[0001] 序列表的引用

[0002] 本申请包含计算机可读格式的序列表。该计算机可读格式通过提述并入本文。

[0003] 对生物材料的保藏的引用

[0004] 本申请包含对于生物材料的保藏的引用，所述保藏通过提述并入本文。完整信息参见本说明书的最后一页。

[0005] 本发明涉及使用可降低乳蛋白等电点的酶产生酸化的乳饮料的方法。本发明还涉及具有脱酰胺酶活性的新酶及其在酸化的乳饮料生产中的用途。

[0006] 发明背景

[0007] 酸化的乳饮料的市场在全球不断增长，所述饮料包括发酵的乳饮料和液体酸乳(yoghurt)，并且人们有兴趣提高这种产品的质量和经济性。

[0008] 酸化的乳饮料一般通过下述方式产生：将酸化的乳与糖浆溶液混合，并对混合物进行均质化处理。酸化可发生在加入化学物质如葡萄糖酸δ-内酯(GDL)的过程中，或者酸化可由于用乳酸细菌发酵乳品而引起。然而，当保存这样的产品时，乳中的一种成分，即酪蛋白，经常沉淀或结合并且聚集，结果饮料易于分相(separate)，使得液体乳清集中在表面。这个过程，经常称作脱水收缩(syneresis)，降低了酸化的乳饮料的质量。

[0009] 果胶、淀粉、改性淀粉、CMC等，经常用作酸化的乳饮料中的稳定剂，但是由于这些稳定剂的成本相对较高，所以人们有兴趣发现其他并且可能甚至更好的溶液。因此本发明的目的是提供用于制造稳定的酸化乳饮料的方法，其中减少了保存时分离成凝乳与乳清。目的是提供稳定化的替换方法，从而补充或者部分替代目前本领域中使用的稳定剂的使用。

[0010] 现有技术中已知能以不改变蛋白质的氨基酸链长的方式降低蛋白质等电点的酶。例如，已经发现了通过作用于酰胺基团以产生羧基从而增加蛋白质负电荷的脱酰胺酶(EP976829，US6756221)。已经描述了通过这样的酶将乳蛋白脱酰胺(WO2006075772、JP2003250460、WO2002068671)。这些公开教导了：蛋白质(例如乳蛋白)可被脱酰胺，以使经修饰的蛋白质在食品中使用时改善多种性质，例如，报道了包含这样的经修饰的蛋白质的乳制品具有更好的味道和质感。然而，这些公开未提及关于蛋白质修饰酶在生产酸化的乳饮料中的用途。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明的发明人令人惊讶地发现，通过在酸化的乳饮料产品制造期间加入可降低乳中酪蛋白的等电点的酶，来减少酸化的乳饮料的脱水收缩。

[0013] 因此，本发明涉及产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括：

[0014] a)将包含乳蛋白的乳底物酸化；和

[0015] b)用具有蛋白质修饰活性，可降低乳蛋白等电点的酶处理；

[0016] 其中步骤b)在步骤a)之前、期间或之后进行。

[0017] 此外，本发明的发明人已经鉴定了具有脱酰胺活性的新酶，其适用于本发明的方法。

[0018] 因此，在另一方面，本发明涉及具有脱酰胺酶活性的分离的多肽，其选自下组：

[0019] a)多肽，其具有与(i)SEQ ID NO：2，或(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸133-318至少91％相同的氨基酸序列；

[0020] b)多肽，其由与(i)SEQ ID NO：1，或(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸397-954至少90％相同的多核苷酸编码；

[0021] c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸的互补链可在高严紧条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸397-954杂交；

[0022] d)多肽，其由包含于大肠杆菌DSM 19445中的质粒编码；和

[0023] e)多肽，其具有通过在(i)SEQ ID NO：2，或(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸133-318中取代、缺失和/或插入一个或数个氨基酸而修饰的氨基酸序列。

[0024] 附图简述

[0025] 图1显示用脱酰胺酶处理的酪蛋白在考马斯染色的IEF凝胶上的结果。在IEF凝胶上加入下述样品(从左至右)：1道：IEF标记；2道：用脱酰胺酶克隆的上清处理的酪蛋白；3道：用准备用于加样到制备型IEF的上清处理的酪蛋白(此样品与2道相比稀释约4倍)；4-11道：用来自制备型IEF的级分的汇集物处理的酪蛋白(汇集物4(7道)包含脱酰胺酶)；12道是酪蛋白标准物。

[0026] 发明详述

[0027] 酸化的乳饮料

[0028] 根据本发明，“酸化的乳饮料”包括基于酸化的乳底物的任何可饮用产品，其可根据本发明的方法产生。可由于加入化学品如乳酸、柠檬酸或葡萄糖酸δ-内酯(GDL)而发生酸化，或者可由于用微生物发酵而发生酸化。因此酸化的乳饮料包括发酵的乳饮料和液体酸乳饮料。

