未还原的低聚糖及其制备方法和用途

本发明是关于新的糖类及其制备方法和用途，特别是关于由 通式α-D-低聚葡糖基α-D低聚葡糖苷表示的未还原的低聚葡糖及 其制备方法和用途。

已知几种不同类型的未还原的低聚糖：已经发现的一种类型 的低聚糖中，蔗糖、erlose、棉子糖、松三糖和蔗果三糖、葡萄 糖和果糖由α-1和β-2键连接，换言之，低聚糖分子中有蔗糖结 构；糖醇，例如麦芽糖醇、麦芽三糖醇和乳糖醇；和海藻糖，其 中蔗糖由α-1和α-1键互相连接。但是，在分子中有蔗糖结构的 低聚糖在酸性溶液中容易分解，因为蔗糖结构是不稳定的。这些 的确限制了食品、饮料等的生产。通常由高压加氢制备的糖醇具 有优良的稳定性，但是其在过量吸收时也具有可以引起腹泻的缺 点，因为糖醇在人体内不易消化和同化。可是，海藻糖很稳定， 本发明人发现其在人体中易于消化和同化成能量。还发现海藻糖 分子量低、粘度低，因此，在以浓的水溶液使用时可结晶性太高， 在贮存过程中析出结晶，这些限制了其在食品工业中的应用。因 此，迫切需要开发高级未还原的低聚糖，其具有优良的稳定性、 消化性和同化性，还具有合适的粘度，对结晶几乎无敏感性或在 结晶形式时具有优良的溶解度。

本发明提供了其分子中具有海藻糖结构的新的未还原的低聚 糖，其对结晶几乎无敏感性或在结晶形式时具有优良的溶解度， 以及提供未还原的低聚糖的制备方法和用途。

为了形成这样的未还原的低聚糖和确定其制备方法，本发明 者研究了可以将其他糖连接到海藻糖分子中的两个葡糖基上的各 种方法。本项研究实际上导致发现本发明的目的可由下述方法达 到：使含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或者含有在其未端具有 海藻糖结构的未还原糖(在本发明中这类糖可优选α-D-低聚葡糖 基α-D-低聚葡糖苷)的水溶液，如同本申请人在日本专利申请362, 131/92号公开的那样，受糖转移酶作用，这样，完成了本发明。 除了制备方法外，本发明特别提供了新的未还原低聚糖，其中一 个或几个葡糖基与海藻糖中两个葡糖基连接。另外，本发明还提 供未还原低聚糖的几个用途，其性能包括优良的稳定性，合适的 粘度，几乎无结晶性或在结晶形式时优良的溶解度，用口吸入时 无味或降低的甜度和同化成热。

图1说明温度对由根瘤菌属(Rhizobium)M-11种得到的未还原 糖生成酶的活性的影响。

图2说明PH值对由根瘤菌属M-11种得到的未还原糖生成酶的活 性的影响。

图3说明由根瘤菌属M-11种得到的未还原糖生成酶的热稳定性。

图4说明由根瘤菌层M-11种得到的未还原糖生成酶的PH值稳定 性。

图5是结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的红外吸收光 谱。

图6是结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷粉沫X-射线衍 射图。

虽然本发明的未还原的低聚糖可以用化学方法合成，但是从 工业观点用生物化学反应来合成是最有利的，具体地说，其中使 糖转移酶与含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或者含有在其末端 具有海藻糖结构的未还原糖的水溶液作用。优选的海藻糖源是含 有可能最高含量海藻糖的糖浆和粉末，通常含量5％(W/W)或更多， 优选20％(W/W)或更多，更优选含有50％(W/W)或更多海藻糖的粉末 (下文中使用的百分数除非另有说明指的是“W/W％”)。为了制备 这类糖浆或粉末，其中部分还原的淀粉水解产物用酶催化转化的 方法，特别是本申请人在日本专利申请362,131/92号，156, 338/93号和199,971/93号中公开的那些方法，是适合使用的，因 为这些方法促进了大规模生产。必要时市场上可买到的海藻糖可 任意使用。

适用于本发明的α-葡糖基糖是具有α-葡糖苷键的那些糖， 例如淀粉、胶凝淀粉、液化淀粉、加溶淀粉、直链淀粉、支链淀 粉、部分还原的淀粉水解物、糖转移淀粉产物、环糊精、糊精、 麦芽糖低聚糖和蔗糖。

适用于本发明的未还原糖是本申请人在日本专利申请362, 131/92号中公开的那些糖，可以通过使部分过原的淀粉水解产物 与具有由葡萄糖聚合度3或更高的部分还原的淀粉水解物生成在其 未端具有海藻糖结构的未还原糖的酶的作用来制备(该酶在本发明 中可称为未还原糖生成酶)。正如本发明人在日本专利申请349, 216/93号中公开的那样，这类未还原糖生成酶可以是能够生成该 酶的微生物培养物，所述微生物例如根瘤菌属(Rhizobium)M-11种 和节杆菌属(Arthrobacter)Q36种，其保藏在The PatentMicroorganism Depository，National Institute ofBioscience and Humantechnology，Agency of IndustrialScience and Technology，1-3，Higashi.1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，保藏号分别是FERM BP-4230 和FERM Bp-4316，和通用的微生物，包括Brevibacterium helovolum(ATCC 11822)、水生黄杆菌(Flavobueterium aquatile)(IFO3772)、藤黄微球菌(Microcoecus luteus)(IF 03064)、玫瑰色微球菌(Microeccus rosens)(ATCC 186)、 Curtobacteriumcitreum(IFO15231)、耻垢分枝杆菌( Mycobacteriumsmegmatis)(ATCC19420)和Terrabacter tumeseens(IFO12960)，或者是通过用常用方法随意提纯该培养 物可得到的酶制剂。上述培养物或酶制剂具有从葡萄糖聚合度3或 更高的一种或多种部分还原的淀粉水解产物生成在其未端有海藻 糖结构的未还原糖的性质。

在制备上述未还原糖中，合适的方法是使上述的未还原糖生 成酶与部分未还原的淀粉水解产物作用，上述淀粉水解产物通常 的制备方法为：使α-葡糖基糖，例如部分还原的淀粉水解产物， 如淀粉、胶凝淀粉、液化淀粉、加溶淀粉、直链淀粉、支链淀粉 和糊精，受到α-淀粉酶作用或者受到α-淀粉酶和淀粉脱支酶作 用。

关于糖转移酶，环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(EC 2.4.1. 19)是最好的，但是在必要时可使用其他酶如α-淀粉酶(EC 3.2. 1.1)和α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)。在使用环麦芽糖糊精葡 聚糖转移酶时，可任意选择由通用的芽孢杆菌属(Bacillus)或克 雷白氏杆菌属(klebsiella)的微生物得到的那些酶。α-淀粉酶包 括由芽孢杆菌属的微生物得到的那些酶，特别是糖化的α-淀粉酶。 α-葡糖苷酶包括通用的微生物和酶，除了由植物如稻谷和小麦种 子得到的酶外，例如青霉属和毛霉属。

任何糖转移反应都可用于本发明中，只要其能得到本发明的 未还原的低聚糖，根据使用的酶任意选择。例如，在使用环麦芽 糖糊精葡聚糖转移酶或α-淀粉酶时，可以选择反应，使一种酶与 含有海藻糖和α-葡糖基糖如液化淀粉和部分还原淀粉水解产物的 水溶液作用，以便使一个或多个α-葡糖基由α-葡糖基糖中转移 到海藻糖中的两个葡糖基上，得到本发明的未还原的低聚糖。在 这种情况下，α-葡糖基糖与海藻糖的重量比通常是0.1至100倍， 优选0.2至20倍。另一方面，α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷可 通过使在其未端有海藻糖结构的未还原糖与环麦芽糖糊精葡聚糖 转移酶作用来制备。在使用α-葡糖苷酶时，例如可选择使酶与含 有海藻糖和α-葡糖基糖如糊精、麦芽糖低聚糖和有校低分子量的 蔗糖的水溶液作用，以便使α-葡糖基从α-葡糖基糖上转移到海 藻糖中的两个葡糖基上。在这种情况下，α-葡糖基糖与海藻糖的 重量比通常是0.1至100倍，优选0.2至20倍。

