アンピシリン耐性の質感付与性乳酸菌株

本発明は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)およびストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)等の乳酸菌の変異体であって、抗生物質アンピシリンに耐性で、かつ、乳中で増殖させると親株の他の増殖特性を保持しながら質感を向上させることが発見された変異体に関する。本発明は、さらに、このような変異体を含むスターター培養物などの培養物、およびこの培養物を用いて発酵させた乳製品に関する。

食品産業では、食品の味および質感を向上させるためのみならず、これらの食品の貯蔵寿命を延ばすために、数多くの細菌、特に乳酸菌、を使用する。酪農産業では、乳酸菌を、(発酵によって)乳を酸性化するためのみならず、それらを取り入れて製品に質感を与えるために、集中して使用する。

食品産業で使用される乳酸菌の中では、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、ペディオコッカス(Pediococcus)およびビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属が挙げられる。ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)種の乳酸菌は、単独でまたはラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)などの他の細菌と組み合わせて、食品、特に発酵製品の製造に広く用いられる。それらは、特に、発酵乳、例えばヨーグルトの製造に使用する発酵物の調合に用いられる。それらのいくつかは、発酵製品の質感を増強させるのに大きな役割を果たしている。この特性は、多糖類の産生と密接に関連している。

現在、ヨーグルトの流行は、マイルドな風味と高い質感である。今日、マイルドな風味と高い質感は、マイルドな風味を生みだす培養物を使用すること、および所望の濃厚さを与える増粘剤またはタンパク質を添加することによって達成されている。ヨーグルトの生産者は、増粘剤を添加せず、これらの細菌の特性によりヨーグルトを製造できるようにしたいと望んでいる。これにより、コストを削減し、成分表示の項目が減るだろう。これを達成するための非常に魅力的な方法の1つは、高レベルの質感を生みだすスターター培養物を得ることである。

業界の要求を満たすように食品に質感を与えるためには、乳酸菌、特にラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの新規な質感付与性(texturizing)株を設けることが必要となってきている。特にストレプトコッカス・サーモフィルスの新規質感付与性株と共に用いることができるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの新規質感付与性株が必要である。

本発明者らは、以前に、発酵乳製品用の乳基質を発酵するのに使用すると、高い質感をもたらすラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス菌等の改良された乳酸菌を同定するための新規な選択方法を開発した。

国際特許出願(PCT)第WO2012/052557号に記載されている方法は、本発明者が、驚くべきことに、乳酸菌のD−サイクロセリンおよび機能的に同等の抗生物質に対する耐性と質感付与特性の向上との間に関連性があることを確認したことに関する。

D−サイクロセリン(D−4−アミノイソオキサゾリジン)は、細胞溶解を引き起こすアラニンラセマーゼ、D−アラニル−D−アラニンリガーゼ、D−アラニル−アラニンシンターゼおよびD−アラニンパーミアーゼを阻害する抗生物質である。D−アラニンラセマーゼは、細胞壁のペプチドグリカン層に不可欠な部分であるD−アラニンの産生に必須である。

アンピシリンは、ベータラクタムクラスの抗生物質であり、ほとんどの乳酸菌を含む多くのグラム陽性菌に対して有効である。アンピシリンは、DD−トランスペプチターゼ型の酵素(EC3.4.16.4)の競合的阻害剤である。アンピシリンによるDD−トランスペプチターゼの阻害により、細菌細胞壁の形成に必要なペプチド結合の形成が妨げられ、最終的には細胞の溶解がもたらされる。

数多くの様々な細菌についてアンピシリン耐性の変異体が記述されているが、本発明者らの知る限り、従来技術では、本明細書中で述べるようなアンピシリン耐性と質感付与特性の向上と間の関連性については記載も示唆もされていない。

本発明者らは、驚くべきことに、アンピシリンに耐性である乳酸菌変異体群を乳の発酵に用いると、高い剪断応力および/またはゲル剛性が生じることを見出した。

本発明者らは、抗生物質アンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある質感付与性乳酸菌株を得るための方法を開発した。

本明細書中に記載する乳酸菌株を得るための方法は、以下の2つの工程を含む: (i)最初に、アンピシリンに耐性な乳酸菌株をスクリーニングし選択する、ここで、アンピシリンに耐性とは、天然/野生型の乳酸菌におけるものよりも通常著しく高いアンピシリン耐性が存在することを意味し得る;ならびに (ii)工程(i)で同定されたアンピシリン耐性株のプールから、質感付与特性が向上した乳酸菌株をスクリーニングし選択する。