[0029] 根据本发明，酸化的乳饮料是可饮用的，其意义为它们为液体形式并作为饮料消费，即它们适合于饮用而不是用匙食用。“液体形式”指产品为物质的流体状态，因而表现出易于流动的特性。因此，液体的形状通常由装液体的容器确定，与例如凝胶样物质相反，后者是软的但不能自由流动，如酸乳或布丁。

[0030] 根据本发明，酸化的乳饮料的粘度可低于40Pa(在剪切速率为300pr.s时获得)，优选小于30Pa，更优选小于20Pa，并且甚至更优选在300pr.s的剪切速率时为15-20Pa。

[0031] 酸化的乳饮料的粘度可以如下定义：

[0032] 原理：此方法基于通过粘度测定法测量(恒定速率)而对质地进行表征。通过恒定速率测量，粘度和剪切速率表现为剪切速率的函数。提取由流动曲线选择并计算的参数。

[0033] 材料：具有CC 25(bop/cup)测量系统的StressTech流变仪。

[0034] 步骤：在开始测量前，必须将样品调节至正确的温度13℃。

[0035] 通过下述方式记录流动曲线：增加变形(deformation)(剪切速率：0.2707至-1 -1300s )，然后减小变形(剪切速率：300至0.2707s )。

[0036] 设置：

[0037] 法向力(normal force)：

[0038] ·方法：To Gab

[0039] ·最大负荷力：10N

[0040] ·法向力低于10N时开始测量

[0041] ·暂停：1000秒。

[0042] ·样品高度约为1.000mm

[0043] 剪切速率：

[0044] ·21步-往复(up and down)：0.2707-0.3304-0.4923-0.7334-1-2-4-6-10-25-50-75-100-125-150-175-200-225-250-275-300。

[0045] ·延迟时间：5秒。

[0046] ·积分时间：10秒。

[0047] 温度和时间：

[0048] ·平衡时间：-

[0049] ·手动：重复1次

[0050] ·手动控制：13℃

[0051] ·测量后的温度：13℃

[0052] 前进的位置(advanced position)：

[0053] ·位置分辨率：85y rad

[0054] ·达到稳定状态，间隔+-：0.010

[0055] ·强度：60％

[0056] ·参考曲线：关闭

[0057] 根据本发明，酸化的乳饮料的pH可小于4.6，优选小于4.4，更优选小于4.2，并且甚至更优选约pH 4或者更低。在一个方面，酸化的乳饮料的pH小于3.8，如小于3.6。

[0058] 根据本发明，酸化的乳饮料的脂肪含量可为0至2％，优选1.5％以下，1％以下，0.5％以下或者约0.1％或更小。酸化的乳饮料的非脂乳固体(milk solidnon-fat)含量小于20％，优选小于8.5％，小于8％，小于7.5％，小于7％，小于6.5％，小于6％，或者约
5％。

[0059] 根据本发明，酸化的乳饮料的乳蛋白含量可小于8％，优选小于4％，小于3.5％或者小于3％。在一个优选的实施方案中，酸化的乳饮料的乳蛋白含量为约2.5至约3％。在另一个优选的方面，酸化的乳饮料的乳蛋白含量小于2％，优选约1％的乳蛋白含量。

[0060] 根据本发明，酸化的乳饮料的保存期多于7天，优选多于14天，更优选多于28天，如多于3个月。

[0061] 优选地，根据本发明的酸化的乳饮料的稳定性增加。可在将酸化的乳饮料保存适当天数后，通过测量因为脱水收缩而集中在表面上的乳清的高度而确定稳定性。也可在加速脱水收缩(如通过离心进行)后来确定稳定性。

[0062] 产生酸化的乳饮料的方法

[0063] 如上所述，用于产生根据本发明的酸化的乳饮料的方法包括：

[0064] a)将包含乳蛋白的乳底物酸化；和

[0065] b)用具有蛋白质修饰活性，可降低乳蛋白等电点的酶处理；

[0066] 其中步骤b)在步骤a)之前、期间或之后进行。

[0067] 在本发明的上下文中，“乳底物”可为任何未加工的和/或加工过的乳材料，其能根据本发明的方法进行酸化。因此，有用的乳底物包括但不限于任何包含乳蛋白的乳品或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、浓缩乳、干乳、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或乳酪。显然，乳底物可以来源于任何哺乳动物。

[0068] 优选地，乳底物是乳糖溶液/悬浮液，并且更优选底物是奶。在优选的实施方案中，乳底物是脱脂乳粉的水溶液。

[0069] 乳底物包含乳蛋白，例如酪蛋白和乳清蛋白。在本发明的上下文中，“乳蛋白”可以是乳中天然存在的任何蛋白质。涉及酸化的乳饮料中的乳蛋白时，乳蛋白包括酶修饰的(enzymatically modified)乳蛋白。

[0070] 术语“乳品/乳”应理解为通过为任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳状分泌物。