这些酶催化反应通常在温度20-80℃和PH 3-9条件下进行，当 用常用方法如载体约束法、交联法和截留法停止时，酶和微生物 本身在连续或间歇方法中可重复使用。在上述糖转移反应中，从 工业观点用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶一般是最合适的，因为其 允许使用较便宜的α-葡糖基糖作为糖供体，并得到高收率的α-D -低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷。特别是使用从嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)得到的环麦芽糖糊精葡糖转移酶 是特别合适的，因为其可在高温下使用，这样可抑制在反应混合 物中淀粉物质的逆行作用和微生物污染，和加速了酶催化反应。 在这种情况下，含有海藻糖和α-葡糖基糖，例如胶凝淀粉、液化 淀粉、DE1-50的部分还原淀粉水解产物、淀粉糊精和环糊精的水 溶液，或者含有在其末端有海藻糖结构的未还原糖的水溶液，与 每构α-葡糖基糖0.1单位或更多，优选1-25单位这样一种环麦芽 糖糊精葡聚糖转移酶作用1-100小时，优选4-70小时，生成未还原 的低聚糖(缩写为“Gm-T-Gn”，其中“G”和“T”分别表示葡糖 残基和α，α-海藻糖，而“m”和“n”表示整数1-8)，例如，麦 芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽三糖苷、 麦芽五糖基麦芽四糖苷和麦芽五糖基麦芽五糖苷，其中一个或几 个α-葡糖基转移到海藻糖中的两个葡糖基上。在必要时，这些糖 可以进一步与一种或多种水解酶，特别是β-淀粉酶(EC 3.2.1 .2)或β-淀粉酶和淀粉脱支酶如支链淀粉酶和异淀粉酶作用， 以聚集做为主要产物的麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷 和麦芽三糖基麦芽三糖苷，接着收集产物。

通常含有多达5-60％(以干固体为基础)用上述糖转移反应或与 水解结合生成的四或更多的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的 溶液，在过滤、提纯、浓缩和用喷雾干燥或冷冻干燥脱水后，可 以液体、糖浆或固体形式使用。

一般，为了充分发挥低级α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷 的特性，在糖转换反应和接着的水解反应完成后，得到的含有四 糖、五糖和六糖的溶液直接使用，或在使用之前进一步分离和提 纯，成为富集四糖、五糖和六糖的产物、为了达到上述分离和提 纯，任意选择通用方法，例如酵母发酵法、膜过滤法、分级沉降 法、碱处理和/或柱色谱法，以分离和除去衍生的糖。特别是用强 酸性阳离子交换剂盐的柱色谱，正如在日本专利特许公开23, 799/83号和148,794/84号中公开的那样，适合于除去衍生的糖， 以便收集富集未还原的四糖和五糖的级分或富集未还原的四糖、 五糖和六糖的级分。在上述色谱中，可任意使用固定床法、移动 床法和模拟移动床法。在必要时可分别收集四糖、五糖和六糖。

本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷是未还原的低聚 糖，其很稳定、无味或甜度低，有合适的粘度，对结晶几乎不敏 感或在结晶形式时易溶解。另外，本发明的低聚糖作为热源是有 效的，因为其对消化酶是敏感的和由口吸入时在体内是可同化的。 本发明的低聚糖还用作糖增甜剂物质，其具有减少的增甜能力和 生龋性，因为其几乎不可能用生龋微生物发酵。本发明的低聚糖 可与容易引起与糖的褐化反应的氨基酸和低聚肽一起使用，因为 其化学上是稳定的。本发明的低聚糖能稳定容易失去其活性的生 物活性物质以及具有合适的粘度，减少的发酵性和控制渗透压的 性质，产生形状和光滑表面，防止其他糖的结晶，防止淀粉物质 的逆行作用。

α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的这些性质适于生产食品， 包括食物、饮料、饲料和宠物饲料，以及生产各种组合物，包 括化妆品、药品和有形体。本发明的有比较低分子量的α-D-低 葡糖基α-D低聚葡糖苷的增甜能力很低，但是可直接用于增甜调 味料。上述低聚糖可与合适量的一种或多种其他增甜剂一起使用， 这些增甜剂例如粉状淀粉糖浆、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异 构化糖、蜜、槭糖、山梨糖醇、二氢查耳酮、卡哈苡苷、 α-葡糖基卡哈苡苷、甜叶葡苷、甘草甜、L-天冬酰胺基-L-苯 基丙氨酸甲酯、糖精、对羟苯基甘氨酸和丙氨酸，以及在必要 时使用填料，例如糊精、淀粉和乳糖。

粉状的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷可直接用作填 料、赋形剂或粘合剂，或必要时，在与其他填料、赋形剂和/或 粘合剂混合后成型为颗粒、球、棒条、板、立方体或片状，因为 该粉末基本上是不吸湿的，很耐热的和很稳定的。该粉末适合作 为例如糖食和焙烤食品的原料，其中面粉、玉米粉和淀粉部分或 全部被上述粉末所代替。

一般，本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷适用于增 甜食品和饮料，以及改善其味道和质量，因为上述低聚葡糖苷与 具有其他类型味道如酸，咸，涩，美味和较好味的物质很好调合， 以及其酸性高和耐热。本发明的低聚葡糖适用于各种调味料，例 如酱油、酱油粉、miso、miso粉、“moromi”、“hishio” 、“furikake”、蛋黄酱、佐料、醋、“sanbai-zu”、“ funmatsu-sushi-su”、“Chuka-no-moto”、tentsuyu“( cenpura汤)”、“mentsuyu(日式面条汤)”、调味汁、调味番 茄酱、“Yakinikn-no-tare(烤肉汤)、咖喱奶油面粉糊、stew premix、预混合汤料、“dashi-no-moto”、混合调味料、“ mirin(浓加甜清酒)”、“shin-mirin(合成的mirin)，食糖和 咖啡糖。另外，本发明的低聚糖适用于增甜，例如日式糖食，如 “senbei(脆米饼)”、“arare(片状senbei)”、“okoshi(粟和 米薄脆饼干)、米粉糕、“manju(豆-果子酱夹心的奶油小圆甜 面包)”、“uiro(甜米果冻)”、“an(豆果酱)”、“yokan( 甜豆果冻)”、“mizu-yokan(软赤豆果冻)”、“kingyoku”、 果冻、castella和“amedama(日式咖啡)；西式糖食，如奶油 小圆甜面包、饼干、薄脆饼干、曲奇饼、馅饼、布丁、加糖 奶油酱、蛋奶羹、奶油泡夫、华夫饼干、松蛋糕、多福饼、巧 克力、口香糖、焦糖和糖果；冷冻甜食，如冰淇淋和冰糕；糖浆 ，如蜜饯用的那些糖浆和“kaki-gori(刨冰)；酱和糊，如面粉 糊、花生酱、果泥；加工的水果和蔬菜，如果酱、马茉兰、糖果 脯和蜜饯水果；腌制产品，如“fukujin zuka(用酱油腌制蔬菜片) ”“bettara-zuke”(新鲜萝卜泡菜)”、“senmai-zuke”和 rakkyozuke(腌制亚实基隆葱)”；腌制产品的预混合物，如“ takuan-zuke-no-moto”和“hakusai-zuke-no-moto”；“su- konbu”、“sakisurume”和“fugu-no-mirinboshi”；fugu- no-mirinboshi”；“tsukudani(用酱油蒸煮的食品)”，如紫菜( 干海草)、“sansai(肉类产品，如火腿和香肠；鱼肉产品，如鱼 肉火腿、鱼肉香肠、“kamaboko(清煮鱼酱)”、“chikuwa( literally bamboowheels)”和“tenpura(油炸食品)”；调味品， 如“unino-shiokara(咸海胆内脏)”、“ika-no-shiokara(咸 乌贼内赃)”、“su-konbu”、“sakisurume”和“fugu-no- mirinboshi”；“tsukudani(用酱油蒸煮的食品)”，如紫菜(于海 草)、“sansai(山茉)”、“surume(干乌贼)、小鱼和贝类、 用酱油蒸煮的食品；”日盘装食品，如“nimame(熟豆)，马铃薯 沙拉和“konbu-maki(海带卷)；”奶产品；罐装和瓶装产品，如 肉、鱼肉、水果和蔬菜；酒精性饮料，如合成清酒、配制酒、葡 萄酒和威士忌酒；饮料，如咖啡、可可、果汁、碳酸饮料、乳酸 饮料和乳酸杆菌饮料；预混合和速熟食料，如布丁粉、热蛋糕粉、 “sokuseki-shiruko(赤豆汤与米粉糕的预混合料)”和速溶汤粉 ；婴儿食品；疗效性食料；以及改善食品和饮料的味道和质量。