本明細書の実施例2に示すように、本発明者らは、アンピシリン耐性乳酸菌株のプールからだと、質感付与特性が向上した乳酸菌株をスクリーニング/選択するのが比較的早いことを見出した。本質的に、この理由は、非常に多くの割合の(工程(i)で選択した)アンピシリン耐性乳酸菌株は、質感付与特性も向上していることを本発明者らが確認したからである。

従って、アンピシリン耐性についての最初のスクリーニングおよび選択は、質感付与特性が向上した乳酸菌株を迅速かつ効率的にスクリーニングおよび選択できるようにするための前工程の一種と見ることができる。

当業者には明らかなように、本明細書に記載のスクリーニングおよび選択方法の大きな利点は、質感付与特性が向上した乳酸菌株を比較的迅速かつ効率的にスクリーニングおよび選択できることである。

例えば、商業的に関連する特性を有する、例えば、発酵乳製品を調製するのに使用すると後酸性化が低くなるといった、乳酸菌株を既に有している場合、突然変異誘発のための出発細胞としてこの株を使用して、例えば、後酸性化が低いといったその良好な特性を維持したまま質感付与特性が向上した新規の乳酸菌株を比較的迅速に選択し得ることができる。

本明細書の実施例2に示すように、最初に選択したアンピシリン耐性株の約25%が、28mlの酸性化乳についてポリスチレン25mlピペットから少なくとも50秒間という流出時間による基準において、有意に高い質感をもたらした。

本明細書に記載の新規なスクリーニングおよび選択方法を使用することなく、このような長時間の流出時間をもたらす乳酸菌株を同定することは不可能であろう(または非常に長い時間がかかるであろう)ことを申し述べる。

理論に制限されるものではないが、驚くべきことに本明細書で確認されたアンピシリン耐性と質感付与特性の向上と間の関連性は、アンピシリン耐性乳酸菌細胞は、いわゆる細胞外多糖(EPS)を多く生成するという理論により説明できる可能性がある。よって、理論的には、そのようなEPSが細胞の周囲に一種の保護を与えている可能性、すなわち、これらのEPSは細胞に侵入しようとするアンピシリンから細胞を保護し、それによってより高いアンピシリン耐性がもたらされているという可能性が考えられる。

理論に制限されるものではないが、EPSの生成が増加することで、アンピシリン耐性乳酸菌を用いた発酵乳における質感が向上したという可能性も考えられる。

上述したように、本明細書中で同定した乳酸菌株は、最初に、アンピシリン耐性、すなわち天然/野生型の乳酸菌が耐えうるものよりも著しく高いアンピシリン濃度に対し耐性であることにより選択される。

上記の驚くべき知見に従って、本発明は、アンピシリンに耐性および/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性があるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス株等の質感付与性乳酸菌株、並びにこのような菌株を得るための方法に関する。さらに、本発明は、かかる変異体を含むスターター培養物等の培養物、並びにかかる培養物を用いて発酵した発酵乳製品等の乳製品に関する。

定義 本明細書で使用する場合、用語「乳酸菌」とは、糖を発酵し主に乳酸を生成し、そして酢酸およびプロピオン酸等を含む酸も生成する、グラム陽性の、微好気性または嫌気性細菌を指す。産業的に最も有用な乳酸菌は、「ラクトバチルス目(order Lactobacillales)」に見られ、ラクトコッカス種Lactococcus spp.)、ストレプトコッカス種(Streptococcus spp.)、ラクトバチルス種(Lactobacillus spp.)、ロイコノストック種(Leuconostoc spp.)、ペディオコッカス種(Pediococcusspp.)、ブレビバクテリウム種(Brevibacterium spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)、およびプロピオニバクテリウム種(Propionibacterium spp.)が挙げられる。加えて、厳格な嫌気性菌群に属する乳酸産生菌であるビフィズス菌、すなわちビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium spp.)も、一般に乳酸菌群に含まれる。これらは、しばしば食用培養物として単独または他の乳酸菌と組み合わせて使用される。ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)およびストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)種の菌を含む乳酸菌は、通常、バルクスターター培養用の凍結または凍結乾燥させた培養物、あるいは発酵乳製品などの乳製品を製造するための発酵容器またはバットに直接植菌するためのいわゆる「ダイレクトバットセット」(Direct Vat Set)」(DVS)培養物として酪農産業に供給される。このような培養物は、一般的に「スターター培養物」又は「スターター」と呼ばれている。

用語「乳」は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、またはラクダなどの任意の哺乳動物を搾乳して得られる乳汁分泌物として理解されるべきである。好ましい実施形態では、乳は牛乳である。乳という用語には、植物材料からなるタンパク質/脂肪の溶液、例えば、豆乳も含む。

