 써모필루스( Streptococcus thermophilus )와 같은 유산균의 돌연변이주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 돌연변이주를 포함하는 스타터 컬처(starter cultures)와 같은 컬처 및 이러한 컬처(cultures)로 발효시킨 유제품에 관한 것이다.
식품 산업 분야에서는 특히 식품의 맛과 텍스처(조직감)을 향상시키기 위해서 뿐만 아니라, 이들 식품의 저장 수명을 연장시키기 위할 목적에서 다양한 세균, 특히 유산균이 사용된다. 낙농업 분야에서, 유산균은 밀크의 산성화(발효에 의해)을 일으키기 위해서 뿐만 아니라 이들이 혼입되는 제품 내로 텍스처화시키고자 할 경우에 집중적으로 사용된다. 식품 산업 분야에서 사용되는 유산균 중에서도 특기할 만한 것은 스트렙토코커스( Streptococcus )속, 락토코커스( Lactococcus )속, 락토바실러스( Lactobacillus )속, 류코노스톡( Leuconostoc )속, 페디오코커스( Pediococcus )속 및 비피도박테리움( Bifidobacterium )속을 들 수 있다. 스트렙토코커스 써모필러스( Streptococcus thermophilus ) 종의 유산균은 식품 특히 발효제품 생산시 단독으로 또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스와 같은 다른 세균과 함께 집중적으로 이용되고 있다. 이들은 예컨대 요거트와 같은 발효유 제품에 사용되는 발효품 형성시 사용된다. 이들 중 몇몇은 발효제품의 텍스처 발달에 있어서 주도적인 역할을 한다. 이러한 특징은 다당류 생산과 밀접하게 관련되어 있다. 요거트 제품 분야의 최근 추세는 부드러운 맛과 높은 텍스처감이다. 오늘날 이러한 목표는 부드러운 맛을 내는 컬처의 사용 및 원하는 농도를 제공하기 위한 농후제 또는 단백질 첨가에 의해 달성된다. 요거트 생산자는 농후제 첨가 없이 요거트에 이러한 특성을 부여할 수 있기를 원한다. 이에 의해 단가를 낮추고 청정도를 높일 수 있다. 이러한 바램을 달성하는 한가지 매우 매력적인 방안은 고수준의 텍스처를 결과시키는 스타터 컬처를 확보하는 것이다. 산업상의 요구사항을 만족시키기 위해, 유산균의 신규한 텍스처화 균주(texturizing strains), 특히 식품의 텍스처화를 위해 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스를 제공하는 것이 필요하게 되었다. 특히 스트렙토코커스 써모필러스의 신규한 텍스처화 균주와 함께 사용가능한 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 신규한 텍스처화 균주에 대한 필요성이 크게 대두되고 있다. 다른 여러가지 세균에 대해 D-시클로세린에 대한 돌연변이 내성이 설명된 바 있으나, 이들 돌연변이들이 유제품의 텍스처를 증가시키는데 사용될 수 있다는 보고는 이제까지 없었다. 스트렙토코커스 써모필러스 돌연변이주도 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 돌연변이주도 이제까지 설명된 바 없다.
발명의 개요 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 D-시클로세린에 내성이 있는 일군의 유산균 돌연변이주들을 밀크 발효에 사용할 경우, 모균주보다 훨씬 높은 전단응력(shear stress) 및/또는 겔 강성(gel stiffness)를 발생시킨다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 항생제인 D-시클로세린 및/또는 그의 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 이러한 텍스처화 유산균 균주를 얻는 방법을 제공하였으며 높은 텍스처화 특성을 갖는, D-시클로세린 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스종의 신규한 일군의 유산균 균주들을 제공하였다. 전술한 놀라운 발견에 따라, 본 발명은 D-시클로세린 및/또는 이것과 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스 종과 같은 텍스처화 유산균 균주 및 이러한 균주들을 수득하는 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 상기 돌연변이주를 포함하는 스타터 컬처와 같은 컬처 및 유제품, 예컨대 이러한 컬처로 발효된 발효유 제품에 관한 것이기도 하다.