此外，本发明的低聚糖可用于家畜和家禽包括蜜蜂、家蚕和 鱼的饲料和宠物饲料中，以改善其味道质量。除了因作味道质量 改善剂，味道掩蔽剂和质量改善剂外，本发明的低聚糖还可适用作 以固体、糊或液体形式的口用产品的增甜剂，口用产品包括化妆 品和药品、如雪茄烟、香烟、牙膏、口红、唇膏、内用药、锭剂、 鱼肝油滴剂、口服清凉剂、口香片和含漱剂。

本发明的低聚糖还可适用作化妆品生产中的稳定剂、渗透作 用控制剂、赋形剂、控湿剂、粘度控制剂和质量改善剂，所说化 妆品例如肥皂、护肤霜、洗澡液、护发霜、唇膏、皮肤改善剂和 头发再生剂。

除了用作渗透作用控制剂、赋形剂、导管给饲和浆液制剂外 ，本发明的α-D-低聚葡糖基-α-D-低聚葡糖苷在药品生产中也可 用作生物活性物质中活性或活性组分的稳定剂，所说的生物活性 物质例如细胞分裂素包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素， 肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、巨噬细胞移动抑制因子、 菌落刺激因子、转移因子和白细胞间素2；激素，例如胰岛素、 生长激素、促乳泌素、促红素、促卵胞成熟激素；疫苗，例如BCG 疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛豆病毒疫 苗、破伤风类毒素、饭匙清抗毒液素和人体免疫球蛋白；抗菌素 ，例如青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素和卡那霉素硫 酸盐；维生素，例如维生素B1、核黄素、L-抗坏血酸、鱼肝油、 类胡萝卜素、麦角甾醇和生育酚；酶，例如脂酶、胰肽酶E、尿激 酶、蛋白酶和葡聚糖酶；提取物，例如人参提取物、鳄龟提取物、 小球藻提取物、蜂巢蜡胶提取物和蜂乳；活的微生物，如病毒、 乳酸杆菌、双岐杆菌和酵母。为了将本发明的α-D-低聚葡糖基α -D-低聚葡糖苷加入到上述组合物包括食品、饮料、化妆品、药品 和有形体中，任意使用通用方法，例如混合、捏和、溶解、熔化、 吸入、渗透、散布、加入、涂覆、喷洒、注射和固化，然后完成 它们的加工。加入的α-D低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的量定到使 其显示出其特性，一般在产物中有0.1％或更多，优选5％或更多。 会发现这样得到的组合物有广泛的用途，例如在家庭，农业，林 业，渔业和化学，工业产品中应用，以及在食品、饮料、化妆品 和口服或肠胃外使用的药物中应用。

下列试验将详细说明本发明。具体地说，试验A首先说明由根 瘤菌属(Rhizobium)M-11种来制备、提纯和表征未还原糖生成酶， 然后说明由部分还原淀粉水解物用该酶来制备海藻糖和在其末端 有海藻糖结构的未还原糖。而试验B将说明本发明的几种α-D-低 聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的制备和物化性质。

试验A-1

用根病瘤属M-11种制备未还原糖生成酶

将由2.0％(W/V)麦芽糖，0.5％(W/V)胨，0.1％(W/V)酵母提取液， 0.1％(W/V)磷酸二氢钠，0.1％(W/V)磷酸二氢钾和水组成的液体培 养基的PH调至7.0。将该液体培养基分成100ml等分试样，然后， 分别放入500ml烧瓶中，在120℃消毒20分钟，冷却，用根瘤菌属 M-11种(FERM BP-4130)接种，在27℃和130rpm下培养24小时， 这样，得到接种培养液。

约20升含有与在接种培养液中使用的相同组合物的培养基放 入30L发酵瓶中，消毒，冷却到30℃，用1％(V/V)接种培养液接种， 并在30℃和PH6.0-8.0下在通气和搅拌条件下培养24小时。得到 的培养液中的酶催化活性是约1.5单位/ml。一部分培养液经离心 分离成细胞和上清液，然后，将细胞悬浮在50mM磷酸盐缓冲液( PH7.0)中，得到起始体积，接着分析得到的细胞悬浮液和上清液 的酶催化活性。结果，发现在细胞悬浮液中酶催化活性约0.6单位 /ml。而在上清液中酶催化活性约0.9单位/ml。

未还原糖生成酶分析如下：向4ml1.25％(W/V)麦芽五糖底物在 50mM磷酸缓冲液(PH7.0)中的溶液中加入1ml酶溶液，混合物在 40℃保温60分钟，在100℃加热10分钟使酶钝化，用去离子水准确 稀释至10倍，用Somogyi-Nelson法测定还原能力。作为对照试验， 将相同的酶溶液的新鲜制剂通过在100℃加热10分钟钝化，然后按 照与上述相类似方法测试。1单位酶定义为在上述条件下1分钟内 降低以麦芽五糖的量表示的1微摩尔还原能力的酶量。

试验A-2

酶的提纯

约18升试验A-1中得到的培养液用“MINI-LAB”，一种超高压 细胞均化器(日本大阪Dainippon pharmacutical Co.，Ltd生产) 处理，以破碎细胞。生成物在10,000rpm下离心30分钟，得到约 16升上清液。将硫酸铵溶于该上清液中，得到的溶液饱和度0.2， 使生成物在4℃放置1小时，然后在10,000rpm下离心30分钟，接着 收集新生成的上清液。

将硫酸铵再溶于上清液中，得到溶液的饱和度0.6，使生成物 在4℃放置24小时，然后在10,000rpm下离心30分钟，接着收集生 成的沉淀物。将沉淀物溶于10mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中，对新鲜 的磷酸缓冲液渗析24小时，并在10,000rpm下离心30分钟以除去不 溶物质。将渗析的溶液(360ml)分成两份，然后分别加入用300ml “DEAE TOYO Pear”硅胶的离子交换柱色谱中(上述硅胶是日本东 京Tosoh Corporation的产品)。

吸附在硅胶上的目的酶用还含有氯化钠的相同磷酸缓冲液从 柱上洗脱。得到的活性酶级分对还含有2M硫酸铵的相同磷酸盐缓 冲液渗析，在10,000rpm下离心30分钾以除去不溶物质，得到的上 清液加入用300ml“Butyl Toyo Pearl 650”硅胶(日本东京( Tosoh Corporation的产品)的疏水柱色谱中。吸附在柱上的酶用 从2M降低至oM的线性梯度溶液洗脱，接着收集活性酶级分。然后 该级分再加入用300ml“Toyo Pearl HW-55”(日本东京Tosoh Corporation生产的树脂)硅胶过滤色谱中，收集活性酶级分。酶 催化活性、比活性和具体提纯步骤中的收率如表1所示。