用語「乳基質」は、本発明の方法に従って発酵させることができる任意の生乳および/または加工乳材料であり得る。従って、有用な乳基質として、これらに限定されないが、例えば、全乳または低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、再構成粉乳、練乳、粉乳、乳清、乳清透過液、乳糖、乳糖を結晶化させた母液、ホエータンパク質濃縮物、またはクリームなどのタンパク質を含む任意の乳または乳状製品の溶液/懸濁液が挙げられる。明らかに、乳基質は、任意の哺乳動物に由来するもの、例えば、実質的に純粋な哺乳動物の乳であってもよく、または再構成粉乳であってもよい。

好ましくは、乳基質中のタンパク質の少なくとも一部は、カゼインまたは乳清タンパク質などの天然の乳中に存在するタンパク質である。しかし、タンパク質の一部は、天然の乳中に存在しないタンパク質であってもよい。

発酵前に、乳基質を、当技術分野で既知の方法に従って均質化および低温殺菌してもよい。

本明細書で使用する場合、「均質化(Homogenizing)」とは、強力に混合することにより可溶性懸濁液またはエマルジョンを得ることを意味する。均質化を発酵前に行う場合、乳脂肪が乳から分離できないほど小さなサイズに破砕するように行ってもよい。乳を強制的に高圧で小さなオリフィスに通すことによって達成してもよい。

本明細書中で使用する「低温殺菌(Pasteurizing)」とは、微生物などの生きた生物の存在を低減または排除するために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、低温殺菌は、指定された期間、指定された温度を維持することによって達成される。指定された温度は、通常、加熱により達成される。温度および時間は、有害細菌などの特定の細菌を殺すまたは不活性化するように選択することができる。その後、急冷工程を行ってもよい。

本発明の方法における「発酵」とは、微生物の作用により炭水化物をアルコール又は酸に変換することを意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、乳糖を乳酸に変換することを含む。

発酵乳製品の製造に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素、微生物の量および特性、ならびに処理時間などの適切なプロセス条件をいかに選択するかがわかるであろう。明らかに、発酵条件は、本発明が達成できるように、すなわち、固体または液体の形態としての乳製品(発酵乳製品)を得るように、選択される。

本文脈において、ヨーグルトスターター培養物は、少なくとも1つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株および少なくとも1つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む細菌培養物である。本明細書では、「ヨーグルト」とは、乳を、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株およびストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物により発酵させることにより得られる発酵乳製品を指す。

「質感(texture)」または「口当たり(mouthfeel)」とは、口の中における製品の物理的および化学的な相互作用を意味する。

乳の質感を決定する方法には、発酵乳の剪断応力(粘度(viscosity))、ゲル剛性、および粘着性(ropiness)を測定することを含み、これらは容易に実現可能であり、当技術分野で公知であり、そして本明細書で説明される。

本文脈において、用語「剪断応力」、「ゲル剛性」、および「粘着性」が、粘度を決定する。

粘度(単位はPa・s)は、剪断応力(Pa)/剪断速度(1/s)として定義される。

剪断応力の値は、剪断速度=300(1/s)が本明細書の標準であるとする。剪断速度が300(1/s)と測定された粘度を使用すると、官能実験で、レオロジー測定値と粘度感/口当たりの濃さとの間に最高の相関が見られたことが示されている(データは示さず)。

用語「ゲル剛性」または「ゲル硬度」とは、発酵乳製品が圧力を受けたときにその構造が保持される時間の長さの尺度であり、1HZで測定される。

本明細書で使用する場合、用語「粘着性(ropiness)」とは、発酵乳製品における糸(stringsおよびthreads)の形成ならびに凝集性(cohesiveness)を意味する。粘着性は、Int.Dairy J.16(2);111−118(Folkenberg et al.2006)に記載のように定義および測定される。

本明細書の「アンピシリン耐性」という用語は、特定の変異体細菌株が、当該抗生物質を含む培養培地中で死滅しない、または当該変異体細菌株が由来する対応非変異株と比較してより死滅速度が有意に遅いことを意味する。耐性は、培養培地中の抗生物質化合物の濃度に依存した変異株および非変異株間の増殖特性の違いを反映し得る。例えば、培養培地中の抗生物質の濃度が低いと、非変異株の増殖が停止または大幅に減少する一方、変異株の増殖には影響しないということがある。好ましくは、耐性の評価における感受性標準株として使用できる非変異株として、CHCC13995株が挙げられる。