[0071] 在一个实施方案中，乳底物可以比原料乳更浓，并且因此其蛋白质含量可以高于5％，优选高于6％，高于7％，高于8％，高于9％，或者高于10％，并且乳糖含量高于7％，优选高于8％，高于9％，或者高于10％。

[0072] 在酸化之前，可以根据本领域的已知方法将乳底物均质化并巴氏灭菌。

[0073] 在本文中使用时，“均质化”指强烈混合，以获得可溶的悬浮液或乳液。如果在酸化前进行均质化，可以将乳脂破碎成更小的尺寸，使得乳脂不再从乳中分离。这可以通过迫使乳在高压经过小孔而实现。

[0074] 在本文中使用时，“巴氏灭菌”指加热至并在特定高温保持特定的时间。这种高温可为，例如，至少65℃，至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃或者至少95℃，并且乳底物可以保持在这样的高温，例如，至少15秒，至少20秒，至少30秒，至少5分钟或者至少10分钟。这种巴氏灭菌将减少或消除活生物体如微生物在乳底物中的存在。
乳底物的巴氏灭菌还可能使一些乳蛋白全部或部分变性。如果在酶处理后进行，巴氏灭菌还可能使酶失活。然后可以进行快速冷却步骤。

[0075] 在本发明的方法中，将乳底物酸化。这样的酸化可以是化学酸化，如通过加入酸，如乳酸或柠檬酸，或者葡萄糖酸δ-内酯(GDL)，其为食品酸化中常用的D-葡萄糖酸的环酯。

[0076] 在本发明的方法的优选方面，酸化包括用微生物发酵乳底物。

[0077] 在本发明的方法中，“发酵”指通过微生物的作用将碳水化合物转化成醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。

[0078] 在本发明上下文中，“微生物”可以包括能发酵乳底物的任何细菌或真菌。

[0079] 用于大多数发酵乳制品的微生物选自细菌，通常指乳酸细菌组。如本文所使用的，术语“乳酸细菌”指革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖，产生酸，包括乳酸作为主要产生的酸，还包括乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸细菌可在“乳杆菌”目中找到，其中包括乳球菌属菌种(Lactococcus spp.)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属菌种(Leuconostoc spp.)、假明串珠菌属菌种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属菌种(Pediococcus spp.)、短杆菌属菌种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属菌种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属菌种(Propionibacterium spp.)。此外，属于严格厌氧细菌、双歧杆菌，即双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)组、产生乳酸的细菌通常包括在乳酸细菌组中，其常单独或与乳酸细菌组合用作食品培养物。

[0080] 通常向乳品业提供乳酸细菌，作为冷冻或冻干培养物用于生产用起子(bulk starter)繁殖，或者作为所谓的“直投式(Direct Vat Set)”(DVS)培养物，意欲用于直接接种入发酵容器或罐中，用于生产乳制品，如酸化的乳饮料。这种培养物通常称作“起子培养物”或“起子”。

[0081] 常用的乳酸细菌的起子培养物菌株通常分为：最适生长温度约30℃的嗜温性生物体，和最适生长温度约40至约45℃的嗜热性生物体。属于嗜温组的典型生物体包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜假明串珠菌乳脂亚种(Peudoleuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌菌种包括作为实例的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德式乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、瑞士 乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德式乳 杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

[0082] 属于双歧杆菌属的严格厌氧细菌也常用作乳品起子培养物，包括双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，并且通常包括在乳酸细菌组中。此外，丙酸乳杆菌属(Propionibacteria)的菌种用作乳制品起子培养物，特别是在乳酪的生产中。此外，属于短杆菌属的生物体常用作食品起子培养物。

[0083] 另一组微生物起子培养物是真菌培养物，包括酵母培养物和丝状真菌的培养物，其具体用于某些类型的乳酪和饮料的产生中。真菌的实例包括洛克福青霉(Penicillium roqueforti)、白青霉(Penicillium candidum)、白地霉(Geotrichum candidum)、开菲尔圆酵母(Torula kefir)、开菲尔酵母(Saccharomyces kefir)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

[0084] 在本发明的优选实施方案中，用于乳底物发酵的微生物是干酪乳杆菌或嗜热链球菌与德式乳杆菌保加利亚亚种的混合物。

[0085] 用于酸化的乳饮料生产的发酵方法是公知的，并且本领域的技术人员知道如何选择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和特性、添加剂如碳水化合物、香料、矿物质、酶(例如凝乳酶(rennet)和磷脂酶)和工艺时间。显然，应选择发酵条件以支持本发明的实现，即获得适于产生酸化的乳饮料的发酵乳制品。

[0086] 在本发明的方法的一个实施方案中，在酸化之前或之后，向乳底物中加入糖浆(syrup)。

[0087] 本发明的上下文中的“糖浆”是能够为终产物即酸化的乳饮料带来香味和/或甜味的任何额外的添加剂成分。其可为包含例如糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的液体糖(liquid sugar of fructose)、阿斯巴甜(aspartame)、糖醇、果实浓缩物、橙汁、草莓汁和/或柠檬汁的溶液。

