α-乳清蛋白基因构建物 |
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| 申请号 | CN95194129.1 | 申请日 | 1995-07-12 | 公开(公告)号 | CN1157635A | 公开(公告)日 | 1997-08-20 |
| 申请人 | PPL治疗学(苏格兰)有限公司; | 发明人 | 朱利安·库普尔; 安琪莱克·施涅克; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了重组基因构建物用于在 牛 细胞中表达α- 乳清 蛋白，尤其是人α-乳清蛋白。为增强表达α-乳清蛋白，提供了新的基因构建物，载体，转化细胞以及遗传工程化的转基因动物。已证明人α-乳清蛋白对人婴幼儿营养有优越性，本发明能够廉价有效地在人乳中生产主要乳清蛋白。 | ||||||
| 权利要求 | 1、一种重组基因构建物，该构建物适于在牛细胞中表达α-乳清蛋白或其功 能等价物或其部分。 |
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| 说明书全文 | 本发明涉及重组的基因构建物，该构建物可表达α-乳清蛋白或其功能等价物 或其部分。人乳相对牛乳、绵羊乳、驼乳、山羊乳等其他类型的乳有更优越的营养价值， 有助于人类婴幼儿生长。然而许多母亲认为乳房喂乳困难或不便。在婴幼儿食品需 求量极大的国家，也极其需要提供一种有人乳营养价值的乳制品。 人乳相对其他哺乳动物(例如牛或绵羊)乳的主要区别之一在于，它含α-乳 清蛋白作为主要乳清蛋白。尽管α-乳清蛋白也存在于其他种类的乳中，但其浓度 相对较低，主要乳清蛋白为β-乳球蛋白。α-乳清蛋白水平在种与种之间不同， 人乳含量约为2.5mg/ml，牛乳0.5-1.0mg/ml，鼠乳0.1-0. 8mg/ml。 编码牛α-乳清蛋白及人α-乳清蛋白的基因序列已得到阐明；有类序列信息 分别由Vilotte等在Biochemie 69：609-620(198 7)和Hall等在Biochem J242：735-742(1987) 发表。 本发明寻求利用基因工程技术构建重组的基因，使得这种重组基因构建物在哺 乳类细胞中表达时即可在乳中产生含量高于1.0mg/ml，如1.2mg/ml 或更高的α-乳清蛋白。所述构建物一般适于在非人类的动物细胞尤其是牛细胞中 表达。 一方面，本发明提供了一种适于在非人类动物细胞优选牛细胞中表达α-乳清 蛋白或其功能等价物或其部分的重组表达系统。优选地，本发明的重组表达系统适 于表达人类α-乳清蛋白或其功能等价物或其部分。 本文使用的术语“表达系统”是指包括蛋白编码区并连结到所有对蛋白表达必 要的遗传信号的基因序列。任选地，表达系统也包括诸如启动子、增强子等调节元 件以增强蛋白编码区域的转录和/或翻译，或者控制表达。调节元件可位于蛋白编 码区域的上游或下游，或者位于蛋白编码区的内含子(非编码部分)中。蛋白编码 区域序列自身具有调节能力也是可能的。 术语“功能等价物”指任何与参考序列或蛋白功能实质等价的衍生物。“功能 等价物”尤其包括那些核苷酸和/或氨基酸序列被插入、缺失或替换但对生物学功 能尤其是产乳生物学功能没有明显不利影响的衍生物。 基因工程对研究或是对商业目的均是有力的技术。使用基因工程技术(见Ma niatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982 和“Principle of Genetic Engineening”， Old and Primrose，第5版，1994，两文均引为文献)可将 外源遗传物质转入宿主细胞，在其中复制和/或表达由该外源遗传物质编码的蛋白 或多肽。为了操作简便，遗传工程通常用原核微生物如E.coli等作宿主，但 也使用真核生物尤其如酶母、藻类等。在一些应用中也使用真核细胞培养。 Brinster等在Cell27：223-231，1981中描述了 将基因显微注入单细胞胚胎原核中所引起的哺乳类基因改变。这里外源遗传物质引 入动物受精卵中，该受精卵在植入养母体内后进一步以正常方式发育成胚胎。真正 的转基因动物在每一细胞中均含有外源DNA拷贝。 一旦注入的遗传物质成功整合到宿主染色体，该动物即称为“转基因动物”并 且转移的基因以正常的孟德尔方式遗传，但基因转移操作成功率较低，尤其是对大 型饲养动物如猪、羊、牛等。至今还不可能控制转移的基因整合进入宿主染色体的 位置。 一定条件下仅产生“镶嵌型”的供体动物对于本发明的目的来说已经是很充分 的。此时转移的基因整合到仅仅一定器官的染色体中。镶嵌型动物一般通过将外源 DNA引入发育较晚期的胚胎而得到。 牲畜转基因的最具前景的应用之一是，利用哺乳动物乳房作为“生物反应器” 生产含药用及营养价值重组蛋白的乳。对表达外源蛋白而言，哺乳动物乳房因其以 分泌方式大量生产蛋白而颇具吸引力。重组DNA技术可用来改变用于人或动物消 费的牛乳的蛋白成份，如在牛乳中表达人乳蛋白可增加其作为婴幼儿食品的营养价 值。(Strijker等，Harnessing Biotechnolog y for the 21st Century，Ladisch and B oser编辑，美国化学协会，38-21页(1992))。用普通和高级饲养 技术繁殖多产动物从而较便宜地增加产量对上述重组技术应用是有益的。 在哺乳动物乳房表达转基因的第一步是克隆感兴趣蛋白的基因。为了使蛋白表 达到乳中，一般使用在乳中表达主要乳蛋白基因的启动子。乳蛋白基因受到严格调 节，在非乳房组织中不表达，以使对其它组织负面影响的可能性降到最小。用来在 乳房中表达异源蛋白的调节基因有α-S1-酪蛋白(Strijker et.， 1992，上述文献)，β-乳球蛋白(Wright等，生物技术9：831 -834(1991))，乳清酸性蛋白(Ebert和Schindler，转 基因农用动物：进展报告(1993))和β-酪蛋白(Ebert Schind ler，1993，上述文献)。 新的基因构建物在用于牛之前一般先在转基因小鼠中检验。对得自转基因小鼠 的乳作重组蛋白定量分析，如果乳量充足，可分离蛋白检查其结构特征和生物活性。 对用于牛的特定构建物的选择主要考虑表达水平和所产生的重组蛋白的真实程度。 牛的转基因通常始自注射数百拷贝的基因构建物到合子两个原核中的一个。合 子取自体内输卵管(Roschlau等，Arch Tierz，Berlin 31：3-8(1988)；Roschlau等，繁殖与受精杂志(Supp l38)，哺乳动物卵操作的细胞生物学，Greve等编辑(1989)；H ill等，Theriogenology37：222(1992)；Bo wen et al.生物繁殖50：664-448(1994))或对体外成 熟的卵作体外受精(Krimpenforth等，生物技术9：844-84 7(1991)；Hill等，1992，上述文献；Bowen等，1993 上述文献)。牛的合子需在15,000×g离心数分钟从中除掉不透明的脂类， 以便用相差显微镜，Nomarski和Hoffman干涉相差显微镜观察原核。 