抗生物質アンピシリンに対し耐性である乳酸菌株とは、本明細書では、乳酸菌株の増殖に適した培地(例えば、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスにはMRS培地、ストレプトコッカス・サーモフィルスには、2%(w/v)乳糖を含有するM17)中で37℃で20時間の培養後、OD₆₀₀測定による増殖が、抗生物質アンピシリンを含まない当該培地内でのOD₆₀₀測定による増殖に比べ20%減少する抗生物質アンピシリンの量が400ng/mlより多い乳酸菌株として定義される。

アンピシリンに耐性である変異乳酸菌株は、本明細書ではさらに、E−テストで読み取る変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度(MIC)値が、当該変異株が由来する母株の場合よりも少なくとも1インクリメント(increment)高いことによっても定義される。

本文脈において、用語「変異体」は、本発明の株(または母株)を、例えば、遺伝子操作、放射線照射、および/または化学処理をすることにより得られる由来株または由来可能な株として理解されるべきである。また、変異体は、自然発生する変異体であってもよい。変異体は、機能的に同等な変異体、例えば、母株と実質的に同一または改善した特性(例えば、粘度、ゲル剛性、および粘着性に関する特性)を有する変異体であることが好ましい。このような変異体は、本発明の一部である。特に、用語「変異体」は、本発明の菌株に、エタンメタンスルホネート(EMS)又はN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトログアニジン(NTG)のような化学的突然変異原やUV光を用いた処理を含む従来から用いられている任意の突然変異誘発処理を施して得られる株、または本発明の菌株から自然発生する変異体を意味する。変異体には、複数の突然変異誘発処理(1つの処理とは、スクリーニング/選択工程前に行う1つの突然変異誘発工程であると理解すべきである)を施してもよいが、現在、20以下、または10以下、または5以下の処理(またはスクリーニング/選択工程)を実施することが好ましい。現在好ましい変異体は、母株と比較して、細菌ゲノムにおけるヌクレオチドの1%未満、0.1未満、0.01未満、0.001%未満、またはさらに低い0.0001%未満が削除または別のヌクレオチドに置換されている。

本文脈において、用語「多様体(variant)」は、本発明の株と機能的に同等な株、例えば、実質的に同一または改善した特性(例えば、粘度、ゲル剛性、および粘着性に関する特性)を有する株として理解されるべきである。適切なスクリーニング技術を用いて同定できる多様体は、本発明の一部である。

本発明を説明する文脈における(特に以下の特許請求の範囲の文脈における)用語「a」及び「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものとして解釈すべきである。用語「含む(containing)」、「有する(having)」、および「含む(including)」は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語(すなわち「含むが、これらに限定されない」という意味)として解釈すべきである。本明細書において値の範囲を列挙するのは、本明細書中に特に示さない限り、その範囲内の各個別の値をそれぞれ言及するための簡便な方法を単に提供するという意図であり、各個別の値はそれぞれ本明細書に列挙したかのように、明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に示す、任意の及び全ての例、または例示的な言葉(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をより明確にする意図であり、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言葉は、請求されていない要素が本発明の実施に必須であるという意味に解釈すべきではない。

本発明の実施および態様 本明細書で論じるように、高い割合の抗生物質アンピシリン耐性乳酸菌は、乳中で増殖させると、商業的に関連する質感付与性株と比べ質感を向上させることが見出された。

当業者は、アンピシリンと効果態様を同じくするかまたは標的を同じくする他の抗生物質も、本明細書に記載の種類の変異体を単離するために単独で又はアンピシリンと組み合わせて使用可能であることを認識するであろう。従って、本発明は、DD−トランスペプチターゼに対する他の阻害剤といった機能的に等価な他の抗生物質の使用をも包含する。このような抗生物質として、アモキシシリン、ペニシリンG、プロカインペニシリン、ベンザチンペニシリン、およびペニシリンVが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

第1の態様において、本発明は、以下を特徴とする乳酸菌株に関する: (i)当該乳酸菌株は、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、37℃で20時間の培養後、OD₆₀₀測定による増殖が、抗生物質を含まない当該培地内でのOD₆₀₀測定による増殖に比べ20%減少する抗生物質の量が400ng/mlより多いという定義によると、抗生物質アンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に対して耐性である;ならびに、 (ii)少なくとも10⁴CFU/mlの当該乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が少なくとも50秒である。 好ましくは、工程(i)の抗生物質は、アンピシリンである。

(i)の点のOD₆₀₀測定による増殖が20%減少する抗生物質の量を決定するためのアッセイ、および(ii)の点の28mlの酸性化乳についてポリスチレン25mlピペットからの流出時間を決定するためのアッセイの両方とも、既知で市販の標準的な要素に基づくものである。