[0088] 可以使用本领域已知的任何方法将酸化的乳底物和糖浆的混合物均质化。可以进行均质化以获得平滑而稳定的液体均匀溶液。可以通过本领域已知的任何方法进行酸化的乳底物和糖浆的混合物的均质化，如通过迫使乳在高压穿过小孔。

[0089] 在本发明的一个实施方案中，向酸化的乳底物如发酵的乳底物中加水，并且将酸化的乳底物如发酵的乳底物和水的混合物均质化。

[0090] 在本发明的方法的另一个实施方案中，因为加入糖浆，其可以是酸性的(acidic)，即通过将乳底物和以例如果实浓缩物、橙汁、草莓汁和/或柠檬汁形式的糖浆混合，而进行乳底物的酸化。

[0091] 本发明的方法的步骤b)包含酶处理。酶处理可以在步骤a)之前进行，即乳底物可以在酸化前经受酶处理，如在加入化学酸化剂之前或接种微生物之前。酶处理可以在步骤a)的过程中进行，即乳底物可以在酸化的同时经受酶处理。在一个实施方案中，在用微生物接种乳底物之前或之后加入酶，和在进行发酵的同时在乳底物上发生酶反应。

[0092] 或者，可以在步骤a)之后进行酶处理，即乳底物可以在酸化后经受酶处理。如果酸化的乳底物与糖浆混合和任选地均质化，那么可以在此之前或之后进行酶处理。可以在加入糖浆的同时或之后加入酶，但是要在均质化之前，或者可以在将酸化的乳底物和糖浆混合并均质化之后加入酶。

[0093] 在优选的实施方案中，步骤b)在步骤a)之前或过程中进行。在更优选的实施方案中，乳底物在步骤a)之前经受巴氏灭菌，并且在巴氏灭菌之后但在酸化之前或过程中进行酶处理，例如，可以在用微生物接种之前或之后加入酶，并且酶反应与发酵基本上同时发生。

[0094] 在甚至更优选的实施方案中，乳底物在步骤a)之前经受巴氏灭菌，并且在巴氏灭菌之后但在酸化之前进行酶处理。在甚至更优选的实施方案中，在酶处理之后但在酸化之前进行另一次巴氏灭菌，即，巴氏灭菌在步骤b)之前和之后进行，并且在第二次巴氏灭菌之后进行步骤a)。

[0095] 以合适的量加入蛋白质修饰酶，在选择的反应条件下实现期望程度的蛋白质修饰。可以以0.0001-1g/L乳底物，优选0.01-0.1g/L乳底物的浓度加入酶。

[0096] 本发明的方法中的酶处理可通过如下方式进行：向乳底物中加入酶并使酶反应在适当的温度以适当的保持时间发生。酶处理可以根据本领域公知的原理，在经选择以适合所选的蛋白质修饰酶的条件进行。还可以通过使乳底物与已固定化的酶接触而进行处理。

[0097] 酶处理可以在任何合适的pH进行，例如2-10，如在4-9或5-7的pH。可以优选使酶在乳底物的天然pH起作用，或者，如果因为发酵而获得酸化，酶可以在发酵过程中在乳底物的天然pH起作用，即pH将从未发酵乳底物的天然pH逐渐降低至发酵乳底物的pH。

[0098] 酶处理可以在任何合适的温度进行，例如1-70℃，如2-60℃。如果乳底物因为用微生物发酵而酸化，则可以在发酵期间，例如在35-45℃进行酶处理。

[0099] 任选地，使酶作用于乳底物之后，可以通过本领域已知的任何方法将酶蛋白去除、减少和/或失活。

[0100] 任选地，可以向酸化的乳饮料中加入其他成分，如着色剂；稳定剂，例如果胶、淀粉、改性淀粉、CMC等；或多不饱和脂肪酸，例如ω-3脂肪酸。这些成分可以在生产过程中在任意点加入，即酸化之前或之后，酶处理之前或之后，和任选地加入糖浆之前或之后。

[0101] 具有蛋白质修饰活性的酶

[0102] 在本发明的方法中，可以使用酶降低酸化的乳饮料中乳蛋白的等电点，从而减少保存时的脱水收缩。

[0103] 应理解的是，在本发明的上下文中，“乳蛋白”指任何乳蛋白，即乳品中天然存在的任何蛋白质。因此，在本发明的方法中，可以降低任何乳蛋白的等电点。换句话说，在本发明的方法中，使用酶降低至少一种乳蛋白，即至少一种乳品中天然存在的蛋白质的等电点。