表1中的在硅胶过滤步骤中洗脱得到的提纯的酶制剂用7.5％( W/V)聚丙烯酰胺凝胶的电泳测定纯度，电泳待到单个的蛋白质谱 带，证明该酶制剂是电泳均匀的和高纯的。

                           表1 提纯步骤                   酶活性            比活性            收率

                       (单位)            (单位/mg蛋白质)    ％ 培养液                     26,800                               100 细胞破碎后的上清液         20,300            0.10               76 盐析后的渗析溶液           16,100            0.32               60 从离子交换柱中出来的洗脱液 11,300            5.5                42 从疏水柱中出来的洗脱液     5,730             98                 21 从硅胶过滤柱中出来的洗脱液 3,890             195                15

试验3 

酶的表征

一部分试验A-2中得到的提纯的酶制剂在凝胶浓度10％(W/V)下 做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过与用相同的凝胶做电泳的标 准分子标记物(日本东京Nippon Bio-Rad Laboratories kk生产 的比较测定分子量，表明酶的分子量约77,000-87,000道尔顿。

另一部分提纯的酶制剂用2％(W/V)“Ampholine”(瑞典 Upsala，pharmacia LKB的产品)的聚丙烯酰胺凝胶做等点电泳， 然后通过测定电泳凝胶中的PH测定等电点，表明该酶的等电点约3. 6-4.6。

温度和PH对酶催化活性的影响根据上述分析方法测定。结果 分别如图1和2所示。当在PH7.0保温60分钟时发现最佳温度约40℃， 而在40℃保温60分钟时最佳PH约7.0。酶的热稳定性通过在不同 温度下在50mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中保温该酶60分钟进行测定， 在水浴中冷却，并分析剩余的酶催化活性。而PH稳定性通过在不 同的PH值和25℃下在50mM磷酸盐缓冲液中保温该酶16小时来测定 ，调节缓冲液至PH7.0，分析剩余活性。结果分别由图3和4所示。 在温度高达40℃和PH约6-9时该酶是稳定的。

试验A-4

未还原糖的制备

将含有20％(W/V)葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、 麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖作底物的水溶液与在试验A-2中 得到的2单位提纯的酶/g固体底物混合，并在40℃和PH7.0下反应 48小时，生成物去离子化，并在用“Wako Beads WB-330”柱(日 本大阪Waka pure Chemical Industries，Ltd.的产品)的高效液 相色谱上分析反应产物。高效液相色谱在室温下进行操作，水作 为洗脱液，以流速0.5ml/分加入柱中，同时用“RI-8012”差式折 光计(日本东京Tosoh Corporation生产)监测洗脱液。结果如表2 所示。

由表2中的结果明显看出，反应产物由剩余的底物和新生成的 糖PI、PII、PIII、PIV和PV组成，并无其他糖。具有葡萄糖 聚合度4或更高的PII、PIII、PIV和PV的收率比较高，即85％ 或更高，而具有葡萄糖聚合度3的PI的收率比较低。上述结果表明 没有由葡萄糖和麦芽糖生成糖。

                             表2 底物             反应产物         HPLC中洗脱时间       组成

                              (分)                 ％ 葡萄糖           葡萄糖           33.4                 100.0 麦芽糖           麦芽糖           28.5                 100.0 麦芽三糖         PI+              23.3                 35.0

             麦芽三糖         25.9                 65.0 麦芽四糖         PII+             21.6                 85.6

             麦芽四糖         24.1                 14.4 麦芽五糖

             PIII+            19.7                 92.7

             麦芽糖           22.6                 7.3 麦芽六糖         PIV+             18.7                 93.5

             麦芽六糖         21.4                 6.5 麦芽七糖         PV+              17.8                 93.4

             麦芽五糖         21.0                 6.6

注：表中PI、PII、PIII、PIV和PV表示由相应的底物即 麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖生成的新 产物。

为了提纯这些新生成的糖，反应产物进行脱色、去离子化、 浓缩和用“XT-1016(Na+型)”，一种碱金属形式的强酸性阳离子 交换剂(日本东京Tokyo Organic Chemical Industries，Led.生 产)进行柱上分极。具体地说，将阳离子交换剂装入3个有夹套的 和串连的不锈钢柱中，每个柱内径2.0cm，长1m，然后装入反应产 物，其量是阳离子交换剂体积的5％(V/V)，以空速0.13加入55℃水 进行分离，收集含有97％和更高新生成的糖的级分。得到的级分 分别冻干成高纯度的糖制剂。对具体底物的收率，以干固体为基 础，PI约9％，PII约65％，PIII约82％，PIV约P80％，PV约77％。 产品最终纯度，PI约97.5％，PII约98.6％，PIII约99.5％，PIV约98. 4％，PV约98.4％。

然后，用Somogyi-Nelson法测定这些高纯度糖制剂的还原能 力，它们的还原能力用DE表示。结果如表3所示。

由表3中的结果明显看出，所有制剂都显示出很弱的还原能力。 认为还原能力是由于加入和存在于制剂中的微量还原麦芽糖低聚 糖引起的，以及所有新生成的糖基本上没有还原能力。

                       表3

糖制剂          纯度(％)          DE

PI              97.5              0.83

PII             98.6              0.35

PIII            99.5              0.10

PIV             98.4              0.27

PV              98.4              0.23

试验A-5

用葡萄糖淀粉酶的酶降解

将50mg试验A-4中制备的任何一种糖制剂PI、PII、PIII、 PIV或PV溶于1ml50mM乙酸盐缓冲液(PH4.5)中，向生成物溶液中 加入1单位葡萄糖淀粉酶(日本东京Seikagakn Corporation生产 的)，并在40℃保温6小时以进行酶降解，用高效液相色谱分析降

解产物。结果，在所有降解产物中仅检测出葡萄糖和海藻糖。内 容物和葡萄糖与海藻糖的摩尔比如表4所示。

                    表4

                 葡萄糖    海藻糖    摩尔比

糖制剂           (％)      (％)      (葡萄糖/海藻糖)

PI               36.2      63.8      1.07

PII              52.0      48.0      2.06

PIII             61.4      38.6      3.02

PIV              68.3      31.7      4.09

PV               72.9      27.1      5.11

显然，表4中的结果表明PI由葡萄糖淀粉酶降解为1个葡萄糖 分子和1个海藻糖分子；PII降解为2个葡萄糖分子和1个海藻糖分 子；PIII降解为3个葡萄糖分子和1个海藻糖分子；PIV降解为4个葡 萄糖分子和1个海藻糖分子；PV降解为5个葡萄糖分子和1个海藻 糖分子。

考虑到葡萄糖淀粉酶的反应特性，这些未还原糖会具有通过 α-1，4或α-1，6键将葡萄糖分子连在海藻糖分子上的结构。特 别是PI是葡萄糖聚合度3的未还原糖，其中1个葡萄糖分子连在1 个海藻糖分子上；PII是葡萄糖聚合度4的未还原糖，其中2个葡萄 糖分子连在一个海藻糖分子上；PIII是葡萄糖聚合度5的未还原糖， 其中3个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上；PIV是葡萄糖聚合度6 的未还原糖，其中4个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上；PV是葡 萄糖聚合度7的未还原糖，其中5个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子 上。在使PI、PII、PIII、PIV和PV受β-淀粉酶作用后，PI 和PII不降解，而PIII降解为1个麦芽糖分子和1个PI分子；PIV降 解为1个麦芽糖分子和1个PII分子；PV降解为2个麦芽糖分子和1 个PI分子。

上述结果表明由本发明的未还原糖生成酶引起的反应是分子 同转化反应，其既不同时发生底物的降解也不同时发生底物的聚 合，换句话说，不改变它们的葡萄糖聚合度。因此，由酶作用产 生的PI、PII、PIII、PIV和PV分别是α-葡糖基海藻糖(由“ Gn-T表示，其中“G”和“T”分别表示葡萄糖残基和α，α-海藻 糖，而“n”是整数1或更大)，特别是α-葡糖基海藻糖(或α-麦 芽糖基葡糖苷)、α-麦芽糖基海藻糖(或α-麦芽三糖基葡糖苷)、 α-麦芽三糖基海藻糖(或α-麦芽四糖基葡糖苷)、α-麦芽四糖基 海藻糖(或α-麦芽五糖基葡糖苷)、α-麦芽五糖基海藻糖(或α- 麦芽六糖基葡糖苷)。