当業者は、本明細書中で説明したようにラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株の成長に適したMRS培地およびストレプトコッカス・サーモフィルス株の成長に適したM17培地+2%(w/v)乳糖を含む乳酸菌株の増殖に適した標準培地が分かるであろう。

従って、当業者は、本明細書中におけるアッセイの詳細な説明(例えば、実施例2参照)に基づき日常的にこれらのアッセイを繰り返して、ある対象の乳酸菌株がアンピシリンおよび/またはDD−トランスペプチターゼ阻害する他の抗生物質に耐性である要件((i)の点)および質感付与特性が向上するという要件((ii)の点)に適合するか否かを客観的に決定することができる。

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

好ましい実施形態では、(i)の点のOD₆₀₀測定による増殖が20%減少する抗生物質の量は、500ng/mlより多い、例えば、600ng/mlより多い、例えば、700ng/mlより多い。

別の好ましい実施形態では、(ii)の点の流出時間は、少なくとも60秒、例えば少なくとも70秒、例えば少なくとも80秒、例えば少なくとも90秒、例えば少なくとも100秒、例えば少なくとも110秒である。

第二の態様において、本発明は、以下を特徴とする乳酸菌株に関する: (i)当該乳酸菌株は、E−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度(MIC)値が、当該乳酸菌株が由来する母株のMICよりも少なくとも1インクリメント高いという定義によると、抗生物質アンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に対して耐性である;ならびに、 (ii)少なくとも10⁴CFU/mlの当該変異乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が、少なくとも10⁴CFU/mlの当該母株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間の少なくとも2倍である。 好ましくは、工程(i)の抗生物質は、アンピシリンである。

(i)の点のE−テスト、および(ii)の点の28mlの酸性化乳についてポリスチレン25mlピペットからの流出時間を決定するためのアッセイの両方とも、既知で市販の標準的な要素に基づくものである。

従って、当業者は、本明細書中におけるアッセイの詳細な説明(例えば、実施例1および実施例2参照)に基づき日常的にこれらのアッセイを繰り返して、ある対象の乳酸菌株がアンピシリンおよび/またはDD−トランスペプチターゼ阻害する他の抗生物質に耐性である要件((i)の点)および質感付与特性が向上するという要件((ii)の点)に適合するか否かを客観的に決定することができる。

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

好ましい実施形態では、(i)の点のE−テストにおける変異乳酸菌株のMICが、母株のMICよりも少なくとも2インクリメント、例えば少なくとも3インクリメント、例えば少なくとも4インクリメント、例えば少なくとも5インクリメント高い。

別の好ましい実施形態では、(ii)の点の流出時間は、少なくとも50秒、例えば少なくとも60秒、例えば少なくとも70秒、例えば少なくとも80秒、例えば少なくとも90秒、例えば少なくとも100秒、例えば少なくとも110秒である。

本発明の第3の態様は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに受託番号DSM25852で寄託されたラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC15466株およびそれらの変異体および多様体からなる群より選択された乳酸菌株に関する。

当業者は、出発材料として当該寄託株を使用することにより、従来の突然変異誘発又は再分離技術により、日常的に、本明細書に記載の関連する特徴および利点を保持するそれらのさらなる変異体または誘導体を得ることができることは、当業者にとって明らかである。従って、用語「それらの変異体」とは、出発材料として当該寄託株を使用することにより得られる変異株であって、少なくとも10⁴CFU/mlの乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が少なくとも50秒であるという当該寄託株の必須特性を保持している変異体に関する。

本発明の第4の態様は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の乳酸菌株を10⁴〜10¹⁴CFU/gで含む組成物に関する。

好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも1つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株を含む。好ましくは、組成物は、少なくとも1つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株および少なくとも1つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む。

別の好ましい実施形態では、組成物は、スターター培養物として使用可能である。

さらに別の好ましい実施形態では、組成物は、凍結、凍結乾燥または液体の形態である。

本発明に係る乳酸菌株(アンピシリンおよび/またはDD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性があり、質感付与特性が向上した乳酸菌株)は、好ましくは、発酵乳製品を調製するために使用できる。用量および投与は、当該技術分野に従って実施できる。

さらに、発酵乳製品を製造するための本明細書に記載の他の関連工程は、全て当該技術分野に従って実施できる。発酵乳製品を調製するための他の関連工程は、当業者に公知で日常的な工程である。

従って、本発明の第5の態様は、本発明の第1、第2、または第3の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第4の態様に係る組成物を用いて乳基質を発酵することを含む、発酵乳製品を調製するための方法に関する。

第6の態様は、本発明の第4の態様に係る方法によって得られる発酵乳製品に関する。

第7の態様は、本発明の第1、第2、または第3の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第4の態様に係る組成物を含む発酵乳製品に関する。