将2-4pl含数百个DNA构建物拷贝的缓冲液注入原核。转基因被认为是整合 进入到染色体DNA的随机断点，该断点由显微注射中机械裂解产生。最理想的是， 转基因在合子阶段DNA复制前整合，确保成体中每个细胞含有转基因。一般转基 因的数个“拷贝”成线状连结，整合到单个染色体的单个位点。整合位点是随机的。整 合可能在第一轮DNA复制后发生，也可能晚至2或4细胞阶段发生(Wall and Seidel，1992)，产生转基因镶嵌型的动物。高至30％的可 在体细胞组织检查到转基因的动物不向后代传递该转基因(或传递率低于预期的5 0％)。 显微注射后，胚胎直接转移到受体的输卵管内或者培养数天后转移到受体牛的 子宫内。通过对初生牛犊组织样品的Southern印迹分析，证明转基因的整 合。而转基因的表达通过分析适当组织中的基因产物来测定，本发明是分析乳中的 基因产物量。显微注射后胚胎存活率，转基因整合频率，表达频率和水平，配子系 传递频率，均因注射的DNA构建物的量和质、所使用的小鼠品系(Brinst er等，Proc Natl Acad Sci USA82：4438-4 442(9185))及操作人员的技术技巧不同而相异。此基本方法已用于生产 转基因绵羊(Wright等，1991，上述文献)，转基因山羊(Ebert and Schinder，1993，上述文献)，转基因猪(Rexroad 和Purcel，第11届动物繁殖国际会议A.I.Dublin5：29 -35(1988))和转基因牛(Krimpenfort等，1991，上述 文献；Hill等，1992，上述文献；Bowen等，1994，上述文献)。 WO-A-88/01648(Immunex公司)，WO-A-88/0 0239和WO-A-90/05188(均为药物蛋白质有限公司所有)也作为 参考文献，其描述了重组基因构建，整合重组基因的转基因动物生产，在哺乳期成 年雌性哺乳动物乳房中表达编码蛋白表达所采用的合适的技术和方法。这些及上述 文献均引入本文作参考。 Stacey等在分子及细胞生物学14(2)：1009-1016(1 994年2月)的文章也引为参考文献，该文描述了小鼠α-乳清蛋白基因被人α -乳清蛋白基因代替的剔除实验。然而该论文未报道α-乳清蛋白的表达。 在一个实施方案中，本发明提供了一种表达系统，该系统是用不同于替换天然 存在基因的技术的其它技术来产生。 另一方面，本发明提供了一种转基因哺乳动物，该动物的细胞整合了适于表达 α-乳清蛋白(优选人α-乳清蛋白)或其功能等价物或其部分的重组表达系统。 重组表达系统一般整合入转基因动物的基因组中，可以遗传，因此其后代也含有转 基因并因此也包括在本发明内。合适的转基因动物包括(但不限于)绵羊、猪、牛、 山羊，尤其优选牛。 另外，本发明包括含这种重组表达系统的载体，还包括用这种重组表达系统 转化的宿主细胞(任选地以载体形式转化)。 另一方面，本发明提供了通过重组表达系统表达生产的α-乳清蛋白，希望的 是在转基因哺乳动物中生产这种α-乳清蛋白。α-乳清蛋白基因在哺乳期雌性哺 乳动物乳房中自然活化，因此本发明重组表达系统表达的蛋白将在此期间生产并作 为乳的成分分泌。也可通过激素或其他方法诱导乳分泌而生产感兴趣的蛋白。含α -乳清蛋白的加工过的乳制品也在本发明范围内。 在一优选实施方案中，重组表达系统包括如下构建物，命名为pHA1，pH A2，pBBHA，pOBHA，pBAHA，pBova-A或pBova-B。 构建物pHA1，pHA2，pBBHA，pOBHA和pBAHA表达人α-乳 清蛋白因此优选，尤其优选pHA2。构建物pHA2于1995年2月15日保 藏于NCI MB，保藏号NCI MB 40709。 含上列特定构建物的类似转基因哺乳动物是优选的。 进一步发现，本发明获得的乳除了每单位体积中α-乳清蛋白浓度增加外，产 乳量也增加。这个发现是未曾预料的，因此，含人α-乳清蛋白基因(或功能等价 物或其部分)的构建物和转基因动物(特别是牛)均为本发明的优选实施方案。 尽管我们不希望受理论束缚，但据信人α-乳清蛋白基因的启动子区域仅对α -乳清蛋白在人体内增强的天然表达有部分作用。据信增强表达可通过将蛋白编码 区3’和/或5’旁侧序列包括在本发明重组表达系统中而获得。 人α-1ac基因蛋白编码区的3’和5’旁侧序列已首次测序。3’旁侧区 的部分序列(核苷酸1-264，1331-2131，2259-2496，2 519-2680和3481-3952)示于SEQ ID NOS.16至2 0，同时5’旁侧的全序列示于SEQ ID NO.21。实验中观察到，包含 任一或两者序列均会使α-乳清蛋白的表达水平大大增加。表达的增加也会在蛋白 编码区域为非人α-乳清蛋白时观察到。 序列SEQ ID NOS.16-20和21据信都对α-乳清蛋白在人乳 中高水平表达有用，因此组成本发明的另一方面。 另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，具有与SEQ ID NOS.16 -20中任一个或SEQ ID NO.21或其一部分或其功能等价物基本相 同的序列。 这种多核苷酸形式多样(如DNA或RNA，双链或单链)，但一般双链DN A最为方便。本发明的多核苷酸可作为重组基因构建物的一部分存在，而后者包括 在载体之中(如表达载体)或整合入转基因动物的染色体内。任何包括上述多核苷 酸的载体或转基因动物构成本发明的一另个方面。 从再一方面看，本发明提供了一种重组表达系统(优选适于表达α-乳清蛋白 (优选人α-乳清蛋白)或其部分或其功能等价物)，所述重组表达系统包括选自 野生型α-乳清蛋白基因的EcoRI与XhoI限制位点间的多核苷酸和野生型 人α-乳清蛋白基因的BamHI和EcoRI位点间的多核苷酸的多核苷酸，或 者其部分或其功能等价物。 在一优选的实施方案中，本发明的重组表达序列包括上述多核苷酸，其部分和 其功能等价物。 本发明还包括含上述重组表达系统的载体和用这种载体转化的细胞。本发明进 一步包括转基因动物，其中的转基因包含重组表达系统。 图1，如实施例1中所述，示出牛α-乳清蛋白PCR引物序列。 图2，如实施例1和实施例4所述，示出牛α-乳清蛋白PCR引物的位置及 其产物。 图3，如实施例2所述，表明人α-乳清蛋白基因的两个重叠的基因组λ克隆 的限制性图谱(pHA-2和pHA-1)。 图4，如实施例3所述，表明牛β-乳球蛋白基因的三个重叠的基因组λ克隆 的限制性图谱。 图5，如实施例4所述，示出对转入牛α-乳清蛋白基因的转基因小鼠的脱脂 乳和非转基因小鼠乳比较分析而作的SDS-PAGE。 图6，如实施例5所述，示出人α-乳清蛋白转基因构建物。 图7，如实施例5所述，示出对转入人α-乳清蛋白基因的转基因小鼠的脱脂 乳和非转基因小鼠乳比较分析而作的SDS-PAGE。 图8，如实施例5所述，示出人α-乳清蛋白转基因小鼠乳的Western 分析，以人α-乳清蛋白标准作对照。 图9，如实施例6所述，示出转基因构建物PKU1至PKU4的PCR克隆 策略。 图10，如实施例6所述，示出PKU引物1至10的序列。 