스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스,액티노마이세스 이스라엘리에 대한 면역단백질(ＩｇＹ)을함유한 계란으로 추출한 항 구강질환 각각의 항원을배합한 혼합 면역단백질 또는 난황분말을 함유한 아이스크림

스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리에 대한 면역단백질(ＩｇＹ)을 함유한 계란으로 추출한 항 구강질환 각각의 항원을 배합한 혼합 면역단백질 또는 난황분말을 함유한 아이스크림{Ice-cream containing the Mixed IgY or Yolk Extracted from Egg containing anti-Streptococcus mutans IgY, anti-Streptococcus sanguis IgY and anti-Actinomyces israelii IgY individually}

본 발명은 구강질환을 일으키는 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii )를 항원화시켜서, 닭에게 각각을 접종하여 산란계의 난황에서 구강질환을 일으키는 균에 대한 면역단백질(IgY)을 생산하여, 각각 생산된 면역단백질을 적정비율로 배합한 면역단백질을 식품첨가제로 이용하는 기술을 제공하는데 그 특징이 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 상기 각각의 면역단백질(IgY)을 배합한 혼합 면역단백질을 함유한 아이스크림에 관한 것이다.

본 발명과 관련하여 종래 우리나라 기술은 다음의 원리에 따라 발명하였다.

포유류(태생동물)의 신생아는 모친의 면역항체를 태반 혹은 모유를 통해서 획득하고 자기의 면역 기능이 성숙될 때까지 초기 감염증을 면역시킨다.

그러나, 태반도 모유도 없는 조류 이하의 동물 즉, 난생동물의 경우 어미 닭이 획득한 면역항체는 난황 중에 이행되어 축적되고 자손에 전해진다. 난황 중의 항체는 포유류의 IgG 분류의 항체에 해당되나 단백 화학적 성질이 약간 다르고 또한, 난황 유래의 항체이므로 비교 면역학 분야 등에서는 IgY(Immunoglobulin Yolk)라 부른다.

어미 닭에서 알을 통해 병아리로 면역항체의 이행은 1893년 클렘버러(Klemberer)에 의해 발견되었다.

그후 1960년대까지 여러 종류의 항원(세균, 바이러스, 단백질 등)을 산란계에 면역시켜, 대응하는 특이적 항체가 난황 중에 이행, 축적하는 사실이 확인되었다(마키슨 1965; 프라져 등 1934, 펫터슨 등 1962).

이러한 연구결과를 기초로 우리 나라에서 충치 유발을 예방하기 위해서 닭에 충치 유발균을 접종하여 계란 중 난황에 생성된 면역단백질을 추출하여 구강질환을 예방하는 연구가 실행되어졌다.

우리 나라에서 이남형(1997)이 면역단백질 함량을 제고시키는 산란계용 사료 및 이 사료에 의해 사양함과 함께 스트랩토코커스 뮤탄스 균주의 백신을 접종시켜 특수 면역단백질을 다량 함유하는 계란을 생산하는 방법(대한민국 공개특허공보 1999-011237)을 출원하였다. 이는 사료에 켈프밀, 또는 계피, 또는 박하, 또는 참숯을 첨가한 배합사료를 산란계에 섭취시킴과 함께 스트랩토코커스 뮤탄스 균주를 산란계에 면역처리하여 면역단백질 함량을 제고시키는 계란생산방법이다. 이승배(1996)가 충치예방용 난황 IgY 항체의 제조방법(대한민국 공개특허공보 1997-073607)을 출원하였다. 이는 스트랩토코커스 뮤탄스를 산란계에 면역처리하여 충치예방용 난황 IgY 항체 제조방법에 관한 것이다.

사람에게서 구강질환을 일으키는 균은 인간 치아 플라그(Human dental plaque)에서 글루칸네이즈(Glucanase)를 생산하는 균으로, 액티노마이세테세에(Actinomycetaceae), 스트랩토코카이(Streptococci), 헤모필리(Haemophili), 그람-음성 혐기성균(Gram-negative anaerobes)으로 크게 나뉘고, 종으로는 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 스트랩토코커스 미니터( Streptococcus minitor ), 액티노마이세스 네슬렌디( Actinomycesnaeslundii) , 액티노마이세스 비스코서스( Actinomyces viscosus ), 박테리오네마 메트루초티( Bacterionema matruchotii ), 박테리오디스 스페이스( Bacteroides species ), 로티아 덴토카리오샤( Rothia dentocariosa ) 등이 있다 .