试验A-6

海藻糖和在末端有海藻糖

结构的未还原糖的制备

在加热时将50份(重量)“PINE-DEX#4”一部分还原的淀粉水 解产物(日本京都Matsutani Chemical Ind.CO.，Ltd.生产的) 溶于60份(重量)水中，生成的溶液调至45℃和PH6.5，每克部分 还原的淀粉水解产物加入1单位未还原糖生成酶(用试验A-2中的方 法制备的)，反庆96小时，生成在其未端有海藻糖结构的未还原糖， 接着在100℃加热10分钟使酶纯化。反应混合物稀释至约20％，每 克部分还原淀粉水解产物加入10单位“Glucozyme”，一种葡萄糖 淀粉酶(日本京都Naguse Biochemicals Ltd.生产的)，反应40小 时，加热使酶纯化。生成的溶液用活炭脱色，用离子交换剂脱离 子，用普通的方法浓缩至约60％。得到的糖溶液含有29.5％海藻糖( 以干固体为基础)。在60℃和空速0.4下将该浓缩液加入预先装有 “CG6000(Na+型)”一种强酸性阳离子交换剂(日本东京Japan Organo Co.,Ltd生产的)的不锈钢柱中，收集富海藻糖的级分。 该级分含有约90％海藻糖(以干固体为基础)。然后，该级分浓缩至 约75％，加入结晶器中，加入约2％结晶的海藻糖水合物作晶种，逐 渐冷却，得到结晶度约45％的糖膏。该糖膏从干燥塔的上部通过加 压至150kg/cm2的喷咀进行喷雾干燥。同时从干燥塔的上部向其下 部送入85℃空气，聚积在安装在干燥塔底部的运输机的金属丝网 上的结晶粉末逐渐运送到干燥塔外，同时通过金属丝网向干燥塔 的上部送45℃空气。然后，把结晶粉末加入老化塔中，在热空气 流中老化10小时以完成其结晶和脱水，这样，得到结晶的海澡糖 水合物粉末。

试验B-1

制备-α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷

将50份(重量)的按试验A-6的方法制备的海藻糖和“PINE- DEX#1”，还原的淀粉水解产物(DE8)(日本京都Matsutani ChemicalInd，Co.，Ltd.生产)溶于150份(重量)的水中，同时加 热，调节该生成的溶液到60℃和PH6.0，加入由日本岡山 HayashibaraBiochemical Laboratories，Inc.生产的从嗜热脂 肪芽孢杆菌(Bacillus Stearo thermophilus)得到的环麦芽糖糊 精葡聚糖转移酶，其量为10单位/g部分还原的淀粉水解产物，反 应40小时，并在100℃加热30小时，以钝化该酶。然后，将该溶液 调节到55℃和PH5.0，加入由日本京都Nagase Biochemcals Ltd. 生产的“β-淀粉酶#500”，其量为20单位/g部分还原的淀粉水 解产物，反应16小时，并在100℃加热15分钟，以钝化该酶。以干 固体为基准，该溶液含有作为α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷 的“物质1”、“物质2”和“物质3”的含量分别约15％、约15％ 和约4％。该溶液然后用活性炭脱色，用离子交换剂(H±和OH-型) 脱离子，浓缩到约45％，并加到柱色谱中，接着收集富物质1、2 和3的级分。用于分离的该离子变换剂是“XT-1016(Na+型)”，盐 形式的强酸性阳离子交换剂，(由日本东京Japan Organo，Co.， Ltd.生产的)，其以水悬浮液的形式装在四个管不尔锈钢柱子中 ，每个柱子内径5.4cm，长5m。在这种情况下，这四个柱子串联 总长度约20m。在保持这些柱子的温度在55℃的情况下，将5(V/V) 的有关的糖溶液加到这些柱子中，然后，以空速(SV)0.3加入55℃ 的水进行分离，接着收集富含物质1、2和3的级分。这些级分再 加到装有十八烷基硅胶载体的“YMC-Pack P-355-15”制备液相色 谱柱中(该制备液相色谱由日本京都YMC Co.，Ltd.生产)，用水 作洗脱液，收集纯度97％或更高的级分，冷冻干燥并粉碎，得到粉 状高纯度的物质1、2和3。

试验B-2

α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的物化性质

用试验B-1中的方法制备的高纯度的物质1、2和3，测定如下 的物化性质。

(1)元素分析

物质1

实验值：C＝44.2％，H＝6.2％

计算法：C＝43.25％，H＝6.35％

        (对分子式：C24H42O21)

物质2

实验值：C＝43.7％，H＝6.0％

计算值：C＝43.48％，H＝6.3％

        (对分子式：C30H52O26)

物质3

实验值：C＝43.8％，H＝6.1％

计算值：C＝43.64％，H＝6.31％

        (对分子式：C36H62O31)

(2)分子量

   物质1 666.6

   物质2 828.7

    物质3 90.9

(3)紫外吸收光谱

   这三种物质即没有显示特征吸收。

(4)颜色反应

   这种物质在蒽酮-硫酸反应时，着色成绿色，但是对费林 反应和碘反应是负的。

(5)结构

(a)当用1N硫酸水解时，这三种物质形成唯一的产物D-葡 萄糖。

(b)当受葡糖淀粉酶作用时，物质1形成2摩尔葡萄糖和1 摩尔海藻糖；物质2形成3摩尔葡萄糖和1摩尔海藻糖；物质3形成 4摩尔葡萄糖和1摩尔海藻糖。

(c)碳核磁共振分析(13C-NMR)，对物质得到不同的12个 13C信号。这表明物质1有24个碳原子，并存在12对2个等价碳原子。 根据Klaus Bock等人在Advance in Carbohydrate Chemistryand Biochemistry，Vol.42，PP.192-225(1984)中介绍的化学位移 ，通过把这些碳原子归类于标准物质α-D-吡喃葡萄糖、α，α- 海藻糖和麦芽糖，认为物质1具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)- α-D-吡喃葡糖基α-D-麦芽糖苷所表示的结构。

而物质2得到不同的19个13C信号。其表明物质2具有30 个碳原子，并存在7对2个等价碳原子和一组5个等价碳原子。类 似于物质1，根据Klaus Bock某人介绍的化学位移，通过将这些碳 原子归类，认为物质2具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-0-α-D 吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-α-D-麦芽糖苷所代表的结 构。

物质3给出不同的16个13C信号。其显示物质3有36个碳原子。 并存在15对2个等价碳原子和一组6个等价碳原子。类似于物质1， 根据Klaus Bock等人介绍的化学位移，通过将这些碳原子归类， 认为物质3具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-0-α-D-吡喃葡糖基 -(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-α-D-麦芽三糖甘所代表的结构。

基于上述结果，物质1、2和3的结构可以分别用如下的化学 式1、2和3表示。

化学式1：    

化学式2：

化学式3：

因为这些结构，所以物质1、2和3分别命名为“α-D麦芽糖 基-α-D-麦芽糖苷(或麦芽糖基麦芽糖苷)”、“α-D-麦芽三糖 基α-D-麦芽糖苷(或麦芽三糖基麦芽糖苷)”和“α-D-麦芽三糖 基α-D-麦芽三糖苷(或麦芽三糖基麦芽三糖苷)”。上述的结果 说明，这些物质是迄今未知的，完全新的分子中具有海藻糖结构 的未还原的低聚糖类。

试验B-3

急性毒性    

用鼠口服给药，试验用试验B-1的方法制备的高纯度麦芽糖基 麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的急性 毒性。结果，发现麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦 芽三糖基麦芽三糖苷是低毒的，用它们的最大的给药剂量没有看 到死亡。这些都说明它们的LD50简单地是50g/kg或更高。

