包含乳酸菌或其处理物的脂质代谢和/或糖代谢改善剂 |
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| 申请号 | CN201280059978.4 | 申请日 | 2012-12-06 | 公开(公告)号 | CN104010648A | 公开(公告)日 | 2014-08-27 |
| 申请人 | 可尔必思株式会社; | 发明人 | 仲村太志; 芦田延久; 石田优; 藤原茂; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供改善脂质代谢和糖代谢两者的 微 生物 的用途，具体而言，涉及脂质代谢和/或糖代谢改善剂、以及包含该改善剂的饮食品和药物组合物，所述脂质代谢和/或糖代谢改善剂的特征在于，包含具有针对过 氧 化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性的、选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌体、其菌体处理物或它们的混合物作为有效成分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种菌体或该菌体的处理物，其具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性。 |
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| 说明书全文 | 包含乳酸菌或其处理物的脂质代谢和/或糖代谢改善剂技术领域[0001] 本发明涉及包含乳杆菌属和双歧杆菌属的菌体或其处理物的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其特征在于，将与代谢综合症密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor))α和γ活化的能力高。本发明还涉及包含这种脂质代谢和/或糖代谢改善剂的、功能性食品、或者用于治疗或预防脂质代谢相关和糖代谢相关的疾病或紊乱的药物组合物。 背景技术[0002] 近年来，代谢综合症的患者和潜在患者正在增加。代谢综合症是指内脏脂肪型肥胖兼具高脂血症、高血糖、高血压等的病理状态，动脉硬化性疾病的发病风险高。改善代谢综合症且与脂质/糖代谢相关的PPAR受到注目。PPAR为核内转录控制因子，主要在肝脏、小肠中高度表达的PPARα通过促进脂肪酸β氧化来促进脂肪燃烧作用，还显示出促进HDL胆固醇产生的作用。主要在脂肪组织中高度表达的PPARγ调节脂肪组织中的脂肪细胞分化，抑制源自脂肪细胞的炎症因子TNF-α分泌，促进脂联素(adiponectin)的分泌，从而改善胰岛素抵抗力(insulin resistance)。 [0004] 另一方面，报道了乳酸菌或双歧杆菌的菌体、其培养物(培养液、培养上清和它们的浓缩物等)对脂质代谢的改善、例如血中胆固醇的减少、体脂肪或内脏脂肪的降低等有效(例如，专利文献1～4)。但是，它们无法活化PPAR，效果也无法令人满意。另外，报道了乳酸菌的有机溶剂提取物能够活化PPAR(专利文献5)，其仅显示出PPARα的活性，而且其效果也不充分。进而，报道了将短乳杆菌SBC8803株给药于酒精性肝病模型小鼠，并考察了肝脏的PPARα活性，但没有发生变化(非专利文献1)，报道了对给予高脂饮食的脂肪肝模型给药多种乳酸菌的混合物，结果因高脂饮食而表达减少了的PPARα活性恢复(非专利文献2)，但没有关于PPARγ的记载。为了提高代谢综合症的治疗/预防效率，期待能将PPARα和PPARγ两者活化的原材料(双重激动剂)。 [0005] 现有技术文献 [0006] 专利文献 [0007] 专利文献1：日本特开2008-24680号公报 [0008] 专利文献2：日本特许第4336992号 [0009] 专利文献3：日本特开2003-306436号公报 [0010] 专利文献4：日本特许第3777296号 [0011] 专利文献5：日本特开2007-284360号公报 [0012] 非专利文献 [0013] 非专利文献1：Int.J.Food Microbiol.128(2):371-377,2008 [0014] 非专利文献2：J.Nutr.139(5):905-911,2009 发明内容[0015] 发明要解决的问题 [0016] 本发明的目的在于提供PPARα和PPARγ两者的激动活化作用高、用于改善脂质代谢和/或糖代谢两者的有效且安全的手段。 [0017] 本发明的另一个目的在于提供用于治疗或预防与脂质代谢异常和/或糖代谢异常相关的疾病或紊乱的手段。 [0018] 用于解决问题的方案 [0020] 因此，本发明包含以下的特征。 [0021] (1)一种菌体或该菌体的处理物，其具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性。 [0022] (2)根据上述(1)所述的菌体或该菌体的处理物，其显示出如下所述的阳性：PPARα活性相对于PPARα报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100为70以上、且PPARγ配体活性相对于PPARγ报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100为超过0(零)。 [0023] (3)根据上述(1)或(2)所述的菌体或该菌体的处理物，其中，菌体属于噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)种。 [0024] (4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的菌体或该菌体的处理物，其中，菌体为CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株或CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、或者这些菌株的突变株或育种株、或者CP2305株(保藏号FERM BP-11331)的突变株或育种株。 [0025] (5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的菌体处理物，其中，菌体处理物为菌体破坏物、菌体提取物或它们的干燥物。 [0026] (6)一种脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其特征在于，包含具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性的菌体、其菌体处理物或它们的混合物作为有效成分，其中，优选的是，菌体选自乳杆菌属和双歧杆菌属。 [0027] (7)一种脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其特征在于，包含具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性的、选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌体、其菌体处理物或它们的混合物作为有效成分。 [0028] (8)根据上述(6)或(7)所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其显示出如下所述的阳性：PPARα活性相对于PPARα报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100为70以上、且PPARγ配体活性相对于PPARγ报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100为超过0(零)。 [0029] (9)根据上述(6)～(8)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其中，菌体属于噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)种。 [0030] (10)根据上述(6)～(9)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其中，菌体为噬淀粉乳杆菌CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株、噬淀粉乳杆菌CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、或加氏乳杆菌CP2305株(保藏号FERM BP-11331)、或者这些菌株的突变株或育种株。 [0031] (11)根据上述(6)～(10)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其中，菌体处理物为菌体破坏物、菌体提取物或它们的干燥物。 [0032] (12)根据上述(6)～(11)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其还包含饮食品或药用的载体或赋形剂。 [0033] (13)一种饮食品，其包含上述(6)～(12)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂作为食品添加物。 [0034] (14)根据上述(13)所述的饮食品，其为脂质代谢和/或糖代谢改善用的功能性食品或保健食品。 [0035] (15)一种用于预防、改善或治疗脂质代谢异常和/或糖代谢异常的药物组合物，其包含上述(6)～(12)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂作为有效成分。 [0036] (16)一种具有脂质代谢和/或糖代谢改善作用的饮食品的制造方法，其包括在饮食品中添加上述(6)～(12)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂。 [0037] (17)噬淀粉乳杆菌CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株、噬淀粉乳杆菌CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、加氏乳杆菌CP2305株(保藏号FERM BP-11331)、或者这些菌株的突变株或育种株、其菌体处理物或者它们的混合物在上述(6)～(12)中任一项所述的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的制造中的用途。 [0038] (18)一种赋予脂质代谢和糖代谢改善效果的噬淀粉乳杆菌CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株或噬淀粉乳杆菌CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、或者这些菌株的突变株或育种株、或者加氏乳杆菌CP2305株(保藏号FERM BP-11331)的突变株或育种株。 [0039] (19)一种噬淀粉乳杆菌CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株或噬淀粉乳杆菌CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、或者这些菌株的突变株或育种株、或者加氏乳杆菌CP2305株(保藏号FERM BP-11331)的突变株或育种株。 [0040] (20)根据上述(1)或(2)所述的菌体或该菌体的处理物，其中，菌体属于乳杆菌(Lactobacillus)属或双歧杆菌(Bifidobacterium)属。 [0041] (21)上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或该菌体的处理物在脂质代谢和/或糖代谢改善用组合物的制造中的用途。 [0042] (22)上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或该菌体的处理物在脂质代谢和/或糖代谢预防用组合物的制造中的用途。 [0043] (23)根据上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或菌体处理物，其用于制造脂质代谢改善和/或糖代谢改善用组合物。 [0044] (24)根据上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或菌体处理物，其用于制造脂质代谢预防和/或糖代谢预防用组合物。 [0045] (25)根据上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或菌体处理物，其用于制造皮下脂肪减少和/或内脏脂肪减少用组合物。 [0046] (26)根据上述(1)～(5)中任一项所述的菌体或菌体处理物，其用于制造皮下脂肪堆积预防和/或内脏脂肪堆积预防用组合物。 [0048] 根据本发明，摄取具有针对PPARα和PPARγ两者的双重激动活性的、包含噬淀粉乳杆菌CP1563株、噬淀粉乳杆菌CP1562株、加氏乳杆菌CP2305株等的噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)等的菌体或其菌体处理物，从而强烈活化PPARα，由此促进脂肪燃烧和HDL胆固醇产生而改善脂质代谢，进而通过活化PPARγ来改善胰岛素抵抗力而改善糖代谢，结果能够预防/改善代谢综合症。 附图说明[0049] 图1为示出膳食诱导肥胖模型中的乳酸菌的用量依赖性效果(HDL-胆固醇)的图表。*和**表示统计显著性。 [0050] 图2为示出膳食诱导肥胖模型中的乳酸菌的用量依赖性效果(动脉硬化指数)的图表。**表示统计显著性。 [0051] 图3为示出膳食诱导肥胖模型中的乳酸菌的抗代谢综合症效果的图表。A表示HDL-胆固醇，B表示LDL-胆固醇，C表示中性脂肪，D表示动脉硬化指数，E表示高分子脂联素，F表示内脏脂肪重量。*、**、***和+表示统计显著性。 [0052] 图4为示出对健康的人类志愿者给药了噬淀粉乳杆菌CP1563株破碎菌体时的脂质代谢改善效果的图表。比较对照组不含有CP1563株破碎菌体。A表示对体重的影响或效果，B表示对体脂肪率的影响或效果，C表示对BMI的影响或效果，D表示对体温的影响或效果，E表示对皮下脂肪的影响或效果，以及F表示对内脏脂肪的影响或效果。 具体实施方式[0053] 以下，详细说明本发明。 [0054] 1.脂质代谢和/或糖代谢改善剂 [0055] 本发明根据第1方式提供一种脂质代谢和/或糖代谢改善剂，其特征在于，包含具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性的菌体、其菌体处理物或它们的混合物作为有效成分，所述菌体优选为乳酸产生菌、更优选为选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌体。 [0056] 本发明还提供如以下说明那样的、上述菌体或其菌体处理物。 [0057] 本说明书中的“PPARα激动活性”促进脂肪燃烧和HDL胆固醇产生而改善脂质代谢。通过提高该活性，高脂血症、脂质异常症、肥胖症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、动脉硬化症、炎症性症状等疾病的预防、改善或治疗成为可能。 [0058] 本说明书中的“PPARγ激动活性”抑制源自脂肪细胞的炎症因子TNF-α分泌，促进脂联素的分泌，从而改善胰岛素抵抗力、改善糖代谢。通过提高该活性，高血糖症、非胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化症、心脏肥大、缺血性心脏疾病等疾病的预防、改善或治疗成为可能。 [0059] 此外，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂由于具有PPARα激动活性和PPARγ激动活性两者，因此对于包括肥胖、糖尿病的所谓代谢综合症的预防、改善或治疗是有效的。 [0060] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的PPARα激动活性是如下所述的阳性活性：相对于PPARα报告基因检测(参照后述实施例)中的阴性对照0(零)和阳性对照100，通常为70以上、优选为80以上、进一步优选为90以上、最优选为100以上、例如为110以上、120以上、130以上或140以上。 [0061] 本说明书中，PPARα报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100在后述定义1中被定义。 [0062] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的PPARγ激动活性是如下所述的阳性活性：相对于PPARγ报告基因检测(参照后述实施例)中的阴性对照0和阳性对照100为超过0(零)的活性，例如为2以上、4以上、5以上、优选为10以上、20以上、进一步优选为30以上、35以上、最优选为40以上。 [0063] 本发明中，PPARγ报告基因检测中的阴性对照0(零)和阳性对照100在后述定义2中被定义。 [0064] 根据本发明，具有针对PPARα和PPARγ的双重激动活性的菌体为选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌体、其菌体处理物或它们的混合物。 [0065] 这种菌体不限定于以下菌体，例如为噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、乳双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、发酵 乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、短乳杆 菌(Lactobacillus brevis)、植 物 乳 杆 菌(Lactobacillus plantarum)、唾 液 乳 杆 菌 (Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、这些菌种的突变株或育种株。 [0066] 优选的菌株为噬淀粉乳杆菌株(例如CP1563株；保藏号FERM BP-11255、CP1562株；保藏号FERM BP-11379)、加氏乳杆菌株(例如CP2305株；保藏号FERM BP-11331)、婴儿双岐杆菌株、短双歧杆菌株、或者这些菌株的突变株或育种株，最优选的菌株为CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株或者其突变株或育种株。需要说明的是，噬淀粉乳杆菌CP1563株和噬淀粉乳杆菌CP1562株是源自人类肠道的乳酸菌。这些菌株或其处理物在后述实施例中已确认具有脂质代谢和/或糖代谢改善作用，可以从独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1筑波中心中央第6)获取。 [0067] 本发明中可以使用的乳酸产生菌、优选为选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌种可以通过使用在乳杆菌(乳酸菌)、双歧杆菌的菌种的培养中通常使用的培养基、在通常使用的条件下培养来进行增殖并回收。 [0068] 培养基通常只要是含有碳源、氮源、无机盐类等且能够高效地进行上述菌种的培养的培养基，就可以使用天然培养基、合成培养基中的任意种。作为碳源，例如可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、废糖蜜等，作为氮源，例如可以使用酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物、酵母提取物、肉提取物等有机含氮物质。另外，作为无机盐类，例如可以使用磷酸盐、钠、钾、镁、锰、铁、锌等。作为适于培养乳酸菌的培养基，例如可列举出MRS液体培养基、GAM培养基、BL培养基、Briggs Liver Broth、动物奶、脱脂奶、乳性乳清等。优选的是，可以使用经灭菌的MRS培养基。另外，用于食品用途时，可以调制使用仅由食品原材料和食品添加物构成的培养基。作为天然培养基，也可以使用蕃茄汁、胡萝卜汁、以及蔬菜汁、或者苹果、菠萝、葡萄汁等。 [0069] 培养在20℃～50℃、优选为25℃～42℃、更优选为约37℃下在厌氧条件下进行。温度条件可以利用恒温槽、加热罩、加热套(jacket)等来调整。另外，厌氧条件下是指菌能够增殖的水平的低氧环境下，例如通过使用厌氧室、厌氧箱或加入了除氧剂的密闭容器或袋等，或者通过单纯地将培养容器密闭，从而能够设为厌氧条件。培养的形式为静置培养、振荡培养、容器培养(tank culture)等。另外，培养时间没有特别限制，例如可以设为3小时～96小时。培养开始时的培养基的pH优选维持在例如4.0～8.0。 [0070] 例如，作为乳酸菌使用噬淀粉乳杆菌CP1563株和噬淀粉乳杆菌CP1562株时，可以在食品级的乳酸菌用培养基中接种乳酸菌，在约37℃下用一夜(约18小时)进行培养。 [0071] 培养后，可以直接使用所得到的乳酸菌培养物，也可以进一步根据需要进行利用离心分离等的粗纯化和/或利用过滤等的固液分离、灭菌操作。优选的是，进行离心分离，仅将乳酸菌的菌体回收。需要说明的是，本发明中使用的乳酸菌可以是湿菌体或者也可以是干燥菌体。 [0072] 制作上述选自乳杆菌属和双歧杆菌属中的菌种或菌株的突变株时，将这些菌在MRS培养基中静置培养至对数增殖期后，用灭菌生理盐水或灭菌水清洗，然后在该灭菌生理盐水或灭菌水中例如在N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等诱变剂50～500μg/ml、30～37℃的条件下处理30～60分钟，能够得到突变株。诱变中，除了NTG之外，也可以使用紫外线、或甲磺酸乙酯(EMS)、氟尿嘧啶(5-FU)等公知的诱变剂，可以应用一般已知的手段。得到的菌株的分类上的细菌学特性例如可以通过考察16S rRNA基因碱基序列的同源性、利用与标准株的DNA-DNA杂交考察DNA-DNA同源性、考察糖的同化性等来确认。 [0073] 关于本说明书中的菌体处理物，可例示出菌体破坏物、菌体提取物、它们的干燥物、冷冻物、水分散物、乳化物等，但不限定于这些。 [0074] 菌体破坏物是对菌体利用破碎(此时得到菌体破碎物)、磨碎、酶处理、化学试剂处理、溶解等进行破坏处理而得到的，只要具有针对过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的双重激动活性，则菌体破坏物的形态是任意的。例如，可优选使用的是，如对在水性介质中将菌体破碎而成的液体直接利用冻干等进行干燥而得到的物质那样、将被破坏了的菌体整体(即，构成细胞的基本上全部的成分)直接回收而得到的物质。 [0075] 菌体的破坏可以使用该技术领域中公知的方法和设备、通过例如物理破碎、酶溶解处理等来进行。物理的破碎利用湿式(菌体悬浮液的状态下处理)或干式(菌体粉末的状态下处理)来进行均可，可以通过使用均质器、球磨机、珠磨机、戴诺磨、行星磨(planetary mill)等进行的搅拌，通过使用喷射式粉碎机、弗氏压碎器、细胞破碎机等而得到的压力，或者通过过滤器过滤来进行。酶溶解处理例如可以使用溶菌酶等酶来破坏菌体的细胞壁。 [0076] 具体而言，关于用于制备菌体破碎物的方法，将乳酸菌的悬浮液在公知的戴诺磨细胞破碎机(DYNO-MILL破碎装置等)中使用玻璃珠在圆周速度10.0～20.0m/s(例如约14.0m/s)、处理流速0.1～10L/10min(例如约1L/10min)下、在破碎槽温度10～30℃(例如约15℃)下处理1～7次(例如3～5次)，从而将菌体破碎。另外，例如，将乳酸菌的悬浮液在公知的湿式喷射式粉碎机细胞破碎机(JN20Nano Jet Pul等)中在喷射压力50～ 1000Mpa(例如270MPa)、处理流速50～1000(例如300ml/min)下处理1～30次(例如10次)，从而将菌体破碎。另外，也可以在公知的干式行星磨细胞破碎机(GOT5Galaxy5等)中、将乳酸菌的菌体粉末在各种球(例如氧化锆制10mm球、氧化锆制5mm球、氧化铝制1mm球)共存下、在转速50～10000rpm(例如240rpm、190rpm、110rpm)下处理30分钟～20小时(例如5～10小时)，从而将菌体破碎。也可以将乳酸菌的菌体粉末在公知的干式喷射式粉碎机细胞破碎机(Jet O Mizer等)中在供给速度0.01～10000g/min(例如0.5g/min)、 2 2 喷射压力1～1000kg/cm(例如6kg/cm)的压力下处理1～10次(例如1次)，从而将菌体破碎。 [0077] 本发明中，菌体的破碎物即使为在菌体上开孔的程度下也会发挥效果，但理想的是，以菌体的平均长径为破坏处理前的90％以下的方式来制备。例如利用溶解处理来破坏菌体时，有时菌体的平均长径会接近0％。因此，可以以菌体破碎物中的菌体的平均长径为破碎前的90％以下、优选为80％以下、70％以下、60％以下或50％以下、进一步优选为40％以下、30％以下或20％以下的方式来破坏菌体。 [0078] 菌体和/或菌体破碎物可以进行干燥而制成粉状物或粒状物。作为具体的干燥方法，没有特别限制，例如可列举出喷雾干燥、滚筒干燥、真空干燥、冻干等，可以将它们单独或组合采用。此时，也可以根据需要添加通常所使用的载体或赋形剂。 [0079] 进而，菌体提取物可以如下得到：适当组合水、有机溶剂或混合溶剂自菌体或菌体破碎物进行提取操作，回收包含有效成分的级分，所述有效成分具有针对PPARα和PPARγ的激动活性，从而得到菌体提取物。有机溶剂为极性溶剂、非极性溶剂、它们的混合溶剂，极性溶剂的例子中包括甲醇、乙醇、丙醇等醇类、丙酮、乙腈、二噁烷、DMSO、DMF等，非极性溶剂的例子中包括乙醚等醚类、己烷、庚烷等烃类、二氯甲烷、氯仿等卤代烷类等。特别是，认为本发明的有效成分如后述实施例中记载那样、具有容易被乙醚等非极性有机溶剂提取的性质，但利用乙醇、乙腈、DMSO等极性有机溶剂也能提取一部分。提取物具有针对PPARα和PPARγ的激动活性可以利用如后述实施例中记载那样的PPARα报告基因检测和PPARγ报告基因检测等公知的检测法来确认。由上文中例示的属于乳杆菌属或双歧杆菌属的菌种或菌株得到的提取物均具有活化PPARα和PPARγ的能力。它们当中，特别是噬淀粉乳杆菌CP1563株、噬淀粉乳杆菌CP1562株、加氏乳杆菌CP2305株等的提取物具有针对PPARα和PPARγ的更优异的配体活性。本发明的菌体提取物也包含使用蒸发仪等蒸发器进行浓缩、优选去除溶剂而得到的浓缩物或残留物。 [0080] 进而，也可以自上述菌体破碎物使用公知的分离/纯化法来纯化具有脂质代谢和糖代谢改善作用的成分或级分。