충치 유발균으로 가장 대표적인 것은 스트랩토코커스 뮤탄스로, 이 균은 설탕 성분 존재시 스트랩토코커스 뮤탄스의 표면 단백질(surface protein)이 치아표면에 결합하여 균 자체에서 생산되는 포도당 전이효소(glucosyl transferase: G Tase)가 충치를 유발하는데 중요한 역할을 한다. 포도당 전이효소(G Tase)가 식사로부터 제공되는 각종 당류를 발효하여 불용성이면서 끈적끈적한 글루칸(glucan)을 생성함으로써 치아 우식증이 시작된다.

스트랩토코커스 뮤탄스는 불용성 글루칸을 합성하는 세포결합 포도당 전이효소(Cell Associated Glucosyl Transferase: CA G Tase)와 수용성의 글루칸을 합성하는 무세포 포도당 전이효소(Cell-Free Glucosyl Transferase: CF G Tase)의 2종류 작용으로 치아표면에 결합하여 치아 우식증을 일으킨다.

그러나, 구강질환은 1가지 균이 아닌 구강질환을 일으키는 다수의 균주를 예방해야 하므로 각각의 특이항체가 함유된 계란에서 면역단백질을 추출하여 혼합한 복합 특수 면역단백질 개발을 필요로 하는 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 제반 문제점을 해소하기 위해, 종래에는 스트랩토코커스 뮤탄스 균주 하나만으로 항원화하여 면역단백질을 생산하였으나, 본 발명에서는 구강질환을 일으키는 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 균주의 백신을 각각 다른 닭에게 투입해서 이들 3가지 균주에 대한 면역단백질(IgY)의 생산방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 각각의 면역단백질을 함유한 계란 생산방법에서 생산된 계란 또는 난황으로부터 추출된 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)을 일정비율 배합하여 제조한 혼합 면역단백질을 제조하고, 또한 이 혼합 면역단백질을 함유한 아이스크림을 제공함에 있다.

도 1은 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii )에 대한 면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 2는 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii )에 대한 총 면역단백질(IgY) 역가이다.

도 3은 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii )에 대한 면역단백질(IgY) 역가이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 구강질환을 일으키는 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 항원을 수산화알미늄 유화제와 혼합하여 각각의 다른 닭에게 1차 접종한 후, 상기 각각의 항원을 ISA25 유화제와 혼합하여 2차 접종하고, 상기 각각의 항원을 ISA25 유화제와 균질 혼합하여 산란 개시 후 다시 3차 접종하여, 각 산란계 당 3회씩 총 9회를 접종 면역처리하여 상기 각각의 항원에 대한 항 구강질환 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 면역단백질(IgY)을 제공하는 방법에 그 특징이 있다.

또 다른 발명은 상기 계란이나 난황으로부터 추출한 항 구강질환 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcussanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 면역단백질(IgY)을 함유한 아이스크림에 관한 것이다.

본 발명의 구성을 보다 상세하게 기술하면, 닭에게 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리 항원 각각을 유화제 수산화나트륨과 혼합하여 1차 접종하고, 유화제(ISA25)와 혼합하여 2차 접종 후, 균질화하여 산란 개시 후 3차 접종을 하여 면역화시켜, 상기 3개균을 3회씩 총 9회를 접종하며, 접종간격은 2주 정도로 투여량이 균수 108/㎖ 정도가 되게 접종 면역처리하여 난황에 3가지 항원에 대한 항 구강질환 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 면역단백질(IgY)을 함유하는 것을 특징으로 하는 계란생산방법에 관한 것이다.

상기 발명을 보다 구체적으로 기술하면, 닭에 투여된 항원에 대해 획득한 상기 면역단백질을 함유한 계란을 소정의 용기를 이용하여 난황막을 분리한 난황을 추출하고, 추출된 난황에 증류수를 첨가하고 교반 후, 저온 방에서 일정시간 방치 후, 원심 분리한 상등액에 함유된 수용성 상기 면역단백질인 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리 항원에 대한 각각의 특수 면역단백질 비를 1 : 1 : 1 또는 1 : 2 : 2로 배합한 것을 특징으로 한다.