[0104] 因此，在一个实施方案中根据本发明用于产生酸化的乳饮料的方法包括：

[0105] a)将包含乳蛋白的乳底物酸化；和

[0106] b)用具有蛋白质修饰活性，可降低乳蛋白等电点的酶处理；

[0107] 其中步骤b)在步骤a)之前、期间或之后进行。

[0108] 在优选的实施方案中，乳蛋白是酪蛋白。

[0109] 优选地，使用的酶具有可以不改变蛋白质的氨基酸链长，即不水解蛋白质中的肽键，也不向氨基酸链的N-端或C-端添加新氨基酸的方式降低蛋白质等电点的活性。

[0110] 在本发明的一个方面，通过在低pH向乳蛋白引入更多的负电荷而降低乳蛋白的等电点。这样的负电荷可以添加在乳蛋白即酪蛋白的表面。

[0111] 在本发明方法的一个优选方面，具有可降低乳蛋白等电点的蛋白质修饰活性的酶是能将额外的负电荷以不改变蛋白质的氨基酸链长的方式引入蛋白质的酶。也就是说，不通过例如在氨基酸链的C-端或N-端加入更多(带负电的)氨基酸而增加氨基酸链长，从而引入额外的负电荷。优选通过修饰蛋白质中的氨基酸侧链而引入额外的负电荷。在一个优选的方面，这样的修饰不包括蛋白质的交联。酶可以具有将蛋白质中的酰胺基团脱酰胺的活性，通过直接作用于这些基团而不水解蛋白质中的肽键也不使蛋白质交联来进行。酶可以是，例如，天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、酰胺酶或脱酰胺酶。

[0112] 在一个更优选的方面，酶具有脱酰胺酶活性。

[0113] 术语“脱酰胺酶”指可催化多肽链(蛋白质)中并入的氨基酸谷氨酰胺或天门冬酰胺的γ-酰胺水解并释放侧链羰基和氨的酶。这样的酶也可以称作肽谷氨酰胺酶、蛋白质-脱酰胺酶、蛋白质脱酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酰胺水解酶。脱酰胺酶的组包含但不限于分配于EC 3.5.1.44亚类的酶(在Kikuchi，M.，Hayashida，H.，Nakano，E和Sakaguchi，K.Peptidoglutaminase.Enzymes for selective deamidation ofγ-amide ofpeptide-bound glutamine.Biochemistry 10(1971)1222-1229中描述)。

[0114] 在本发明的方法中使用的具有蛋白质修饰活性的酶可以是动物、植物或微生物来源的。优选的酶获得自微生物来源，特别是丝状真菌或酵母，或者细菌。

[0115] 酶可以例如，源自曲霉属的菌种，例如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)；盘基网柄菌属(Dictyostelium)，例如D.discoideum；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、高大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)、脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝 根霉(R.stolonifer)；核 盘菌 属(Sclerotinia)，例 如S.libertiana；毛癣菌属(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如；W.sclerotiorum；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)；金黄杆菌属(Chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(e.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)、迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。

[0116] 在一个优选的实施方案中，酶是细菌的，例如来自黄杆菌(Flavobacteria)纲，如来自黄杆菌目，如来自黄杆菌科，如来自金黄杆菌属的菌株。优选的酶是脱酰胺酶，其具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％相同的序列。

[0117] 具有脱酰胺酶活性的新酶

[0118] 本发明人已经从具有脱酰胺酶活性的金黄杆菌属中鉴别了新酶。编码酶的基因之开放阅读框的DNA序列如SEQ ID NO：1所公开。由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。SEQ ID NO：3显示活性脱酰胺酶的N-端序列，如通过实验所确定的。SEQ ID NO：4显示成熟酶的186个氨基酸长的氨基酸序列。成熟酶的分子量为～20kDa，如通过SDS-PAGE所确定的。SEQ ID NO：5显示无信号肽编码区的酶编码基因的DNA序列。

[0119] 因此，本发明的一个方面涉及具有脱酰胺酶活性的多肽，其选自下组：

[0120] a)多肽，其具有与(i)SEQ ID NO：2，或(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸133-318至少75％，优选至少80％或至少90％，更优选至少91％，至少95％或至少97％相同的氨基酸序列；

[0121] b)多肽，其由与(i)SEQ ID NO：1，或(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸397-954至少80％，优选至少90％，更优选至少95％或至少97％相同的多核苷酸编码；

[0122] c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸的互补链在高严紧条件下，优选非常高严紧条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸397-954杂交；

[0123] d)多肽，其由包含于大肠杆菌DSM 19445中的质粒编码；和

[0124] e)多肽，其具有通过在(i)SEQ ID NO：2，或(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸133-318中取代、缺失和/或插入一个或数个氨基酸而修饰的氨基酸序列。

[0125] 多肽可以是分离的。

[0126] 术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多肽。

[0127] 在一个优选的方面，本发明的多肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的氨基酸133至318相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸的氨基酸序列。

[0128] 在另一个优选的方面，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有脱酰胺酶活性的片段，所述片段包含至少100，如至少150或200个氨基酸。在更优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸133至318，或其等位变体，或其具有脱酰胺酶活性的片段，所述片段包含至少100，如至少150或200个氨基酸。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体或其具有脱酰胺酶活性的片段组成，所述片段包含至少100，如至少150或200个氨基酸。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸133至318或其等位变体或其具有脱酰胺酶活性的片段组成，所述片段包含至少100，如至少150或200个氨基酸。