作为这种分离/纯化法，可列举出：盐沉淀和有机溶剂沉淀等利用溶解性的方法；透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差的方法；如离子交换层析法那样的利用电荷差的方法；如亲和层析法那样的利用特异性结合的方法；疏水层析法、反相层析法等利用疏水性的方法等，可以使用这些方法中的1种或组合使用2种以上。 [0081] 如上所述得到的菌体破碎物、菌体提取物或含有效成分的级分可以直接制成脂质代谢和/或糖代谢改善剂，或者，可以与饮食品或药用的载体或赋形剂组合而制成脂质代谢和/或糖代谢改善剂。若有需要，可以含有崩解剂、粘结剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、矫臭剂、芳香剂、酸味剂、着色剂等添加剂。另外，对剂型没有限制，例如可以采用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、糖浆剂、干糖浆剂、液体剂、悬浮剂、乳化剂等。 [0082] 关于本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中所含的上述菌体或其处理物，以处5 14 理前的菌体的菌数计，是非限定性的，是由相当于例如约10 个/g～约10 个/g、优选为约 8 12 10 个/g～约10 个/g的菌数制作而成的。 [0083] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂包含上述菌体或菌体处理物作为有效成分，菌体或菌体处理物可以由1种或多种菌种得到。 [0084] 因此，本发明还提供CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株、CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、CP2305株(保藏号FERM BP-11331)、或者这些菌株的突变株或育种株、其菌体处理物或它们的混合物在本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的制造中的用途。 [0085] 进而，本发明还提供赋予脂质代谢和糖代谢改善效果的CP1563株(保藏号FERM BP-11255)株或CP1562株(保藏号FERM BP-11379)、或者这些菌株的突变株或育种株。 [0086] 本说明书中，本发明所涉及的“FERM BP-11255”是基于布达佩斯条约于2010年5月25日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))进行国际保藏的噬淀粉乳杆菌CP1563株的保藏号，“FERM BP-11379”是基于布达佩斯条约于2011年4月22日在该生物保藏中心进行国际保藏的噬淀粉乳杆菌CP1562株的保藏号，此外，“FERM BP-11331”是基于布达佩斯条约于 2007年9月11日在该生物保藏中心进行国际保藏的加氏乳杆菌CP2305株的保藏号。 [0087] 2.饮食品和药物组合物 [0088] 进而，本发明还提供一种饮食品，其包含本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂作为食品添加物。根据该实施方式，饮食品为用于改善脂质代谢和糖代谢的功能性食品或保健食品。 [0089] 进而，本发明还提供一种具有脂质代谢和糖代谢改善效果的饮食品的制造方法，其包括在饮食品中添加本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂。 [0090] 进而，本发明还提供一种用于预防、改善或治疗脂质代谢异常和糖代谢异常的药物组合物，其包含本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂作为有效成分。 [0091] 以下，对本发明的药物组合物和饮食品进行说明。 [0092] 持续摄取上述得到的脂质代谢改善剂时，可期待获得脂质代谢和糖代谢的改善效果，因此能够用于脂质代谢相关和糖代谢相关疾病或紊乱的治疗或预防。因此，脂质代谢和/或糖代谢改善剂也可以添加在饮食品、药品等中来使用。 [0093] 在药物组合物或饮食品(功能性食品等)中使用本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂时，对药物组合物或饮食品的形态没有特别限制，例如可以制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、糖浆剂、干糖浆剂、液体剂、悬浮剂、吸入剂等口服制剂、栓剂等经肠制剂、点滴剂、注射剂等剂型。它们当中，优选制成口服制剂。需要说明的是，液体剂、悬浮剂等液体制剂也可以为在即将服用前在水或其它适当的介质中溶解或悬浮的形态，此外，在片剂、颗粒剂的情况下，也可以利用周知的方法将其表面涂覆。进而，本发明的脂质代谢改善剂也可以使用该技术领域中公知的技术而制成持续释放性制剂、延缓释放制剂或立即释放制剂等对释放进行控制的制剂。 [0094] 这种剂型可以在上述成分中根据剂型配混通常所使用的赋形剂、崩解剂、粘结剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、矫臭剂、芳香剂、酸味剂、着色剂等添加剂并根据常法来制造。例如，将脂质代谢和/或糖代谢改善剂制成药物组合物时，可以配混药学上可接受的载体或添加剂。作为这种药学上可接受的载体和添加物的例子，可列举出水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸钠、水溶性右旋糖酐、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物而可接受的表面活性剂等、以及脂质体等人工细胞结构物等。 [0095] 药物组合物或饮食品中的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的含量只要可赋予脂质代谢和糖代谢的改善效果就没有特别限制，此外，虽然根据其剂型而不同，但是，作为上述菌体或菌体处理物的量，通常为0.0001～99质量％、优选为0.001～80质量％、更优选为0.001～75质量％的范围，为了能够摄取有效成分的理想摄取量，理想的是制成能够管理每1天中的给药量的形态。另外，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中所含的菌体或 5 12 菌体处理物是非限定性的，例如为以处理前的菌体的菌数计由相当于约10 个/g～约10 8 12 个/g、优选为约10 个/g～约10 个/g的菌数制作的量。 [0096] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中可以添加或配混其它脂质代谢改善剂和/或糖代谢改善剂。作为其它脂质代谢改善剂，并没有限定，可列举出降脂药(他汀系药剂、贝特系药剂、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等)、维生素剂(烟酸、维生素E等)。另外，作为其它糖代谢改善剂，并没有限定，可列举出吡格列酮等。 [0097] 进而，本发明的药物组合物或饮食品中也可以共存其制造中所使用的各种添加剂、其它的各种物质。作为这种物质、添加剂，可列举出：各种油脂(例如，大豆油、玉米油、红花油、橄榄油等植物油、牛脂、沙丁鱼油等动物油脂)、生药(例如蜂王浆、人参等)、氨基酸(例如谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸、精氨酸等)、多元醇(例如乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、糖醇、作为例子有山梨糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇等)、天然高分子(例如阿拉伯胶、琼脂、水溶性玉米纤维、明胶、黄原胶、酪蛋白、谷蛋白或谷蛋白水解物、卵磷脂、淀粉、糊精等)、维生素(例如维生素C、维生素B群等)、矿物质(例如钙、镁、锌、铁等)、膳食纤维(例如甘露聚糖、果胶、半纤维素等)、表面活性剂(例如甘油脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯等)、纯化水、赋形剂(例如葡萄糖、玉米淀粉、乳糖、糊精等)、稳定剂、pH调节剂、抗氧化剂、甜味剂、呈味成分、酸味剂、色素和香料等。 [0098] 另外，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中，作为上述有效成分以外的功能性成分或添加剂，例如可以配混牛磺酸、谷胱甘肽、肉毒碱、肌酸、辅酶Q、葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酸内酯、胡椒提取物、姜提取物、可可提取物、瓜拉那提取物、藤黄果提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸、辣椒素、辣椒素酯、各种有机酸、类黄酮类、多酚类、儿茶素类、黄嘌呤衍生物、低聚果糖等难消化性低聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等。 [0099] 给药或摄取本发明的脂质代谢改善剂和含有该改善剂的药物组合物或饮食品的对象(被检体)为脊椎动物，具体而言，为哺乳动物，例如人、灵长类(猴、黑猩猩等)、家畜动物(牛、马、猪、羊等)、宠物用动物(犬、猫等)、实验动物(小鼠、大鼠等)、以及爬行类和鸟类，优选为人。 [0100] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的给药或摄取量根据对象的年龄和体重、给药/摄取途径、给药/摄取次数、脂质代谢异常的严重程度等而不同，为了达成目标作用，可以由本领域技术人员酌情在宽范围内进行变更。例如，以口服的方式给药或摄取时，理想的是，脂质代谢和/或糖代谢改善剂中所含的菌体或其菌体处理物以处理前的菌体的量计6 12 7 11 相对于每1kg体重通常给药约10 个～约10 个、优选为约10 个～约10 个。 [0101] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂、药物组合物和饮食品的安全性高，因此也可以进一步增加摄取量。每1天中的摄取量可以在1次中摄取，也可以分为几次来摄取。另外，对其给药或摄取的频率也没有特别限定，可以根据给药/摄取途径、对象的年龄和体重、脂质代谢异常或糖代谢异常的严重程度、由脂质代谢异常或糖代谢异常引起的疾病或紊乱的发病的有无、目标效果(治疗、预防等)等各种条件适当选择。 [0102] 对本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂、药物组合物和饮食品的给药/摄取途径没有特别限定，可列举出口服给药或摄取、或者非口服给药(例如直肠内、皮下、肌肉内、静脉内给药)等，特别优选以口服的方式给药或摄取。 [0103] 关于本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂、药物组合物和饮食品，作为脂质代谢改善，具有降低对象的血中脂质的作用、促进皮下脂肪和/或内脏脂肪的代谢的作用、抑制体重增加的作用。具体而言，本发明的脂质代谢改善剂、药物组合物和饮食品通过降低对象的总胆固醇、LDL-胆固醇、中性脂肪、动脉硬化指数和/或内脏脂肪，和/或提高HDL-胆固醇和/或脂联素，从而具有使脂质代谢正常化的作用。 [0104] 关于本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂、药物组合物和饮食品，作为糖代谢改善，通过改善胰岛素抵抗力从而具有能够预防、改善或治疗高血糖症、非胰岛素依赖型糖尿病等疾病的作用。 [0105] 因此，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂、药物组合物和饮食品对于脂质代谢和糖代谢相关的疾病或紊乱显示出优异的预防、改善和治疗效果。另外，安全性高，容易长期持续的摄取。 [0106] 本发明中，“脂质代谢相关疾病或紊乱”是指，由脂质代谢的异常引起的疾病、紊乱、症状或综合症。对于脂质代谢相关疾病或紊乱，例如并没有限定，包括动脉硬化、高脂血症、脂肪肝、肥胖症、代谢综合症、循环系统疾病(心肌梗塞、脑梗塞等)等。 [0107] 本发明中，“糖代谢相关疾病或紊乱”是指，除非胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症以外，还包含由糖尿病导致的并发症，例如血脂异常、高血压症、内皮性紊乱和炎症性粥样动脉硬化症等。 [0108] 本发明的饮食品含有上述脂质代谢和/或糖代谢改善剂。本发明中，饮食品中也包括饮料。含有本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的饮食品中，除了利用脂质代谢改善作用和糖代谢改善作用来谋求增进健康的保健饮食品、功能性饮食品、特定保健用饮食品等之外，还包括能够配混上述脂质代谢和/或糖代谢改善剂的所有饮食品。 [0109] 作为含有本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的饮食品，特别优选功能性饮食品。本发明的“功能性饮食品”是指对生物体具有一定功能性的饮食品，例如，包括：包括特定保健用饮食品(包括带有条件的特定保健用食品)和营养功能饮食品在内的保健功能饮食品、特殊用途饮食品、营养补充饮食品、健康补充饮食品、补充剂(例如片剂、包衣片、糖衣片、胶囊和液体剂等各种剂型的补充剂)和美容饮食品(例如减肥饮食品)等全部的所谓保健饮食品。本发明的功能性饮食品还包括根据食品法典(FAO/WHO联合食品标准委员会)的食品标准使用健康宣称(Health claim)的保健饮食品。 [0110] 作为饮食品的具体例子，可列举出经管经肠营养剂等流食、压片糖果(table candy)、片剂、咀嚼片、片剂、粉剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂和保健饮料等制剂形态的保健饮食品和营养补充饮食品；绿茶、乌龙茶和红茶等茶饮料、清凉饮料、果冻饮料、运动饮料、乳饮料、碳酸饮料、蔬菜饮料、果汁饮料、发酵蔬菜饮料、发酵果汁饮料、发酵乳饮料(酸奶等)、乳酸菌饮料、乳饮料(咖啡牛奶、水果牛奶等)、粉末饮料、可可饮料、牛奶以及纯化水等饮料；黄油、果酱、拌饭粉和人造黄油等涂抹调味品类；蛋黄酱、起酥油、卡士达酱(custard cream)、调味汁类、面包类、米饭类、面条类、意大利面、味噌汤、豆腐、酸奶、汤或酱油类、点心(例如，饼干、曲奇类、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖、片剂(tablet))等。 [0111] 本发明的饮食品中，除了上述脂质代谢和/或糖代谢改善剂之外，还可以配混该饮食品的制造中使用的其它食品材料、各种营养素、各种维生素、矿物质、膳食纤维、各种添加剂(例如呈味成分、甜味剂、有机酸等酸味剂、稳定剂、香料)等并利用常法来制造。 [0112] 本发明的饮食品中，脂质代谢和/或糖代谢改善剂的配混量可以由本领域技术人员考虑饮食品的形态、所需的口味或口感来适当确定。通常，所添加的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中的菌体或其菌体处理物的总量以处理前的菌体的量计通常为0.0001～99质量％、优选为0.001～80质量％、更优选为0.001～75质量％的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的配混量是适当的。本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂由于安全性高，因此能够进一步增加其在饮食品中的配混量。为了摄取脂质代谢和/或糖代谢改善剂的理想摄取量，优选制成能够管理每1天中的摄取量的形态。由此，通过以能够管理本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的理想摄取量的形态来摄取本发明的饮食品，从而提供使用该饮食品的针对脂质代谢相关和/或糖代谢相关疾病或紊乱的预防方法及改善方法。 [0113] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂通过本领域技术人员能够利用的任意适当的方法而含有在饮食品中即可。例如，可以将本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂制备成液体状、凝胶状、固体状、粉末状或颗粒状后，将其配混在饮食品中。或者，也可以将本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂直接混合或溶解在饮食品的原料中。本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂可以涂布、覆盖、浸渗或吹送于饮食品。本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂可以均匀地分散于饮食品中，也可以不均匀分布。也可以配制装有本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的胶囊等。也可以用可食薄膜、食用涂布剂等包裹本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂。另外，也可以在本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂中加入适当的赋形剂等后成形为片剂等形状。也可以对含有本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的饮食品进一步进行加工，这种加工品也被包含在本发明的范围内。 [0114] 本发明的饮食品的制造中，也可以使用饮食品中惯用的各种添加物。