试验B-4

结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的制备及物化性质

把接试验B-1的方法制备的纯度97％或更纯的α-D-麦芽三糖基 α-D-麦芽三糖苷(物质3)用通常的方法脱色、脱离子并浓缩到70％， 将该浓缩物移到烧杯中，并在4℃冷却室中静置2个月，使结晶体 析出。离心收集结晶体，用最小量的水洗涤，这样得到纯度99.0％ 的结晶体。

试验的该结晶体的物化性质如下：     (1)颜色

   无色，透明结晶体。

(2)溶解度

   比较高，在25℃100ml水中大约可溶解91g。

(3)熔点

   215℃

(4)红外吸收光谱

把1毫克粉状结晶体和20omg无水KBr混合，制成透明的片， 然后分析其红外吸收光谱，结果如图5所示。

(5)粉末的X-射线衍射

按照F.H.Stodola芽人在Journal of thd AmericanChemical Society，Vo1.78，PP 2,514-2,518(1956)中介绍的方法，用 铜靶2-射线测定结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的粉末 X-射线衍射谱图。结果示于图6。由图6所示的粉末X-射线衍射分 析的结果，明显的可以看出结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三 糖苷有主要的衍射角(2θ)7.8°、10.0°、13.1°、17.5°、和 18.2°。

上述的结果说明该结晶体是新的结晶的α-D-麦芽三糖基α- D-麦芽三糖苷。

任何的方法，只要它们能够从过饱和的溶液中析出并收 集结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的都可用于本发明， 常规的方法，例如糖膏分离法、闭塞粉碎法、流化床造粒法和喷 雾干燥法都可随意选择。该结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三 糖苷显示出很弱的收湿性，该收湿性根据α-D-麦芽三糖基α-D- 麦芽三糖苷的纯度而变化，但是适用于各种组合物，例如食品、 饮料、分妆品、药物、成形体和化学品，因为它基本上是不收湿 的、自由流动的、不粘结、不固化，并且很容易处理。结晶的α -D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的熔点和旋光率随它的纯度而变 化。特别是该熔点通常随着纯度的降低而降低并加宽。因此，结 晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的纯度可以随意地选择， 以满足它的最终用途的要求。

下面的实施例A和实施例B将分别说明α-D-低聚葡糖基α-D-低 聚葡萄苷的制备方法和它们的几种用途。

实施例A-1

把1份(重量)按试验A-6的方法制备的海藻糖和2份(重量)的“ PINE-DEX#4”，糊精产品(DE18)(日本京都Matsutani Chemical Ind.，Co.，Ltd.生产)，溶于3.7份(重量)水中，同时加热把生 成的溶液调节到60℃和PH5.6，加入每克糊精15单位日本岡山 Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc，生产的由嗜热，脂肪芽 孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)产生的环麦芽糖糊精葡聚 糖转移酶，反应24小时，并加热，以钝化该酶。然后将该溶液用 活性碳脱色，用离子变换剂(H+-和OH--型)脱离子并提纯，用通常 的方法浓缩，得到75％糖浆，收率约92％(以干固体为基础)。

含有约65％以干固体为基准，未还原的低聚糖类如麦芽糖基麦 芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽三糖苷、麦芽四 糖基麦芽三糖苷和麦芽四糖基麦芽四糖苷的该产物具有降低的甜 度、合适的粘度和保温活性，这些性质使得该产物在包括食品、 饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。    

实施例A-2

把1份(重量)由日本大阪Wako Pure Chemical Industries， Ltd.生产的海藻糖和1.5(重量)的α-环糊精溶于4份(重量)水中， 同时加热，将生成的溶液调节至65℃和PH15.6，加入每克α-环 糊精10单位的如实施A-1用的同样类型环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应 24小时并加热以钝化该酶。然后，将该溶液调节至55℃和PH5.6， 加入每克固体20单位日本京都Nagase Biochemicals Ltd生产的 “β-淀粉酶#1500”，反应16小时并加热，以钝化该酶。用类似 于实施例A-1中的方法提纯并浓缩该生成物，得到75％糖浆，收率 约93％(以干的固体计)。

含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基 麦芽三糖苷分别为约15％、约15％和4％(按干固体计)的该产物像实 施例A-1的产物那样具有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其 使得该产物在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组 合物中广泛应用。

实施例A-3

向20％淀粉悬浮液中加入“Fermamy 60L”α-淀粉酶(丹麦哥 本哈根Novo Nordish Lndustry生产)，其量为淀粉固体的0.015％， 在95-100℃液化并加热以钝化该酶，这样，得到一种液化的有DE3 的淀粉溶液。向该溶液中加入按试验A-6的方法制备的海藻糖，其 量与淀粉物质的量相同(按干固体计)，调至55℃和PH5.3，加入每 克淀粉50单位由日本岡山Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.生产的异淀粉酶和10单位与实施例A-1中所用 的相同类型的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应40小时，并加热 以钝化该酶。然后，通过加入水稀释该溶液到约25％，调至55°和 PH5.3，加入每克固体20单位β-淀粉酶，反应16小时，并加热以 钝化该酶。然后，用类似于实施A-1的方法提纯并浓缩该溶液，并 用通常方法喷雾干燥，得到水分含量小于约2％的75％糖浆，收率约 90％，(按干固体计)。

含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基 麦芽三糖苷其量分别为约20％、约20％和约6％(按干固体计)的该产 物像实施例A-1的产物那样，有降低的甜度，合适的粘度和保湿活 性，其使得该产物在包括食品、饮料、化妆品、药品和成形体的 各种组合物中广泛应用。

实施例A-4

将按实施例A-2的方法制备的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三 糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖溶液浓缩到约45％，为 了提高麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦 芽三糖苷的含量，用类似于试验B-1的方法，只是分离的离子交换 剂用“Dowex 50WX4(Ca2+型)”盐形式的强酸性阳离子交换剂美国 密兹它州DOW Chemical co.代替，来进行色谱分离该溶液，并且 用类似于实施例A-1的方法收集、提纯和浓缩富含麦芽糖基麦芽糖 苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的级分，得到 65％糖浆，收率约45％(以干固体计)。

按干固体计，含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷 和麦芽三糖基麦芽三糖苷分别为约35％、约35％和约10％的该糖浆像 实施例A-1的产物那样有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其 使得该糖浆在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组 合物中广泛应用。

实施例A-5

将按实施例A-3中的方法制备的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽 三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖溶液浓缩到约50％。 然后按照试验B-1中的色谱分离该浓缩物，按照类似于实施例A-1 中的方法，收集、提纯、浓缩富含麦芽糖基麦芽糖苷或麦芽糖三 基麦芽糖苷或麦芽三糖基麦芽三糖苷的级分，得到65％的糖浆，收 率分别为约15％，约15％和约4％(以固体计)。

含有约97％(以干固体计)高纯度麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖 基麦芽糖苷或麦芽三糖基麦芽三糖苷的这些糖浆像实施例A-1中的 产物那样，有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其使得这些 浆液在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中 广泛应用。

实施例A-6

将按实施便A-5中的方法得到的高纯度麦芽三糖基麦芽三糖苷 浓缩到约85％，加到结晶器中，加入2％结晶的麦芽三糖基麦芽三糖 苷作晶种，逐渐搅拌以结晶，移到浴缸中，让其在室温下静置2天， 以便完成结晶并老化，以批量的形式把该生成物加到粉碎机中， 干燥并过筛，得到结晶的麦芽三糖基麦芽三糖苷粉末。

该产物基本上不收湿且容易处理。此外，该产物适合用于包 括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中，因为其 有优良的溶解度和稳定性、降低的甜度、合适的粘度和保湿活性。

实施例A-7

向含有按照试验A-6中的方法制备的在其末端有海藻糖结构的 未还原的低聚糖的20％糖混合物溶液中加入每克固体10单位环麦芽 糖糊精葡聚糖转移酶，反应24小时，并加热以钝化该酶。然后调 整该溶液到55℃和PH5.3，加入每克糊精20单位β-淀粉酶，反应 16小时，并加热以钝化该酶。然后，按照类似于实施例A-1中的方 法，提纯并浓缩该溶液，得到75％糖浆，收率约92％。(以干固体为 基准)。