本発明の第8の態様は、乳製品を調製するための本発明の第1、第2、または第3の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第4の態様に係る組成物の使用に関する。

好ましい実施形態では、乳製品は、発酵乳製品である。好ましくは、発酵乳製品は、ヨーグルトである。

本発明の第9の態様は、乳酸菌株を得るための方法であって、 a)乳酸菌株のプールから、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、37℃で20時間の培養後、OD₆₀₀測定による増殖が、抗生物質を含まない当該培地内での増殖に比べ20%減少する抗生物質の量が400ng/mlより多いという定義により、抗生物質アンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある乳酸菌株のプールを選択および単離すること;ならびに b)工程a)のアンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある乳酸菌株のプールから、少なくとも10⁴CFU/mlの当該乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が少なくとも50秒である、乳酸菌株を選択および単離すること; を含む方法に関する。

好ましくは、当該方法は、 a)乳酸菌株のプールから、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、37℃で20時間の培養後、OD₆₀₀測定による増殖が、アンピシリンを含まない当該培地内での増殖に比べ20%減少するアンピシリンの量が400ng/mlより多いという定義により、抗生物質アンピシリンに耐性がある乳酸菌株のプールを選択および単離すること;ならびに b)工程a)の抗生物質アンピシリンに耐性がある乳酸菌株のプールから、少なくとも10⁴CFU/mlの当該乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が少なくとも50秒である、乳酸菌株を選択および単離すること; を含む。

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

好ましい実施形態では、(i)の点のOD₆₀₀測定による増殖が20%減少する抗生物質の量は、500ng/mlより多い、例えば、600ng/mlより多い、例えば、700ng/mlより多い。

別の好ましい実施形態では、(ii)の点の流出時間は、少なくとも60秒、例えば少なくとも70秒、例えば少なくとも80秒、例えば少なくとも90秒、例えば少なくとも100秒、例えば少なくとも110秒である。

第10の態様は、乳酸菌株を得るための方法であって、 a)乳酸菌母株を設けること; b)E−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度(MIC)値が、当該変異乳酸菌株が由来する母株のMICよりも少なくとも1インクリメント高いという定義により、抗生物質アンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある変異乳酸菌株のプールを選択および単離すること;ならびに c)工程b)のアンピシリンおよび/または酵素DD−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある変異乳酸菌株のプールから、少なくとも10⁴CFU/mlの当該変異乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が、少なくとも10⁴CFU/mlの当該母株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間の少なくとも2倍である、変異乳酸菌株を選択および単離すること; を含む方法に関する。

好ましくは、当該方法は、 a)乳酸菌母株を設けること; b)E−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度(MIC)値が、当該変異乳酸菌株が由来する母株のMICよりも少なくとも1インクリメント高いという定義により、抗生物質アンピシリンに耐性がある変異乳酸菌株のプールを選択および単離すること;ならびに c)工程b)のアンピシリンに耐性がある変異乳酸菌株のプールから、少なくとも10⁴CFU/mlの当該変異乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間が、少なくとも10⁴CFU/mlの当該母株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間の少なくとも2倍である、変異乳酸菌株を選択および単離すること; を含む。

好ましい実施形態では、乳酸菌母株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

本発明のさらにより好ましい実施形態では、母株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに受託番号DSM24021で寄託されたラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC13995株である。

好ましい実施形態では、(i)の点のE−テストにおける変異乳酸菌株のMICが、母株のMICよりも少なくとも2インクリメント、例えば少なくとも3インクリメント、例えば少なくとも4インクリメント、例えば少なくとも5インクリメント高い。

別の好ましい実施形態では、(ii)の点の、少なくとも10⁴CFU/mlの当該変異乳酸菌株を接種し37℃で20時間酸性化した、2%(w/v)の脱脂粉乳を含有する28mlの全脂肪牛乳についてのポリスチレン25mlピペットからの流出時間は、少なくとも50秒、例えば少なくとも60秒、例えば少なくとも70秒、例えば少なくとも80秒、例えば少なくとも90秒、例えば少なくとも100秒、例えば少なくとも110秒である。