발명의 상세한 설명 정의 본 발명에서 "유산균(lactic acid bacterium)"이라 함은 당을 발효시켜 아세트산 및 프로피온산과 함께 주로 젖산을 생산하는, 그램-양성의 미호기성 또는 혐기성 세균을 가리킨다. 산업상 가장 유용한 유산균은 "락토바실랄레스 (Lactobacillales)" 목에서 발견되는 것들로서, 여기에는 락토코커스 spp. ( Lactococcus spp.), 스트렙토코커스 spp. ( Streptococcus spp.), 락토바실러스 spp. ( Lactobacillus spp.), 류코노스톡 spp. ( Leuconostoc spp.), 페디오코커스 spp. ( Pediococcus spp.), 브레비박테리움 spp. ( Brevibacterium spp.), 엔테로코커스 spp. ( Enterococcus spp.) 및프로피오니박테리움 spp. ( Propionibacterium spp.)가 속한다. 이에 더해서, 편성 혐기성 세균 그룹인 비피도박테리아에 속하는 젖산 생성균, 즉, 비피도박테리움 spp. ( Bifidobacterium spp.) 역시도 일반적으로 유산균 그룹에 포함된다. 이들은 흔히 식품 컬처에 단독으로 사용되거나 또는 다른 유산균과 조합하여 사용된다. 락토바실러스 종 및 스트렙토코커스 써모필러스 종의 세균을 포함하는 유산균은 보통 유제품 산업에서 발효유 제품과 같은 유제품 생산을 위한 발효용기 또는 발효통(vat) 내로의 직접 접종을 위하여, 소위 소위 "Direct Vat Set (DVS)" 컬처로서 또는 벌크 스타터 번식을 위해 냉동된 컬처 또는 동결건조된 컬처로서 공급된다. 이러한 컬처는 일반적으로 "스타터 컬처(starter cultures)" 또는 "스타터"로서 칭해진다. 본 명세서에서 "밀크(milk)"라 함은 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타와 같은 여하한 모든 포유동물을 착유하여 수득되는 젖의 분비로서 이해하여야 한다. 바람직한 구체예에서, 밀크는 우유이다. 밀크라는 용어는 또한 예컨대 두유와 같이, 식물성 물질로 만들어진 단백질/지방 용액도 포함한다. "밀크 기질(milk substrate)"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따라 발효될 수 있는 모든 원유 밀크 및/또는 가공된 밀크 물질일 수 있다. 따라서, 유용한 밀크 기질의 비제한적인 예로는 호울 밀크, 또는 저지방 밀크, 스킴 밀크, 버터밀크, 재조성된 분유, 농축유, 건조유, 유청, 퍼미에이트(permeate), 락토스, 락토스를 결정화시켜 얻은 모액, 유청단백질 농축물, 또는 크림을 포함한 모든 밀크 또는 밀크 유사 제품의 용액/현탁액을 들 수 있다. 밀크 기질은 예컨대 실질적으로 순수한 포유동물 밀크로부터 유래한 것일 수도 있고, 도는 재조성된 분유로부터 유래된 것일 수도 있다. 좋기로는, 밀크 기질 중 단백질의 적어도 일부는 카제인 또는 유청 단백질과 같이 밀크 중에서 자연발생하는 단백질인 것이 바람직하다. 그러나, 단백질 부분은 밀크에서 자연발생하지 않는 단백질일 수도 있다. 발효에 앞서서, 본 발명이 속한 기술 분야에 알려진 방법에 따라 밀크 기질을 균질화시킨 다음 파스퇴르처리할 수 있다. 본 명세서에서 "균질화(homogenizing)"이라는 용어는 가용성 현탁액 또는 에멀젼을 얻기 위해 격렬히 혼합하는 것을 의미한다. 만일 발효에 앞서서 균질화를 수행할 경우, 이는 유지방을 보다 작은 크기로 분해하여 밀크로부터 더 이상 분리되지 않도록 하기 위하여 수행되는 것일 수 있다. 이것은 밀크를 작은 오리피스를 통해 고압으로 밀크에 힘을 가함으로써 수행될 수 있다. 본 명세서에서 "파스퇴르 처리(Pasteurizing)"라 함은 미생물과 같은 살아있는 생명체의 존재를 감소시키거나 박멸하기 위한 밀크 기질의 처리를 의미한다. 좋기로는, 파스퇴르 처리는 특정 온도를 특정 기간 동안 유지함으로써 달성된다. 특정 온도는 일반적으로 가열에 의하여 달성한다. 온도 및 기간은 유해 세균과 같은 특정 세균을 사멸시키거나 불활성화시키도록 선택될 수 있다. 급속 냉각 단계가 이어질 수 있다. 본 발명의 방법에서 "발효"라 함은 미생물의 작용에 의하여 탄수화물이 알코올 또는 산으로 전환되는 것을 의미한다. 좋기로는, 본 발명의 방법에서 발효는 락토스를 젖산으로 변환시키는 것이다. 발효유 제품을 생산하는데 사용되는 발효법은 잘 알려져 있으며 당업자라면 적절한 작업 조건, 예컨대 온도, 산소, 미생물(들)의 양 및 특징, 및 가공 시간과 같은 적절한 공정 조건을 어떻게 선택해야할지 잘 알 것이다. 발효 조건은 본 발명을 달성하기 위하여, 즉, 유제품을 고체 또는 액체 형태(발효유 제품)로 수득할 수 있도록 선택된다. 본 발명의 문맥상, 요거트 스타터 컬처는 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 세균 컬처이다. 따라서, "요거트"라 함은 밀크에 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주와 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 조성물을 접종 및 발효시켜 얻을 수 있는 발효유 제품을 일컫는다. 본 발명의 문맥상, "전단응력(shear stress)"은 점도를 결정한다. 점도 (단위 Pa·s)는 전단응력(Pa)/전단율(1/s)로서 정의된다. 전단응력 값은 본 발명에서 전단율 = 300 1/s에서의 스탠다드로서 보고된다. 관능실험 결과(데이터 제시하지 않음), 레올로지 측정값과 관능 점도(sensory viscosity)/입안 농후도(mouth thickness) 간의 베스트 상관관계는 전단율 300 1/s에서 측정된 점도를 이용할 경우 발견되는 것으로 나타났다. 