含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖芏和麦芽三糖基 麦芽三糖苷分别为约25％，约25％和约8％(按干固体计)的该糖浆像 实施便A-1的产物那样，有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性， 其使得该糖浆在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种 组合物中广泛应用。

实施例A-8

将按实施例A-4中的方法制备的含有含量增加的麦芽糖基麦芽 糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的浆液用通 常的方法喷雾干燥，得到湿含量约1％的粉末，收率约90％

像实施例A-1的产物那样，该粉末很适合用于包括食品、饮料、 化妆品、药物和有形体的各种结合物。

实施例A-9

将按实施例A-5中的方法制备的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷糖浆 在60℃冷冻干燥24小时。得到的干产物加到粉碎设备中，得到湿 含量约0.5％的粉剂，收率约93％。

像实施例A-1的产物那样，该粉末适合用于包括食品、饮料、 化妆品、药品和成形体的各种组合物。

实施例B-1

增甜剂

将1份(重量)按实施例A-6中的方法得到的结晶的麦芽三糖基 麦芽三糖苷粉末和0.05份(重量)“α-G Sweet”--一种由日本东 京ToYo Sugar Refining Co.，Ltd.生产的α-葡糖基卡哈茨苷混 合均匀，把该混合物加到造粒机中，得到粒状增甜剂。

该增甜剂有很好的味觉质量及与蔗糖比较有约2倍多的增甜能 力，从增甜能力的观点看该增甜剂的热量是蔗糖的大约一半。

该增甜剂适合于增甜那些热量摄取受限制的那些肥胖或糖尿 病人所用的那些低热的食物和饮料。另外，该增甜剂也适合于增 甜使之抑制牙的龋齿的食物和饮料，因为它由生龋的微生物产生 的酸和不溶的葡聚糖是很少的。

实施例B-2

硬糖果

把100份(重量)的55％蔗糖溶液和20份(重量)按实施例A-1中的 方法得到的含有未还原的低聚糖如麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖 基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆混合，同时加热，用 真空加热法浓缩该混合物到湿含量低于2％，加入1份(重量)柠檬酸 和适量的柠檬食用香料和着色剂，并用常用的方法成形。

该产品是高质量的硬糖果，其是松脆、味觉质量优良的，并 且没有蔗糖的结晶。    

实施例B-3

草莓酱

把150份(重量)的新鲜草莓，60份(重量)的蔗糖，20份(重量) 麦芽糖，40份(重量)的按实施例A-2的方法得到的含有麦芽糖基麦 芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆，5 份(重量)的果胶和1份(重量)的柠檬酸放在一个锅里煮浓，并把生 成物装瓶。

实施例B-4

乳酸饮料

将10份(重量)脱脂奶在80℃巴氏杀菌20分钟，冷却到40℃， 加入0.3份(重量)发酵剂，在约30℃发酵10小时。均化该生成物， 加入4份(重量)按实施例A-8中的方法得到的含有麦芽糖基麦芽糖 苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末，将1份 (重量)蔗糖和2份(重量)异构糖，并把该混合物保持在70℃巴氏杀 菌。然后冷却该混合物，加入适量调味剂并装瓶。

该产品是一种高质量乳酸饮料，其味道和甜度与酸味很协调。

实施例B-5

增甜浓缩奶

在100份(重量)鲜奶中溶解3份(重量)按实施例A-1中的方法得 到的含有未还原的低聚糖如麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽 糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆，和1份(重量)蔗糖，用板式 加热器加热对该生成物溶液进行消毒，浓缩至70％并消毒装罐。

该产品可以很好地用于罐身食品及水果、咖啡、可可和茶 的调味品，因为它有中等甜度和极好的味道。

实施例B-6

果汁粉

将22份(重量)的喷雾干燥的橙汁与50份(重量)的由实施例A-9 中的方法得到的高纯度麦芽糖基麦芽糖粉，10份(重量)蔗糖，0. 65份(重量)柠檬酸酐，0.1份(重量)马来酸，0.1份重量)L-抗环血 酸，0.1份(重量)柠檬酸钠、0.5份(重量)茁芽霉多糖和适量粉状 调味剂混合均匀，磨成细粉，加到流化床造粒器中并在40℃通风 温度下造粒30分钟，同时喷一种按实施例A-4中的方法得到的高含 麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦苷三糖基麦芽三糖 苷的糖浆作为粘合剂到该粉上，然后分成规定的量并包装。

该产品是果汁粉，其天然果汁含量约30％。该产品没有不希望 的味道和气味、吸湿和固化并且在延长的时间周期中很稳定。

实施例B-7

巧克力

把40份(重量)可可浆、10份(重量)可可脂、30份(重量)蔗 糖和20份(重量)按实施便A-9的方法得到的高纯度麦芽糖基麦芽糖 苷粉末混合，把生成的混合物加到精研机中以减小颗粒大小，加 入到制巧克力表研炼机中并在50℃捏和2天。在捏和过程中，向该 混合物中加入0.5份(重量)卵磷脂，并充分混合和散。然后用热 敏控制器调节该混合物到31℃，在该脂固化前立即倒在模子中， 用振动器驱气，并在20分钟内通过10℃冷却孔道以完全固化。然 后把模子中的物料取出并包装。

该产品有很好的颜色、光泽和组织，但没有吸水性，在嘴里 很好的熔化，显示出轻度的甜度和淡的味道。

实施例B-8

口香糖

通过加热把3份(重量)的胶质基料软化，加入4份(重量)的蔗 糖和3份(重量)按实施例A-8中的方法得到的含有麦芽糖基麦芽糖 苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末，与适 量的调味剂和着色剂混合，用辊子捏合，并用通常的方法成形的 包装。

该产品是有很好的组织、香味和味道的口香糖。

实施例B-9

蛋奶羹

把100份(重量)玉米淀粉、100份(重量)的按实施例A-3的方法 制得的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖和麦芽三糖基 麦第三糖苷的粉末、80份(重量)的麦芽糖、20份(重量)蔗糖和1 份(重量)的氯化钠混合均匀，向生成的混合物中加入280份(重量) 的新鲜鸡蛋，搅拌混合，慢慢加入1000份(重量)沸的奶，放到火 上同时搅拌，直至玉米淀粉凝胶并且该混合物都变为半透明，冷 却，加入适量香子兰香料，分成规定的量并包装。

该产品有平滑的光泽、中等甜度和极好的味道。

实施例B-10

“uiro-no-moto(速溶的“uiro”)”

90份(重量)大米粉与20份重量玉米淀粉、120份(重量)按实 施例A-9的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷粉和4份(重量)茁 霉多糖混合均匀，得到“uiro-no-noto”。该“uiro-no-moto” 与适量的“maccha(一种绿茶)”和水一起混和，将生成物分装在 器皿中并蒸汽处理60分钟，得到“maccha-uiro”。

该产品光泽极佳有刺激性。另外该产品有长的贮存期限，因 为足以抑制淀粉的老化作用。

实施例B-11

乳剂

用通常的方法通过加热，把0.5份(重量)聚氧乙烯二十二烷基 醚，1份(重量)聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯，1份(重量)的油溶的 单硬脂酸甘油酯，0.5份(重量)二十二醇、1份(重量)鳄梨油、3. 5份(重量)按实施例A-7中的方法制得的含有麦芽糖基麦芽糖苷、 麦芽三糖基麦芽糖和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆、1份(重量) α-糖基芸香苷和适量的维生素E及杀菌剂溶解，向该混合物中加 入5份(重量)1，3-丁二醇、0.1份(重量)羧基乙烯基聚合物和 85.3份(重量)精制水，并用均化器乳化。