作为添加物，并没有限定，可列举出显色剂(亚硝酸钠等)、色素(栀子色素、红102等)、香料(橙子香料等)、甜味剂(甜叶菊、阿斯巴甜等)、防腐剂(醋酸钠、山梨酸等)、乳化剂(硫酸软骨素钠、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化剂(EDTA二钠、维生素C等)、pH调节剂(柠檬酸等)、化学调味料(肌苷酸钠等)、增稠剂(黄原胶等)、膨胀剂(碳酸钙等)、消泡剂(磷酸钙)等、粘结剂(多聚磷酸钠等)、营养强化剂(钙强化剂、维生素A等)、赋形剂(水溶性糊精等)等。进而，还可以进一步添加高丽参提取物、刺五加提取物、桉树提取物、杜仲茶提取物等功能性原材料。 [0115] 本发明的饮食品如上所述具有脂质代谢和糖代谢改善作用，因此对于脂质代谢相关和糖代谢相关疾病或紊乱起到优异的预防和改善作用，而且安全性高且无副作用的担心。另外，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂的风味好，即使在各种饮食品中添加也不会妨碍该饮食品的风味，因此得到的饮食品容易长期持续摄取，可期待脂质代谢相关疾病或紊乱的优异的预防和改善作用。 [0116] 进而，本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂不仅可以配混在人用的饮食品中，而且可以配混在家畜、赛马、宠物等的饲料中。饲料大致等同于除对象是人以外的饮食品，因此关于上述饮食品的记载，对于饲料也同样适用。 [0117] 实施例 [0118] 以下，根据实施例更具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。 [0119] [实施例1] [0120] <菌体粉末的制作> [0121] 将各乳酸菌的菌株的冻存原种在平板培养基上复苏后，使用液体培养基实施预先培养(pre-preincubation)、预培养(preincubation)、主培养(main incubation)(5ml→40ml→2L)。表1中示出使用的菌种、菌株、培养基、培养温度。需要说明的是，接种量设为各液体培养基重量的1％，培养18小时(使用的培养基和培养温度参照表2)。培养后，在10℃下以12000g离心分离7分钟，去除培养上清。加入离子交换水，同样地进行离心分离后，进行冻干，将冻干了的菌体用磨机(TESCOM)分散，得到菌体粉末。 [0122] [表1] [0123]菌种名称 菌株No. 培养温度 平板培养基 液体培养基 Enterococcus faecalis 1 37 MRS MRS Lactobacillus gallinarum 2 37 MRS MRS Lactobacillus delbrueckii 3 37 MRS MRS Lactobacillus johnsonii 4 37 MRS MRS Lactobacillus crispatus 5 37 MRS MRS Lactobacillus amylovorus CP1563 37 MRS MRS Lactobacillus amylovorus 6 37 MRS MRS Lactobacillus amylovorus 7 37 MRS MRS Lactobacillus amylovorus ATCC33620 37 MRS MRS Lactobacillus amylovorus CP1562 37 MRS MRS Lactobacillus acidophilus 8 37 MRS MRS Lactobacillus salivarius 9 37 MRS MRS Lactobacillus brevis 10 37 MRS MRS Lactobacillus coryniformis 11 37 MRS MRS Lactobacillus homohiochii 12 37 MRS MRS Lactobacillus buchneri 13 37 MRS MRS Lactobacillus gasseri CP2305 37 MRS MRS Lactococcus lactis 14 30 MRS MRS Leuconostoc lactis 15 25 MRS MRS Lactobacillus paracasei 16 37 MRS MRS Lactobacillus parakefir 17 37 BL GAM Lactobacillus plantarum 18 37 BL GAM Lactobacillus helveticus 19 37 ATCC ATCC Bifidobacterium adolescentis 20 37 BL GAM Bifidobacterium longum 21 37 BL GAM Bifidobacterium breve 22 37 BL GAM Bifidobacterium infantis 23 37 BL GAM Bifidobacterium catenulatum 24 37 BL GAM Bifidobacterium bifidum 25 37 BL GAM [0124] (乙醚提取物的制作) [0125] 将2g的菌体粉末悬浮在500ml的0.5mol/l氢氧化钾/乙醇溶液(关东化学株式会社)后，进行2分钟的超声波破碎处理(输出40％，最大750W中使用探头，VC-750(东京理化器械株式会社))。将处理后的液体转移至500ml的带红帽的广口培养瓶(耐热性，三商株式会社)，将其盖紧。在100℃的沸水中静置加热1小时后，用流动水冷却。在冷却后的菌液中加入浓盐酸(和光纯药工业株式会社)，将pH调节至2以下。 [0126] 将液体部分在40℃热水浴中用旋转蒸发仪(NVC-2100，东京理化器械株式会社)浓缩至约50ml左右。2等分到50ml的玻璃制离心管(AGC Techno Glass)中后，加入等量的乙醚(和光纯药工业株式会社)，用振荡机(200次/分钟，R-30，TAITEC)搅拌1小时，分取上层。将该操作总计实施4次后，将分取级分用旋转蒸发仪干固。吹送氮气使其完全干固后，溶解在500μL的特级DMSO(和光纯药工业株式会社)中，在棕色小瓶(耐冷性，三商株式会社)中在-80℃下保存。乙醚中的脂肪酸浓度使用NEFA C-Test Wako(和光纯药工业株式会社)来测定。 [0127] [实施例2] [0128] [0129] 将非洲绿猴肾脏来源的培养细胞CV-1调制成5x104个/ml的浓度，在包含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(SIGMA公司)中悬浮后，使用平底24孔板(Corning公司)以500μL/孔的浓度、在5％(v/v)CO2气氛下、在37℃下培养24小时。24小时后，在显微镜下确认80～90％融合后，按照以下的步骤实施转染。 [0130] 在血清用量减少培养基Opti-MEM(Invitrogen公司)25μl中添加包含用于编码由PPARα配体结合区域(人来源)和GAL-4DNA结合区域(酵母来源)构成的嵌合蛋白的DNA片段的质粒pM-PPARα0.16μg、被设计为表达受到前述嵌合蛋白控制的luc(海萤来源)报告基因质粒即p4×UASg-tk-luc0.16μg、以及具有在细胞内显示出一定的表达的病毒性表达启动子的luc(海肾来源)表达质粒即pRL-CMV0.016μg，并混合，添加PLUS Reagent(Invitrogen公司)4μl，在室温下静置15分钟。然后，添加Lipofectamine Reagent(Invitrogen公司)1μl和Opti-MEM25μl并混合，在室温下静置15分钟，然后添加Opti-MEM200μl。将得到的液体250μl添加到用Opti-MEM清洗过的培养CV-1细胞中，在37℃下培养3小时。培养后去除培养基，添加包含10％(v/v)FBS的DMEM培养基1ml。 [0131] (定义1：“PPARα活性的阴性对照0、阳性对照100”) [0132] 评价样品的制备如下进行。将各种乳酸菌的乙醚提取物用Opti-MEM稀释以使DMSO的最终浓度成为0.1％。作为PPARα配体的阳性对照，使用GW7647(SIGMA公司)，作为阴性对照，使用DMSO。关于检测时的浓度，乳酸菌提取物样品设为2.5μM(脂肪酸换算值)，GW7647设为10nM。 [0133] 自转染起24小时后吸取CV-1细胞的培养基，逐个添加500μl的各种评价样品，6小时后用500μl的PBS清洗2次。吸去PBS后，逐个添加100μL的将Reporter Lysis5x Buffer(Promega公司)用水稀释5倍而成的溶液，在-80℃冰箱内将每个板逐个冻存。 [0134] 在96孔白色微孔板(PerkinElmer公司)中加入冻存的样品30μL，使用Dual-GloTM Luciferase Assay System(Promega公司)测定发光强度(590nm和645nm)，从而测定PPARα配体能力。关于活性，将阴性对照设为0，将阳性对照设为100，用相对值来表示。 [0135] (结果) [0136] 将结果示于表2。 [0137] PPARα活性值为70以上、优选为80以上、90以上、95以上、100以上、120以上、140以上是优选的。 [0138] [表2] [0139]评价样品 菌株No. 活性 阴性对照 - 0 阳性对照 - 100 Lactobacillus amylovorus CP1563 146.7 Lactobacillus amylovorus CP1562 97.9 Lactobacillus gasseri CP2305 94.2 Lactococcus lactis 14 87.7 Lactobacillus amylovorus ATCC33620 87.7 Lactobacillus amylovorus 7 83.3 Bifidobacterium infantis 23 78.0 Lactobacillus amylovorus 6 72.7 Bifidobacterium adolescentis 20 71.8 Bifidobacterium breve 22 70.1 Lactobacillus acidophilus 8 65.3 Bifidobacterium longum 21 60.5 Lactobacillus salivarius 9 55.2 Lactobacillus crispatus 5 53.8 Lactobacillus gallinarum 2 50.7 Bifidobacterium catenulatum 24 49.3 Bifidobacterium bifidum 25 47.3 Lactobacillus johnsonii 4 46.2 Lactobacillus plantarum 18 44.1 Enterococcus faecalis 1 43.5 Lactobacillus delbrueckii 3 43.2 Lactobacillus paracasei 16 34.8 Lactobacillus helveticus 19 32.5 Leuconostoc lactis 15 30.4 Lactobacillus homohiochii 12 30.2 Lactobacillus parakefir 17 26.8 Lactobacillus brevis 10 16.8 Lactobacillus buchneri 13 14.5 Lactobacillus coryniformis 11 -6.1 [0140] 由表2的结果显示，根据菌株的不同，活化能力大大不同。其中观察到噬淀粉乳杆菌CP1563株显示出最强的PPARα活化能力，具有比阳性对照更强的活化能力。需要说明的是，上述现有技术中示出的专利文献5(日本特开2007-284360)中，报道了噬淀粉乳杆菌ATCC33620株(JCM1126)显示出比阳性对照更高的活性，但在本结果中比阳性对照活性低，仅显示出噬淀粉乳杆菌CP1563株的60％左右的活化能力。进而，专利文献5(日本特开2007-284360)中活性最高的NCI9040株也仅显示出噬淀粉乳杆菌CP1563株的67％左右的活化能力。 [0141] [实施例3] [0142] [0143] 将非洲绿猴肾脏来源的培养细胞CV-1制备成5x104个/ml的浓度，在包含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(SIGMA公司)悬浮后，使用平底24孔板(Corning公司)以500μL/孔浓度、在5％(v/v)CO2气氛下、在37℃下培养24小时。24小时后，在显微镜下确认80～90％融合后，按照以下的步骤实施转染。 [0144] 在血清用量减少培养基Opti-MEM(Invitrogen公司)25μl中添加包含用于编码由PPARγ配体结合区域(人来源)和GAL-4DNA结合区域(酵母来源)构成的嵌合蛋白的DNA片段的质粒pM-PPARα0.16μg、被设计为表达受到前述嵌合蛋白控制的luc(海萤来源)报告基因质粒即p4×UASg-tk-luc0.16μg、具有在细胞内显示出一定的表达的病毒性表达启动子的luc(海肾来源)表达质粒即pRL-CMV0.016μg，并混合，添加PLUS Reagent(Invitrogen公司)4μl，在室温下静置15分钟。然后，添加Lipofectamine Reagent(Invitrogen公司)1μl和Opti-MEM25μl并混合，在室温下静置15分钟后，添加Opti-MEM200μl。将得到的液体250μl添加到用Opti-MEM清洗过的培养CV-1细胞中，在37℃下培养3小时。培养后去除培养基，添加包含10％(v/v)FBS的DMEM培养基1ml。 [0145] 评价样品的制备如下进行。将表1记载的乳酸菌的菌株当中的PPARα活化能力较高的8个菌株即噬淀粉乳杆菌CP1563株、婴儿双岐杆菌No.23株、短双歧杆菌No.22株、加氏乳杆菌CP2305株、青春双歧杆菌No.20株、链状双歧杆菌No.24株、乳酸乳球菌No.14株、长双歧杆菌No.21株的乙醚提取物用Opti-MEM稀释以使DMSO的最终浓度成为0.1％。 [0146] (定义2：“PPARγ配体活性的阴性对照0、阳性对照100”) [0147] 作为PPARγ配体的阳性对照，使用曲格列酮(Troglitazone)(和光纯药工业株式会社)，作为阴性对照，使用DMSO。关于检测时的浓度，乳酸菌提取物样品设为2.5μM(脂肪酸换算值)，曲格列酮设为1μM。 [0148] 自转染起24小时后吸取CV-1细胞的培养基，逐个添加500μl的各种评价样品，6小时后用500μl的PBS清洗2次。吸去PBS后，逐个添加100μL的将Reporter Lysis5x Buffer(Promega公司)用水稀释5倍而得到的溶液，在-80℃冰箱内将每个板逐个冻存。 [0149] 在96孔白色微孔板(PerkinElmer公司)加入冻存的样品30μL，使用Dual-GloTM Luciferase Assay System(Promega公司)测定发光强度(590nm和645nm)，从而测定PPARγ配体能力。关于活性，将阴性对照设为0，将阳性对照设为100，用相对值来表示。 [0150] (结果) [0151] 将结果示于表3。 [0152] [表3] [0153]评价样品 菌株No. 活性 阴性对照 - 0 阳性对照 - 100 Lactobacillus amylovorus CP1563 42.1 Bifidobacterium infantis 23 34.7 Bifidobacterium breve 22 14.2 Lactobacillus gasseri CP2305 6.5 Bifidobacterium adolescentis 20 3.7 Bifidobacterium catenulatum 24 -4.3 Lactococcus lactis 14 -10.0 Bifidobacterium longum 21 -13.3 [0154] 根据表3的结果，噬淀粉乳杆菌CP1563株、婴儿双岐杆菌No.23株、短双歧杆菌No.22株、加氏乳杆菌CP2305株、青春双歧杆菌No.20株观察到PPARγ活化能力。其中，噬淀粉乳杆菌CP1563株显示出最强的PPARγ活化能力。 [0155] 另外，也存在像乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)No.14株那样的、具有较高的PPARα活性但不具有PPARγ活性的菌体。因此，本申请发明中的如噬淀粉乳杆菌CP1563株等那样活化PPARα和PPARγ的见解是优异的见解。 [0156] [实施例4] [0157] [0158] 如下制备乳酸菌噬淀粉乳杆菌CP1563株(FERM BP-11255)。 [0159] 从人的粪便采集、分离噬淀粉乳杆菌CP1563株。利用16S rDNA碱基序列分析和表型性状(phenotypic character)的观察鉴定菌种。 [0160] 需要说明的是，此处得到的菌株基于布达佩斯条约的规定于2010年5月25日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1筑波中心中央第6)进行国际保藏，被赋予保藏号FERM BP-11255。 [0161] 将乳酸菌使用自用配方的食品级乳酸菌培养基在37℃下培养18小时，通过离心分离收集菌体。使用去离子水清洗并收集菌体后，再悬浮于适量的水中，在达到90℃的温度下进行杀菌。将杀菌后的悬浮液在以下的条件下进行戴诺磨破碎。 [0162] 使 用 设 备：DYNO-MILL破 碎 装 置(Multi-lab0.6L，Shinmaru Enterprises Corporation) [0163] 圆周速度：14.0m/s [0164] 处理流速：1L/10min [0165] 处理次数：5次 [0166] 破碎槽温度：15℃ [0167] 使用玻璃珠：直径0.5mm0.4L [0168] 通过上述破碎(破坏)处理，乳酸菌悬浮液中的菌体的平均长径缩小至处理前的68％(2.77μm→1.89μm)。