图11示出无效的和人源化的α-乳清蛋白等位基因的结构。 图12为α-乳清蛋白缺陷的哺乳期乳腺的总RNA的Northern分析。 图13，示出靶鼠的α-乳清蛋白的Western分析。 图14为野生型α-lac-哺乳期乳腺的组织学分析。 图15A示出RNase保护分析，用以区分人的替换型α-乳清蛋白mRN A与小鼠的α-乳清蛋白的mRNA。图15B示出小鼠和人的替换型α-乳清蛋 白mRNA的RNase保护分析。 图16示出用疏水作用层析定量分析α-乳清蛋白。 SEQ ID NOS16-20给出从BamHI位点到载体限制位点( 包括EcoRI位点)的部分序列，其位于内源性人α-乳清蛋白基因的蛋白编码 区域的3’一侧，如下所示： SEQ ID NO 16：核苷酸1至264(包括两端点) SEQ ID NO 17：核苷酸1331至2131(包括两端点) SEQ ID NO 18：核苷酸2259至2496(包括两端点) SEQ ID NO 19：核苷酸2519至2680(包括两端点) SEQ ID NO 20：核苷酸3481至3952(包括两端点) SEQ ID NO.21给出了从EcoRI位点到XhoI位点的序列， 位于内源性人α-乳清蛋白基因的蛋白编码区域5’一侧。 具体地，图11上部分表明了野生型鼠α-乳清蛋白的位点，转录区的位置与 方向由箭头所示。翻译终止位点和RNA多聚腺苷酸位点也已标明，中间部分示出 了无效的等位基因的结构。带条纹区表明了HPRT可选择盒(Cassette) 。下部分表明人的替换等位基因的结构。方格区表明人α-乳清蛋白片段。转录起 始，翻译终止和多聚腺苷酸位点均已标明。所示限制性酶切位点为：Hind III( H)；BamHI(B)；XbaI(X)。 图12中所示两个放射自显影图为使用人α-乳清蛋白探针，随之使用大鼠β -酪蛋白探针对同一滤膜作重复杂交的结果。所用探针在每一放射自显影图下标明。 各条道中RNA的来源在其上标记处说明。 图13中A道含纯化的人α-乳清蛋白。B至F道为来自靶小鼠的乳样品，基 因型在其上方标明。G和H道为C和D道的短时间曝光物。 图14中所示光镜照片为乳房组织的苏木精/曙红染色切片(原始放大倍数1 00X)。各乳腺基因型已表明。 图15A中，小鼠与人DNA在α-lach等位基因的3’连结位于翻译终 止位点和多聚腺苷酸信号间。人α-乳清蛋白mRNA3’未翻译末端含120b p的小鼠序列。小鼠和人的替换的α-乳清蛋白mRNA用小鼠RNA探针通过杂 交检测，并由核糖核酸酶消化保护所产生的RNA片段大小区别。人的序列由方格 表明，小鼠序列由阴影区表明。所示限制酶切位点为Hind III(H)；BaI( B)；XbaI(X)。 图15B中所示放射自显影是5％的聚丙烯酰胺尿素薄层凝胶。RNA的来源 在各道上方标明。A道示出与小鼠RNA探针杂交的野生型RNA，该探针未被核 糖核酸酶消化。D道至J道示出来自α-lacm/α-lach杂合子的RNA 样品；数字表明具体的小鼠，是图15中所给定量估计的来源。保护片段的预测大 小也被标明。 图16上部分给出三种乳样的Phenyl-Sepharose洗脱曲线。 1，α-lach/α-lach同合子(小鼠#22)；2，α-lacm/α -lach杂合子(小鼠#76)；3，α-lacm/α-lacm野生型。下 部分示出用已知的人α-乳清蛋白量对积分峰区所作的标准曲线。 本发明参照如下非限制性实施例作进一步描述。 实施例1牛α-乳清蛋白基因的克隆 已知有三种不同的牛α-乳清蛋白，其中B型最普遍。来自Bos(Bos) nomadicus f.d.indicus的A型不同于B型，表现在10号 位残基：A为Glu，而B中则为Arg取代。来自Bos(Bibos)jav anicus的C型其序列差异尚不清楚(Mc Kenzie & White， Advances in Protein Chemistry 41，173 -315(1991)。牛α-乳清蛋白基因(编码B型)可用图1中标明的PC R引物从基因组DNA克隆。引物已给出如下序列号： Ba-2 SEQ ID NO 1 Ba-7 SEQ ID NO 2 Ba-8 SEQ ID NO 3 Ba-9 SEQ ID NO 4 所有PCR反应中的DNA来源是来自Holstein-Friesian 牛的血。 使用引物Ba-9结合引物Ba-8扩增的启动子区长度为0.72kb。这 -BamHI/EcoRI片段克隆到Bluescript(pBA-P0.7)。 使用引物Ba-7结合引物Ba-8扩增的启动子区长度为2.05kb。这 -BamHI/EcoRI片段克隆到Bluescript(pBA-P2)。 整个牛α-乳清蛋白基因，包括5’0.72kb和3’0.3kb的旁侧序列 区，可用引物Ba-9结合引物Ba-2加以扩增。这些引物包括BamHI限制 酶识别位点，可将扩增的3kb片段直接亚克隆到pUCI8的BamHI位点， 产生pBova-A构建物(见图2)。 将来自克隆pBA-P2的BamHI/EcoRV片段连到pBOVA-a 的EcoRV/BamHI片段，产生构建物pBOVA-b(见图2)。 因为TAQ多聚酶缺乏校正活性，因此检验扩增的牛α-乳清蛋白DNA与发 表的牛α-乳清蛋白基因是否一致是必要的。序列分析在所有外显子及两个引物片 段中进行。比较牛α-乳清蛋白外显子与Vilotte发表的结果，表明了3个 改变： (i)外显子I在+759位由C变为A；成为5’非编码区 (ii)外显子I在+792位由CTA变为CTG；均编码亮氨酸 (iii)外显子II在+1231位由GCG变为ACG；丙氨酸变为亮氨酸 这表明蛋白B型更为常见。 尽管不能排除PCR扩增中序列错读，但以上错配可能系由于牛DNA来源不 同。 实施例2 人α-乳清蛋白基因的克隆 人α-乳清蛋白的DNA序列已发表(Hall et al.，Bioch em.J.，242：735-742，(1987))。使用人的序列设计PCR 引物以克隆两个来自人基因组DNA的小片段，其中一个位于基因的5’端，另一 个在3’端。它们被亚克隆到pUC18载体，作为探针检测商购(Strata geme)λ基因组文库。两个含有α-乳清蛋白基因的重组细菌噬菌体，即4a 和5b.1，已用现成方法分离(Sa mbook et al，分子克隆实验手 册，第2版，Cold Spring Har bor Laboratory( 1989))。限制酶切图谱证明两个克隆均含人α-lac基因的完整的编码序 列，但存在的5’及3’端序列长短不一(图3)。克隆5b.1外显子序列分析 及克隆4a外显子和5’旁侧区域序列分析结果表明它们与发表序列一致。 3’序列的一些部分示于SEQ ID NOS.16至20。5’序列示于 SEQ ID NO.21。 实施例3 克隆牛β-乳球蛋自基因(bBLG) 牛BLG(bBLG)的DNA序列已发表(Jamieson et al； Gene，61；85-90，(1987)；Wagner，unpublis hed，E MBL Data Library：BTBLACEX(1991)) 。使用牛序列设计PCR引物以克隆牛BLG基因从5’端开始的片段。