该产品是一种保湿乳剂，其适合用作防晒剂和皮肤增白剂。

实施例B-12

护肤膏

用通常的方法通过加热把2份聚(重量)聚氧乙烯甘醇单 硬脂酸酯、5份(重量)半乳化的丙三醇单硬脂酸脂，2份(重量)α -葡糖基芸香苷，1份(重量)液体石蜡，10份(重量)甘油三辛酸酯、 4份(重量)按实施便A-9中的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖粉 末和适量防腐剂溶解，向生成的溶液中加入5份(重量)1，3-丁 二醇和66份(重量)精制水，用均化器乳化，并通过搅拌与适量的 调整味剂混合。

该产品是很好的涂敷膏，其很适于用作防晒膏、皮肤改善剂 和皮肤增白剂。

实施例B-13

洁牙剂

将55份(重量)磷酸钙，1.5份(重量)月桂酸钠，25份(重 量)丙三醇，0.5份(重量)聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯，15份( 重量)按实施便A-4中的方法制得的高含量麦芽糖基麦芽糖苷、麦 芽糖三基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆、0.02份(重 量)的糖精和0.05份重量防腐剂与13份重量水混合。

该产品有很好的光泽和去污力，宜作和洁牙剂。

实施例B-14

管摄食

把由20份(重量)按实施例A-8中的方法制得的含有麦芽糖基麦 芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末，1. 1份(重量)甘氨酸，1份(重量)谷氨酸钠、0.4份(重量)乳酸钙、 0.1份(重量)碳酸镁、0.01份(重量)维生素B1和0.01份(重量)维 生素B2组成的组合物分成249的等分试样，装在小的层压铝包中， 然后将其热密封。

将一包该产品溶于约33-500ml水中，然后不经肠给食到鼻腔、 胃或肠中。

该产品适用作养驯动物3及人的通过不经肠途径的管饲法。

实施例B-15

管摄食

把由580份(重量)按实施例A-6中的方法制得的结晶的麦芽三 糖基麦芽三糖苷粉末、190份(重量)干york、209份(重量)脱脂 奶、4.4份(重量)氯化钠、1.85份(重量)氯化钾、4份(重量)硫 酸镁、0.01份(重量)维生素B1、0.1份(重量)抗坏血酸钠、0 .6份(重量)乙酸维生素E和0.04份(重量)烟酰胺组成的组合物分成 259的等分试样，装在小的层压的铝包中，然后将其热密封。

将1包该产品溶于约150-300ml水中，然后非肠道给食到鼻腔、 胃和肠中。

实施例B-16

液体干扰素制剂

用通常的方法，把由日本岡山Hayashibara BiochemicalLaboratories，Inc.制备的由日本东京Cosmo Bio Co.，Ltd.生产的天然人体干扰素-γ制剂用于一种的固定抗 人体干扰素-γ抗体柱上，以便吸附在该制剂中的天然人体的干扰 素-γ上，但是使小牛血清白蛋白作为稳定剂通过该柱子以便除去， 通过把含按实施例A-5中的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷 糖浆的生理盐水加到该柱子中，加入量7％(按干固体计)，在改变 该盐水的PH的同时，洗脱该吸附的天然人体干扰素-γ。然后将 该该洗脱液进行膜过滤并且在消毒情况下装入药水瓶中，得到一 种液体制剂，其含105单位的天然人体γ-干扰素/ml。

该液体制剂适用于治疗病毒性疾病、变应性疾病、风湿病、 糖尿病和恶性肿瘤，其中该液体制剂是口服或不经肠给药，剂量 为1-20ml/天/成年人。即使当让该液体制剂在4℃或25℃静置20天， 该液体制剂仍保留它的初始活性，因为其用麦芽糖基麦芽糖苷作 为稳定剂。

实施例B-17

液体肿瘤坏死因子制剂

按通常的方法，把由日本岡山Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.制备的由日本东京Cosmo，Bio Co.，Ltd. 工业生产的天然人体肿瘤坏死因子-α制剂用于固定的抗人体肿瘤 坏死因子-α，但是要用小牛血清白蛋白作为稳定剂通过该柱子以 便除去，使用一种含有按实施便A-5中的方法制得的高纯度麦芽三 糖基麦芽糖苷糖浆的生理盐水洗脱该吸附的人肿瘤坏死因子-α， 用量为10％[以干固体计]，同时改变盐水的PH。把得到的洗脱液进 行膜过滤并在消毒情况下装入药水瓶中，得到一种液体制剂，共 含有104单位天然人肿瘤坏死因子-α/ml。

该液体制剂可用于治疗病毒性疾病，变应性疾病、风湿病、 糖尿病和恶性肿瘤，其中该液体制剂是口服或不经肠给药，剂量 是1-20ml/天/成人。即使当让其在4℃或25℃静置20天时该制剂 仍保持它的初始活性，因为麦芽三糖基麦芽糖苷作为稳定剂。

实施便B-18

干扰素片剂

按通常的方法，把由日本岡山Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc，制备的并由日本东京Cosmo Bio Co.，Ltd. 工业生产的天然人体干扰素-α制剂用于固定的抗人体干扰素-α 抗体柱上，以在其上吸附制剂中的天然人体干扰素-α，但是使小 牛血清的蛋白作为稳定剂通过该柱子以便除去，通过使用一种含 有按实施例B-1中的方法制得的高纯变麦芽三糖基麦芽糖苷粉末的 生理盐水，用量为5％(以干固体计)，来洗脱该吸附的天然人体干 扰素-α，同时改变盐水的PH。将得到的洗脱液进行膜过滤、脱 水，并通过加入大约20倍量的结晶的无水麦芽糖粉末(该麦芽糖粉 末是由日本岡山Hayashibara Dhoji Co.，Ltd.工业生产的，注 册商标“Finetose T”，进行粉碎将生成物粉末加到压片机中得 到片剂，每批约200g，其含约150单位天然人体干扰素-α/片。

该片剂适宜用作锭剂，治疗病毒性疾病、变应性疾病、风 湿病、糖尿病和恶性肿瘤，其中该片剂是口服给药，剂量约1-10 片/天/成人。特别是该片剂适用作为近年来迅速增加的爱滋病 (AIDS)人的治疗药剂。

甚至当让其在室温静放时该片剂在处长的时间周期内仍保持 它的初始活性，因为作为稳定剂加入的麦芽三糖基麦芽糖苷和麦 芽糖的功能很好。

实施例B-19

肥料棒

把一种把料组合物，N＝14％，P2O5＝8％，K2O＝12％，茁霉多糖、 一种含有按实施例A-3中的方法制得的麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三 糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末、硫酸钙和水混合 均匀，各组分的重量比为70∶5∶5∶15∶5，把生成的混合物加到挤压 机中，该机的L/D＝20，压缩比＝1.8，用于切割的内径30mm，在 80℃加热的同时挤成短棒。

该产品有很好的操作性能，不需要包装。该产品是硬的，足 以在全部的使用层中使用它，通过改变组成可以控制组分的渗出 速度。在必要时，该产品可以与植物激素、农药、土壤调节剂混 合。

由上所述，很明显地看出，本发明的α-D-低聚葡糖基2-D-低 聚葡糖苷是一种未还原的低聚糖，其是很稳定的，很容易溶于水 ，并有极好的质量和降低的甜度。另外，本发明的α-D-低聚葡糖 基α-D-低聚葡糖苷具有提高的化学稳定性和稳定氨基酸和很容易 引起棕黄反应的低聚肽的性能，以及稳定其活性或活性组分很容 易钝化的生物活生物质。本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡 糖苷还有另外的性能，例如活化性能，适宜的粘度、降低的发酵 性，以及具有控制渗透压、产生光泽、保湿、防止其他糖类结 晶和防止淀粉物质的逆行作用的性能。这些性能都适合用于生产 包括食品、饮料、化妆品、药品和成形体的各种组合物中。这 些都会在本领域作出很大的贡献。

因此，本发明的包括α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的未 还原的低聚糖类的形成及其制备和应用在食品、饮料、化妆品和 药物领域会有工业重要性。