본 발명의 문맥상, "기능적으로 동등한 항생제(functionally equivalent antibiotic)"라는 용어는 D-시클로세린과 동일한 작용 모드 또는 동일한 표적을 갖는 항생제, 예컨대 D-알라닐-D-알라닌 리가제의 다른 억제제, 예컨대 반코마이신 (Tytgat 외 (2009), Curr. Med. Chem. 16(20) : 2566-2580) 및 D-알라닌 라세마제의 다른 억제제, 예컨대 O-카바모일-D-세린, 알라포스핀 및 할로알라닌 (Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258)을 의미한다. "D-시클로세린 및/또는 기능적으로 동등한 항생제에 내성이다"라 함은 컬처 배지 중 상기 항생제의 존재 하에서, 특정의 돌연변이된 세균 균주가 사멸되지 않거나, 또는 상기 돌연변이된 균주가 유도된 대응하는 돌연변이되지 않은 균주에 비해 훨씬 느리게 사멸되는 것을 의미한다. 컬처 배지 중의 항생제 화합물의 농도에 따라, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 균주들의 변경된 성장 특성에 의해서도 내성이 반영될 수 있다. 예를 들어, 컬처 배지 중에 항생제가 저농도로 포함되어도 돌연변이되지 않은 균주의 성장은 방지되거나 현저히 감소될 것이지만 돌연변이된 균주의 성장은 영향을 받지 않는다. 내성 평가시 민감한 레퍼런스 균주로서 사용될 수 있는 돌연변이되지 않은 균주로는 좋기로는 균주 CHCC13995 및 CHCC13994를 들 수 있다. 본 발명의 실시예 1 및 2는 D-시클로세린에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스와 스트렙토코커스 써모필러스 각각의 돌연변이주들의 분리를 예시하고 있다. 당업자라면 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 기초하여, 돌연변이되지 않은 각 모균주에 대하여 D-시클로세린 및/또는 기능적으로 동등한 항생제에 대해 내성인 돌연변이 균주는 사멸시키기 않거나 사멸시켜도 훨씬 느리게 사멸시키지만 모균주의 세포 대다수는 효과적으로 사멸시키는 D-시클로세린의 양 또는 기능적으로 동등한 항생제의 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 문맥상 "돌연변이주(mutant)"라는 용어는 예컨대 유전자 조작, 방사능 및/또는 화학물질 처리 수단에 의하여 본 발명의 균주(또는 모균주)로부터 유도된 균주 또는 유도될 수 있는 균주인 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이주는 자연발생적인 돌연변이주일 수도 있다. 이러한 돌연변이주는 기능적으로 동등한 돌연변이주, 예컨대, 모균주와 동등하거나 개선된 특성 (예컨대, 텍스처, 전단응력, 점도, 겔 강성, 마우쓰 코팅, 풍미, 포스트 산성화, 산성화 속도 및/또는 파지 로버스트성)을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 돌연변이주 역시 본 발명의 일부이다. 특히, "돌연변이주"라는 용어는 본 발명의 균주를 에탄 메탄 설포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)와 같은 화학적 돌연변이원, UV 광선을 이용한 처리와 같은 돌연변이 처리하여 얻어진 균주 또는 자연발생적인 돌연변이주를 가리킨다. 돌연변이주는 수회에 걸쳐 돌연변이 처리될 수 있으나 (일회 처리는 스크리닝/선택 단계를 수반하는 한번의 돌연변이 단계이다), 좋기로는 이러한 처리(또는 스크리닝/선택 단계)를 20회 이하, 또는 10회 이하, 또는 5회 이하로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직한 돌연변이주에서는 모균주에 비하여 세균 게놈 중의 뉴클레오타이드의 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 또는 심지어 0.0001% 미만이 다른 뉴클레오타이드로 치환되거나, 결실된 것이다. 본 명세서에서, "변이체(variant)"라는 용어는 본 발명의 균주와 기능적으로 동등한 균주인 것으로서, 예컨대, 텍스처, 전단응력, 점도, 겔 강성, 마우스 코팅, 풍미, 포스트 산성화, 산성화 속도, 및/또는 파지 로버스트성의 측면에서 본 발명의 균주와 실질적으로 동등하거나 더욱 개선된 특성을 갖는 균주인 것으로 이해되어야 한다. 적절한 스크리닝 기술을 이용하여 동정될 수 있는 이러한 변이체는 본 발명의 일부이다. 본 발명의 문맥상 (특히 첨부된 특허청구범위에서) "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 용어는 달리 언급되거나, 문맥상 명백히 반대의 뜻을 가리키는 것이 아닌 한 단수와 복수를 모두 포괄하는 것이다. "포함하는", "갖는", "비롯하여", 및 "함유하는" 등의 용어는 달리 언급하지 않는 한 확장가능한(open-ended) 용어로서 이해되어야 한다 (즉, "...을 포함하나 이에 한정되지 않는"의 의미). 본 발명에서 어떤 값을 범위로 나타낼 경우, 달리 언급하지 않는 한 그 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값들도 모두 칭하여 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 이러한 각각의 분리된 개별적인 값들은 명세서에서 개별적으로 명시된 것처럼 이해되어야 한다. 본 발명에 설명된 모든 방법은 달리 언급하거나, 명백히 반대되는 문맥으로 이해되지 않는 한 여하한 적절한 순서로 수행되어도 무방하다. 모든 예시, 예시적인 언어 (예컨대 "..와 같은") 등의 용어는 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위하여 사용된 용어일 뿐, 달리 주장되지 않는 한, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 어떠한 표현도 필수구성이 아닌 구성요소를 본 발명에 있어서 필수적인 것으로 이해되도록 해석되어서는 아니된다. 본 발명의 실시 및 태양 D-시클로세린 (D-4-아미노-이속사졸리돈)은 세포 용해를 일으키는 D-알라닌 퍼미아제, 알라닌 라세마제, D-알라닐-D-알라닌 리가제, 및 D-알라닐알라닌 신타제를 억제하는 항생제이다. D-시클로세린에 대해 내성인 미코박테리움(Mycobacterium)의 돌연변이주들은 D-알라닌 라세마제 유전자의 발현을 증가시킴으로 해서 D-알라닌을 과생산한다 (Caceres 외 (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055). 