该片段亚 克隆到pUC18载体，作为探针使用，检查商购的牛(Stratagene) λ基因组文库。分离了3个基因组λ克隆作了限制酶切分析定性(见图4)。其中 两个克隆(BB13，BB17)含有完整的bBLG编码区，外加不同长短的旁 侧区域，而克隆BB25缺少编码区域，完全由5’旁侧区域组成，序列分析表明 这个克隆的终点位于ATG翻译起始点的上游12bp。包含整个BB13和BB 17的Sal片段亚克隆到pUC18，来自克隆BB25的EcoRI片段克隆 到pBluescript(图4)。 实施例4 牛α-乳清蛋白构建物的组装与表达 转基因构建物(图2) pBova-A由牛α-乳清蛋白编码区，0.72kb的5’旁侧及0.3k b的3’旁侧区域组成，作为3Kb的BamHI片段克隆到Bluescrip t载体。 pBova-B含3个片段： 1、来自克隆pBA-P2的1.47kb大小的BamHI-EcoRV片 段。 2、来自克隆pBova-A的2.78kb大小的EcoRV-BamHI 片段。 3、BamHI消化的克隆载体Bluescript。 牛α-乳清蛋白在转基因小鼠中的表达 将两个构建物pBova-A和pBova-B(图2)注入小鼠胚胎，产生 转基因动物。通过SDS-PAGE电泳结合考马斯蓝染色分析乳并与α-乳清蛋 白标准量比较，表明了α-乳清蛋白表达水平的变动情况，其中PBova-A检 测不到，PBova-B表达水平高至0.5-1mg/ml(见图5和表1)。 表1 转基因小鼠中牛α-乳清蛋白的表达 小鼠 考马斯蓝染色 244.12 BOVA-a - 244.14 BOVA-a - 244.15 BOVA-a - 245.23 BOVA-b - 245.8 BOVA-b - 245.4 BOVA-b - 245.7 BOVA-b + 245.21 BOVA-b - 245.13 BOVA-b + 249.13 BOVA-b - 246.15 BOVA-b - 249.18 BOVA-b ++ 249.23.1 BOVA-b ++ 249.23.5 BOVA-b ++ 249.25.3 BOVA-b - 249.25.7 BOVA-b - 249.30.3 BOVA-b - -＝＜0.5mg/ml 249.30.4 BOVA-b - +＝＝0.5-1mg/ml 249.33.2 BOVA-b +/++ ++＝＝1-2mg/ml 249.33.3 BOVA-b +/++ 表1表明转基因小鼠乳中牛α-乳清蛋白的相对水平，通过比较经考马斯蓝染 色的胶上蛋白标准而估算得到。 实施例5 人α-乳清蛋白基因构建物的装配与表达 α-乳清蛋白是人主要乳清蛋白，而绵羊与牛的主要乳清蛋白为β-乳球蛋白。 α-乳清蛋白的表达水平种与种不同，人乳含大约2.5mg/ml，牛乳含0.5 -1.0mg/ml，小鼠乳含0.1-0.8mg/ml。为了弄清使α-乳清蛋 白基因高水平表达的序列，设计了不同的构建物。它们含有a)不同长度的来自人 α-乳清蛋白基因座的5’和3’旁侧区域。b)来自牛α-乳清蛋白位点的5’ 旁侧区域，或c)来自牛或鸟β-乳球蛋白基因的5’旁侧区域。鸟β-乳球蛋白 基因启动子已被成功地用于在小鼠乳中高效表达(＞10mg/ml)异源基因。 转基因构建物(图6) pHA-1由人α-乳清蛋白编码区域和来自λ克隆5b.1的约1.8kb的 5’旁侧及3kb的3’旁侧区域组成，其作为7kb的EcoRI/SalI片 段克隆到pUC18。 pHA-2由人α-乳清蛋白编码区域和来自λ克隆4a的约3.7kb的5’ 旁侧和13kb的3’旁侧区域组成，其作为约19kb的SalI片段克隆到p UC18。 pOBHA(鸟β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于4个DNA片段： 1、一个4.2 kb的SalI/ECoRV片段，包含鸟β-乳球蛋白启动 子(见WO-A-90/05188)； 2、一个74bp的合成寡核苷酸，对应于一个8bp的BClI接头和人α -乳清蛋白序列的15-77位碱基，作为一个平末端/BglI片段使用； 3、一个6.2kb的BglI/PstI人α-乳清蛋白片段，它源自λ克 隆4a，包括位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的区域。 4、用PstI和SalI酶切的pSL1180(Phamacia)。 pBBHA(牛β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于以下4个DNA片段： 1、一个3.0kb的ECoRI片段， 含来自克隆BB25-3的牛β-乳 球蛋白启动子，作为EcoRI/EcoRV片段使用； 2、一个74bp的合成寡核苷酸，对应于一个8bp的BClI接头和人α -乳清蛋白序列15-77位碱基，作为平末端/BglI片段使用； 3、一个6.2kb的BglI/PstI人α-乳清蛋白片段，来自克隆 4a，包括位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的区域； 4、用EcoRI和PstI酶切的Bluescript载体。 pBAHA(牛β-乳球蛋白，人α-乳清蛋白)构建于以下4个DNA片段： 1、一个0.72kb的BamHI-StuI片段，含来自克隆pBA-P 0.7的牛α-乳清蛋白启动子； 2、一个62bp的合成寡核苷酸，对应于人α-乳清蛋白序列15-77位 碱基，作为平末端/BglI片段使用； 3、一个6.2kb的人α-乳清蛋白基因BglI/PstI片段，来自λ 克隆4a，含位于77位碱基BglI位点和3’侧XhoI位点间的序列； 4、用BamHI和PstI酶切的Bluescript载体。 人α-乳清蛋白在转基因小鼠中的表达 将5种构建物注入小鼠胚胎，产生转基因动物。所有构建物在小鼠乳中均表达 人α-乳清蛋白。含人α-乳清蛋白基因和不同长短的旁侧区域的pHA-1和p HA-2在大多数动物中表达水平介于1至18mg/ml(213.5pHA -2)。含由鸟或牛BLG启动子启动的人α-乳清蛋白基因的pOBHA和pB BHA有稍低的表达水平。含由0.72kb牛α-乳清蛋白启动子驱动的人α- 乳清蛋白基因的pBAHA有与pHA-1或pHA-2相似的表达水平，但表达 可检水平蛋白的转基因动物的百分数较低。这个发现令人惊讶的，因为同样的牛启 动子序列驱动牛α-乳清蛋白基因，结果表现极差(见实施例4和Vilotte et al；FEBS，Vol.197，1.2.13-18(1992))。 表2总结出转基因蛋白相对量。来自这些动物的脱脂乳用SDS-PAGE结 合考马斯蓝染色、等电点聚焦、Western印迹(使用商购的抗人α-乳清蛋 白抗体(Sigma)进行)和色谱聚焦技术分析。这些分析的结果表明，与人α -乳清蛋白标准(Sigma)比较，转基因蛋白的分子量、等电点和抗原性正确。 