一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法 |
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| 申请号 | CN201310693004.8 | 申请日 | 2013-12-18 | 公开(公告)号 | CN103734745A | 公开(公告)日 | 2014-04-23 |
| 申请人 | 武汉市元大生物科技有限公司; | 发明人 | 朱玲; 刘敏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种高浓度乳 铁 蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法。包括：离心 脱脂 ；等电点沉淀法去除 酪蛋白 ；微滤膜除菌； 超滤 浓缩；接种嗜酸乳杆菌；加入乳化剂均质； 真空 浓缩；将蛋白浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中；添加冻干保护剂； 冷冻干燥 。该方法制备得到的乳铁蛋白的含量较高，乳铁蛋白的纯度大约为48%。与传统工艺相比，降低了乳铁蛋白结构中热敏性成分的分解，提高了乳铁蛋白的收率；同时该方法制备所得的复合微胶囊能够增强其对外界环境的抵抗 力 ，降低乳铁蛋白在加工、运输过程中和人体胃酸中的活性损失，显著提高乳铁蛋白和嗜酸乳杆菌到达肠道的生理活性，有效保持免疫与微生态双活性，增强产品对人体的保健功能，提高产品的附加价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)离心脱脂新鲜牛初乳在0-4°C条件下经3000-3500r / min离心20min脱脂； 2)等电点沉淀法去除酪蛋白将脱脂乳置于35-40°C水浴中，缓慢滴加乳酸溶液调其pH值至4.6-4.8，静置30min后，在20°C条件下离心除去酪蛋白，收集离心后的上清液得初乳乳清； 3)微滤膜除菌将上述初乳乳清用陶瓷膜过滤，除去乳清中残留的脂肪、蛋白和菌体等，获得澄清的乳清液； 4)超滤浓缩将上述透过液采用分子截留量为IOkD的中空纤维超滤膜装置进行超滤分离，截留富含乳铁蛋白的浓缩液； 5)接种嗜酸乳杆菌按浓缩液体积的3-5%接入高密度嗜酸乳杆菌，于恒温培养箱中30-40°C发酵培养24-36h，使嗜酸乳杆菌活菌数量达到109cfu/L以上，获得富含嗜酸乳杆菌活菌体的乳铁蛋白发酵液； 6)加入乳化剂均质将乳酸甘油酯和大豆磷酯复合溶解后以发酵液质量的0.1%-0.5%加入到乳清发酵液中，均质； 7)真空浓缩将步骤6得到的乳状液在45-55 °C条件下真空浓缩，使浓度达到18-27% ； 8)将步骤7所得到的浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中，调节溶液pH值为6.0_8.0 ； 9)添加冻干保护剂在所得浓缩液中添加5-10%质量浓度的葡聚糖和1-10%质量浓度的甘露醇，控制料液的厚度在10-20mm范围内； 10)冷冻干燥将步骤9所得的浓缩液预冻至一 40°C，将捕水器降温至一 60°C，开启真空泵，将系统真空抽至10Pa，开启加热，使物料得到一定升华潜热，并保持系统真空在20-30Pa直至冻干，系统真空达到5Pa，保持一定时间，使物料彻底冻干后入库备用。 |
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| 说明书全文 | 一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法技术领域背景技术[0002] 乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。它是一种具有多种生物学功能的蛋白质，能够参与铁的转运，对肠中的铁离子具有增溶作用，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能。由于乳铁蛋白具有广泛而独特的生物学功能和理化特性，作为食品、医药等领域的新兴成员，正在受到越来越多的关注。它在治疗、营养补充、食品等方面将有着广阔的应用前景，因此非常具有开发和研究价值。 [0003] 嗜酸乳杆菌不仅存在于胃中，它还是人体小肠内的主要益生菌。它能调整肠道菌群平衡，抑制肠道有害微生物的增殖。嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拮抗作用。其所分泌的嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等抗生物素类物质，能有效抵制肠道致病菌的生长，减轻肝脏解毒负担。嗜酸乳杆菌在肠道内发酵后，还可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，还可以减少胆固醇的吸收，并能降低辐射对人体的伤害。 [0004] 最近几年，牛初乳制品已成为食品及功能性乳制品开发的热点，牛初乳生产加工企业、牛初乳制品种类越来越多。但是由于起步较晚，目前我国的牛初乳生产企业大多规模较小，产品质量不高，主要是以普通牛初乳为原料生产出的牛初乳类干粉产品，特异性乳铁蛋白产品很少，同时这些产品在生产过程中主要应用巴氏杀菌、喷雾干燥等热处理技术，产品中乳铁蛋白的活性会有较大损失，不易保藏，胃肠通过率非常低。而本实验则是探索如何在工业化生产的条件下，最大限度地保持乳铁蛋白和嗜酸乳杆菌的双重生物活性，同时克服胃酸的杀伤，增强制品对人体的保健功能。 发明内容[0005] 本发明提供一种高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊的制备方法，以新鲜牛初乳和高密度培养的嗜酸乳杆菌为原料，采用超滤浓缩、真空冷冻干燥技术制备同时具备免疫和微生态调节双重活性的复合微胶囊。