따라서, 본 발명의 발명자들은 D-알라닌을 본래부터 더 많이 생산하는 유산균 균주의 자연발생적인 돌연변이주를 분리하는 것이 가능할 것으로 판단하였다. 이러한 돌연변이주들을 분리 및 특징화하였다. 당업자들은 본 명세서에 설명된 유형의 돌연변이주의 분리를 위하여, D-시클로세린과 동일한 작용 모드 또는 동일한 표적을 갖는 다른 항생제들을 단독으로 사용하거나 또는 D-시클로세린과 병용할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 D-알라닐-D-알라닌 리가제 또는 D-알라닌 라세마제의 다른 억제제와 같은 기능적으로 동등한 다른 항생제들의 사용도 포괄한다. 본 발명에서 "D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제(functionally equivalent antibiotics to D-cycloserine)"라는 용어에는, D-알라닌의 합성을 방해하고, D-,알라닌이 세포내로 운반되는 것을 방해하며, D-알라닌으로부터 D-알라닐-D알라닌의 형성을 방해하거나, D-알라닐-D-알라닌이 펩티도글리칸 폴리머의 빌딩 블록 내로 포함되는 것을 방해하는 화합물들이 모두 포괄된다. 이러한 항생제의 예로는, 효소인 D-알라닌-라세마제, D-알라닐-D-알라닌 리가제, D-알라닐알라니나제 신타제 및 D-알라닌 퍼미아제를 억제하는 항생제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. D-시클로세린과 기능적으로 동등한 이러한 항생제들의 예로는 반코마이신, O-카바모일-D-세린, 알라포스핀 및 할로알라닌을 들 수 있으나 이에 한정되지 ㅇ아않는다. D-시클로세린에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스의 몇몇 돌연변이주들은 밀크에서 생육시킬 경우 모균주의 다른 성장 특성을 유지하면서도 모균주에 비해 증가된 텍스처를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 전술한 놀라운 발견에 따라, 본 발명의 제1 태양은: a) 유산균 모균주를 제공하는 단계; b) D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린에 대하여 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 모균주의 돌연변이주를 분리하는 단계; 및 c) 밀크에서 성장시킬 경우 모균주에 비해 전단응력 및/또는 겔 강성이 더 클 경우 더 높은 텍스처를 제공하는 것으로 판정되는 돌연변이주를 선택함으로써, 텍스처화 유산균 균주를 수득하는 단계 를 포함하여 이루어지는, 텍스처화 유산균 균주를 수득하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 전술한 제1 태양은: a) 유산균 모균주를 제공하는 단계; b) D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린에 대하여 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 모균주의 돌연변이주를 분리하는 단계; 및 c) 밀크에서 성장시킬 경우 모균주에 비해 전단응력 및/또는 겔 강성이 더 클 경우 더 높은 텍스처를 제공하는 것으로 판정되는 돌연변이주를 선택함으로써, 밀크에서 성장시킬 경우 전단응력 및/또는 겔 강성이 증가되는 유산균 돌연변이주를 수득하는 단계 를 포함하여 이루어지는, 밀크에서 성장시킬 경우 전단응력 및/또는 겔 강성이 증가되는 유산균 돌연변이주를 수득하는 방법에 관한 것이다. 증가된 전단응력 및/또는 증가된 겔 강성에 의해 결정되는 바와 같이 모균주에 비해 선택된 돌연변이주에 의해 더 높은 텍스처가 발생하는 것은 전유와 저지방유 모두에서 일어난다. 바람직한 일 구체예에서, 밀크는 우유이다. 좋기로는 밀크는 전유 우유인 것이 좋다. 바람직한 일 구체예에서 유산균 모균주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유산균이다. 그러나, 다른 유산균, 예컨대 락토코커스( Lactococcus spp . ), 락토바실러스( Lactobacillus spp . ), 류코노스톡( Leuconostoc spp . ), 페디오코커스( Pediococcus spp . ), 브레비박테리움( Brevibacterium spp . ), 엔테로코커스 ( Enterococcus spp .), 프로피오니박테리움( Propionibacterium spp .), 및 비피도박테리움( Bifidobacterium spp .)을 사용하는 것도 본 발명의 일부이다. 바람직한 일 구체예에서, 돌연변이주들은 D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제를 함유하는 성장 배지에서 유산균 모균주를 인큐베이션시키고, D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제에 의해 사멸되지 않거나 또는 시험된 비돌연변이 세포들 대다수보다 현저히 더 느리게 사멸되는 모균주의 돌연변이주를 분리함으로써 수득된다. 그러나, 본 발명은 D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제에 대한 돌연변이주를 분리하는 당업자에게 공지인 다른 방법 역시도 포괄한다. 따라서, 본 발명의 제1 태양의 방법에 사용되는 모균주는 D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성이 없거나 (또는 내성이 덜한) 균주이다. 일 구체예에서 돌연변이주는 D-시클로세린 및/또는 D-시클로세린과 기능적으로 동등한 항생제에 내성인 자연발생적인 돌연변이주일 수 있다. 또 다른 구체예에서 본 발명의 방법은 모균주를 예컨대 b 단계 전 또는 b 단계 동안 돌연변이시키는 단계 (예컨대 화학처리 또는 방사능 처리 또는 유전자 조작기술 수단에 의한다)를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서 돌연변이주는 모균주를 예컨대 화학처리 또는 방사능 처리하여 얻을 수 있으며, 또는 유전자조작 기술 수단에 의해 수득된 돌연변이일 수도 있다. "텍스처(texture)" 또는 "구강촉감(mouthfeel)"이라 함은 입 안에서의 제품의 이화학적 상호작용을 의미하는 것이다. 