表2 转基因小鼠中人α-乳清蛋白表达 小鼠 考马斯蓝染色 Western印边 205.19 pHA1 - - 204.10 pHA1 ++ ++ 204.7 pHA1 +++ +++ 230.15.3 pHA1 +++ n.d. 230.15.5 pHA1 +++ n.d. 230.15.6 pHA1 +++ n.d. 230.21.5 pHA1 +++ n.d. 230.21.1 pHA1 ++ n.d. 211.18 pHA2 + ++ 211.17 pHA2 - - 211.16 pHA2 +++ +++ 212.11 pHA2 + n.d. 213.5 pHA2 ++++ ++++ 212.13 pHA2 ++ n.d. 212.19 pHA2 - n.d. 213.4 pHA2 +++ n.d. 212.7 pHA2 - n.d. 232.10 BBHA - - 233.1 BBHA - - 231.4 BBHA ++ ++ 232.9 BBHA + + 231.9 BBHA - n.d. 232.5 BBHA + + 231.3 BBHA + + 232.6 BBHA - n.d. 237.6 BBHA - n.d. 235.15 OBHA - n.d. 235.19 OBHA ++ ++ 236.6 OBHA ++ ++ 234.1 OBHA + + 234.4 OBHA ++ ++ 234.14 OBHA + + 239.14 BAHA +++ +++ 239.4 BAHA - n.d. 240.7 BAHA - n.d. 239.3 BAHA - n.d. 239.6 BAHA ++ ++ 239.12 BAHA - n.d. 243.1 BAHA ++ n.d. 242.9 BAHA +++ n.d. 241.16 BAHA + n.d. 234.14 BAHA - n.d. 243.13 BAHA + n.d. 243.10 BAHA - n.d. 243.4 BAHA - n.d. 表2表明人α-乳清蛋白在转基因小鼠乳中的相对水平，其通过与标准蛋白在 考马斯蓝染色的凝胶和Western印迹反应相比较而得到。 - 表示 ＜ 0.5mg/ml + 表示 ＝ 0.5-1mg/ml ++ 表示 ＝ 1-2mg/ml +++ 表示 ＝ 2-3mg/ml ++++ 表示 ＞ 5mg/ml n.d. 表示 未能断定 来自几个小鼠的结果表示于图7和图8中。图7示出转基因小鼠脱脂乳的SD S-PAGE分析，以非转基因小鼠乳为对照；图8表明转基因乳的人α-乳清蛋 白的Western印迹，以人的α-乳清蛋白标准作对照。 实施例6 在体内人α-乳清蛋白启动子控制下，诱变的牛α-乳清蛋白的表 达 人α-乳清蛋白转基因的表达与天然的牛α-乳清蛋白转基因相比是相对较高 的，反应出内源牛和人基因表达水平的不同。因为这种不同可能由5’端控制区域 的不同引起，因此，将牛α-乳清蛋白转录起始点的5’区域用人α-乳清蛋白基 因的相应序列即代。 构建了PKU-5和PKU-1H两种构建物，它们包含了显示于表3中的氨 基酸取代。 下列SEQ ID NOS给于所用的PCR引物 PKU-1 SEQ ID NO.5 PKU-2 SEQ ID NO.6 PKU-2L SEQ ID NO.7 PKU-3 SEQ ID NO.8 PKU-4 SEQ ID NO.9 PKU-5 SEQ ID NO.10 PKU-6 SEQ ID NO.11 PKU-7 SEQ ID NO.12 PKU-8 SEQ ID NO.13 PKU-9 SEQ ID NO.14 PKU-10 SEQ ID NO.15 PKU-5 在克隆的第一步有三个片段亚克隆到pUC18的EcoRI/BamHI位 点： (1)来自使用PKU-引物7结合引物8的PCR扩增的EcoRI至Pv uI片段(见图10)； (2)来自使用PKU-引物9结合引物10的PCR扩增的PvuI至Bs aBI片段(见图10)；和 (3)来自pBA的BsaBI至HindIII片段。 最终的构建物包括6个DNA片段： (1)3.7kb的SalI至KpnI片段，含来自λ克隆4a的人α-乳 清蛋白启动子(图3)； (2)152bp的合成寡核苷酸，含有KpnI位点到AUG的人α-乳清 蛋白基因序列和从AUG到HapI位点的牛α-乳清蛋白基因序列； (3)来自第一步亚克隆的1.25kb大小的HpaI至HindIII片段； (4)来自pBA的0.95kb的HindIII至BglII片段。 (5)来自λ克隆4a(图3)的人α-乳清蛋白基因3’侧的3.7kb大 小的BamHI至XhoI片段，作为BamHI片段使用； (6)用SalI和BamHI酶切处理过的Bluescript KS- 载体。 PKU-1H以与PKU-5同样的方式构建，只是片段(3)来自PKU- 1。 PKU-1由6个DNA片段构建(见图9)： (1)一个2.04kb大小的来自pBOVA-6的SstI至HpaI片 段； (2)一个0.46 kb大小的来自PCR产物A的HpaI至PvuI片段 (PKU-引物对1和2；见图10)； (3)一个0.60kb大小的来自PCR产物B的PvuI至BsaBI片 段(引物对3和4；见图10)； (4)一个0.22kb大小的来自pBOVA-6的BsaBI至Hind III片段； (5)一个0.95kb大小的来自pBOVA-6的HindIII至BglII 片段。 (6)用Sst I和BglIII消化的载体pSL1180。 表3 存在于转基因构建物中的氨基酸取代 取代 人启动子 质粒 人3′旁侧 位置 9 30 53 80 Tyr，Tyr，Tyr，Tyr + pPKU-1H Ser，Tyr，Leu，Leu + pPKU-5 转基因小鼠中的表达情况 构建物PKU-1H和PKU-5已注入小鼠胚胎中。目前转基因动物均来自 PKU-5构建物。喂养这些动物以便分析其乳。 实施例7 破坏α-乳清蛋白缺陷和将人α-乳清蛋白基因替换物插入到小鼠 中对哺乳的影响 材料与方法 小鼠品系 携带α-乳清蛋白无效等位基因和人源化α-乳清蛋白替换等位基因的小鼠， 是通过分别饲养来自靶胚干细胞克隆M2和F6与Balb/c交配所得嵌合体而 得到，如前所述(Fitzgerald et al.J.Biol.Chem 245：2103-2108)。饲养这些品系过程中，α-乳清蛋白的基因型通 过对尾部活组织中制备的基因组DNA作Southern分析而决定。 RNA分析 总RNA用Auffray和Rougeon的方法从产后506天的雌性小 鼠腹部乳腺制得(Eur.J.Biochem 107：303-14)。Nor thern检测依标准程序进行(Sambook et al，Molecul ar Cloning)。用于杂交的探针为：一个3.5kb大小的含完整的小 鼠α-乳清蛋白基因的BamHI片段，和一个1.1kb大小的大鼠β-酪蛋白 cDNA(Blackburn et al Nucl.Acids Res 10：2295-2307)。 RNAse保护分析 32P-CTP标记的反义RNA用T7RNA聚合酶(Promega)从 一个克隆于Bluescript KS的455bp的HindIII-BalI小 鼠α-乳清蛋白基因片段转录得到(图15A)，转录反应、溶液杂交和RNAs e消化的条件均按Promega推荐进行。