破碎后，将悬浮液冻干，得到破碎乳酸菌冻干粉末。 [0169] 本实施例中，验证了乳酸菌对膳食诱导肥胖模型小鼠的效果和用量依赖性。 [0170] 首先，按照表4中示出的配方配混原料，制造乳酸菌配混高脂饮食。 [0171] [表4] [0172] [0173] 将C57BL/6雄小鼠(5周龄)用如上所述地制备的高脂饮食(对照饮食)预先喂养1周，制成肥胖模型小鼠。接着，用噬淀粉乳杆菌CP1563株破碎菌体配混高脂饮食(以重量计配混0％、0.25％、0.5％、1.0％)喂养6周。喂养根据成对喂养法实施，以各组的摄入量同等的方式进行调整。实验结束时进行采血，测定HDL胆固醇值，从而验证乳酸菌的效果。需要说明的是，动脉硬化指数根据以下的算式求出： [0174] 动脉硬化指数＝(总胆固醇-HDL胆固醇)÷HDL胆固醇 [0175] 将结果示于图1(HDL-胆固醇)和图2(动脉硬化指数)。确认到通过CP1563株破碎菌体的给药改善了HDL-胆固醇及动脉硬化指数，其效果依赖于用量。 [0176] 进而，验证了乳酸菌对膳食诱导肥胖模型小鼠的抗代谢综合症效果。 [0177] 具体而言，将上述肥胖模型小鼠用噬淀粉乳杆菌CP1563株破碎菌体配混高脂饮食(以重量计配混0％、1％)喂养3个月。然后，测定肥胖模型小鼠的HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、中性脂肪、动脉硬化指数、高分子脂联素及内脏脂肪重量。 [0178] 将其结果示于图3的A～图3的F。如图3的B、图3的C、图3的D和图3的F中所示，通过CP1563株破碎菌体的给药，LDL-胆固醇、中性脂肪、动脉硬化指数及内脏脂肪重量显著减少。另外，通过CP1563株破碎菌体的给药，HDL-胆固醇及高分子脂联素显著上升。因此，通过乳酸菌的破碎物的给药，显著地改善了肥胖模型小鼠的脂质代谢。 [0179] [实施例5] [0180] [0181] 为了确认噬淀粉乳杆菌CP1563株破碎菌体的HDL胆固醇等脂质相关指标及对体内脂肪的影响，实施了12周的摄取试验。试验采用双盲平行组间对照试验，遵守基于赫尔辛基宣言的伦理原则而实施。 [0182] 将CP1563株使用自用配方的食品级乳酸菌培养基在37℃下培养18小时，通过过滤器浓缩收集菌体。将浓缩液在达到90℃的温度下进行杀菌，通过冻干得到乳酸菌冻干粉末。在以下的条件下将菌体用行星球磨机进行破碎。 [0183] 使用设备：行星球磨机(SKF-04，SEISHIN ENTERPRISE Co.，Ltd.) [0184] 圆周速度：14.0m/s [0185] 原料投入量：200g投料量/罐 [0186] 使用介质：φ2(3kg/罐) [0187] 转速：110rpm(罐、台均为该转速) [0188] 粉碎时间：10小时 [0189] 通过上述破碎(破坏)处理，得到菌体的平均长径缩小至处理前的47％(2.77μm→1.30μm)的CP1563株破碎菌体。 [0190] 将HDL胆固醇为40mg/dL以下且BMI为28以上的成人男女志愿者40名随机分配为2组，将包含100mg CP1563株破碎菌体的胶囊、或者不含CP1563株破碎菌体的胶囊以1天2胶囊、早餐前或早餐时与水一起服用的方式摄取12周。将胶囊的配方示于表5。 [0191] [表5] [0192] 原材料(每1个胶囊) [0193]组成 对照食品 被检食品 L.amy/ovorus CP1563株破碎菌体 0mg 100mg 日食玉米淀粉IPW 127mg 127mg Pinedex#2AG 223mg 123mg 明胶胶囊(白色1号) 77mg 77mg 总计 427mg 427mg [0194] 诊查/体检在摄取0、8、12周后实施，利用CT扫描的脂肪量测定在摄取0、12周后实施。 [0195] 将结果示于图4的A～图4的F。如图4的A、图4的B、图4的C和图4的D中所示，通过CP1563株破碎菌体的给药，体重和BMI与摄取开始前相比明显降低，体脂肪率和BMI与对照组相比显示出明显的降低(图4的B、图4的C)。另外，体温与对照组相比显示出明显的降低(图4的D)。进而，如图4的E中所示，通过CP1563株破碎菌体给药，皮下脂肪面积与摄取开始前相比明显降低。另外，对于摄取开始时内脏脂肪面积为100cm2以上的内脏脂肪型肥胖的被检者31名，观察了内脏脂肪量的变化值，结果如图4的F中所示CP1563株破碎菌体给药组的内脏脂肪减少量多。因此，通过CP1563株破碎菌体的给药，改善了体重、BMI、体脂肪率等体检值，皮下脂肪量和内脏脂肪量显示出统计上的显著性降低。 [0196] 因此，表明本说明书中记载的菌体能够用作用于制造脂质代谢改善用和/或糖代谢改善用组合物的菌体。另外，表明本说明书中记载的菌体可以用作用于制造脂质代谢改善预防用和/或糖代谢改善剂预防用组合物的菌体。 [0197] 进而，表示本说明书中记载的菌体可以用作用于制造皮下脂肪减少用组合物和/或内脏脂肪减少用组合物的菌体，可以用作用于制造皮下脂肪堆积预防用组合物和/或内脏脂肪堆积预防用组合物的菌体。 [0198] 需要说明的是，以下示出上述体检中的测定方法的详细情况作为参考。 [0199] 摄取0、8、12周后去医院时，令被检者在前一晚21点以后不要摄取水以外的饮食物并在上午去医院进行测定。 [0200] (体重/体脂肪率测定) [0201] 使用TANITA CORPORATION的体内脂肪计TBF-310进行测定。 [0202] (利用CT扫描的脂肪量测定) [0203] CT扫描使用Hitachi Medical Corporation的CT扫描系统(CT-W450)。 [0204] 设备设定： [0206] mAs值：90mAs [0207] 窗位：0 [0208] 窗宽：1000 [0209] 拍摄方法：按照以下的(a)～(i)依次进行。 [0210] (a)令预先换好检查服的被检者以举起双臂的状态仰躺在台板上。 [0211] (b)使台板移动至拍摄位置附近。 [0212] (c)露出脐部，用裂隙灯(光线定位器)进行拍摄位置对准。 [0213] (d)进行2～3次的CT拍摄时的呼吸的练习。 [0214] (e)使台板上升、下降，一边确认灯一边进行最终的拍摄位置对准。 [0215] (f)在脐的中心部位以手动设定拍摄1张。 [0216] (g)接着自相同位置以3张连续的自动设定拍摄脐中心部及其上下部3mm。 [0217] (h)确认拍摄的3张图像，保存1张接近脐的中心部的图像。有前次测定图像的情况下，采用与前次图像的测定位置相近的图像。 [0219] 检查时的注意事项： [0220] (1)指导被检者在检查日前一天极力控制低聚糖、膳食纤维多的膳食、碳酸饮料的摄取。 [0221] (2)指导被检者在检查日不要穿着束腰、紧身衣裤等矫形内衣。 [0222] (3)换检查服时，无论男女，令被检者在检查服的里面只穿内衣，将内裤向下拉使其远离脐部。穿着内衣勒紧腹部而产生的勒痕时，按摩腰周围。 [0223] (4)拍摄时，令被检者仰躺在台板上后，纠正其姿势以使其躺直。 [0224] (5)进行位置对准前，使被检者的腰浮起数次，使台板处不存在皮肤的张紧。 [0225] (6)一边以呼气时能够拍摄脐部的方式对准指示拍摄位置的灯，一边令被检者进行呼吸练习，从而进行位置对准。 [0226] (7)有前次测定时的拍摄图像时，参照前次图像并用监视器确认，从而确定拍摄位置。 [0227] 产业上的可利用性 [0228] 本发明的脂质代谢和/或糖代谢改善剂由于在人体试验中能够改善脂质代谢和/或糖代谢，因此对于这种代谢异常相关的疾病或紊乱的预防、改善或治疗是有用的。具体而言，根据本发明，提供不仅具有高PPARα活化能力、而且具有高PPARγ活化能力的乳酸菌噬淀粉乳杆菌CP1563株。本发明的乳酸菌利用PPARα活化来促进脂肪燃烧，增加由PPARγ活化带来的脂肪细胞所分泌的有益因子即脂联素的表达，从而能够用于各种疾病或紊乱的预防或治疗。因此，本发明在药品、饮食品、畜产等领域中有用。 [0229] 本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考被并入本说明书中。 [0230] 另外，本说明书中使用的微生物的保藏号如下。 [0231] “FERM BP-11255”是基于布达佩斯条约于2010年5月25日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))进行国际保藏的噬淀粉乳杆菌CP1563株的保藏号。 [0232] “FERM BP-11379”是基于布达佩斯条约于2011年4月22日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))进行国际保藏的噬淀粉乳杆菌CP1562株的保藏号。 [0233] “FERM BP-11331”是基于布达佩斯条约于2007年9月11日在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))进行国际保藏的加氏乳杆菌CP2305株的保藏号。 |
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