[0129] 多肽的“等位变体”是由基因的等位变体编码的多肽。基因的等位变体是占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽，即多肽的等位变体。

[0130] 编码脱酰胺酶的多核苷酸

[0131] 本发明的另一个方面涉及编码具有脱酰胺酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

[0132] a)多核苷酸，其编码的多肽具有与(i)SEQ ID NO：2，或(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸133-318至少75％，优选至少80％或至少90％，更优选至少91％，至少95％或至少97％相同的氨基酸序列；

[0133] b)多核苷酸，其与(i)SEQ ID NO：1，或(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸397-954至少80％，优选至少90％，更优选至少95％或至少97％相同；

[0134] c)多核苷酸，其互补链在高严紧条件下，优选非常高严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸397至954，或(iii)(i)或(ii)的亚序列杂交。

[0135] 术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的5’和/或3’端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列。SEQ ID NO：1的亚序列优选包含至少100个连续的核苷酸，更优选至少200、300、400或500个连续的核苷酸。优选的亚序列由SEQ ID NO：1的核苷酸397至954组成。此外，亚序列可以编码具有脱酰胺酶活性的多肽片段。

[0136] 就本发明而言，杂交表示核苷酸序列或其互补物在高至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、它的互补链，或这些任一个的亚序列。优选的亚序列由SEQ ID NO：1的核苷酸397至954或其互补链组成。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

[0137] 在一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列，如氨基酸133至318，或这些任一个的互补链。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO：1或其核苷酸397至954，或这些任一个的互补物。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区或其互补物。

[0138] 对于长度至少100个核苷酸的长探针，将高至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。

[0139] 对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在65℃(高严紧性)，或更优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次
15分钟。

[0140] 在特定的实施方案中，使用0.2X SSC、0.2％SDS优选至少在65℃(高严紧性)，或者更优选至少在70℃(非常高严紧性)进行洗涤。在另一个特定的实施方案中，使用0.1X SSC、0.2％SDS优选至少在65℃(高严紧性)，或更优选至少在70℃(非常高严紧性)进行洗涤。

[0141] 对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶 液，1mM焦磷 酸钠 (sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。

[0142] 对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度下洗涤两次，每次15分钟。

[0143] 在含盐的杂交条件下，有效的Tm控制探针和结合滤膜的DNA之间成功杂交所需的同一性程度。

[0144] 可以使用下述公式确定有效的Tm以确定各种严紧性条件下两个DNA杂交所需的同一性程度。

[0145] 有效的Tm＝81.5+16.6(log M[Na+])+0.41(％G+C)-0.72(％甲酰胺)[0146] (参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)[0147] SEQ ID NO：1的G+C含量是39.3％。对于中严紧性，甲酰胺为35％，并且5X SSPE+的Na 浓度为0.75M。对这些数值应用这一公式，得到有效的Tm为70.3℃。

[0148] 另一个相关的关系是两个DNA之间的1％错配可使Tm降低1.4℃。为了确定两个DNA在中严紧性条件下在42℃杂交所需的同一性程度，使用下述公式：

[0149] ％同源性＝100-[(有效的Tm-杂交温度)/1.4]

[0150] (参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)[0151] 对这些数值应用这个公式，则在中严紧性条件下在42℃两个DNA杂交所需的同一性程度为100-[(70.3-42)/1.4]＝79.8％。

[0152] 序列同一性

[0153] 参数“同一性”或“同源性”描述两个氨基酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的比对通过使用来自EMBOSS软件包(Rice，P.，Longden，I.和Bleasby，A.(2000)EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277；http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序而确定。Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所述的全局比对算法。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开放罚分为10，和缺口延伸罚分为0.5。

[0154] 将本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性或同源性程度计算为：两个序列比对中完全匹配的数目，除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。结果以百分比同一性表示。

[0155] 当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置具有同样的氨基酸残基时，则发生完全匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目。

[0156] 在特定的实施方案中，多肽的氨基酸序列与，或对，SEQ ID NO：2的同一性百分比由下述方式确定：i)使用Needle程序比对两个氨基酸序列，采用BLOSUM62取代矩阵、缺口开放罚分为10，并且缺口延伸罚分为0.5；ii)计算比对中完全匹配的数目；iii)用完全匹配的数目除以两个氨基酸中最短者的长度，和iv)将iii)的除法结果转化成百分比。对，或与本发明其他序列的同一性百分比以相似方式计算。

[0157] 就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80：TM TM
726-730)使用LASERGENE MEGALIGN 软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定，采用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。配对比对参数是K元组＝
3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。