被保护的片段用聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离，放射自显影观察。 乳组分及产量分析 乳样在哺乳期3-7天于Hypnorm(Roche)/Hypnovel (Janssen)麻醉状态下收集。通过腹膜注入150mU的催产素(Int ervet)并轻轻按摩挤发。乳脂肪含量用Fleet和Linzell方法计 算(J.Physiol 175：15)。去脂肪的乳用于分析蛋白(Brad ford Analyt.Biochem 72：248-54)，乳糖用酶法 检测，将乳样依次与β-半乳糖苷酶(Boehringer)，葡萄糖氧化酶和 过氧化酶(Sigma)保温，该法来自Bergmeyer和Bernt(Me thods in Enzyme Analysis 3：1205-1212)。 产乳量是用滴定水技术计算，如Knight等所述(Comp.Bioch em.Physiol 84A：127-133)，测定一般选在哺乳期3至6 天小鼠哺乳完毕48小时后。 乳中α-乳清蛋白的分析和定量 乳样在16％的SDS-PAGE凝胶(Novex)上分析，并转移到Im mobilonP膜作Wester印迹反应。先用兔抗人α-乳清蛋白的抗血 清(Dako)吸附，继而用羊抗兔的IgG过氧化酶抗体偶联物吸附，并用增强 的化学发光系统观察(Amersham)从而检测α-乳清蛋白。 乳样中α-乳清蛋白用Lindahl等的方法的改进方法定量(Analy t Biochem 140：394-402)，该法用依赖钙的苯基-琼脂糖 层析纯化α-乳清蛋白。乳样用27％(W/V)的硫酸铵按1∶10稀释，在室 温保温10分钟，然后离心。上清与等体积100mM Tris/Cl，pH7. 5，70mMEDTA混合，装于已用50mM Tris/Cl，pH7.5， 1m ME DTA预平衡的苯基-琼脂糖(Pharmacia)柱上(200μl 填充体积)。用同样缓冲液洗柱子，α-乳清蛋白用50m MTris/Cl，p H7.5，1m MCaCl2洗脱出。检测柱子在280nm的光吸收，并对α- 乳清蛋白部分的峰面积求积分。使用已知量的纯化的人α-乳清蛋白从零至2.4 6mg/ml建立了标准曲线(图16)。 组织学分析 将幼仔从产后第六天正处于哺乳期的母鼠处移走，两小时后处死母鼠，分解胸 部乳腺，贮存于中性缓冲的福尔马林中，用石蜡包埋并用标准方法用苏木精/曙红 染色。 结果 小鼠α-乳清蛋白基因缺失 如Stacey等(1994年，上述文献)所述，建立了一株小鼠品系，其 包含完整小鼠α-乳清蛋白编码区的2.7kb片段及0.57kb的启动子已缺失， 并用2.7kb的含次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)选择标记基因替换(见 图11)。携带此等位基因的动物命名为α-lac-。野生型小鼠α-乳清蛋白 等位基因命名为α-lacm。 对取自哺乳期第5天的乳腺RNA所作的 Northern分析表明，α- 乳清蛋白mRNA在α-lac-/α-lac-同合子中不存在(见图12)， 证明α-乳清蛋白基因已被除去，无别的α-乳清蛋白mRNA源存在。在所有样 品中同样RNA与样品β-酪蛋白RNA杂交(见图12)。 α-乳清蛋白缺陷除对哺乳期外对小鼠其它时期没有明显的影响。两种性别的 α-lac-/α-lac-同合子和α-lacm/α-lac-杂合子外表， 行为和繁殖均正常。然而，α-lac-/α-lac-同合子雌鼠不能成功地哺 育幼仔，其幼仔在出生后5-10天内死去。同合子雌鼠α-lac-/α-la c-的后代转移给野生型母鼠喂养能正常存活。相反，野生型母鼠的后代转移给同 合子α-lac-/α-lac-母鼠喂养，不能生存。表4说明α-lac-/ α-lac-母鼠喂养的幼仔大约是α-lacm/α-lacm野生型鼠喂养幼 仔重量的一半。产乳量的计算结果与此一致。α-lacm/α-lac-杂合子 产乳量与野生型相近，但α-lac-/α-lac-同合子的产乳量急剧下降( 表4)。 表4 靶小鼠品系中，乳成分，幼仔重量，乳房组织重量和产乳量 基因型 α-lacm/α-lacm α-lacm/α-lac- α-lac-/α-lac- α-lacm/α-lach α-lach/α-lach 脂肪(％ v/v) 28.23±1.65(7) 29.6±1.3(6) 45.25±2.15(6)*** 25.25±1.36(7) 21.2±0.23(4)* 蛋白质 (mg/ml) 87.52±5.82(7) 95.81±9.5(5) 164.63±13.92(8)*** 94.51±5.97(7) 77.07±1.05(4) 乳糖 (mM) 62.44±9.27(7) 42.7±4.2(6) 0.7±0.34(3)*** 42.40±1.93(7) 56.85±3.8(4) 单个幼仔重量 (g) 2.82±0.25(8) 3.14±0.1(7) 1.52±0.12(10)*** 2.9±0.15(8) 3.4±0.75(4) 每幼仔乳房 组织重量 (g) 0.34±0.06(7) 0.4±0.1(7) 0.35±0.05(8) 0.31±0.04(6) 0.51±0.09(4) 产乳量 (g/天) 7.51±0.44(4) 6.7±0.38(6) 1.37±0.48(4)*** n.t. 9.94±0.65(5)* 不成对t-测试统计分析，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001； 数据是平均值±SE 括号中数字表明分析的母鼠个数 n.t.，未检测 乳通过人工挤乳由各基因型取得，并对其中关键成分作了分析。取自α-la cm/α-lac-杂合子的乳与野生型乳外观没有不同，脂肪、蛋白含量与野生 型的也相似(表4)。尽管乳糖含量在α-lacm/α-lac-杂合子中略微 减少，统计分析表明区别并不明显。相反，取自α-lac-/α-lac-同合 子的乳粘稠，难以从乳头挤出并在组成上与野生型明显不同，脂肪含量比野生型高 约60％，蛋白含量高约88％，而乳糖明显缺乏。在α-lac-/α-lac -母鼠中检测到的0.7mM乳糖表观浓度代表乳中葡萄糖含量，因为所用的乳糖 分析法涉及乳糖至葡萄糖的酶法转化。野生型乳的葡萄糖的直接分析表明其浓度为 1.8mM。 来自α-lac-/α-lac-同合子的乳中，乳蛋白的Western分 析未检查到α-乳清蛋白(见图13，F道)。苯基-琼脂糖层析进一步证明了这 一点。该技术可特异鉴别α-乳清蛋白，适于对乳α-乳清蛋白含量定量计算(表 5；也见图16)。当用于取自α-lac-/α-lac-同合子的乳时，未检 测到α-乳清蛋白。而α-lacm/α-lac-杂合子的乳中α-乳清蛋白浓 度为0.043mg/ml，约是野生型的一半(表5)。 