또 다른 발명의 구성은 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)의 일정 비율 중 어느 하나로 배합한 항 구강질환 혼합 면역단백질을 첨가한 아이스크림을 제조시, 항 구강질환 혼합 면역단백질 난황 분말 1.0∼5.0중량% 이하, 항 구강질환혼합 면역단백질 IgY 추출분말 0.6중량% 이하로 첨가한 아이스크림에 관한 것이다. 다만, 항 구강질환 혼합 면역단백질 IgY의 추출과정이 복잡하고, 계란 당 추출되는 그 양이 극소하므로 아이스크림의 가격대비 첨가할 수 있는 양이 제한적이다. 일반적으로 아이스크림은 빙과류에 속하는 식품이므로 항상 먹을 수 있기 때문에 그 양은 특정하지 않고 대략 0.1중량% 내지 0.6중량%로 하는 것이 적절하다. 그러면 최소한의 항 구강질환 혼합 면역단백질 IgY로 충치예방에 효과가 있게 된다.

이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다.

다만, 본 발명의 권리범위는 실시예에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리항원 각각을 닭에 접종 및 면역단백질(IgY) 제조

당업자라면 누구나 용이하게 입수할 수 있는 연세대 한국 미생물 보존센터에서 동결건조된 스트랩토코커스 뮤탄스(KCCM 11823)를 구입하였고, 또한 한국생물자원센터에서 동결건조된 스트랩토코커스 상기스(KCTC 3731)를 구입하여 사용하였고, 오타커(Otake: 1991)배양법으로 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스 각각을 브레인-하트 인퓨젼(Brain-Heart Infusion: BHI) 배지에서 설탕(sucrose) 5% 첨가하여 37℃에서 스트랩토코커스 뮤탄스는 24시간, 스트랩토코커스 상기스는 48시간 혐기배양하여 증균시키며, 또한 미국 ATCC로부터 액티노마이세스이스라엘리(ATCC 12104)를 구입한 동결건조된 실험 미생물을 브레인-하트 인퓨젼 배지에서 3∼7일간 37℃, 10% CO ₂ 배양기(incubator)에서 증균시켰다.

위와 같이 각각 증균된 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리 균주를 5% 포르말린 용액이 첨가된 배양기(incubator)에서 사멸시킨 후, 사멸된 균 10,000g을 5℃에서 15분간 원심분리하여 수집하였다.

상기 각각의 3가지 균주를 1차 접종 때는 유화제 수산화알미늄을, 2차부터는 유화제(IAS25)로 혼합 후, 균질화하여 산란 개시 후 총 9회를 접종하며, 접종 간격은 2주 정도로 투여량이 균수 10 ⁸ /㎖ 정도가 되게 접종 면역처리하였다.

실시예 2

1. 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리 항원 접종후 총 면역단백질(IgY)함량 및 항 구강질환 스트랩토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트랩토코커스 상기스(Streptococcus sanguis), 액티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii) 각 면역단백질(IgY) 함량

산란계 시험 33주간 동안에 수집된 계란은 1주 단위로 동일 처리구 계란을 혼합 균질화시킨 후에 난황 10g에 증류수 100㎖를 첨가한 후 교반시키고, 4℃ 저온 방에서 12시간 방치하였다. 10,000×g에서 15분간 원심분리하여 수용성 면역단백질을 분리하였다.

분리한 상기 면역단백질 함량을 분석한 자료는 표 1에 나타내었다.

대조구보다 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)의 함량이 많았으며,스트랩토코커스 뮤탄스 균주의 면역단백질 함량이 가장 많았고, 스트랩토코커스 상기스 균주와 액티노마이세스 이스라엘리 균주의 면역단백질의 함량은 유사하게 나타났다.

2. 총 면역단백질(IgY) 및 각 3개균의 면역단백질(IgY) 역가 측정

총 면역단백질(IgY) 및 각 3개균 면역단백질(IgY) 역가는 모두 비경쟁적 샌드위치 엘리사 테스트(non-competitive sandwich ELISA test)로 측정하며, 상기 면역단백질(IgY) 역가는 스트랩토코커스 뮤탄스를 함유한 코팅버퍼(0.02M Tris, 0.15 NaCl, pH 9.0)를 준비하고, 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 100㎕를 채우고, 4℃에서, 12시간 배양하였다.