밀크의 텍스처를 측정하는 방법으로는 발효유의 전단응력(점도) 또는 겔 강성을 측정하는 것을 들 수 있으며 용이하게 실시가능하며 본 발명에 속한 기술 분야에 익히 알려져 있을 뿐 아니라 본 명세서에도 예시되어 있다. 돌연변이주는 단계 c)에서, 만일 이것이 모균주와 동량, 예컨대 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우, 발효유 중에서 모균주보다 더 큰 전단응력 및/또는 더 큰 겔 강성을 나타내는 것에 의해 판정되는 바와 같이 더 큰 텍스처를 발생시킬 경우 선택된다. 바람직한 일 구체예에서, 돌연변이주는 300 1/s (Pa)로서 전단응력으로서 측정시 밀크 중에서, 모균주에 의해 발생되는 점도보다 적어도 약 5% 더 높은, 적어도 약 10% 더 높은, 적어도 약 15% 더 높은, 적어도 약 20% 더 높은, 적어도 약 25% 더 높은, 적어도 약 30% 더 높은, 적어도 약 35% 더 높은, 적어도 약 40% 더 높은, 적어도 약 50% 더 높은 점도를 발생시킨다. 또 다른 바람직한 일 구체예에서, 돌연변이주는 밀크 중에서, 모균주에 의해 발생되는 겔 강성보다 적어도 약 5% 더 높은, 적어도 약 10% 더 높은, 적어도 약 15% 더 높은, 적어도 약 20% 더 높은, 적어도 약 25% 더 높은, 적어도 약 30% 더 높은, 적어도 약 35% 더 높은, 적어도 약 40% 더 높은, 적어도 약 50% 더 높은 겔 강성을 발생시킨다. 좋기로는, 돌연변이주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후 300 1/s (Pa)로서 전단응력으로서 측정시, 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유(full fat cow milk) 중에서 약 105 Pa 보다 높은 점도를 발생시키고, 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후 300 1/s (Pa)로서 전단응력으로서 측정시, 약 75 Pa 보다 높은 점도를 발생시킨다. 바람직한 일 구체에에서, 돌연변이주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후, 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유 중에서 약 80 Pa 보다 높은 겔 강성을 발생시키고, 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후, 약 140 Pa 보다 높은 겔 강성을 발생시킨다. 제2 태양에서 본 발명은 본 발명의 제1 태양에 따른 방법에 의해 수득가능한 유산균 균주에 관한 것이다. 바람직한 일 구체예에서, 유산균 균주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 및 스트렙토코커스 써모필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주이다. 또 다른 바람직한 일 구체예에서, 유산균 균주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후 300 1/s (Pa)로서 전단응력으로서 측정시, 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유(full fat cow milk) 중에서 약 105 Pa 보다 높은 점도를 발생시키고, 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후 300 1/s (Pa)로서 전단응력으로서 측정시, 약 75 Pa 보다 높은 점도를 발생시킨다. 좋기로는, 유산균 균주는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후, 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유 중에서 약 80 Pa 보다 높은 겔 강성을 발생시키고, 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 경우, 밀크 1 ml 당 적어도 10 4 개 세포의 양으로 접종될 경우 37℃ 밀크 중에서 12 시간 성장 후, 약 140 Pa 보다 높은 겔 강성을 발생시킨다. 제3 태양에서 본 발명은 도이치 잠룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24019로 기탁된 균주 CHCC12944, 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24020으로 기탁된 균주 CHCC12945 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스종에 속하는 유산균 균주에 관한 것이다. 돌연변이주와 변이체는 이들의 기원이 된 기탁된 균주의 전단응력 및/또는 겔 강성 특징을 나타낸다. 제4 태양에서 본 발명은 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24010으로 기탁된 균주 CHCC13235, 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24011로 기탁된 균주 CHCC13236 및 이들의 돌연변이주 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 유산균 균주에 관한 것이다. 돌연변이주와 변이체는 이들의 기원이 된 기탁된 균주의 전단응력 및/또는 겔 강성 특징을 나타낸다. 제5 태양에서, 본 발명은 도이치 잠룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24019로 기탁된 균주 CHCC12944, 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24020으로 기탁된 균주 CHCC12945와 동일하거나 더 개선된 겔 강성 및/또는 전단응력 특성을 갖는, D-시클로세린 및/또는 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 종에 속하는 유산균 균주에 관한 것이다. 