用于降低食品或兴奋剂中的丙烯酰胺的热稳定天冬酰胺酶 |
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| 申请号 | CN200880102299.4 | 申请日 | 2008-06-12 | 公开(公告)号 | CN101778939B | 公开(公告)日 | 2014-09-10 |
| 申请人 | C-列克塔有限责任公司; | 发明人 | T·格赖纳-斯托费尔; M·斯特鲁哈拉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及酰胺 水 解 酶用于制备食品或兴奋剂的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.酰胺水解酶在制备食品或兴奋剂中的用途，其中食品或兴奋剂与所述酰胺水解酶在至少70℃的温育温度下温育，其特征在于所述酰胺水解酶的最适温度范围是70℃到 |
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| 说明书全文 | 用于降低食品或兴奋剂中的丙烯酰胺的热稳定天冬酰胺酶[0002] 在全世界人们已经消费包含碳水化合物的食品长达几个世纪。如今，这类食品可以各种形式获得，例如采用以下形式：脆面包，面包干，饼干，椒盐卷饼，白色烤面包，早餐谷类食品，脆面包干(Biskuites)，脆炸土豆片，玉米粉圆饼小片，油煎土豆片(Pommes frites)，米粉糕等等。 [0003] 在加工或制备含碳水化合物的食品期间经常形成丙烯酰胺，尤其是在加热过程中，诸如发生在烘焙(Backen)、烤(Braten)、干烤 炙烤(Grillen)或油炸(Frittieren)期间，例如，并因此在这些食品中浓缩。在制备兴奋剂期间也观察到类似的现象，诸如制备咖啡期间。 [0004] 在2002年4月瑞典食品安全管理局第一次公布了食品中丙烯酰胺浓度的检测结果。同年世界卫生组织(WHO)发布的报告讨论了可能源于食品中高丙烯酰胺浓度的健康风险等等(FAO/WHO：″HealthImplications of Acrylamide in Food″，Geneva 2002)。 [0005] 丙烯酰胺是直接作用于人遗传密码(DNA)的物质。此外，在肝脏中丙烯酰胺被酶转化为环氧丙酰胺，遗传毒性作用归咎于其。例如，丙烯酰胺和环氧丙酰胺都能与氨基酸和核碱基形成化合物，从而可以改变DNA和血红蛋白的结构与功能。总体上丙烯酰胺被专家分类为致癌的，损伤DNA，有毒的，因为引起刺激作用、超敏反应以及对生殖系统造成风险。 [0006] 食品中形成丙烯酰胺的最重要来源是氨基酸天冬酰胺，其在食品诸如土豆、稻米和谷类中常见，但也以相当高的浓度存在于咖啡、干果中。如果食品/兴奋剂除了天冬酰胺外还包含糖诸如果糖或葡萄糖，则在高温下丙烯酰胺的形成甚至被进一步增加。 [0007] 食品或兴奋剂的制备方法(包括预处理步骤以降低丙烯酰胺含量)是现有技术已知的(例如参见US 7,037,540，US 2004/81724或US2005/202153)。其中酶尤其是天冬酰胺酶用于预处理的方法也是现有技术已知的。在一些情况下，这些预处理步骤(用于促进从待制备的食品或兴奋剂中去除、灭活和/或提取天冬酰胺)是非常昂贵和/或耗时的。 [0008] 因此，制备咖啡豆的方法分别包括，例如，复杂的干燥、蒸煮或润湿步骤。这类预处理步骤的目的是打开咖啡豆的气孔，以便以更好的方式提取、减少或灭活咖啡豆中包含的天冬酰胺。 [0011] 所有上述的复杂的以及在一些情况下还是耗时的预处理步骤直接或间接导致成本提高，因为它们延长了整个制备过程，从而使其成本更高。 [0012] 因此，作为本发明基础的目的是改进现有技术已知的食品或兴奋剂的制备方法。这种改进将尤其简化用于减少食品或兴奋剂中天冬酰胺或丙烯酰胺含量的预处理步骤，这样的话可以使整个制备方法时间更短花费更低。 [0014] 已经令人吃惊地发现食品或兴奋剂可以使用酰胺水解酶制备，所述酰胺水解酶在50℃持续温育5分钟后仍具有至少75％的剩余活性。 [0015] 本发明涉及酰胺水解酶用于制备食品或兴奋剂的用途，优选的用来减少食品或兴奋剂中的天冬酰胺含量，所述酰胺水解酶优选的为天冬酰胺酶，其在50℃持续温育5分钟后具有至少75％的剩余活性。当食品或兴奋剂接受后续热处理时，天冬酰胺含量的降低优选的还导致食品或兴奋剂中丙烯酰胺的含量降低，因为天冬酰胺是丙烯酰胺的前体。 [0017] 图2显示不同温育温度下激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)天冬酰胺酶I的酶活性。rA：相对活性(％)，T[℃]：以摄氏度为单位的温度。 [0018] 图3显示95℃温度下激烈热球菌天冬酰胺酶I的温度稳定性。rA：相对活性(％)，min：时间，以分钟为单位。很明显可以从图中看出，在95℃温育60分钟后，天冬酰胺酶具有大约100％的相对活性或剩余活性。 [0019] 图4显示99℃温度下激烈热球菌天冬酰胺酶I的温度稳定性。rA：相对活性(％)，min：时间，以分钟为单位。很明显可以从图中看出，在99℃温育60分钟后，天冬酰胺酶具有大约70％的相对活性或剩余活性。 [0020] 图5显示，如实施例4在80℃下利用根据本发明的天冬酰胺酶预加工生咖啡豆来烤两种类型的咖啡后，丙烯酰胺的含量降低。空白1和样品1-小果咖啡类混合物，空白2和样品2-巴西小果咖啡类。 [0021] 酰胺水解酶属于水解酶的酶家族。