本発明の第11の態様は、本発明の第8または第9の態様に係る方法によって得られる乳酸菌株に関する。

本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によって説明される。

材料: 培地:ストレプトコッカス・サーモフィルスに適切な培地として、次の培地が挙げられる。 以下の組成を有する既知のM17寒天培地: 寒天、12.75g/L アスコルビン酸、0.5g/L カゼインペプトン(トリプシン分解)、2.5g/L β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、19g/L 硫酸マグネシウム水和物、0.25g/L 肉エキス、5g/L 肉ペプトン(ペプシン分解)、2.5g/L ソヤペプトン(パパイン分解)、5g/L 酵母エキス、2.5g/L。 そして、以下の組成を有するM17ブロス培地: アスコルビン酸、0.5g/L 乳糖、5g/L 硫酸マグネシウム、0.25g/L 肉エキス、5g/L 肉ペプトン(ペプシン分解)、2.5g/L グリセロリン酸ナトリウム、19g/L ソヤペプトン(パパイン分解)、5g/L トリプトン、2.5g/L 酵母エキス、2.5g/L 最終pH7.0±0.2(25℃)。

これらの培地は、通常、20g/lの乳糖(2%w/v)を添加して使用される。

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスに適切な培地として、次の培地が挙げられる。 以下の組成を有する既知のMRS寒天培地: バクトプロテオースペプトンNo.3、10g/l バクト牛肉エキス、10g/l バクト酵母エキス、5g/l デキストロース、20g/l ソルビタンモノオレート複合体、1g/l クエン酸アンモニウム、2g/l 酢酸ナトリウム、5g/l 硫酸マグネシウム、0.1g/l 硫酸マンガン、0.05g/l 第二リン酸カリウム、2g/l バクト寒天、15g/l。 そして、以下の組成を有するMRSブロス培地: バクトプロテオースペプトンNo.3、10g/l バクト牛肉エキス、10g/l バクト酵母エキス、5g/l デキストロース、20g/l ソルビタンモノオレート複合体1g/l クエン酸アンモニウム、2g/l 酢酸ナトリウム、5g/l 硫酸マグネシウム、0.1g/l 硫酸マンガン、0.05g/l 第二リン酸カリウム、2g/l 最終pH6.5±0.2(25℃)。

当業者に知られているように、M17培地は、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖に適していると考えられる培地であり、MRS培地は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの増殖に適していると考えられる培地である。

当業者によって理解されるように、本文脈において、特定のM17およびMRS培地濃縮物は、異なる業者から得てもよく、また、特定の業者が、独立して、本明細書に関連する対象株のアンピシリン耐性について(標準的な測定不確実性の範囲内で)本明細書に関連する結果を得てもよい。

実施例1:アンピシリン耐性選択アッセイ 当該方法を、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの株を用いて示す。ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いたアンピシリン耐性選択アッセイを実施するために、MRS培地ではなく、M17培地に2%w/v乳糖を加えたものを使用すべきである。

対象のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株を10mlのMRSブロス培地に接種して、嫌気条件下、37℃で少なくとも20時間培養する。培養物に浸漬した綿棒を使用し、MRS寒天プレート(直径90mm)の表面全体に塗布する。抗生物質感受性試験(Antimicrobial Susceptibility Testing(Biomerieux,cat.#501558))用のアンピシリンE−テストスティック(0.016〜256μg/ml)を寒天上に置き、プレートを嫌気条件下、37℃で24時間以内インキュベートする。アンピシリンの最小発育阻止濃度(MIC)とは、播種した株について目視できるほど増殖が阻害される最低濃度のことであり、これは楕円形の阻害領域がE−テストストリップと交わる点において読み取る。

本明細書で説明するようなアンピシリンに対する耐性が増加したラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス細胞は、本明細書ではE−テストで読み取られるMIC値が、母株よりも少なくとも1インクリメント高いラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス細胞として定義する。

アンピシリンに対する耐性の増加についてこの基準を満たすことができる細胞は、本明細書では、本実施例1のアンピシリン耐性アッセイにおけるアンピシリン耐性細胞として定義する。

結論: 特定の対象株(例えば、関連する市販品から得た株)について本実施例1のアンピシリン耐性選択アッセイに基づき、当業者は、この特定の対象株が本明細書における関連アンピシリン耐性を有するか否かを日常的にテストすることができる。

実施例2:レオロジー特性が向上したラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス変異体を単離するためのアンピシリンの使用 株: ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC13995 ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC15466(CHCC13995のアンピシリン耐性変異体)

変異体の単離: ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC13995株のアンピシリン耐性変異体を単離するために、0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/mlまたは700ng/mlの量のアンピシリンを含有する10mlのMRSブロス中に単一コロニー由来の増殖細胞を嫌気的に接種し37℃で少なくとも20時間増殖させた。