수세 버퍼(washing buffer; 0.02M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) 150㎕로 3회 수세시킨 후, 분석할 시료(난황 수용성 면역단백질) 100㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다가 다시 수세 버퍼 150㎕로 3회 수세시키고, 10,000:1로 희석된 토끼 항-닭 IgG Ab-HRB 100㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 다시 수세 버퍼 150㎕로 3회 수세시키고, 기질용액(0.1% TM BS, 0.05M 구연산-인산 버퍼, pH 5.0, 0.02% H ₂ O ₂ ) 100㎕ 첨가하였다.

실온에서 1시간 반응시키고 반응정지액(2N H ₂ SO ₄ ) 50㎕를 가하여 450㎚에서 흡광도(OD)를 측정하였다.

산란계 시험 33주 동안에 수집된 계란의 난황에서 얻어진 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)의 역가의 변화량을 도 1에 나타내었다.

측정된 결과는, 총 면역단백질 역가는 도 2 및 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)은 도 3에 제시된 바와 같다.

도 2를 참조하여 총 면역단백질 역가를 설명하면, 스트랩토코커스 뮤탄스 균주에 대한 역가가 가장 높게 측정되고, 스트랩토코커스 상기스와 액티노마이세스 이스라엘리 균주의 역가는 스트랩토코커스 뮤탄스 균주보다 낮았지만, 유사하였다. 일반 계란에 해당하는 대조구의 총 면역단백질 역가는 170에 가깝게 측정되었고 구강 질환 예방에 필요한 각 3개균 면역단백질 역가는 170보다 높게 측정되었다.

도 3을 참조하여 각 3개균 면역단백질의 역가를 설명하면, 스트랩토코커스 뮤탄스의 역가는 1.2, 스트랩토코커스 상기스는 0.5, 액티노마이세스 이스라엘리는 0.55로 측정되었다. 대조구인 일반 계란에서는 거의 측정되지 않았다.

이 실험에서 스트랩토코커스 뮤탄스 균주에 대한 면역단백질이 가장 많이 만들어졌고, 다른 균주에 대한 면역단백질은 적게 만들어졌다.

실시예 3

추출된 스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리 항원에 대한 면역단백질을 혼합하는 배합공정

스트랩토코커스 뮤탄스, 스트랩토코커스 상기스, 액티노마이세스 이스라엘리에 대한 면역단백질을 1 : 1 : 1 또는 1 : 2 : 2로 배합한 혼합 면역단백질을 생산하였다.

실시예 4

혼합 면역단백질 첨가 아이스크림 제조

항-구강질환 혼합 면역단백질 난황 분말 5.0중량%, 항-구강질환 혼합 면역단백질추출분말 0.6중량%를 함유하는 아이스크림 제조 배합비를 표 2에 예시하였다. 통상적으로 IgY항체를 함유한 난황이나 면역단백질은 추출하는 과정에 많은 경제적 비용이 소요되므로 최소한 용량을 사용하여 최대의 효과를 보고자 한다. 따라서, 난황분말은 0.5중량%가 최소의 함유량이고, 난황분말은 0.1중량%가 아이스크림에의 최소 함유량이다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

본 발명에 의해 생산된 스트랩토코커스 뮤탄스( Streptococcus mutans ), 스트랩토코커스 상기스( Streptococcus sanguis ), 액티노마이세스 이스라엘리( Actinomyces israelii ) 항원에 대한 각각의 면역단백질(IgY)을 배합한 면역단백질을 함유한 계란 및 이 계란으로부터 추출한 혼합 면역단백질을 함유한 아이스크림 등을 섭취하게 함으로써 구강질환 예방에 탁월한 효능을 발휘할 수 있게 되었다.

또한, 본 발명에 의한 생산방법에 의하여 생산된 계란의 난황에서 추출된 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)은 수용성이므로 물에 타서 쉽게 구강을 청소할 수 있는 특징이 있고, 설탕함량이 높은 과자류나 아이스크림 등에 구강질환 상기 각각의 항원에 대한 면역단백질(IgY)을 첨가함으로써, 치아 우식, 잇몸병 등에 대한 기대효과가 예상된다.