酰胺水解酶的区别特征在于它们裂解/水解酰胺基。它们被分到EC编号EC 3.5.1和3.5.2(酶委员会(Enzyme Commission)编号，根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology)(NC-IUBMB)的定义)。 [0022] 就说明而言，术语“剩余活性”旨在表示，与在其他反应条件(pH，底物等等)都相同的其最适温度范围内的初始比活性/体积活性相比，在特定温度温育特定时间后酶具有的任何比酶活性/体积酶活性。在这种情况下，就说明而言酶的比活性/体积活性旨在表示转化底物的比值(μmol)每单位时间(分钟)每酶量(mg或ml)。酶的剩余活性产生于上述温育时间后酶的比活性/体积活性除以初始比活性/体积活性，用百分比(％)表示。在这种情况下，酶的比活性优选的表示为U/mg，酶的体积活性优选的表示为U/ml。可选的，就描述而言酶的比活性/体积活性还可以表示为katal/mg或katal/ml。 [0023] 术语“酶活性”，有时还被称为“催化活性”或“催化效率”，通常是本领域技术人员已知的，表示酶的转化率，通常通过比例kkat/KM表示，其中kkat是催化常数(还称为转换数(turnover number))，KM值对应于底物浓度，其中反应率位于其极大值的一半。可选的，酶-1 -1的酶活性还可以用比活性(转化底物的μmol×mg ×min ；参见上文)或体积活性(转化-1 -1 底物的μmol×ml ×min ；参见上文)表示。关于酶活性还可以参考综述文献诸如Voet等，″Biochemie″[Biochemistry]，1992，VCH-Verlag，第13章，331-332页。 [0025] [0026] 在上表中，例如，实施方案C6表示在70℃至少50分钟后，酰胺水解酶具有至少75％的剩余活性，更优选的为至少80％，最优选的为至少90％。在尤其优选的实施方案中，在上述指定条件下酰胺水解酶优选的具有75-100％的剩余活性范围，更优选的为75-90％。 [0027] 在优选的实施方案中，使用的酰胺水解酶是天冬酰胺酶。就说明而言，天冬酰胺酶旨在表示催化天冬酰胺水解为天冬氨酸和铵的酶。在优选的实施方案中，这是I型天冬酰胺酶，在另一优选的实施方案中，是II型天冬酰胺酶。 [0028] 酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)，优选是热活性的。 [0029] 就说明而言，“热活性的”表示这类酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)的最适温度高于50℃。 [0030] 术语“最适温度”通常是技术人员已知的，涉及酶显示其最大酶活性的温度范围。结合这点可以参考相关文献诸如例如Voet等，″Biochemie″，1992，VCH-Verlag，第13章，331页；I.H.Segel，EnzymeKinetics：Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-StateEnzyme Systems，Wiley Interscience，1993； 和 A.G.Marangoni，EnzymeKinetics：A Modern Approach，Wiley Interscience，2002。 [0031] 就说明而言，最适温度优选的旨在表示温度范围，其中根据本发明使用的酰胺水解酶在其他恒定的反应条件下具有最大酶活性的至少80％，优选的至少90％。 [0032] 酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)最适温度范围优选的为60℃到130℃，更优选的为70℃到120℃，进一步优选的为75℃到110℃，最优选的为80℃到100℃，尤其是85℃到95℃。 [0033] 因此根据本发明使用的酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)优选的不仅是热稳定的(即就它们的酶活性而言耐受热处理)，此外还是热活性的(即只在较高温度下显示它们全部的酶活性)。 [0034] 迄今为止现有技术中还不知道有方法使用热活性天冬酰胺酶处理食品或兴奋剂来降低丙烯酰胺含量。 [0035] 在优选的实施方案中，在优选的60℃到120℃的温度下，更优选的65℃到110℃，进一步优选的70℃到100℃，最优选的75℃到100℃和尤其是80℃到90℃，酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)的比活性优选的为至少100，更优选的为至少200，进一步优选的为至少300，进一步优选的为至少500，最优选的为至少800和尤其是至少100单位/mg，其中1单位被定义为在相应的反应温度和pH值为8.6(50mMtris-HCl，25℃pH调节)的条件下从L-天冬酰胺每分钟释放1.0μmol氨的酰胺水解酶的量。 [0036] 令人吃惊地发现热活性的天冬酰胺酶比其他天冬酰胺酶具有实质性的优点。例如，可以在相对较高的温度使用热活性天冬酰胺酶裂解天冬酰胺，这导致与其中高温(尤其是高温下的静置过程)仍然起作用的方法的相容性。此外，在更高的温度下可以更高的反应率进行天冬酰胺的裂解。 [0037] 例如，在咖啡豆的酶处理中，在生咖啡豆用酶处理前必须将它们在水中膨胀。然后在烤咖啡豆前将其再次干燥。