제6 태양에서, 본 발명은 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24010으로 기탁된 균주 CHCC13235, 도이치 잠룽 폰 미크로오가니멘 운트 젤쿨투렌에 수탁번호 DSM 24011로 기탁된 균주 CHCC13236와 동일하거나 더 개선된 겔 강성 및/또는 전단응력 특성을 갖는, D-시클로세린 및/또는 기능적으로 동등한 항생제에 대하여 내성인 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 유산균 균주에 관한 것이다. 제7 태양에서 본 발명은 본 발명의 제2 태양 내지 제6 태양에 따른 유산균 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서 조성물은 혼합물 또는 키트-오브-파츠(kit-of-parts)로서: i) 본 발명의 제2 태양, 제4 태양 또는 제6 태양에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주; 및 ii) 본 발명의 제2 태양, 제3 태양 또는 제5 태양에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주를 포함한다. 일 구체예에서 조성물은 좋기로는 적어도 10 9 CFU (세포형성단위: cell forming units)의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 종에 속하는 균주; 및 적어도 10 10 CFU의 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주를 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에서 조성물은 적어도 10 11 CFU의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 종에 속하는 균주; 및 적어도 10 12 CFU의 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주를 포함한다. 바람직한 일 구체예에서 조성물은 스타터 컬처로서 유리하게 사용가능하며, 냉동, 동결건조되거나 또는 액체 형태이다. 제8 태양에서 본 발명은 본 발명의 제2 태양 내지 제6 태양 중 어느 하나에 따른 유산균 균주 또는 본 발명의 제7 태양에 따른 조성물로 밀크 기질을 발효시킴으로써 유제품을 얻는 것을 포함하는, 발효유 제품과 같은 유제품의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법에 의하여 생산된 유제품은 각각 본 발명의 제2 태양 내지 제6 태양 중 어느 하나에 따른 유산균 균주 또는 본 발명의 제7 태양에 따른 조성물의 유산균 균주를 포함한다. 이 방법에서 밀크 기질은 락토바실러스 종에 속하는 균주와 같은, 본 발명의 균주에 의한 발효 전, 발효 중 또는 발효 후에, 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주와 같은, 본 발명의 균주에 의해 발효될 수 있다. 또한, 상기 방법은 단백질을 가교시킬 수 있는 효소, 트랜스글루타미나제, 아스파틱 프로테아제, 키모신 및 렌넷으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소와 같은 효소를 발효 전, 발효 중 또는 발효 후에, 밀크 기질에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 제9 태양에서 본 발명은 본 발명의 제8 태양에 따른 방법에 의해 수득가능한 유제품, 예컨대 발효유 제품 (예컨대 요거트 또는 버터밀크) 또는 치즈 (예컨대 파스타 필라타의 생치즈)에 관한 것이다. 상기 유제품은 유산균을 포함한다. 상기 유제품은 과일 농축물, 시럽, 프로바이오틱 세균 컬처, 색소, 농후제, 풍미제, 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 포함할 수 있고; 및/또는 상기 유제품은 스터드형(stirred type) 제품, 세트형(set type) 제품 또는 마실 수 있는 제품의 형태일 수 있다. 제10 태양에서 본 발명은 본 발명의 제2 태양 내지 제6 태양 주우 어느 하나에 따른 유산균 균주를 포함하는 유제품에 관한 것이다. 제11 태양에서 본 발명은 발효유 제품 제조를 위한 본 발명의 제2 태양 내지 제6 태양 중 어느 하나에 따른 유산균 균주의 용도에 관한 것이다. 본 발명을 이하의 비제한적인 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다.
도 1은 모균주인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC13995 및 CHCC13995의 2종의 D-시클로세린 돌연변이들인 CHCC12944와 CHCC12945의 43℃에서의 밀크 중 산성화 프로파일(시간에 대한 함수로서 pH)을 도시한 도면이다.
도 2는 모균주인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC13995 및 CHCC13995의 2종의 D-시클로세린 돌연변이들인 CHCC12944와 CHCC12945의, 43℃에서의 2% 탈지유 분말이 부가된 전유(full fat milk) 중에서의 전단응력 (300 1/s (Pa))을 나타낸 도면이다.
도 3은 모균주인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC13995 및 CHCC13995의 2종의 D-시클로세린 돌연변이들인 CHCC12944와 CHCC12945의, 43℃에서의 2% 탈지유 분말이 부가된 전유 중에서의 겔 강성(300 1/s (Pa))을 나타낸 도면이다.
도 4는 모균주인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC13995 및 CHCC13995의 2종의 D-시클로세린 돌연변이들인 CHCC12944와 CHCC12945의, 43℃에서의 2% 탈지유 분말이 부가된 전유 중에서의 전단응력 (300 1/s(Pa))을 나타낸 도면이다.