该方法获得的初乳制品中富含高浓度乳铁蛋白和嗜酸乳杆菌。 [0006] 其通过如下步骤来实现:O离心脱脂新鲜牛初乳在0-4°C条件下经3000-3500r / min离心20min脱脂； 2)等电点沉淀法去除酪蛋白将脱脂乳置于35-40°C水浴中，缓慢滴加乳酸溶液调其pH值至4.6-4.8，静置30min后，在20°C下经离心，除去酪蛋白，收集离心后的上清液得初乳 乳清； 3)微滤膜除菌将预处理后的乳清用陶瓷膜过滤，除去乳清中残留的脂肪、蛋白和菌体等，获得澄清的乳清液； 4)超滤浓缩将上述透过液采用分子截留量为IOkD的中空纤维超滤膜装置进行超滤分离，截留富含乳铁蛋白的浓缩液； 5)接种嗜酸乳杆菌按浓缩液体积的3-5%接入嗜酸乳杆菌，于恒温培养箱中30-40°C发酵培养24-36h，使嗜酸乳杆菌活菌数量达到109cfu/L以上，获得富含嗜酸乳杆菌活菌体的乳铁蛋白发酵液； 6)加入乳化剂均质将乳酸甘油酯和大豆磷酯复合溶解后以发酵液质量的0.1%-0.5%加入到乳清发酵液中，均质； 7)真空浓缩将步骤6得到的乳状液在45-55 °C条件下真空浓缩，使浓度达到18-27% ； 8)将步骤7所得到的浓缩液缓慢加入到已溶解好的壁材中，调节溶液pH值为 6.0_8.0 ； 9)添加冻干保护剂在所得浓缩液中添加5-10%质量浓度的葡聚糖和1-10%质量浓度的甘露醇，控制料液的厚度在10-20mm范围内； 10)冷冻干燥将上述浓缩液预冻至一 40°C，将捕水器降温至一 60°C，开启真空泵，将系统真空抽至10Pa，开启加热，使物料得到一定升华潜热，并保持系统真空在20-30Pa直至冻干，系统真空达到5Pa，保持一定时间，使物料彻底冻干后入库备用； 更近一步地，所述步骤2)中，乳酸溶液浓度为0.8mol / L，离心机转速为4000-6000r / min。 [0008] 更近一步地，所述步骤4)，超滤的工艺参数为:操作温度35 - 55°C、操作压0.08 — 0.12MPa、超滤速度 3.5-4.5 L / min。 [0009] 更近一步地，所述步骤6)中，乳化剂是乳酸甘油酯:大豆磷酯为1:1的混合物。 [0010] 更近一步地，所述步骤8)中，壁材是羧甲基纤维素:阿拉伯胶为1:1的混合物。 [0011] 通过以上方法制备得到的高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊，乳铁蛋白的含量较高，经SDS-PAGE凝胶电泳结果表明，所制得的乳铁蛋白的纯度大约为48%。与传统工艺相比，由于采用膜技术进行“冷杀菌”，低温浓缩，降低了乳铁蛋白结构中热敏性成分的分解，提高了乳铁蛋白的收率；同时该方法制备所得的复合微胶囊能够增强其对外界环境的抵抗力，降低乳铁蛋白在加工、运输过程中和人体胃酸中的活性损失，显著提高乳铁蛋白和嗜酸乳杆菌到达肠道的生理活性，有效保持免疫与微生态双活性，增强产品对人体的保健功能，提高产品的附加价值。且该制品的各项理化指标和卫生指标均符合国家标准，适合工业生产的实际需要，大大提高了生产效率。 [0012] 具体实施方式[0013] 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步具体的说明。实施例[0014] 一、乳铁蛋白浓缩液的制备 I)备选50kg牛初乳置于大型低温离心机,温度控制在4°C,经3500r / min离心20min脱脂。 [0015] 2)将脱脂乳置于38°C水浴中，缓慢滴加浓度为0.8mol / L的乳酸溶液调其pH值至4.8，静置30min后，在20°C条件下经5000r / min离心20min，收集离心后的上清液得初乳乳清。 [0016] 3)将预处理后的乳清用孔径为0.4μπι的陶瓷膜过滤，过滤参数为:操作温度为55°C，进口压力为0.5MPa，出口压力为0.27MPa，表面流速为75L/min。 [0017] 4)将上述透过液采用分子截留量为IOkD的中空纤维超滤膜装置进行超滤分离，超滤的工艺参数为:操作温度51°C、操作压0.llMPa、超滤速度4.2L / min。 [0018] 5)按浓缩液体积5%接入嗜酸乳杆菌母液，于恒温培养箱中30°C厌氧发酵培养24h，嗜酸乳杆菌活菌数量达到2.74X 109cfu/L ；6)将乳酸甘油酯和大豆磷酯为1:1的复合物溶解后以发酵液质量的0.3%加入到乳清发酵液中，均质； 7)将步骤6得到的乳状液在50°C条件下真空浓缩，浓度为21% ； 8)将浓缩液缓慢加入到已溶解的羧甲基纤维素、阿拉伯胶混合比为1:1的壁材中，用2NHC1调节溶液pH值为6.5 ; 9)在所得浓缩液中添加5%质量浓度的葡聚糖和4%质量浓度的甘露醇，料液的装液厚度为10_ ； 10)将上述浓缩液先在一 40°C条件下预冻2h，将捕水器降温至一 60°C，开启真空泵，将系统真空抽至10Pa，开启加热，并保持系统真空在30Pa直至冻干，系统真空达到5Pa，保持30min，使物料彻底冻干后入库备用； 试验例本发明产品对小鼠免疫功能方面的研究 1.试验材料与方法 1.1实验动物与分组: SPF级昆明种雄性小鼠120只，体重为18-22g，由河南省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK (豫)2005-0001。饲料由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，生产许可证号为SCXK (湘)2006-0001。每30只分为I组，共四组。每大组随机分为蒸馏水对照组、普通牛初乳对照组、高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊组，每组10只小鼠。 [0019] 1.2剂量选择及样品处理:取高浓度乳铁蛋白与嗜酸乳杆菌复合微胶囊1.67g (按人体口服推荐量折算所得)加蒸馏水至200ml，取普通牛初乳1.67g加蒸馏水至200ml，空白对照组予以等体积的蒸馏水，分别给予受试动物灌胃，每天灌胃一次，灌胃体积为4ml，连续30天。 [0020] 1.3实验方法:1.3.1迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法) 小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC (0.2ml/每鼠)致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20% (v/v) SRBC (20ul/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。 [0021] 1.3.2抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000 r/min) IOmin.将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫后4天的小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用Hanks液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8mlHanks液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5 乂106个/ mL。将表层培养基加热溶解后与等量的pH7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用SA液配制的10%SRBC50ul (v/v)、20ul脾细胞悬液(5X IO6个/ mL)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(I:8)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。 [0022] 1.3.3 NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)受试小鼠颈椎脱白处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hanks液洗2次，每次离心IOmin (1000r / min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml无菌水20秒，裂解红细胞后再加入 0.5ml 2倍Hanks 液及 8mlHanks 液，1000rpm离心 IOmin,用 ImL含 10%小牛血清的 RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(活细胞数应在95%以上)，调整细胞浓度为2 X IO7个/ml，此为效应细胞，取传代后24h生长良好的YAC-1细胞用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4X IO5个/ml，此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各IOOul (效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各IOOul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton各IOOul ;上述各项均设三个平行孔，于37 0C，5% 二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清IOOul置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液IOOul，根据室温反应3_10min，每孔加入lmol/L的HCl 30ul，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)。 [0023] NK细胞活性=[(反应孔OD-自然释放孔0D) / (最大释放孔OD-自然释放孔OD)]X 100%2.试验结果 2.1本发明产品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响 如表1所示，试验组的小鼠在注射SRBC后24h其足肿胀度较普通牛初乳对照组有较大提高，且与空白对照组和牛初乳对照组比较，其P值均小于0.05，表明在服用本发明产品后小鼠的迟发型变态反应能力有显著提高。 [0024] 表1本发明产品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(X土s).2.2本发明产品对小鼠抗体生成细胞数的影响 如表2所示，试验组的小鼠溶血空斑数较普通牛初乳对照组有较大提高，且与空白对照组和普通牛初乳对照组比较，其P值均小于0.05，表明在服用本发明产品后小鼠的抗体生成细胞数较对照组有显著提高。[0025] 表2本发明产品对小鼠抗体生成细胞数的影响(x土s) 2.3本发明产品对小鼠NK细胞活性的影响 如表3所示，试验组的小鼠NK细胞活性较普通牛初乳对照组有较大提高，且与空白对照组和普通牛初乳对照组比较，其P值均小于0.05，表明在服用本发明产品后小鼠的NK细胞活性较对照组有显著提高。 [0026] 表3本发明产品对小鼠NK细胞活性的影响` 应理解，上述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 |
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