因此咖啡的酶处理需要，尤其是，下列步骤：a)湿润；b)湿润状态下的酶处理；c)干燥；d)烤。 [0038] 常用的脱咖啡因或保证“淡味”的工业方法已经包括上述加工步骤a)、c)和d)。 [0039] 对于干燥步骤c)来说，必须将咖啡豆加热到足够的温度，因为水无法通过其他方式去除。优选的使用热蒸煮(＞100℃)进行咖啡豆的加热和湿润。然后在70-80℃进行后续的干燥步骤c)。 [0040] 如果使用的酰胺水解酶只具有50℃的最适温度，例如，则这将非常不利，因为首先必须冷却到50℃进行酶处理，然后再次加热进行干燥。 [0041] 与此相反，当根据本发明优选的使用热活性天冬酰胺酶时，冷却不是必需的，这代表本发明的一个具体优点。 [0042] 使用热活性天冬酰胺酶的另一优点是作为升温的结果，待水解的天冬酰胺的扩散增加，这同样导致本发明方法的效率增加。 [0043] 本发明的方法可以获得使用酰胺水解酶的制备操作，并保留制备食品或兴奋剂的常用过程的加工步骤，即没有对加工循环的任何重要改变。酶处理优选的可以在加工步骤期间进行，虽然在所述步骤中食品或兴奋剂暴露于较高温度。 [0044] 在进一步优选的实施方案中，在优选的60℃到120℃的温度下，更优选的65℃到110℃，进一步优选的70℃到100℃，最优选的75℃到100℃和尤其是80-90℃，酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)的体积活性优选的为至少50，更优选的为至少100，进一步优选的为至少300，进一步优选的为至少500，最优选的为至少800和尤其是至少1000单位/mg，其中1单位被定义为在相应的反应温度和8.6的pH值(50mM tris-HCl，25℃pH调节)条件下从L-天冬酰胺每分钟释放1.0μmol氨的酰胺水解酶的量。 [0045] 在优选的实施方案中，酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)的最适pH范围优选的为pH 1到pH 14，更优选的为pH 3到pH 12，进一步优选的为pH 5到pH 11，最优选的为pH 7到pH 10，和尤其是pH 8到pH 9。术语“最适pH”通常是技术人员已知的，涉及酶具有其最大酶活性的pH范围。结合这点可以参考相关文献诸如Voet等，″Biochemie″，1992，VCH-Verlag，第13章，331页。就说明而言，术语最适pH优选的旨在表示pH范围，其中根据本发明使用的酰胺水解酶具有在其他恒定的反应条件下最大酶活性的至少80％，优选的至少90％。 [0046] 令人吃惊地发现酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)在提供的非常宽的pH范围内具有活性。在pH 5-pH 10的范围内，这些酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)优选的具有最大活性至少10％的活性。因此，有可能在具有大不相同的pH范围的各种方法中使用该酶。还可以在pH值经历显著波动的方法中使用该酶。还可以是pH值从5到10的的方法。在利用自来水处理生咖啡豆的情况下，例如，可能存在～5的非常低的pH值。 [0047] 在优选的实施方案中，在5-10的整个pH范围，与最大活性(即其他条件都相同的最适pH值下的最大活性，优选的在最适温度和浓度)相比，根据本发明酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)具有至少10％的活性，更优选的至少15％，进一步优选的至少20％，最优选的至少25％和尤其是至少30％。 [0048] 根据本发明使用的酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)优选的在保存时是稳定的。在优选的实施方案G1-G17到K1-K17中，在下表指定的条件下酰胺水解酶具有至少80％的剩余活性，更优选的为至少85％，进一步优选的为至少90％和尤其是至少95％： [0049] [0050] 在上表中，实施方案I5，例如，表示在10℃保存25天后，酰胺水解酶具有至少80％的剩余活性，更优选的为至少85％，进一步优选的为至少90％和尤其是至少95％。在尤其优选的实施方案中，在4℃保存30天的情况下，根据本发明使用的酰胺水解酶具有至少80％的剩余活性。 [0051] 酰胺水解酶类型包括，尤其是，天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)的酶家族，其催化天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨。在优选的实施方案中，根据本发明使用的酰胺水解酶是天冬酰胺酶。 [0052] 众所周知天冬酰胺酶可以转化天冬酰胺(L和D型)和谷氨酰胺(L和D型)。 [0053] 考虑到天冬酰胺酶的这种底物复杂性，根据本发明使用的天冬酰胺酶优选的水解L-天冬酰胺要比L-谷氨酰胺更快和/或有可能比D-天冬酰胺更快。 [0054] L-天冬酰胺对L-谷氨酰胺的KM值比例(单位分别为mM)范围优选的为1∶10到1∶400，更优选的1∶20到1∶200，进一步优选的1∶30到1∶100，最优选的1∶40到1∶80。 [0055] 在优选的实施方案中，根据本发明使用的天冬酰胺酶倾向于L-天冬酰胺而不是L-谷氨酰胺和/或D-天冬酰胺。