도 5는 모균주인 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC13994 및 CHCC13994의 2종의 D-시클로세린 돌연변이들인 CH13235와 CH13236의, 43℃에서의 2% 탈지유 분말이 부가된 전유 중에서의 겔 강성(300 1/s (Pa))을 나타낸 도면이다.
실시예 실시예 1: 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스에서 개선된 레올로지 특성을 갖는 돌연변이주를 분리하기 위한 D- 시클로세린의 사용. 재료 및 방법 균주 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC13995 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC12944 (CHCC13995의 D-시클로세린 내성 돌연변이주) 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC12945 (CHCC13995의 D-시클로세린 내성 돌연변이주) 돌연변이주 분리 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC13995의 돌연변이주를 분리하기 위해, 단일 콜로니를 성장시켜 유도한 세포들을, D-시클로세린을 50-100 ㎍/ml의 범위로 함유하는 MRS 브로쓰 내로 접종하여 포화될 때까지 성장시켰다. 세포들을 희석하고 MRS 플레이트 상에 도말한 다음, 50-100 ㎍/ml 범위의 D-시클로세린의 존재 하에서의 성장 능력을 알아보기 위하여 마이크로타이터 플레이트에서 콜로니들을 스크리닝하였다. 일반적으로, 결과적인 콜로니들의 25%는 D-시클로세린 존재하에서 빨리 성장하는 것으로 동정되었다. 이들을 추가 연구를 위해 선택하였다. 선택된 D-시클로세린 내성 돌연변이주들을 추가 정제하고 밀크 중에서의 이들의 성장 능력을 검사하였다. 이 검사 중에 돌연변이들 중 몇몇이 이들 조건 하에서 모균주보다 상당히 높은 텍스처를 생성하는 것으로 관찰되었다. 레올로지 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유에서 성장시킨 후, 스웨덴의 ReoLogica Instruments AB사 제품 StressTech 레오미터를 이용하여 레올로지 분석을 수행하였다. 결과 CHCC13995의 2 가지 돌연변이주인 CHCC12944 및 CHCC12945는 모균주에 비해 증가된 전단응력(점도)와 겔 강성을 가짐으로 해서 유의적으로 더 높은 텍스처를 제공하였다. 이것은 발효유 내부를 피펫으로 교반함으로써 곧 바로 확인가능하였다. 뿐만 아니라, 다양한 돌연변이들 간에 유청(whey)의 양이 서로 차이가 나는 것으로 관찰되었는데 이것은 추가 연구를 위한 돌연변이 선택에 사용된 변수들 중 하나가 되었다 (하기 표 1 참조). 선택된 돌연변이들주은 저수준의 시네레시스(액화: syneresis)를 나타내는 것들이었다: 하기 예시 (표 1)에서 돌연변이주 1 및 돌연변이주 11은 각각 돌연변이주 CHCC12944 및 CHCC12945에 대응한다.
농후도가 증가한 것으로 나타난 관찰 결과가 실제 레올로지 테스트에 의해 뒷받침되었다 (표 2 및 도 2 및 도 3). 돌연변이주 CHCC12945 및 CHCC12944의 겔 강성 증가는 52% 내지 59% 사이였다. 전단응력도 더 높았지만 겔 강성만큼 높지는 않았다 (표 2 및 도 2 및 도 3).
| 샘플 | 300 1/s에서의 전단응력 (Pa) | 1Hz에서의 겔 강성 (Pa) | | CHCC13995 | 99 | 58.55 | | CHCC12945 | 108.5 | 93.20 | | CHCC12944 | 108 | 89.05 |
레올로지 개선과 별개로, 산성화와 같은 다른 중요한 특성이 훼손될 경우 그 돌연변이주는 덜 매력적이게 될 것이다. 43락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스에서 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유에서 성장될 경우, 선택된 돌연변이주의 산성화 프로파일은 대응하는 모균주의 경우와 동일하다 (도 1). 결론 본 발명에 설명된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 D-시클로세린 돌연변이주는 스타터 컬처와 같은 컬처에 혼합되어 원하는 고수준의 텍스처를 제공할 수 있다. 실시예 2: 스트렙토코커스 써모필러스에서 개선된 레올로지 특성을 갖는 돌연변이주를 분리하기 위한 D- 시클로세린의 사용. 재료 및 방법 균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC13994 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC13236(CHCC13994의 D-시클로세린 내성 균주) 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC13235(CHCC13994의 D-시클로세린 내성 균주) 돌연변이주 분리: 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC13994의 돌연변이주를 분리하기 위해, 단일 콜로니를 성장시켜 유도한 세포들을, D-시클로세린을 50-70 ㎍/ml의 범위로 함유하는 M17+2% 락토스 브로쓰 내로 접종하여 포화될 때까지 성장시켰다. 세포들을 희석하고 M17+2% 락토스 플레이트 상에 도말한 다음, 콜로니들을 골라서 50-70 ㎍/ml 범위의 D-시클로세린의 존재 하에서의 이들의 성장 능력을 알아보기 위하여 마이크로타이터 플레이트에서 콜로니들을 스크리닝하였다. 일반적으로, 결과적인 콜로니들의 25%는 D-시클로세린 존재하에서 빨리 성장하는 것으로 동정되었다. 이들을 추가 연구를 위해 선택하였다. 선택된 D-시클로세린 내성 돌연변이주들을 추가 정제하고 밀크 중에서의 이들의 성장 능력을 검사하였다. 이 검사 중에 돌연변이들 중 몇몇이 이들 조건 하에서 모균주보다 상당히 높은 텍스처를 생성하는지를 관찰하였다. 유청의 양 역시도 겔 강성의 높고 낮음을 가리키는 척도로 삼았다. 레올로지 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유에서 성장시킨 후, 스웨덴의 ReoLogica Instruments AB사 제품 StressTech 레오미터를 이용하여 레올로지 분석을 수행하였다. 결과 CHCC13994의 2 가지 돌연변이주인 CHCC13235 및 CHCC13236은 모균주에 비해 유의적으로 더 높은 텍스처를 제공하였다. 이것은 발효유 내부를 피펫으로 교반함으로써 곧 바로 확인가능하였다. 뿐만 아니라, 다양한 돌연변이들 간에 유청(whey)의 양이 서로 차이가 나는 것으로 관찰되었는데 이것은 추가 연구를 위한 돌연변이 선택에 사용된 변수들 중 하나가 되었다 (하기 표 3 참조). 선택된 돌연변이주들인 하기 표 3의 돌연변이주 9 및 돌연변이주 13은 낮은 시네레시스를 나타내는 2개 돌연변이주들이었다. 이들 2종의 돌연변이주들을 각각 CHCC13236 및 CHCC13235라 명명하였다.