表5 乳α-乳清蛋白含量 来源 α-乳清蛋白(mg/ml) 人 2.9±0.1(2) α-lacm/α-lacm小鼠 0.09±0.005(2) α-lac-/α-lac-小鼠 0(3) α-lacm/α-lac-小鼠 0.043±0.004(5) α-lacm/α-lach小鼠 0.65±0.07(4) α-lach/α-lach小鼠 1.38±0.12(5) 乳样品中α-乳清蛋白含量由苯基-琼脂糖层析估算 数值是平均值±SE 括号中数字表明分析的母鼠数目。 α-乳清蛋白缺陷对乳腺发育无明显影响。表4说明野生型、杂合子α-la cm/α-lac-和同合子α-lac-/α-lac-泌乳期小鼠的乳腺总重 无明显不同。乳腺的光镜分析(图14)表明杂合子与同合子的乳腺在组织学上正 常。但同合子乳腺的小泡与乳腺管扩张，充满脂滴等物质。 人α-乳清蛋白基因替换小鼠α-乳清蛋白基因 我们已得到在小鼠α-乳清蛋白基因位点携带人α-乳清蛋白基因的小鼠。在 α-lac-无效等位基因缺失的2.7kb小鼠α-乳清蛋白基因片段被2.9 7kb的含完整人α-乳清蛋白编码区和5’侧序列的片段所取代。这种人的基因 片段从人转录起始位点上游0.77kb处延伸到翻译终止位点3’端136bp 处的EcoRI位点，与小鼠序列的连结发生在小鼠转录起始位点上游0.57k b处的BamHI位点和小鼠翻译终止位点3’端147kbp处的XbaI位点 (见Stacey et al，1994，上述文献，也见图11)，我们描述 了对携带此等位基因即α-lach的小鼠的分析。 小鼠α-乳清蛋白基因缺失表明，α-乳清蛋白缺陷阻碍乳糖合成，严重破坏 乳产量。我们使用α-lach等位基因检测人α-乳清蛋白在小鼠α-乳清蛋白 缺乏时恢复产乳的能力。α-lacm/α-lach杂合子和α-lach /α-lach同合子小鼠外表、繁殖力、行为均正常。 相比α-lac-/α-lac-小鼠，α-lach/α-lach同合子 母鼠产乳表观正常，能成功养育后代。表4表明由α-lacm/α-lach杂 合子和α-lach/α-lach同合子母鼠养育的幼仔与野生型母鼠所育幼仔 重量相似。我们观察到这些动物能完全正常地连续哺育幼子，由此得到证明。这些 证据清楚表明，人的基因能有功能地替换小鼠的基因。乳组分分析(表4)表明乳 糖浓度在所有基因型中均相似。尽管α-lach/α-lach同合子动物中蛋 白和脂肪浓度有所降低，但仅脂肪减少被统计学的不成对t-测试证明为显著。相 比野生型，这些动物产乳量上升(表4)。 人和小鼠α-乳清蛋白RNA的相对定量 人乳比小鼠乳(0.1mg/ml)含相对多的α-乳清蛋白(2.5mg/m l)。我们希望确定人的α-乳清蛋白基因片段在小鼠位点是否保持高水平的表达， 或是比小鼠基因表达还低。α-lacm/α-lach杂合子小鼠为说明这个问 题提供了理想途径，其中在同一动物中人基因的表达可与小鼠基因表达直接比较。 图15A说明了比较小鼠和人α-乳清蛋白mRNA水平的方法。因为人与小 鼠α-乳清蛋白基因序列的连结位于多聚腺苷酸位点的上游，所以α-lacmR NA含有位于3′端的120个碱基的不翻译的小鼠序列。统一放射标记的小鼠R NA探针用于核糖核酸酶保护分析，以检测区分同一RNA样品中人和小鼠α-乳 清蛋白mRNA。每种mRNA相对丰度由已受到人和小鼠mRNA保护的片段的 标记量计算得出。 核糖核酸酶保护分析结果见图15B。A道示出未消化的455碱基探针，K 道表明酵母tRNA不保护任何片段。野生型小鼠RNA保护了一条305碱基的 RNA片段，该片段与内源小鼠α-乳清蛋白RNA一致(见B道)。同源α-l ach/α-lach腺体RNA保护一条较小的条带，与人α-乳清蛋白mRN A所保护的120碱基的RNA一致(见C道)。D-J道表明与系列杂合子α- lacm/α-lach动物相一致的结果。每种样品中小的与大的被保护片段表 明人和小鼠α-乳清蛋白mRNA均存在。被保护的片段从胶上切下，测定放射同 位素含量并依大小不同调整，并估算了人与小鼠α-乳清蛋白mRNA的比率。表 6示出存在于从图15B中D至J道切下的305碱基和120碱基片段的放射同 位素量，从及杂合子α-lacm/α-lach中人与小鼠α-乳清蛋白mRN A的比例。尽管不同个体鼠间有所波动但人α-乳清蛋白mRNA比小鼠mRNA 含量明显丰富。平均7个α-lacm/α-lach杂合子，人α-乳清蛋白m RNA比小鼠表达高15倍。 表6 α-lacm/α-lach乳腺中人和小鼠α-乳清蛋白mRNA相对量 泳道 鼠号 120碱基 305碱基 人/小鼠 片段a 片段a RNA比率b D 2 5957 1000 15∶1 E 3 5770 547 26∶1 F 4 4825 810 15∶1 G 76 6018 1077 14∶1 H 98 5206 1452 9∶1 I 99 5481 1117 12∶1 J 79 26858 3561 19∶1 各泳道命名表明被保护片段的来源并与图15B相对应 a.数字单位为每分钟计数(c.p.m) b.120碱基片段的c.p.m乘以2.54(以调整大小不同)与305碱基片段的c.p.m的比率 人α-乳清蛋白表达 对靶小鼠品系中α-乳清蛋白作了Western分析。人α-乳清蛋白因其 快速的泳动率而可与小鼠α-乳清蛋白区分开(见A、B道)。α-lach/α -lach同合子与α-lacm/α-lach杂合子小鼠中一条明显的低分子 量条带可被观察到(见C、D、G、H道)，它相应于人α-乳清蛋白标准的位置， 并仅能在表达人α-乳清蛋白的小鼠中观察到。该小鼠通过基因寻靶或原核微注射 得到(数据未示出)。这一点被苯基-琼脂糖层析(见图16)及溴化氰分解释放 的肽分析(数据未示出)所证实。有较低泳动率的带，与小鼠α-乳清蛋白相似， 也是人α-乳清蛋白基因产物，其性质未知，它随α-lach基因剂量不同而强 度有所变化(见G、H道)，也存在于通过原核微注射产生的人α-乳清蛋白转基 因小鼠乳中。 乳样品的α-乳清蛋白含量用苯基-琼脂糖层析作定量。图16说明图13中 所显示的三种乳样，包括α-lacm/α-lach杂合子和α-lach/α -lach同合子的柱洗脱的重叠吸光值曲线。相应于洗脱的α-乳清蛋白的峰已 标记出。α-乳清蛋白含量通过比较积分的峰面积与人α-乳清蛋白标准曲线估算 得到。积分的峰面积与α-乳清蛋白量之间呈线性关系，可高度重复。图16中的 样品中α-乳清蛋白含量估算如下：α-lacm/α-lacm野生型，0.1 mg/ml；α-lacm/α-lach杂合子#76，0.45mg/ml； α-lach/α-lach同合子#22，0.9mg/ml。表5示出来自目 标靶小鼠品系和哺乳期妇女的乳样品中α-乳清蛋白浓度。十分明显，乳中α-乳 清蛋白浓度与基因剂量直接相关，如α-lacm/α-lach杂合子仅为野生 型α-乳清蛋白浓度的一半。因为这些小鼠的产乳量相类似(表4)，所以α-乳 清蛋白的浓度提供了一个表明其合成数量的合理指标。杂合子α-lacm/α- lach乳中人与小鼠α-乳清蛋白成分的相对比例通过假定从单一的小鼠等位基 因表达的α-乳清蛋白量是0.043mg/ml，而其余代表人α-乳清蛋白。 这一点与由α-Lacm/α-Lac-杂合子和野生型小鼠表达的α-乳清蛋白 量相一致。