L-天冬酰胺对L-谷氨酰胺的KM值比例(单位分别为mM)范围优选的为1∶1到1∶400，更优选的1∶5到1∶100，进一步优选的1∶10到1∶50。 [0056] 酰胺水解酶或天冬酰胺酶可以是热不稳定的或热稳定的。热稳定的天冬酰胺酶是现有技术已知的(参见例如Li et al.，Anal.Chem.2002，74，pp 3336-3341，US 5,719,056或Agathi等，Mol.Cell.Biochem.2001，216，pp 93-101)。但是，在制备食品或兴奋剂的方法中使用它们的提示在这些出版物中不是明显的。 [0057] 就说明而言，术语“热稳定的酰胺水解酶”或“热稳定的天冬酰胺酶”优选的旨在表示在50℃温育5分钟后具有至少75％的剩余活性的酰胺水解酶或天冬酰胺酶。 [0058] 天冬酰胺酶优选的是选自以下种的天冬酰胺酶：古生球菌属物种(Archeoglobus sp.)(例如闪烁古生球菌(Archeoglobus fulgidus))，栖热菌属物种(Thermus sp.)(例如Thermus therophilus)，热球菌属物种(Pyrococcus sp.)(例如Pyrococcus abyssi)，热球菌属物种(Thermococcussp.)(例如Thermococcus kodakarensis)，甲烷热杆菌属物种(Methanothermobacter sp.)(例如Methanothermobacterthermautrophicus)或选自其他Euryarchaeota的天冬酰胺酶或激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的天冬酰胺酶I。 [0059] 在优选的实施方案中，天冬酰胺酶由核苷酸序列编码，其优选的与核苷酸序列 [0060] 优选的尤其是本发明使用的天冬酰胺酶由核苷酸序列 [0061] 在优选的实施方案中，天冬酰胺酶的氨基酸序列与氨基酸序列 195-7)确定同源性，使用BLOSUM62矩阵以及对于缺口开口为11.0的值或对于扩大缺口为 1.0的值。 [0062] 在另一尤其优选的实施方案中，根据本发明使用的天冬酰胺酶包括氨基酸序列 [0063] 如上所述，优选的包含碳水化合物的食品或兴奋剂的制备方法通常具有预处理步骤以减少所述食品或兴奋剂中的丙烯酰胺含量。因此优选的在制备中使用本发明的酰胺水解酶，尤其是作为预处理操作的一部分，以将天冬酰胺水解为天冬氨酸。 [0064] 就说明而言，术语“包含碳水化合物的食品”优选的旨在表示按重量计优选的具有总计食品总重的至少0.1％的碳水化合物含量的食品，更优选的按重量计至少1％，进一步优选的按重量计至少5％，进一步优选的按重量计至少10％，最优选的按重量计至少20％，尤其是按重量计至少30％。 [0065] 另外优选的使用本发明的酰胺水解酶在制备食品或兴奋剂中减少天冬酰胺和/或丙烯酰胺的含量，尤其是作为预处理操作的一部分。 [0066] 由于这种使用本发明酰胺水解酶的结果，优选的天冬酰胺含量的降低使得在热后处理期间食品或兴奋剂具有降低的丙烯酰胺含量。 [0067] 就说明而言，术语“热后处理”优选的旨在表示伴有加热食品或兴奋剂的方法。常见的热后处理包括加热，干烤，炙烤，煮，烹饪，烘焙，蒸煮，油炸等等。 [0068] 尤其优选的根据本发明使用的酰胺水解酶适用于包含碳水化合物的食品(诸如，例如，米，面包和烘焙物品，快餐食品，预混合配料(Fertigmischungen)，干果，动物饲料等等)或兴奋剂(诸如咖啡或可可粉)的制备方法。这类食品和/或兴奋剂优选的选自包含以下的组：脆面包，面包干，饼干，椒盐卷饼，白色烤面包，华夫饼干，松饼，过水面包圈(bageles)，羊角面包，巧克力小饼，早餐谷类食品，脆面包干，脆炸土豆片，玉米粉圆饼小片，玉米片，脆点心，坚果，油煎土豆片，米粉糕，玉米糊，蒸粗麦粉，薄煎饼，预混合配料，蛋糕混合配料(Kuchenmischungen)，饼干混合配料(Biscuitmischungen)，面包混合配料(Brotmischungen)，油炸碎面包片，狗粮，猫粮，咖啡豆和可可豆。 [0069] 咖啡豆是尤其优选的。优选的咖啡豆类型是小果咖啡(Coffeaarabica)，中果咖啡(Coffea canephora)，大果咖啡(Coffea liberica)和Coffea robusta。 [0070] 在尤其优选的实施方案中，兴奋剂的制备包括咖啡豆的脱咖啡因和/或清洗，其中使用本发明的酰胺水解酶。 [0071] 在同样尤其优选的实施方案中，兴奋剂的制备包括咖啡豆的水解结合本发明酰胺水解酶的使用，优选的为天冬酰胺酶。在脱咖啡因制备过程中或为了增强口味咖啡豆接受蒸汽处理。在这种情况下，将咖啡豆剧烈加热并与水接触。在此热活性酰胺水解酶的使用被证明在降低生咖啡豆中的天冬酰胺浓度方面是尤其有益的。在高于70℃的温度使用酶完全适合已建立的方法，此外还使反应率非常高，这极大缩短了处理时间。 [0072] 具有上述特性的本发明酰胺水解酶(优选的为天冬酰胺酶)的使用产生了许多出乎意料的优点，这将基于4个说明性实施例在下面列举。技术人员知道这类实施例无论如何不应被认为是限制性的，因为本发明的酰胺水解酶适用于食品或兴奋剂的复数种制备方法。 [0073] 因此，在制备脆炸土豆片时，在蒸汽中烹饪土豆前通常将土豆用天冬酰胺酶预处理，即将土豆切成片，然后将天冬酰胺酶喷射在它们上面或将土豆片浸入包含天冬酰胺酶的溶液中。在一些情况下这种常规天冬酰胺酶处理的持续时间可以是充足的(直至数小时)，因为由于酶的最适温度(通常37℃，参见例如US 7,037,540，实施例5)处理温度最大只能到37℃，天冬酰胺的裂解相应较慢。 [0074] 因为本发明使用的酰胺水解酶的热稳定特性，土豆片在更高的温度下接受天冬酰胺酶处理，即天冬酰胺的降低更快，尤其是因为在更高温度下天冬酰胺的溶解性增加。在一些情况下，借助于酶的热稳定特性，甚至可以在蒸汽中烹饪土豆时同时进行天冬酰胺酶的处理。在这种情况下，例如，可以事先将天冬酰胺酶喷涂到土豆片上。 [0075] 通过热后处理，即通过油炸土豆片，采用常规方式进行酰胺水解酶的灭活。因此，不存在对使用这些热稳定酰胺水解酶的卫生顾虑。 [0076] 另一个实施例涉及咖啡豆的脱咖啡因。在该制备方法中，未经烤的生咖啡豆接受蒸汽处理和/或将其浸泡于局部较热的水中以便从豆中提取咖啡因。通过根据本发明使用的酰胺水解酶，有可能将这类脱咖啡因步骤(通常在高于37℃的温度下操作)与同时发生的天冬酰胺酶处理结合，即用于像这样脱咖啡因咖啡的制备方法可以耗时更短，从而花费更少。用于咖啡豆脱咖啡因的常规方法是技术人员已知的，并且包括“瑞士水处理法”，“直接法”，“间接法”或“甘油三酯处理法”等等。例如，可以参考 R.Heiss，Lebensmitteltechnologie：Biotechnologische，chemische，mechanische und thermische Verfahrender Lebensmittelverarbeitung [Food technology：biotechnological，chemical，mechanical and thermal processes for food processing]，Springer，第6版，2003，在本上下文中完整引用。 [0077] 出人意料的，本发明的酰胺水解酶还可以尤其有利地用于咖啡豆的蒸煮/润湿处理。如上所述，这类蒸煮/润湿处理用于打开咖啡豆的气孔以便咖啡豆中存在的天冬酰胺随后可以被更容易的灭活/减少。蒸煮/润湿处理通常在高温下进行，即优选的最高直至100℃的温度，因为天冬酰胺的溶解性在温暖的溶剂中增加，并且咖啡豆的气孔在温暖的温度下打开更快。借助于本发明的热稳定酰胺水解酶，天冬酰胺的降低可在蒸煮/润湿处理期间同步进行，并且同时天冬酰胺的降低可以更加快捷和有效，因为该酶的高温耐受性。 [0078] 本发明的酰胺水解酶还可以用于产生新鲜烘焙的物品诸如面包，花卷等等。这些新鲜烘焙的物品经常使用烹饪/挤压方法产生，这通常在95℃到105℃之间的温度下操作。因为本发明酰胺水解酶的热稳定特性，可以在烹饪/挤压期间添加酶，从而造成天冬酰胺含量的降低。在烹饪挤压情况下对于天冬酰胺降低来说重要的是生面团的揉捏以及气泡(当二氧化碳从加热的水中逸出时形成)的形成。在后续的烘焙或烤过程中(通常在200℃到600℃的温度范围内操作)，本发明的酰胺水解酶被灭活或变性。 [0079] 处理食品和兴奋剂的许多步骤包括在70℃到110℃高温下的水性培养基中温育操作，这些步骤在导致丙烯酰胺形成的热后处理之前。例如，这些步骤包括烹饪步骤。在生产成形油煎土豆片或成形脆炸土豆片中，例如，使用上述温度范围的水处理。本发明天冬酰胺酶出乎意料的优点是，可以在这些方法中直接使用酶，并且在高温下实现非常高的反应率，从而利用非常少的酶量实现非常高的活性比例。 [0080] 酰胺水解酶还可以有利地用于谷类加工方法。在生产玉米片时，将粗玉米粉与糖、盐和麦芽的混合物一起烹饪，然后进一步加工和烤。烤导致形成不想要的丙烯酰胺。在达到70℃到100℃的烹饪温度期间，非常适于使用本发明的酰胺水解酶以抑制丙烯酰胺的形成。 [0081] 谷类加工经常涉及挤压方法。例如，在生产早餐谷类食品的80-100℃的终了温度进行挤压方法。还描述了包括在70℃到100℃的高温下静置过程的方法。 [0082] 在高温下加工和包含裸麦的产品通常具有非常高的丙烯酰胺含量(例如，脆面包)。在生产脆面包的烘焙过程中很快达到高温。在烘焙过程前可以用本发明酰胺水解酶的溶液处理脆面包，以便减少烘焙过程中丙烯酰胺的形成。 [0083] 根据本发明使用的热稳定酰胺水解酶另一出乎意料的优点是重新使用(循环使用)酶的可能性。因此，因为酰胺水解酶的热稳定特性，其甚至在高温下(即优选的直至100℃)也未变性，所以可以在使用后提取酰胺水解酶或利用另一方法分离其，并由此将其用于新的应用。这种循环的酰胺水解酶溶液可以经受许多次，即优选的最终1，2，3，4或5次循环用于天冬酰胺的降低。 [0084] 根据本发明使用的酰胺水解酶的应用优选的被认为对健康无害，因为这些酰胺水解酶是天然的无毒物质。 [0085] 本发明的另一方面涉及制备食品或兴奋剂的方法，包括步骤： [0086] (i)将食品或兴奋剂与如上文确定的酰胺水解酶在优选的至少50℃的温育温度下温育，更优选的至少60℃，进一步优选的至少70℃，进一步优选的至少80℃，最优选的至少90℃和尤其是至少99℃；和； [0087] (iii)必要时，将食品或兴奋剂优选的加热到比温育温度高至少10℃的温度，更优选的高至少15℃，进一步优选的高至少20℃，最优选的高至少50℃和尤其是高至少60℃。 [0088] 在优选的实施方案中，根据本发明制备食品或兴奋剂的方法包括步骤： [0089] (i)将食品或兴奋剂与如上文确定的酰胺水解酶在优选的至少50℃的温育温度下温育，更优选的至少60℃，进一步优选的至少70℃，进一步优选的至少80℃，最优选的至少90℃和尤其是至少99℃； [0090] (ii)从所述食品或兴奋剂分离酰胺水解酶或灭活酰胺水解酶； [0091] (iii)必要时，将食品或兴奋剂优选的加热到比温育温度高至少10℃的温度，更优选的高至少15℃，进一步优选的高至少20℃，最优选的高至少50℃和尤其是高至少60℃；和 [0092] (iv)必要时，在步骤(i)中重新使用在步骤(ii)中分离的酰胺水解酶。 [0093] 根据本发明方法的步骤(i)优选的在使食品或兴奋剂最初包含的(游离)天冬酰胺量减少至少50％，更优选的至少75％，进一步优选的至少80％，进一步优选的至少85％，最优选的至少90％和尤其是至少95％的条件下(时间，温度，pH值，酰胺水解酶量等等)进行。本领域技术人员可以通过常规的例行试验确定合适的条件。 [0094] 根据本发明方法的步骤(ii)优选的在使可能的后续热后处理中形成的丙烯酰胺量减少至少20％，优选的30％，进一步优选的至少40％和最优选的至少50％的条件下(时间，温度，pH值，酰胺水解酶量等等)进行。 [0095] 在优选的实施方案中，根据本发明方法的步骤(i)优选的在使进行步骤(iii)后食品或兴奋剂包含的丙烯酰胺量达到最多200ppm，更优选的最多150ppm，进一步优选的最多135ppm，最优选的最多100ppm和尤其是最多50ppm的条件下(时间，温度，pH值，酰胺水解酶量等等)进行。本领域技术人员可以通过常规的例行试验确定合适的条件。 [0096] 在同样优选的实施方案中，根据本发明方法的步骤(i)优选的在使进行步骤(iii)后食品或兴奋剂包含的丙烯酰胺量达到最多1000μg/kg，更优选的最多500μg/kg，进一步优选的最多300μg/kg，最优选的最多150μg/kg和尤其是最多50μg/kg的条件下(时间，温度，pH值，酰胺水解酶量等等)进行。本领域技术人员可以通过常规的例行试验确定合适的条件。 [0097] 在优选的实施方案中，进行步骤(i)至少240分钟，更优选的至少120分钟，进一步优选的至少60分钟，最优选的至少20分钟和尤其是至少5分钟。 [0098] 在优选的实施方案中，食品或兴奋剂与酰胺水解酶的重量比范围位于102∶1到10 2 8 4 8 4 10 ∶1，更优选的10 ∶1到10 ∶1，进一步优选的10 ∶1到10 ∶1，最优选的10 ∶1 7 5 7 到10 ∶1和尤其是10 ∶1到10 ∶1。 [0099] 在优选的实施方案中，在水溶液中制备酰胺水解酶，并例如通过喷射将其与食品-6或兴奋剂组合。在这种情况下，水溶液中酰胺水解酶的浓度优选的为10 到100g/l，更优-5 -4 -3 -1 -2 选的10 到10g/l，进一步优选的10 到1g/l，最优选的10 到10 g/l和尤其是10 到-2 5×10 g/l。 [0100] 本发明的另一方面涉及可通过上述方法获得的食品或兴奋剂。所述食品或兴奋剂具有的天冬酰胺和/或丙烯酰胺残留量优选的为最多200ppm，更优选的为最多150ppm，进一步优选的为最多135ppm，最优选的为最多100ppm和尤其是最多50ppm。 [0101] 本发明的另一方面涉及可通过上述方法获得的食品或兴奋剂。所述食品或兴奋剂具有的天冬酰胺和/或丙烯酰胺残留量优选的为最多400μg/kg，更优选的为最多300μg/kg，进一步优选的为最多200μg/kg，最优选的为100μg/kg和尤其是最多50μg/kg。 [0103] 本发明的另一方面是产生如上文确定的酰胺水解酶的方法，包括下列步骤： [0104] a)将如上文确定的载体整合入表达系统； [0105] b)必要时，在所述表达系统中表达酰胺水解酶； [0106] c)必要时，消化或裂解或分离所述表达系统； [0107] d)必要时，添加合适、有可能热稳定的核酸酶来水解所述表达系统的核酸； [0108] e)必要时，将所述表达系统变性，优选的在60℃，更优选的在70℃，进一步优选的在80℃，最优选的在90℃和尤其是在100℃，通过温育处理优选的1分钟，更优选的5分钟，进一步优选的10分钟，最优选的20分钟和尤其是60分钟； [0109] f)必要时，通过离心，过滤，微量过滤或超滤从所述表达系统分离不想要的成分； [0110] g)必要时，将酰胺水解酶与固相支持物结合，其中所述结合通过离子、疏水性相互作用或由亲和标签决定的相互作用发生； [0111] h)必要时，在酰胺水解酶仍然基本上与支持物结合的条件下清洗支持物以去除不想要的成分； [0112] i)必要时，通过合适的缓冲条件从支持物洗脱酰胺水解酶；j)。 [0113] k)必要时，通过沉淀、超滤、冷冻干燥或干燥浓缩酰胺水解酶溶液；和[0114] l)必要时，将酰胺水解酶转移到合适的保存缓冲液中。 [0115] 天然的天冬酰胺酶可以局限于胞内和胞外安排中。如果天冬酰胺酶在胞内安排中大量过表达，就必需克服高天冬酰胺酶浓度在细胞中发挥毒性作用的问题，因为它们水解对细胞必不可少的氨基酸天冬酰胺。出人意料的发现本发明酰胺水解酶在20-37℃的温度范围内只有非常低的剩余活性，在该温度范围内通常进行嗜温性生物诸如例如大肠杆菌(Escherichia coli)，假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或曲霉属物种(Aspergillus sp.)的发酵方法。因此，在25℃酶具有＜2％的剩余活性。这允许在嗜温性表达宿主中大量胞内表达本发明的天冬酰胺酶。 [0116] 本发明的另一方面包括产生如上文确定的酰胺水解酶的方法，其中酰胺水解酶在微生物中胞内表达，其中在培养温度下酰胺水解酶表达期间酶的剩余活性＜30％，优选的＜15％，进一步优选的＜10％，进一步优选的＜5％，最优选的＜2％。 [0118] 在优选的实施方案中，在微生物中酰胺水解酶的胞内表达的情况下，达到活性产率＞10kU/g湿生物质，更优选的＞20kU/g湿生物质，更优选的＞40kU/g湿生物质，更优选的＞60kU/g湿生物质，最优选的＞80kU/g湿生物质。 [0119] 在优选的实施方案中，在微生物中酰胺水解酶的胞内表达的情况下，达到活性产率＞100000单位每升培养基，更优选的＞500000单位每升，更优选的＞1百万单位每升，更优选的＞3百万单位每升，更优选的＞6百万单位每升和最优选的＞10百万单位每升。 [0120] 在优选的实施方案中，本发明的[酰胺水解酶]在嗜温性表达宿主(诸如例如大肠杆菌，假单胞菌属物种，芽孢杆菌属物种，巴斯德毕赤酵母，酿酒酵母或曲霉属物种)中胞内表达。 [0121] 下列实施例用于更加详细的解释本发明，但不应被视为限制性的。实施例 [0122] 实施例1-热稳定天冬酰胺酶的表达 [0123] 在下列条件下，通过PCR方法利用两条引物 [0124] PF_AsnI_S(5′-ACCTGCGGTCTCGCATGAAAATTCTTC-TAATTGGGATGGG-3′； [0125] 1.1PCR条件： [0126] PCR批次： [0127]10μl 10x VENT缓冲液(NEB，Beverly，USA) 2μl dNTPs(各10mM) 100pmol 引物PF_AsnI_S 100pmol 引物PF_AsnI_A 1μl 来自激烈热球菌DSM 3638的DNA 2U VENT聚合酶(NEB) 添加100μl 蒸馏H2O [0128] PCR温度模式： [0129] 2分钟/94℃ [0130] [0131] 2分钟/72℃ [0133] 1.2限制性消化 [0134] 将1.1节中获得的基因克隆入表达载体pRSF-1b [0135] 为此，将PCR产物用限制性核酸内切酶Eco31I和PstI消化，载体pRSF-1b [0136] 1.3限制性消化批次： [0137] [0138] 将限制性消化批次在37℃温育2小时。然后向“载体批次”中添加1 U SAP(虾碱性磷酸酶，Fermentas，Vilnius，Lithuania)进行去磷酸化，在37℃进一步温育30分钟。然后在80℃灭活酶20分钟。随后利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden)纯化产物。 [0139] 1.4连接、转化入大肠杆菌和质粒重新分离 [0140] 通过与T4DNA连接酶温育将载体DNA和PCR产物(参见1.3节)连接到一起，如下所列： [0141] 连接酶批次： [0142]200fmol pRSF-1b 600fmol PCR产物 3μl 10x连接酶缓冲液(Fermentas) 1μl T4DNA连接酶 添加30μl 蒸馏H2O [0143] 将批次在16℃温育8小时，然后通过在65℃温育10分钟将酶灭活。通过电穿孔直接使用1μl该批次转化商品化供应的感受态XL1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，USA)。将电穿孔的细胞铺到含卡那霉素的固体琼脂平板上，然后在37℃培养过夜。按照制造商的说明书，使用质粒纯化试剂盒QIAprep微量制备试剂盒(Qiagen，Hilden)从所获单菌落操作重新分离完成的质粒，获得表达质粒pRSF_Pf-AsnI [0144] 在Rosetta 2(DE3)(Novagen-Merck-Biosciences，Bad Soden)中通过电穿孔将表达质粒pRSF_Pf-AsnI [0145] 从这些平板挑取单克隆，首先产生预备培养物用于表达。为此，将5ml预培养物中1ml与1％(w/v)葡萄糖接种到100ml LB(Kan，Cam)培养基中，在37℃和200rpm(转数/分)条件下振摇直至OD600达到0.6。离心(4℃，15分钟，3200×g)细胞并丢弃上清。将沉淀物在2ml 10％(v/v)甘油中重悬。将悬浮液等分为每份200μl，在液氮中冷冻，保存于-80℃。 [0146] 用于表达的主要培养物由含1％(w/v)葡萄糖的500ml LB(Kan，Cam)培养基组成。它接种了预培养物的等分量。在37℃和200rpm的条件下温育主要培养物。在获得0.9的OD600后，用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，然后在30℃和200rpm条件下振摇过夜。次日通过离心(4℃，15分钟，3200xg)沉淀细胞，在去除培养基后称重沉淀物，将其用20ml裂解缓冲液(10mM tris/HCl pH 8.0，0.5mg/ml溶菌酶)重悬，然后超声(5×30秒，80％功率)破碎。将破碎细胞的悬浮液离心(4℃，30分钟，14000xg)。然后将上清在 80℃温育30分钟，再次离心(4℃，30分钟，14000xg)。弃去沉淀物，取出如此获得的粗提取物，将其在4℃保存用于进一步的研究。测定上清的活性产率为160kU(参见实施例2)。测定重4g的细胞沉淀物的产率为40kU每g湿生物质。 [0147] 实施例2-温度模式的确定 [0148] 分析原理 [0149] 天冬酰胺酶催化天冬酰胺转化为天冬氨酸并释放铵离子。这可以通过使用显色试剂诸如例如奈氏试剂来指示。可选的，还可以通过Berthelot反应(DIN 38 406 E5)检测铵离子。