농후도가 증가한 것으로 나타난 관찰 결과가 실제 레올로지 테스트에 의해 뒷받침되었다 (도 4 및 도 5). 돌연변이주 CHCC13236의 경우 전단응력이 15% 증가하고 겔 강성은 19% 증가하였으며, CHCC13235의 경우에는 겔 강성만이 증가 (23%)한 것으로 나타났다 (표 4).
| 샘플 | 300 1/s에서의 전단응력 (Pa) | 1Hz에서의 겔 강성 (Pa) | | CHCC13994 | 69.6 | 136.6 | | CHCC13236 | 79.7 | 162.5 | | CHCC13235 | 64.9 | 167.3 |
산성화 프로파일의 경우, 선택된 돌연변이주와 대응하는 모균주가 서로 동일하였다 (데이터 미제시). 결론 본 발명에 설명된 스트렙토코커스 써모필러스 D-시클로세린 돌연변이주들은 스타터 컬처와 같은 컬처에 혼합되어 원하는 고수준의 텍스처를 제공할 수 있다. 실시예 3: 발효유 제품의 제조를 위한 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바 실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 D- 시클로세린 돌연변이주들의 사용 스트렙토코커스 써모필러스와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스를 9:1의 비율로 혼합하여 2% 탈지유 분말이 첨가된 전유 우유 내로 접종하여 요거트를 만들었다. 제1 혼합물은 모균주 CHCC13994 및 CHCC13995로 만들고; 제2 혼합물은 스트렙토코커스 써모필러스 D-시클로세린 돌연변이주 CHCC13236 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 D-시클로세린 돌연변이주 CHCC12945로 만들었으며, 제3 혼합물은 스트렙토코커스 써모필러스 D-시클로세린 돌연변이주 CHCC13235 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 D-시클로세린 돌연변이주 CHCC12945로 만들었다. 이들 3종의 혼합 조합물 간의 산성화 프로파일을 비교하자 2종의 돌연변이들을 포함하는 혼합물들의 경우 모균주들로 된 조합물보다 최종 pH가 약간 더 높았다 (데이터 미제시). 숟가락으로 교반한 결과 D-시클로세린 돌연변이주들로 만들어진 제품은 모균주들로 만들어진 제품에 비해 교반에 대해 저항이 크게 증가된 것으로 나타났다. 또한, 얻어진 요거트는 3명의 검사자들의 평가 결과 더욱 크리미한 텍스처를 나타냈고 더 신선한 맛을 내는 것으로 평가되었다.
기탁 및 전문가 진술 ( DEPOSITS AND EXPERT SOLUTION ) 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus )의 균주들인 CHCC12944, CHCC12945 및 CHCC13935를 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 2010년 9월 22일 자로 각각 수탁번호 DSM 24019, DSM 24020 및 DSM 24021로 기탁하였다. 스트렙토코커스 써모필러스( Streptococcus thermophilus )의 균주들인 CHCC13235, CHCC13236 및 CHCC13994를 2010년 9월 22일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany)에 각각 수탁번호 DSM 24010, DSM 24011, 및 DSM 24012로 기탁하였다. 상기 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 협약의 규정 하에 이루어졌다. 본 출원인은 기탁된 미생물들의 시료가 본 출원인에 의하여 승인된 전문가에게만 분양될 것을 요구하는 바이다. 참고문헌 Tytgat 외 (2009), Curr. Med. Chem. 16(20) : 2566-2580. Caceres 외 (1997), J. Bacteriol. 179: 5046-5055. Holtje (2004), The Desk Encyclopedia of Microbiology: 239-258. 이 건 출원명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 그 내용 전체가 참조로 본 발명에 병합되었다.
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24010 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24011 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24012 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24019 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24020 20100922
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM24021 20100922 |