20時間の増殖後、全てのサンプルについてのOD₆₀₀を測定した。

通常、OD₆₀₀測定によるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの嫌気的な増殖が、アンピシリンを含まないMRS培地(すなわち、0ng/mlのアンピシリン)に比べ20%減少するアンピシリンの濃度は、300ng/mlより多かった。アンピシリンの濃度が500ng/mlであった培養物を希釈して、アンピシリンを添加していないMRS寒天プレート上に播種し、その後、37℃で少なくとも20時間嫌気的にインキュベートした。その後、500ng/mlのアンピシリンが存在するマイクロタイタープレート内で37℃で嫌気的な増殖をしたコロニーをピックアップしてスクリーニングした。通常、得られたコロニーの25%は、アンピシリンの存在下で高速に増殖するものとして同定された。これらを、さらなる研究用に選択した。選択したアンピシリン耐性変異体をさらに精製し、それらの乳中で増殖できる能力について試験した。この作業中、変異体のいくつかは以下の条件で親株よりもかなり優れた質感をもたらすことが観察された。

粘性スクリーニング: レオロジースクリーニング分析は、単純なピペット粘度試験により行った。この試験では、アンピシリン耐性変異株の粘度を、28mlの酸性化乳を充填したポリスチレン25mlピペット(CELLSTAR(登録商標))からの流出時間を測定することによって、前もって(実際のレオロジー試験前に)試験した。 各サンプルは、2%(w/v)の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳に、アンピシリン耐性変異体を乳1mlにつき少なくとも10⁴個の細胞の量で接種し37℃で20時間おいて酸性化させた。

ピペッティング試験の前に、酸性化した乳を静かに攪拌することにより均質化し、その後ポリスチレン25mlピペットの上部まで(28ml)充填し、各サンプルについてピペットからの流出時間を3回測定した。表1は、21株のアンピシリン耐性変異体を用いて37℃で20時間発酵した乳についてのピペット粘度試験の結果を示す。結果は、これらの変異体のほとんどは、母株より高い粘度をもたらすことを示している。21株のアンピシリン耐性変異体のうち6株については流出時間が母株のものに比べ2倍になり、アンピシリン耐性変異体の約25%は少なくとも50秒の流出時間となった。

特に、変異体18(アンピシリン変異体No.18)は、流出時間が長かった。この変異由来株をCHCC15466として指定し、実施例3に記載したレオロジー試験に使用した。

結論 本明細書中に記載のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスアンピシリン耐性変異体は、望ましい高レベルの質感を生みだすスターター培養物として、培養物に取り入れることができる。

実施例3:発酵乳製品の調製のためのストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスアンピシリン耐性変異体の使用 レオロジー: 2%(w/v)の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳における増殖に続き、レオロジー分析をReoLogica Instruments AB,SwedenのStressTechレオメータを用いて行った。

上述の実施例は、選択したアンピシリン耐性変異体を単一の培養物として用い発酵した発酵乳は質感が向上したことを示す。本実施例では、ヨーグルトとして製造した発酵乳、すなわちストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの株を組み合わせて用いた発酵乳の質感を分析する。いくつかの変異体により向上する質感付与効果を実証するために、ヨーグルトは、1つの野生型ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC4895株を固定し、これにそれぞれラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス野生型CHCC13995株またはアンピシリン耐性CHCC15466株のいずれかを混合した組み合わせを用いて製造した。ヨーグルト培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルス:ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスが9:1の比率の混合物を、2%(w/v)の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳に接種し、最終pHが4.50になるまで40℃で発酵した。以下の混合物を、4℃で5日間保存した後にStresstechレオメータを用いて分析した。粘着性は、Folkenberg et al.(2006.Int.Dairy J.16(2);111−118)に記載の通りに測定する。結果を表2に示す。

結果は、アンピシリン耐性変異体CHCC15466の単一の培養物を用いて観察された向上した質感付与特性は、ストレプトコッカス・サーモフィルス株の存在下でも維持されることを明らかに示すものである。

この変異体をラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの野生型株の代わりにヨーグルト発酵に用いると、剪断応力への影響はわずかだが、ゲル剛性および粘着性は顕著に向上した。

結論 本明細書に記載のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスのアンピシリン耐性変異体は、ヨーグルト等の発酵乳製品に望ましい高レベルの質感を生みだすスターター培養物として、培養物に取り入れることができる。

寄託および専門家の取決 ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC4895の株は、2007年3月29日、ドイツ国Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),Inhoffenstr.7B,D−38124 Braunschweigに受託番号DSM19242で寄託された。

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC13995の株は、2010年9月22日、ドイツ国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D−38124 Braunschweigに受託番号DSM24021で寄託された。

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスCHCC15466の株は、2012年4月3日、ドイツ国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D−38124 Braunschweigに受託番号DSM25852で寄託された。

寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件の下で行われた。

出願人は、寄託微生物のサンプルは、出願人により承認された専門家のみが利用可能とすべきことを要求する。