因此，α-lacm/α-lac-杂合子估计表达0.61mg/m l人α-乳清蛋白和0.043mg/ml小鼠α-乳清蛋白。因此，α-lacm /α-lach杂合子乳中人α-乳清蛋白约是小鼠α-乳清蛋白的14倍。这与 相对mRNA比率一致。 实施例8 异源基因的增强表达 这些数据证明，包含在pHA-2构建物中的上游启动子区(AUG到-3. 7kb)增强了异源基因的表达。表7示出对来自pHA-2转基因建立者母鼠的 乳分析结果。10个母鼠中的6个表达了高水平的人α-lac，3只母鼠未能表 达可检测水平的人α-lac(在此分析中少于0.2mg/ml)，也不能传递 转基因。我们不能肯定它们是低表达者或是不能转基因。 表8：构建物PKU-0至BALT-B均含牛α-lac启动子(约2kb) ，构建物PKU-1H至PKU-16均含人α-lac启动子(3.7kb)。 使用人α-lac启动子，增加转基因表达至几乎100％。 数据表明使用人α-lac启动子，比用牛启动子表达效率高，而且能在更多 的动物体内诱导表达。 表7 构建物 小鼠 性别 C mg/ml 乳分析 TRANS. MI FREQ. pHA2 210-17 M - - 1/21＝5％ 211-12 F ＜1 - - 14/54 ＝26％ 211-16 F 10 5 3/4 211-17 F ＞＞10 ND 0/8 211-24，27， 29，31，36， 37，42，46， 47，54 M 212-7 F 10 ND 0/5 8/77＝10％ 212-11 F ＜10 1 0/4 212/13 F ＞1 1-5 2/4 212-19 F ＞10 ND 0/8 212-36，44， 45，46 M 213-4 F ＜10 5 0/2 2/14＝14％ 213-5 F ＞10 10 2/8 总整合频率25/166＝15％ ND＝未测到 TBA＝待分析 TBO＝继续饲养 C＝拷贝数 TRANS.＝传递 MI FREQ.＝整合频率 表8 构建物 转基因者 表达者 最大表达 PKU-0 6F/5M 3/5 500 PKU-1 18F/23M 5/18 200 PKU-2 8F/7M 3/8 400* PKU-3 6F/5M 2/6 100* PKU-4 7F/3M 5/18 300* BALT-A 34F/24M n.t. n.t. BALT-B 10F/18M n.t. n.t. PKU-1H 6F/5M 4/5 100 PKU-5 13F/14M 13/13 800 PKU-6 3F/4M 2/2 100 PKU-7 4F/11M 1/1 ＜20 PKU-16 13F/12M n.t. n.t. HαPKU-1 n.t. n.t. n.t. HαPKU-2 n.t. n.t. n.t. n.t.＝未测试 * 估算 序列表 (1)一般信息： (i)申请人： (A)名称：PPL治疗学(苏格兰)有限公司 (B)街道：罗斯岭 (C)城市：爱丁堡 (E)国名：英国 (F)邮码：EH259PP (ii)发明名称：α-乳清蛋白基因构建物 (iii)序列数目：21 (iv)计算机可读形式 (A)媒介类型；软盘 (B)计算机：IBP PC兼容机 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS (D)软件：Patent In Release#1.30 (EPO)版本 (2)序列SEQ ID No：1的信息： (i)序列特征： (A)长度：27碱基对 (B)类型；核酸 (C)链性：单链 (D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID No：1 GCGGATCCAC AACTGAAGTG ACTTAGC 27 (2)序列SEQ ID No：2的信息： (i)序列特征： (A)长度：35碱基对 (B)类型；核酸 (C)链性：单链 (D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID No：2 GATGGATCCT GGGTGGTCAT TGAAAGGACT GATGC 35 (2)序列SEQ ID No：3的信息： (i)序列特征： (A)长度：43碱基对 (B)类型；核酸 (C)链性：单链 (D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID No：3 GCAGGCGAAT TCCTCAAGAT TCTGAAATGG GGTCACCACA CTG 43 (2)序列SEQ ID No：4的信息： (i)序列特征： (A)长度：33碱基对 (B)类型；核酸 (C)链性：单链 (D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID No：4 GAGGATCCAA TGTGGTATCT GGCTATTTAG TGG 33 (2)序列SEQ ID No：5的信息： (i)序列特征： (A)长度：46碱基对 (B)类型；核酸 (C)链性：单链 (D)拓朴结构：线性 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID No：5 GCTGAATTCG TTAACAAAAT GTGAGGTGTA 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GGTGGGCATC 2040 CTGTTCCCTG CCATCCTGGC CAAGCAATTC ACAAAATGTG AGCTGTCCCA GCTGCTCAAA 2100 GACATAGATG GTTATGGAG 2119 关于微生物保藏的说明 (细则13之二) A.对说明书第________页、第____________行所述的微生物的说明 B.保藏事项 其他保藏在补充页中 NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL AND MARINE BACTERIA LTD 保藏单位名称 工业及海洋细菌国家保藏有限公司 保藏单位地址 (包括邮政编码和国名) 23 ST MACHAR DRIVE ABERDEEN ABZ IRY SCOTLAND UNITED KINGDOM 保藏日期 1995年2月15日 保藏编号NCIMB40709 C.补充说明(必要时) 本栏内容有补充页 含质粒pHA-2的大肠杆菌DH5αF′(K12) D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的) 所有指定国 E.补充说明(必要时) 下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”) 保藏号：40709 保藏日：1995年2月15日 保藏的构建物：pHA-2 PCT/RO/134表(1992年7月) |
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