使用奈氏试剂的分析法基于终点测定。在这种情况下，将反应在对应温度温育30分钟，终止，检测形成的铵离子。 [0150] 试剂和溶液 [0151] 试剂： [0152] L-天冬酰胺一水合物：Applichem A3669，MW 150，14g/mol [0153] 硫酸铵：Merck，1.101211，MW 132，14g/mol [0154] 奈氏试剂：Fluka，72190 [0155] Tris，TCA [0156] 储备溶液和缓冲液： [0157] 50mM Tris/HCl pH 8.6 [0158] 172mM L-天冬酰胺溶液 [0159] 1.5M TCA(三氯乙酸) [0160] 标定溶液： [0161] 5mM(NH4)2SO4溶液 [0162] 2.1标定曲线的绘制 [0163] 为此完成下列批次： [0164] [0165] 将所述批次混合，每种添加5μl 1.5M TCA，再次混合所述混合物。 [0166] 对于每种值，在1.5ml反应器中提供860μl蒸镏H2O，添加40μl相应批次，然后混合。向每批次一次性添加100μl奈氏试剂，并短时间混合样品。5分钟后，在436nm处用水平衡光度计，一次性测量样品。将所述值记录在标定线中(参见图1)。 [0167] 2.2样品测量 [0168] 使用商品化的蛋白检测试验(Bradfort，Bio-Rad LaboratoriesGmbH，Munich)，测定示例性实施方案1的粗提取物的蛋白浓度为大约4mg/ml。用50mM tris/HCl pH 8.6将天冬酰胺酶溶液1∶2000稀释。每种待测量样品提供下列批次： [0169]50μl 50mMtris/HCl pH 8.6 35μl 蒸馏H2O 5μl 172mML-Asn溶液 [0170] 将批次混合，将热循环仪预热到所需温度(37，70，80，90和99℃)。 [0171] 将5μl稀释的酶样品添加到所述批次中，添加5μl缓冲液用于空白读数，短时间混合所述批次，然后在相应的反应温度温育30分钟。然后将反应在冰上冷却，通过添加5μl 1.5 M TCA溶液终止反应。 [0172] 然后立刻测定释放的铵离子。对于每种值，在1.5ml反应器中提供860μl蒸镏H2O，添加40μl相应批次，然后混合。一次性向每批次添加100μl奈氏试剂，并短时间混合样品。5分钟后，在436nm处用水平衡光度计，一次性测量样品。 [0173] 首先基于标定曲线(参见图1)将测定的吸收值换算为释放的铵离子。然后通过单位的定义(在检测条件下1个单位的天冬酰胺酶释放1μmol NH4每分钟)，计算酶的体积活性[U/分钟]。这种计算法是本领域技术人员公知的。 [0174] 2.3最适温度的确定 [0175] 测定不同温度下436nm波长处的NH4含量，然后确定所获体积(酶)活性。将90℃的体积活性设定为100％(＝参照值)，然后将其他温度的相应体积活性与该参照值相应地相关(＝相对活性)。相应值在下表中比对，并在图2中用图表表示： [0176] [0177] 实施例3-温度稳定性的确定 [0178] 试剂和溶液，标定曲线的确定以及活性试验的实施如上文示例性的实施方案2所述。 [0179] 3.195℃的温度稳定性 [0180] 在该情况下体积(酶)活性的测定一直在90℃的温育温度进行。为了确定温度稳定性，用50mM tris/HCl pH 8.6将示例性实施方案1的天冬酰胺酶溶液1∶10稀释，然后在95℃预温育不同的时间段(0，1，15，30，45和60分钟)。然后用50mM tris/HCl pH 8.6进一步1∶100稀释，测定残留的剩余活性。将95℃无预孵育的体积酶活性设定为100％(＝参照值)，然后将所有其他值与该参照值相关(＝相对活性)。如此获得/计算得到的值在下表中比对(还可参见图3)： [0181] [0182] 相对活性＝剩余活性 [0183] 3.299℃的温度稳定性 [0184] 按照与上文3.1节所述试验的相同方法进行测定99℃温度稳定性的试验。如此获得/计算得到的值在下表中比对(还可参见图4)： [0185] [0186] 相对活性＝剩余活性 [0187] 实施例4-咖啡豆中丙烯酰胺含量的降低 [0188] 为了确定利用本发明天冬酰胺酶处理食品的效率，生咖啡豆在烤前接受80℃酶的处理步骤，然后测定烤后丙烯酰胺含量的降低。 [0189] 为此准备下列试验批： [0190] 空白对照1：500g生咖啡豆小果类混合物+ [0191] 267g 100mM tris/HCl pH 8.6(25℃) [0192] 空白2：500g生咖啡豆巴西小果类+ [0193] 267g 100mM tris/HCl pH 8.6(25℃) [0194] 样品1：500g生咖啡豆小果类混合物+ [0195] 267g 100mM tris/HCl pH 8.6(25℃)+ [0196] 1400单位的示例性实施方案1的天冬酰胺酶 [0197] 样品2：500g生咖啡豆巴西小果类+ [0198] 267g 100mM tris/HCl pH 8.6(25℃)+ [0199] 1400单位的示例性实施方案1的天冬酰胺酶 [0200] 将空白和样品在80℃转动条件下温育60分钟。然后从咖啡豆中滤出液体，将咖啡豆干燥和烤。 [0201] 由独立的得到认可的检测实验室测定丙烯酰胺含量。所述研究的结果显示于下表(还可参见图4)： [0202] |
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