[0158] 表达载体与宿主细胞

[0159] 本发明的另一个方面涉及包含多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体，和重组宿主细胞，和用于产生这种具有脱酰胺酶活性的多肽的方法，所述方法包括(a)在利于产生所述多肽的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[0160] 术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

[0161] 术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

[0162] 术语“编码序列”指直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

[0163] 术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

[0164] 术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

[0165] 术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

[0166] 如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

[0167] 具有脱酰胺酶活性的多肽的来源

[0168] SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有脱酰胺酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70或至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是至少600个核苷酸，至少优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通
32 3 35
常将探针标记以探测相应的基因(例如，用 P、H、S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包括于本发明中。

[0169] 可由从感兴趣的其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有脱酰胺酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术，分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ IDNO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

[0170] 本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，与给定的来源有关而使用术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

[0171] 本发明的多肽可以是细菌多肽，并且优选可以获得自黄杆菌纲或者是可从黄杆菌纲获得的，更优选获得自黄杆菌目和甚至更优选获得自黄杆菌科。多肽可以获得自下述菌属或者是可从下述菌属获得的：伯杰菌属(Bergeyella)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、噬纤维菌属(Cellulophaga)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、居间菌属(Coenonia)、独岛菌属(Dokdonia)、稳杆菌属(Empedobacter)、黄杆菌属、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、鸟杆菌属(Ornithobacterium)、极地杆菌属(Polaribacter)、冷弯菌属(Psychroflexus)、冷蛇菌属(Psychroserpens)、里默氏杆菌属(Riemerella)、Saligentibacter属或威克斯氏菌属(Weeksella)，优选获得自金黄杆菌属。

[0172] 对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and imperfectstates)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适当的等同物的同一性。

[0173] 上述种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

[0174] 此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物而鉴定并获得本发明的多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

[0175] 本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。实施例

[0176] 实施例1

[0177] SKMP溶液

[0178] 将20ml水+4.5g脱脂乳粉(来自Kerry，即时分散性)在50℃温育10分钟备用，从而获得均匀溶液。

[0179] 糖溶液

[0180] 3.3g蔗糖

[0181] 10.5g葡萄糖

[0182] 向46ml 20mM乳酸缓冲液，pH 4.0中加入这些糖，并在90℃搅拌温育5分钟，然后冷却至5℃。

[0183] 酶

[0184] 将用色谱纯化的金黄杆菌脱酰胺酶(实施例3)，0.9mg/ml，进行稀释以给出表中所示的终浓度。

[0185] 方法A(在巴氏灭菌之前加入酶)

[0186] 将250μl SKMP溶液转移至eppendorf管中。加入20μl酶或水(对照)并在50℃温育120分钟。

[0187] 在85℃以1000rpm将溶液温育30分钟，然后在43℃以1000rpm温育10分钟。

[0188] 加入30μl 4U/l YF-3331(混合菌株培养物，其包含来自Chr.Hansen A/S，Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43℃温育16小时。

[0189] 然后在0-5℃冰/水浴中温育样品20分钟。

[0190] 加入600μl糖溶液(冰浴)，并用移液器来回抽吸(suck up and down)五次。

[0191] 向每个管加入500μl玻璃珠(5℃)。

[0192] 将样品在5℃放入eppendorf热混合器中，1400rpm 10分钟。

[0193] 将样品在5℃放置4天，并测量脱水收缩情况。

[0194] 方法B(在巴氏灭菌之后加入酶)

[0195] 将250μl SKMP溶液转移至eppendorf管中，并在50℃温育120分钟。

[0196] 在85℃以1000rpm将溶液温育30分钟，然后在43℃以1000rpm温育10分钟。

[0197] 加入30μl 4U/l YF-3331(混合菌株培养物，其包含来自Chr.Hansen A/S，Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)+20μl酶或水(对照)，并在43℃温育16小时。

[0198] 然后在0-5℃冰/水浴中温育样品20分钟。

[0199] 加入600μl糖溶液(冰浴)，并用移液器来回抽吸五次。

[0200] 向每个管加入500μl玻璃珠(5℃)。

[0201] 将样品在5℃放入eppendorf热混合器中，1400rpm 10分钟。

[0202] 将样品在5℃放置4天，并测量脱水收缩情况。

[0203] 方法C(在均质化之后加入酶)

[0204] 将250μl SKMP溶液转移至eppendorf管中，并在50℃温育120分钟。

[0205] 在85℃以1000rpm将溶液温育30分钟，然后在43℃以1000rpm温育10分钟。

[0206] 加入30μl 4U/l YF-3331(混合菌株培养物，其包含来自Chr.Hansen A/S，Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)并在43℃温育16小时。

[0207] 然后在0-5℃冰/水浴中温育样品20分钟。

[0208] 加入600μl糖溶液(冰浴)+20μl酶或水(对照)，并用移液器来回抽吸五次。

[0209] 向每个管加入500μl玻璃珠(5℃)。

[0210] 将样品在5℃放入eppendorf热混合器中，1400rpm 10分钟。

[0211] 将样品在5℃放置4天，并测量脱水收缩情况。

[0212] 表1中的数据(两次测定值)显示，与水对照相比，加入脱酰胺酶时脱水收缩减少。可见在巴氏灭菌之后加入酶的效果最显著。

[0213] 表1 脱酰胺酶 平均脱水收缩 偏差(+/-)[0214] ug/ml mm Mm

[0215] 方法A

[0216] 在巴氏灭菌之前加入 57 2.8 0.08

[0217] 水对照 0 3.3 0.04

[0218] 方法B

[0219] 在巴氏灭菌之后加入 57 1.1 0.03

[0220] 水对照 0 3.5 0.25

[0221] 方法C

[0222] 在均质化之后加入 57 3.9 0.12

[0223] 水对照 0 3.8 0.13

[0224] 实施例2

[0225] 如实施例1中所述，根据方法B进行剂量响应实验。

[0226] 表2显示随着脱酰胺酶浓度的增加，脱水收缩减少。

[0227] 表2 脱酰胺酶 平均脱水收缩 偏差(+/-)[0228] ug/ml Mm mm

[0229] 在巴氏灭菌之后加入 0 2.5 0.11

[0230] 在巴氏灭菌之后加入 13 2.2 0.10

[0231] 在巴氏灭菌之后加入 29 1.6 0.00

[0232] 在巴氏灭菌之后加入 57 1.2 0.03

[0233] 实施例3

[0234] 脱酰胺酶的克隆与产生

[0235] 克隆与产生

[0236] 从1989年1月19日采自南极洲的土壤样本分离出金黄杆菌菌种。

[0237] 基于由已知脱酰胺酶的序列(Genbank登录号AB046594(Eur J Biochemvol 268：1410-1421，2001)和GenseqN登录号AAZ49495(EP976829))设计的引物，PCR扩增脱酰胺酶基因。由这种产物获得的序列如SEQ ID NO：1所示。

[0238] 通过PCR将来自洒维奈斯(SavinaseTM)基因(克劳氏芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶)的信号肽以符合读框的方式(in frame)融合于编码脱酰胺酶的基因(SEQ ID NO：5)。

[0239] 通过同源重组将融合基因整合进枯草芽孢杆菌宿主的基因组中。在三启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达基因构建体，所述三启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记(在例如Diderichsen等，A usefulcloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid，30，p.312，1993中描述)。通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体，以确认构建体中正确的DNA序列。选择一个这样的克隆。

[0240] 在旋转摇床上，在500ml带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中进行脱酰胺酶表达克隆的发酵，每个锥形瓶中包含补加34mg/l氯霉素的100ml LB培养基(或者适于枯草芽孢杆菌发酵的其他培养基)。将克隆在30℃发酵5天。

[0241] 通过制备型IEF纯化脱酰胺酶

[0242] 以2.5ml等分试样向PD10TM(Pharmacia)凝胶过滤柱加入50ml上清液以去除盐。从PD10TM(Pharmacia)柱收集70ml.

[0243] 制备样品用于RotoforTM(Biorad)分离。将59ml凝胶过滤上清液与3ml两性电解质Biolyte 3/10(Biorad art 163 1112)混合。如制造商所推荐的进行制备型等电聚焦(IEF)。将样品加样于RotoforTM，并以恒定功率(constant effect)15W电泳4小时。在SDS PAGE上评价由制备型IEF获得的二十个级分，并根据条带模式汇集组分。通过如下所述的定性测定法评价对于酪蛋白的活性。

[0244] 定性的脱酰胺酶测定法

[0245] 通过向Britten Robinson缓冲液pH 7中的1ml1％酪蛋白加入10μl样品，然后在37℃搅拌温育1小时而将酪蛋白脱酰胺化。通过将样品置于冰上而终止反应。

[0246] 通过分析型IEF评价酪蛋白的脱酰胺化。将经酶处理的样品(和未处理的酪蛋白对照)与9M尿素、2％Triton X-100的溶液1∶1混合，以使酪蛋白微团(casein micelles)变性。将样品加样于Pharmacia IEF 3/10上。如制造商推荐的对IEF凝胶进行电泳，然后考马斯蓝染色以显现蛋白质(图1)。将下述样品加样到IEF凝胶上(从左至右)：1道：IEF标记；2道：脱酰胺酶克隆的上清液；3道是准备用于加样到制备型IEF的上清液(此样品与2道相比稀释约4倍)；4-11道：来自制备型IEF的级分的汇集物(汇集物4(7道)包含脱酰胺酶)；12道是酪蛋白标准物。

[0247] 生物材料的保藏

[0248] 依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)，Mascheroder Weg 1 B，D-38124Braunschweig，Germany，给出了下述的登录号：

[0249] 保藏物 登录号 保藏日期

[0250] 大肠杆菌 DSM 19445 2007年6月21日

[0251] 该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律确定的人能够获得该培养物。该保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了本申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解的是，保藏物的可用性并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。